用于合成治療肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用Sieber酰胺樹脂大規(guī)模合成治療肽的方法，所述方法包括固相Fmoc-化學。
【專利說明】用于合成治療肽的方法
[0001]本發(fā)明涉及一種用與大規(guī)模合成含有非天然或人造氨基酸的治療肽的新方法。該方法可放大至巨大體積并且允許成本有效地制造高純肽。
[0002]固相肽合成(SPPS)是首先由Merrifield在1963年引入的高度成功的方法(Merrifield, R.B., J.Amer.Chem.Soc., 1963, 85:2149-54)。從那時起已經用這項技術合成許多肽?，F有技術中用來化學合成肽和蛋白質的方法在Kent, S.B.H.，Ann.Rev.B1chem.，1988，57:957-89中綜述。固相合成允許合成難以在細菌中表達的天然肽、摻入非天然或合成氨基酸、肽主鏈修飾和合成含有D-氨基酸的D-蛋白質。
[0003]已經使用兩種通過固相合成裝配肽鏈的策略:1).逐步固相合成和2).固相片段縮合。在逐步SPPS中，處于N- a -受保護形式的C末端氨基酸和如果需要，側鏈受保護的反應性衍生物，直接或借助合適接頭共價偶聯至一般溶脹在有機溶劑中的“固態(tài)”支持物，例如，聚合物樹脂。移除N-a-保護基，并且以逐步方式添加受保護的后續(xù)氨基酸。當已經獲得所需的肽鏈長度時，移除側鏈保護基并從樹脂切下肽。切割/去保護過程可以在分立步驟中或在相同的時間進行。在固相片段縮合中，通過使用通過逐步SPPS制備的受保護片段，在固相支持物上連續(xù)縮合片段，裝配出靶序列。
[0004]一種形式的SPPS依賴于芴甲氧羰基(或“Fmoc”)以暫時保護a -氨基。采用這種方法，Fmoc基團與氨基共價結合以抑制其親核性。C末端氨基酸經接頭與樹脂共價連接。接下來，用堿如哌啶移除Fmoc基團。這釋放了隨后可用于與活化氨基酸反應的氨基。通過使用過量(一般2-4倍)的活化氨基酸驅動反應完成。在每個去保護和偶聯步驟后，進行一次或多次洗滌以移除過量試劑。通過使用酸性溶液如三氟乙酸(TFA)酸解可實現從樹脂切下肽，同時移除側鏈保護基。常見慣例是添加標稱為“清除劑”的額外化學品，如三異丙基硅烷(TIPS)、三乙基硅烷(TES)、苯酚、苯甲醚、茴香硫醚、水、1,2-乙二硫醇(EDT)U-十二硫醇、二硫蘇糖醇(DTT)和吲哚，連同切割混合物中與釋放的側鏈保護基反應的酸，因而防止那些釋放的基團再連接至切下的肽。
[0005]氨基酸在N末端和C末端具有在合成期間促進氨基酸偶聯的反應性部分。此外，大部分氨基酸上存在的反應性側鏈官能團可以在合成和肽延伸期間與游離末端或其他側鏈基團相互作用并且不利地影響產率和純度。為了在側鏈反應性最小情況下促進正確氨基酸合成，化學基團，稱作“保護基”用來與特定氨基酸官能團結合以“封閉”或“保護”官能團免于非特異性反應。側鏈保護基稱作永久或半永久保護基，因為它們可以在合成期間經受住多個循環(huán)的化學處理并且僅在肽合成完成后用強酸處理期間整體移除。
[0006]目前的前述策略不合乎商業(yè)規(guī)模生產治療肽需要，因為其中所用的樹脂需要使用從聚合物樹脂切下肽的高濃度酸去除肽。除了以大規(guī)模使用大量極端腐蝕性材料的安全性顧慮之外，可能要求專用設備以允許其使用。此外，使用高濃度強酸切下和去保護肽可能導致所需的肽嚴重降解，從而導致低產率和/或產生新雜質，原因在于肽暴露于強酸持續(xù)以規(guī)模進行切割和后處理所需要的時間段。這類雜質可以包括脫水的或氧化的種類或與全部或部分樹脂-接頭與肽連接相關的雜質-這些雜質則可難以除去。因而，需要開發(fā)用于產生治療肽的高效大規(guī)模方法。
[0007]如先前提到，固相肽合成在“固相支持物或錨定物”上啟動。這些“支持物”在產業(yè)中稱作“樹脂”。樹脂可以由聚苯乙烯或其他聚合材料制成，如環(huán)氧乙烷聚合物，例如基于PEG的樹脂或二者的混合物，例如“雜合物”或PEG-聚苯乙烯樹脂。用于通過Fmoc SPPS途徑制造肽酰胺的常用樹脂包括與接頭組合的聚苯乙烯基樹脂，所述接頭適于高濃度酸處理時釋放完全去保護的肽酰胺。常用樹脂包括Rink酰胺樹脂，例如，Rink酰胺樹脂、Rink酰胺MBHA樹脂和Rink酰胺AM樹脂。當用切割混合物中高百分數v/v的酸處理時-例如，一般使用80-95% v/v的三氟乙酸(TFA)，Rink酰胺樹脂從樹脂釋放完全去保護的肽酰胺。
[0008]在1987年，Sieber發(fā)現了一種用于C末端酰胺固相合成的新的酸不穩(wěn)定樹月旨(Tetrahedon Lett.，1987，28 (19):2107-10)。該樹脂利用9-咕噸基基團連同在所述咕噸基和聚苯乙烯之間引入的-OCH2-基團來增加酸不穩(wěn)定性。通過非常溫和的酸解從這種樹脂切下肽酰胺。該論文描述了在這種樹脂上合成兩種肽-第一種肽無側鏈保護基(Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2)，其中通過泵送酸性切割混合物(TFA:1, 2- 二氯乙烷2:98v/v)經過玻璃柱中的該樹脂以0.5g規(guī)模實現從樹脂切下；通過泵送酸性切割混合物(TFA/1, 2- 二氯乙烷-/1，2-乙二硫醇2:98:0.1)經過具有該樹脂的柱從樹脂切下第二種肽(a -MSH):一種含有側鏈受保護基團(叔丁基，Trt, MtrjP Boc)的13個氨基酸肽。需要采用高濃度酸和加熱(TFA/水9:1在30°C，隨后95^^?八連同清除劑在50°0的兩個另外步驟以除去全部側鏈保護基。
