用于蛋白質(zhì)的混合式色譜純化的固相的制作方法
【專利摘要】通過一種混合式色譜系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)由將具有陽離子交換和疏水官能團(tuán)的配體與大孔支持物基質(zhì)連接而形成，配體與支持物基質(zhì)之間僅通過疏水基團(tuán)和支持物基質(zhì)之間鏈連接，所述鏈具有不超過3個(gè)原子的主鏈。
【專利說明】用于蛋白質(zhì)的混合式色譜純化的固相
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年10月19日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/549，146的優(yōu)先權(quán)，通過引用將該申請(qǐng)的內(nèi)容全文納入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]提供了用于純化或分離目的的從液體源提取免疫球蛋白或其他蛋白質(zhì)的技術(shù)，特別的重點(diǎn)在于色譜分離技術(shù)和材料。
[0006]2.現(xiàn)有技術(shù)說明
[0007]從主要是哺乳動(dòng)物體液或細(xì)胞培養(yǎng)收獲物的液體源提取免疫球蛋白和其他蛋白質(zhì)通常對(duì)于得到充分濃縮或純化形式的用于診斷和治療用途以及實(shí)驗(yàn)室研究的蛋白質(zhì)而言是重要的。然而，蛋白質(zhì)(尤其是免疫球蛋白)的純化通常受到以下因素的影響:低產(chǎn)率、使用昂貴的分離介質(zhì)、分離介質(zhì)浸入產(chǎn)物中，和在提取過程中使用的外源性材料的安全控制的影響。本發(fā)明設(shè)法解決這些問題中的至少一些。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過使用混合式色譜系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫球蛋白和其他蛋白質(zhì)的異常高效提取(即純化)，該混合式色譜系統(tǒng)結(jié)合陽離子交換和疏水官能團(tuán)以及大孔支持基質(zhì)。將陽離子交換和疏水性官能團(tuán)被納入配體中，使該配體結(jié)合至固體基質(zhì)，所述固體基質(zhì)具有0.5微米或更大的中值直徑的孔(基本上沒有直徑小于0.1微米的孔)，并且所述配體由該配體上的疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈的連接偶聯(lián)至所述支持物基質(zhì)。使用常規(guī)結(jié)合和洗脫條件，在低PH下實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與基質(zhì)支持的配體的結(jié)合，而在較高pH下實(shí)現(xiàn)對(duì)已結(jié)合蛋白質(zhì)的洗脫。例如，利用液體源一次通過分離介質(zhì)來獲得高產(chǎn)率的高度純化的免疫球蛋白。分離介質(zhì)，即，基質(zhì)支持的配體與使配體與基質(zhì)連接的方法一樣本身是創(chuàng)新的。
[0009]在一些實(shí)施方式中，提供了用于從源溶液純化蛋白質(zhì)的方法，所述方法如下:
[0010](a)使源溶液接觸混合式色譜介質(zhì)，所述混合式色譜介質(zhì)包含與固體支持物偶聯(lián)的配體，該配體包含疏水基團(tuán)以及羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)，其中疏水基團(tuán)通過含肽連接與羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)接合，并且其中固體支持物具有中值直徑為0.5微米或更大的孔并且基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔，并且其中配體由疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈偶聯(lián)至固體支持物，以通過配體來使源溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)合至固體支持物；以及
[0011](b)從固體支持物洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0012]在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是抗體。
[0013]在一些實(shí)施方式中，在4.0-約6.0的pH下實(shí)施接觸步驟(步驟(a))并且在約
6.1-約8.5的pH下實(shí)施洗脫步驟(步驟(b))。
[0014]本發(fā)明范圍內(nèi)的某些方法包括以下步驟:
[0015](a)在pH4.0-約6.0下，使含有抗體的源溶液接觸混合式色譜介質(zhì)，所述混合式色譜介質(zhì)包含與固體支持物偶聯(lián)的配體，配體包含疏水基團(tuán)以及羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)，并且固體支持物具有中值直徑為0.5微米或更大的孔而基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔，配體由疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈與固體支持物偶聯(lián)，以通過配體使源溶液中至少部分抗體與固體支持物結(jié)合；并且
[0016](b)在約6.1-約8.5的pH下從固體支持物洗脫結(jié)合的抗體。
[0017]在一些實(shí)施方式中，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)，并且在一些實(shí)施方式中，所述苯基基團(tuán)通過含肽連接與酸部分接合。
[0018]一些實(shí)施方式中，所述配體是苯甲酰氨基乙酸(benzamidoacetic acid)。在一些實(shí)施方式中，所述連接是位于苯甲酰氨基乙酸的苯環(huán)對(duì)位的烷基氨基基團(tuán)，從而所述配體和連接一起構(gòu)成對(duì)-氨基苯甲酰氨基乙酸基團(tuán)。
[0019]在一些實(shí)施方式中，所述固體支持物由中值粒徑為約25微米-約150微米的顆粒組成。
[0020]在一些實(shí)施方式中，所述固體支持物是膜。在一些實(shí)施方式中，固體支持物是整料。