[0009]盡管上述文章中沒有隱含描述，但是Sieber酰胺樹脂(隨著咕噸基樹脂變得知名)的主要用途是產生側鏈完全保護的肽用于后續(xù)片段縮合反應中。通過使用切割混合物中低百分數v/v(—般1-5% v/v)的酸，這是可實現的。根據商業(yè)供應商(Novab1chem?, merckkgbA) , Sieber 樹脂是“一種借助 tfa 溫和裂解用于 fmocSPPS受保護肽酰胺的超級酸不穩(wěn)定接頭(樹脂)?！?
[0010]已經發(fā)現，使用與Fmoc化學和使用某些濃度三氟乙酸(TFA)(例如，高于10% v/v)的切割溶液組合的Sieber酰胺樹脂可以用來實際地和以大規(guī)模(kg規(guī)模)合成完全去保護的肽酰胺。與使用Rink酰胺樹脂相比時，這是一種用于制造完全去保護的肽酰胺的優(yōu)越方法，因為:
[0011](i)可以使用這種方法實現更大的制造產量
[0012](ii)可以使用這種方法實現更大純度的肽，這允許更容易的下游純化
[0013](iii)它促進原料和溶劑消耗量降低，并且因此是更有成本效益的制造方法
[0014](iv)它是從小規(guī)模至大規(guī)模穩(wěn)健和可重復的方法，因此允許容易放大工藝。
[0015]本發(fā)明提供一種大規(guī)模合成治療肽的新方法，所述方法包括分步固相Fmoc-化學。
[0016]在一個方面，本發(fā)明提供一種合成治療肽的方法，所述方法包括連續(xù)步驟:
[0017](a)在偶極非質子溶劑中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或FmocSieber酰胺樹脂);
[0018](b)使用哌唳在偶極非質子溶劑中的溶液去保護Fmoc基團；
[0019](c)在用偶極非質子溶劑去保護Fmoc后洗滌樹脂；
[0020](d)通過在偶極非質子溶劑中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑隨后添加堿并攪拌，活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂；
[0021](e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂；
[0022](f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)_1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎮(zhèn)四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同偶極非質子溶劑中的堿作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸；
[0023](g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂；
[0024](h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成；
[0025](i)使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈；
[0026](j)過濾來自樹脂的切割混合物；和
[0027](k)蒸發(fā)濾液并且用有機溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
[0028]根據如上文定義的方法的步驟(a)，(b)，(C)和(f)，使用偶極非質子溶劑。這種偶極非質子溶劑可以選自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)或它們的組合 。在一個優(yōu)選實施方案中，使用DMF作為偶極非質子溶劑。
[0029]在另一個方面，本發(fā)明提供一種合成治療肽的方法，所述方法包括連續(xù)步驟:
[0030](a)在二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或Fmoc Sieber酰胺樹脂)；
[0031 ] (b)使用DMF中的哌啶溶液去保護Fmoc基團；
[0032](c)在用DMF去保護Fmoc后洗滌樹脂；
[0033](d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑隨后添加堿并攪拌，活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂；
[0034](e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂；
[0035](f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)_1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲條言四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同DMF中的堿作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸；
[0036](g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂；
[0037](h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成；
[0038](i)使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈；
[0039](j)過濾來自樹脂的切割混合物；和
[0040](k)蒸發(fā)濾液并且用有機溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
[0041]根據如上文定義的本發(fā)明方法的步驟(d)，使用堿。所述堿可以是叔胺堿或其混合物，并且選自N，N-二異丙基乙胺(DIEA)、三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)、2，4，6-三甲基吡啶(TMP，也稱作collidine)、2，3，5，6-四甲基吡啶(TEMP)、2，6- 二叔丁基_4_ 二甲氨基吡啶(DBDMAP)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)。緊鄰本發(fā)明前述方面的優(yōu)選實施方案特征在于，步驟(d)中使用的堿是叔胺，并且在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述堿是N，N-二異丙基乙胺(DIEA)。
[0042]在另一個方面，本發(fā)明提供一種合成治療肽的方法，所述方法包括步驟:
[0043](a)在二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或Fmoc Sieber酰胺樹脂)；
[0044](b)使用DMF中的哌啶溶液去保護Fmoc基團；
[0045](c)在用DMF去保護Fmoc后洗滌樹脂；
[0046](d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑隨后添加堿并攪拌,活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂；
[0047](e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂；
[0048](f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)_1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基脲錫.四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同DMF中的N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸；
[0049](g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂；
[0050](h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成；
[0051](i)使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈；
[0052](j)過濾來自樹脂的切割混合物；和
[0053](k)蒸發(fā)濾液并且用有機反溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
[0054]在另一個方面，本發(fā)明提供一種合成治療肽的方法，所述方法包括連續(xù)步驟:
[0055](a)在二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或Fmoc Sieber酰胺樹脂)；
[0056](b)使用DMF中的哌啶溶液去保護Fmoc基團；
[0057](c)在用DMF去保護Fmoc后洗滌樹脂；
[0058](d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑隨后添加N，N-二異丙基乙胺(DIEA)并攪拌，活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂；
[0059](e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂；
[0060](f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)_1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基脲橡四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同DMF中的N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸；
[0061 ] (g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂；
[0062](h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成；
[0063](i)使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈；