[0021]在一些實(shí)施方式中，提供了混合式色譜介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述混合式介質(zhì)包含與固體支持物偶聯(lián)的配體，所述配體包含疏水基團(tuán)以及羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)，所述固體支持物包含具有中值直徑為0.5微米或更大的孔而基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔的顆粒，并且所述配體由疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈與所述固體支持物偶聯(lián)。
[0022]在一些介質(zhì)中，所述顆粒具有約25微米-約150微米的中值粒徑。在一些介質(zhì)中，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)，并且在一些情況下，所述苯基通過含肽連接與酸部分接合。一些介質(zhì)中，所述配體是苯甲酰氨基乙酸。在這些介質(zhì)的一些中，所述配體由疏水基團(tuán)通過苯甲酰氨基乙酸的苯環(huán)上對(duì)位上的烷基氨基基團(tuán)與所述固體支持物偶聯(lián)，從而所述配體與烷基氨基基團(tuán)一起構(gòu)成4-氨基苯甲酰氨基乙酸基團(tuán)。
[0023]本文還提供了制備混合式色譜介質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟:
[0024](a)將二醇-官能化的固體顆粒上的二醇基團(tuán)氧化為醛基，從而將二醇-官能化的固體顆粒轉(zhuǎn)化為醛-官能化的固體顆粒，所述固體顆粒具有中值直徑為0.5微米或更大的孔而基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔并且具有約200-約300 μ mol/mL的二醇密度；并且
[0025](b)將胺-官能化的配體與醛-官能化的顆粒偶聯(lián)，所述胺-官能化的配體包含與羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)接合的胺-取代的疏水基團(tuán)。
[0026]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)，并且在一些這樣的實(shí)施方式中，所述苯基基團(tuán)通過含肽連接與羧基基團(tuán)接合。在一些實(shí)施方式中，所述配體是苯甲酰氨基乙酸。
[0027]本說明書的術(shù)語“磺基基團(tuán)”表示具有下式的基團(tuán):
[0028]-SO3H
[0029]本發(fā)明的這些及 其他目的、方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將通過下文的解釋而更好地理解。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是IgGl單克隆抗體在本發(fā)明的對(duì)氨基馬尿酸-官能化樹脂上純化的吸收曲線。[0031]圖2是來自初始柱洗滌的流過部分和來自圖1的洗脫的兩個(gè)收集的部分的電泳圖。
[0032]圖3是對(duì)來自圖1的洗脫的兩個(gè)收集部分的HPLC-尺寸排阻色譜分析的吸收曲線。
[0033]發(fā)明詳述和說明性實(shí)施方式
[0034]用作本文所述配體中的疏水性官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)包含芳族基團(tuán)和取代的芳族基團(tuán)。苯基基團(tuán)和聯(lián)苯基基團(tuán)，尤其是苯基基團(tuán)，是芳族基團(tuán)的常見示例并且用于本文的某些實(shí)施方式中。合適的取代基是保持芳族基團(tuán)的疏水性特性的那些；示例包括某些烷基基團(tuán)如己基。較不優(yōu)選對(duì)免疫球蛋白產(chǎn)生位阻現(xiàn)象的取代基?？捎米麝栯x子交換官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)包括羧酸、羧酸酯和磺基基團(tuán)，包括磺基基團(tuán)本身和硫酸鹽。可以通過鏈來接合陽離子交換和疏水部分，所述鏈優(yōu)選包含除了氫原子和取代基以外的不超過5個(gè)原子的鏈。這樣的鏈的示例是含肽的鏈，如-R1-C(O)-NH-R2-,其中R1和R2是烷基基團(tuán)并且R1和R2之一或兩者均可缺失。具體的示例是-c(o)-nh-ch2-。含有作為弱陽離子交換基團(tuán)的羧基官能團(tuán)和作為疏水基團(tuán)的苯基官能團(tuán)之間的后一種連接的配體是苯甲酰氨基乙酸。
[0035]接合所述配體與支持物基質(zhì)(本文也稱為固體支持物)的連接是一個(gè)末端與配體的疏水官能團(tuán)直接偶聯(lián)而另一個(gè)末端與基質(zhì)直接偶聯(lián)的鏈，作為基質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)活化的結(jié)果，該鏈由此包含來自基質(zhì)的任何側(cè)基。不包含除了該連接以外的間隔子(spacer)。如上述，所述鏈?zhǔn)?-3個(gè)原子的含胺的鏈。這樣的鏈的示例是具有式-R3-NH-R4-的那些鏈，其中R3和R4是甲基或 乙基基團(tuán)并且R3和R4之一或兩者均可缺失。這樣的基團(tuán)的具體示例是-CH2-NH-。在配體是苯甲酰氨基乙酸或2-苯甲酰氨基乙磺酸的實(shí)施方式中，配體的苯環(huán)和基質(zhì)之間的特別合適的連接是如下這種連接:其中在苯甲酰氨基乙酸的情況下，該連接的胺基團(tuán)與苯環(huán)在相對(duì)于羰基氨基乙酸基團(tuán)的對(duì)位連接，或者在2-苯甲酰氨基乙磺酸的情況下，該連接的胺基團(tuán)與苯環(huán)在相對(duì)于羰基氨基乙磺酸基團(tuán)的對(duì)位連接。
[0036]可以形成所述配體和至少部分所述連接的化合物的示例是4-氨基苯甲酰氨基乙
酸，也被稱為對(duì)_氨基馬尿酸，其如下式所不:
[0037]
π
『~義、八OH
I ^ 1.....1 I
N ",O
[0038]并且可以形成所述配體和至少部分所述連接的化合物的另一個(gè)示例是2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙磺酸，其如下式所示:
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種從源溶液純化蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含: (a)使所述源溶液接觸混合式色譜介質(zhì)，所述混合式色譜介質(zhì)包含與固體支持物偶聯(lián)的配體，所述配體包含疏水基團(tuán)和選自羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)的酸部分，其中所述疏水基團(tuán)通過含肽連接與所述酸部分接合，所述固體支持物具有中值直徑為0.5微米或更大的孔并且基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔，并且所述配體由所述疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈偶聯(lián)至所述固體支持物，以使所述源溶液中的所述蛋白質(zhì)通過所述配體結(jié)合至所述固體支持物；以及 (b)從所述固體支持物洗脫由此結(jié)合的所述蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(a)在約4.0-約6.0的pH下實(shí)施而步驟(b)在約6.1-約8.5的pH下實(shí)施。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述配體是苯甲酰氨基乙酸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述配體是2-苯甲酰氨基-乙磺酸。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述連接是位于所述苯甲酰氨基乙酸的苯環(huán)上的對(duì)位的烷基氨基，從而所述配體和鏈一起構(gòu)成2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙酸基團(tuán)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述連接是位于所述2-苯甲酰氨基乙磺酸的苯環(huán)上的對(duì)位的烷基氨基，從而所述配體和鏈一起構(gòu)成2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙磺酸基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體支持物由中值粒徑為約25微米-約150微米的顆粒組成。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體支持物是膜。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體支持物是整料。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述源溶液含有濃度為約50mM-約300mM的選自堿金屬和堿土金屬鹵化物的鹽。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述源溶液含有濃度為約IOOmM-約150mM的選自堿金屬和堿土金屬鹵化物的鹽。
14.一種混合式色譜介質(zhì)，所述混合式色譜介質(zhì)包含與固體支持物偶聯(lián)的配體，所述配體包含疏水基團(tuán)和選自羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)的酸部分，其中所述疏水基團(tuán)通過含肽連接與所述酸部分接合，所述固體支持物包含具有中值直徑為0.5微米或更大的孔并且基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔的顆粒，并且所述配體由所述疏水基團(tuán)通過1-3個(gè)原子的鏈偶聯(lián)至所述固體支持物。
15.如權(quán)利要求14所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述顆粒具有約25微米-約150微米的中值粒徑。
16.如權(quán)利要求14所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)。
17.如權(quán)利要求16所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述酸部分是羧基基團(tuán)。
18.如權(quán)利要求16所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述酸部分是磺基基團(tuán)。
19.如權(quán)利要求14所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述配體是苯甲酰氨基乙酸。
20.如權(quán)利要求14所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述配體是2-苯甲酰氨基乙磺酸。
21.如權(quán)利要求19所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述連接是位于所述苯甲酰氨基乙酸的苯環(huán)上的對(duì)位的烷基氨基，從而所述配體和鏈一起構(gòu)成2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙酸基團(tuán)。
22.如權(quán)利要求20所述的混合式色譜介質(zhì)，其特征在于，所述連接是位于所述2-苯甲酰氨基-乙磺酸的苯環(huán)上的對(duì)位的烷基氨基，從而所述配體和鏈一起構(gòu)成2-(4-氨基苯甲酰氨基)_乙磺酸基團(tuán)。
23.一種用于制備混合式色譜介質(zhì)的方法，所述方法包含: (a)將二醇-官能化的固體顆粒上的二醇基團(tuán)氧化為醛基，所述固體顆粒具有中值直徑為0.5微米或更大的孔并且基本沒有直徑為0.1微米或更小的孔并且具有約200-約300 μ mol/mL的二醇密度，從而將所述二醇_官能化的固體顆粒轉(zhuǎn)化為醛-官能化的固體顆粒；以及 (b)將胺-官能化的配體與所述醛-官能化的顆粒偶聯(lián)，所述胺-官能化的配體包含與選自羧基基團(tuán)或磺基基團(tuán)的酸部分接合的胺-取代的疏水基團(tuán)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述疏水基團(tuán)是苯基基團(tuán)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述苯基基團(tuán)通過含肽連接與所述羧基基團(tuán)接合。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述配體是苯甲酰氨基乙酸。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述配體是2-苯甲酰氨基-乙磺酸。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK103998456SQ201280062640
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月19日
【發(fā)明者】J·廖, L·奧列奇, 陳虹, 何學(xué)梅, R·弗羅斯特 申請(qǐng)人:生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司