[0064](j)過濾來自樹脂的切割混合物；和
[0065](k)蒸發(fā)濾液并且用有機溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
[0066]本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案特征在于，在如上文定義的方法的步驟(i)中使用的所述切割混合物由TFA、一種或多種清除劑和DCM組成，其中所述清除劑選自三異丙基硅烷(TIPS)、三乙基硅烷(TES)、苯酚、苯甲醚、茴香硫醚，水、1,2-乙二硫醇(EDT)U-十二硫醇、二硫蘇糖醇(DTT)和吲哚，前提是TFA在所述切割混合物中的百分數不超過25%。
[0067]緊鄰本發(fā)明前述方面的優(yōu)選實施方案特征在于所述清除劑選自TIPS、TES、茴香醚和水。
[0068]本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案特征在于，在如上文定義的步驟(i)中使用的所述切割混合物由TFA、一種或多種清除劑和DCM組成，其中所述清除劑可以選自TIPS、TES、茴香醚和水，條件是TFA在所述切割混合物中的百分數不超過25%。
[0069]對于其中僅需要移除Boc和tBu側鏈保護基的肽，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案特征在于所述切割混合物由15至25% v/v的TFA連同2.5至12% v/v的TIPS及62.5至82.5%v/v的DCM組成；并且甚至更優(yōu)選地在于所述切割混合物由20% v/v的TFA連同10% v/v的TIPS及70% v/v的DCM組成。
[0070]對于其中僅需要移除Boc和tBu側鏈保護基的肽，如上文定義的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于:
[0071]在如上文定義的步驟⑴中使用的所述切割混合物由15至25% v/v的TFA連同2.5至12% v/v的TIPS組成并且切割混合物的剩余部分用DCM補足至100% ;并且甚至更優(yōu)選地在于
[0072]在如上文定義的步驟⑴中使用的所述切割混合物由大約20% v/v的TFA連同大約 10% v/v 的 TIPS 及 70% v/v 的 DCM 組成。
[0073]如上文定義的采用步驟(a)至(k)的本發(fā)明方法的又一個優(yōu)選的實施方案是從Sieber酰胺樹脂切下所產生的肽，同時去保護側鏈保護基。
[0074]另一個本發(fā)明的優(yōu)選實施方案特征在于使用DMF中的哌唳,起初從樹脂移除Fmoc基團。在一個更優(yōu)選的實施方案中，使用DMF中的哌啶，起初從樹脂移除Fmoc基團，其中所述哌唳在DMF中的濃度小于20% (v/v)并且更優(yōu)選地約15% (v/v)。
[0075]根據如上文定義的本發(fā)明方法的步驟(f)，使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲榻'四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同在偶極非質子溶劑如DMF中的堿如N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)，單獨或在組合下實施活化的Fmoc-氨基酸的偶聯。在本發(fā)明前述多個方面的任一個方面的一個優(yōu)選實施方案中，使用“偶聯試劑組合”偶聯的氨基酸殘基，所述偶聯試劑組合選自TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA,HATU/DIEA,HCTU/DIEA,DIC/HOBt,DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA，更優(yōu)選地選自 HCTU/DIEA 和 TBTU/HOBt/DIEA。
[0076]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟(a)中起初如下溶脹Fmoc-Sieber-酰胺樹脂:使用7至12體積DMF處理I至3次至多I小時，甚至更優(yōu)選地，使用10體積DMF處理3次，每次處理持續(xù)10至30分鐘。
[0077]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟b)中如下去保護Sieber樹脂上的Fmoc基團:使用DMF中的哌啶溶液(10-20% v/V)處理I至2次持續(xù)5至20分鐘，甚至更優(yōu)選地DMF中的15% v/v哌啶處理2次持續(xù)10分鐘。
[0078]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟c)中，去保護的樹脂用7至12體積DMF洗滌3至5次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘，甚至更優(yōu)選地用10體積DMF洗滌3次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘。
[0079]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟d)中，通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑，添加DIEA，攪拌至多5分鐘，活化1.2-2.0mol當量(相對于樹脂-批次規(guī)模)的Fmoc-氨基酸用于偶聯；并且更優(yōu)選地，通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑，添加DIEA，攪拌I至2分鐘，活化1.5mol當量(相對于樹脂-批次規(guī)模)的Fmoc-氨基酸用于偶聯。
[0080]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟(f)中,將0.5至1.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)偶聯試劑隨4至10體積DMF中的1.5至2.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)DIEA —起在環(huán)境溫度使用30至120分鐘；和更優(yōu)選地，將0.5至1.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)偶聯試劑與5至7體積DMF中的1.5至2.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)DIEA —起在15至30°C使用60分鐘。
[0081]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟(g)中，將樹脂在每次偶聯后用7至12體積DMF洗滌2至4次持續(xù)至多5分鐘；和在一個更優(yōu)選的實施方案中，將樹脂在每次偶聯后用10體積DMF洗滌2次持續(xù)至多5分鐘。
[0082]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟⑴中:
[0083]-將樹脂浸沒于切割混合物中并且在環(huán)境溫度攪拌2至3小時，并且更優(yōu)選地，將樹脂浸沒并攪拌2.5小時，和
[0084]-將樹脂/切割混合物溶液斷續(xù)地用氮氣鼓吹。
[0085]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟(j)中:
[0086]-將用過的樹脂用小體積的新鮮切割混合物或TFA/DCM(20:80v/v)洗滌I至2次；
[0087]-將用過的樹脂任選地用小體積的MeOH洗滌。
[0088]具有如上文定義的連續(xù)步驟(a)至(j)的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案特征在于，在步驟(k)中，在合并濾液并蒸發(fā)該組合后:
[0089]-使用5至15體積的MtBE沉淀粗制肽；
[0090]-將沉淀的肽干燥至所需要的干燥水平；
[0091]-將沉淀的肽用稀酸或稀酸連同下游層析純化中待使用的有機改性劑溶解
[0092]-將肽純化并且使用反相制備性層析進行鹽交換步驟。
[0093]本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案特征在于它包括以下連續(xù)步驟(a)至(j):
[0094](a)如下腫脹Fmoc-Sieber-酰胺樹脂:使用7至12體積DMF處理I至3次持續(xù)至多I小時，甚至更優(yōu)選地，使用7至12體積DMF處理3次，每次處理持續(xù)10至30分鐘；
[0095](b)如下去保護Sieber樹脂上的Fmoc基團:使用DMF中的哌唳溶液(10-20% v/V)處理I至2次持續(xù)5至20分鐘，甚至更優(yōu)選地使用DMF中的15% v/v哌啶處理2次持續(xù)10分鐘；
[0096](C)用7至12體積DMF洗滌去保護的樹脂3至5次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘，甚至更優(yōu)選地，10體積DMF洗滌3次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘。
[0097](d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑，添加DIEA，攪拌I至2分鐘，活化1.2-2.0mol當量(相對于樹脂-批次規(guī)模)的Fmoc-氨基酸用于偶聯至去保護的樹脂；并且更優(yōu)選地，通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑，添加DIEA，攪拌I至2分鐘，活化1.5mol當量(相對于樹脂-批次規(guī)模)的Fmoc-氨基酸用于偶聯。
[0098](e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂；
[0099](f)通過在環(huán)境溫度用活化的Fmoc-氨基酸溶液浸沒并攪動去保護的樹脂30-120分鐘，將Fmoc-氨基酸偶聯到去保護的樹脂；所述活化的Fmoc-氨基酸溶液在環(huán)境溫度由如上文(d)中所述的Fmoc-氨基酸連同0.5至1.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)偶聯試劑連同4至10體積DMF中的1.5至2.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)DIEA組成；和更優(yōu)選地,在15至30°C由0.5至1.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)偶聯試劑連同5至7體積DMF中1.5至2.5mol當量(相對于Fmoc氨基酸)的DIEA組成持續(xù)60分鐘。
[0100](g)在每次偶聯后用7至12體積DMF洗滌樹脂2至4次至多5分鐘；和更優(yōu)選地用10體積DMF洗滌2次至多5分鐘；
[0101](h)重復步驟(b) - (g)直至肽形成；
[0102](i)通過以下方式，使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈:
[0103]-在切割混合物中浸沒樹脂并且在環(huán)境溫度攪動2至3小時，和更優(yōu)選地通過浸沒和攪動2.5小時，和
[0104]-用氮氣斷續(xù)地對樹脂/切割混合物混合物鼓泡。
[0105](j)過濾來自樹脂的切割混合物，隨后
[0106]-將用過的樹脂用小體積的新鮮切割混合物或TFA/DCM(20:80v/v)洗滌I至2次；并且
[0107]-任選地用小體積的MeOH洗滌用過的樹脂。
[0108](k)合并濾液和洗液及蒸發(fā)該組合，隨后
[0109]-從合并的蒸發(fā)的濾液沉淀粗制肽并且使用5至15體積MtBE洗滌；
[0110]-將沉淀的肽干燥至所需要的干燥水平；
[0111]-將沉淀的肽用稀酸或稀酸連同下游層析純化中待使用的有機改性劑溶解；
[0112]-純化肽并使用反相制備性色譜進行鹽交換步驟。
[0113]緊鄰本發(fā)明前述多個方面的任一方面的優(yōu)選實施方案特征在于步驟(a)至(j)(新子步驟由_#指示)進一步定義如下:
[0114](a)如下起初膨脹Fmoc-Sieber-酰胺樹脂:使用7至12體積DMF處理I至3次持續(xù)至多I小時，甚至更優(yōu)選地，使用7至12體積DMF處理3次，每次處理持續(xù)10至30分鐘；
[0115](b)如下去保護Sieber樹脂上的Fmoc基團:使用DMF中的哌啶溶液(10-20% v/V)處理I至2次持續(xù)5至20分鐘，甚至更優(yōu)選地使用DMF中的15% v/v哌啶處理2次持續(xù)10分鐘；
[0116](C)用7至12體積DMF洗滌去保護的樹脂3至5次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘，甚至更優(yōu)選地，10體積DMF洗滌3次，每次洗滌持續(xù)至多5分鐘。
[0117](d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑，添加DIEA，攪拌至多5分鐘，甚至更優(yōu)選地，攪拌I至2分鐘,活化Fmoc-氨基酸(1.2-2.0mol當量或更優(yōu)選1.5mol當量(相對于樹脂-批次規(guī)模)用于偶聯；
[0118](e)將偶聯溶液充入反應器中的樹脂；
[0119](f)在環(huán)境溫度使用相對于Fmoc氨基酸的0.5至1.5mol當量偶聯試劑連同相對于Fmoc-氨基酸的在4至10體積DMF中的1.5至2.5mol當量DIEA持續(xù)30至120分鐘，甚至更優(yōu)選地，在15至30°C使用5至7體積DMF持續(xù)60分鐘；
[0120](g).在每次偶聯后用7至12體積DMF洗滌樹脂2至4次至多5分鐘；甚至更優(yōu)選地用10體積DMF洗滌2次至多5分鐘；
[0121 ] (h).重復步驟(b) - (g)直至肽形成；
[0122](i).在切割混合物中浸沒樹脂并且在環(huán)境溫度攪動2至3小時，和更優(yōu)選地浸沒并攪動樹脂2.5小時；
[0123](1-1).用氮氣斷續(xù)地對樹脂/切割混合物溶液鼓泡；
[0124](j).過濾來自樹脂的切割混合物；
[0125](j-Ι).將用過的樹脂用小體積的新鮮切割混合物或TFA/DCM(20:80v/v)洗滌I至2次；
[0126](j-2).任選地用小體積的MeOH洗滌用過的樹脂；
[0127](k).合并濾液并且蒸發(fā)該組合，
[0128](k-Ι)使用5至15體積MtBE沉淀粗制肽；
[0129](k-2).將沉淀的肽干燥至所需要的干燥水平；
[0130](k-3)將沉淀的肽用稀酸或稀酸連同下游層析純化中待使用的有機改性劑溶解
[0131](k-4).純化肽并使用反相制備性色譜進行鹽交換步驟。
[0132]應當承認一些保護基(例如Arg的2，2，4，6，7_五甲基-二氫苯并呋喃_5_磺酰(Pbf)側鏈保護)將需要更高百分數的酸，一般50-80%，以在實際時間范圍內移除側鏈保護基，然而，本發(fā)明的全部其他多個方面保持相同。構思的其他側鏈保護基包括但不限于甲氧基三甲基苯磺?；?Mtr)、2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃_6_磺酰氯(Pmc)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)和2，4, 6-三甲氧基芐基(Tmob)。
[0133]本發(fā)明還提供這樣的情況，此時希望在切割期間和之后保留某些側鏈保護基。例如，重要的是保留Cys上的乙酰氨基甲基(Acm)側鏈保護基從而完成的肽可以按其線性形式純化并且此后當移除保護基并且二硫鍵在兩個Cys殘基之間形成時環(huán)化。
[0134]附圖簡述
[0135]圖1:描述使用Rink酰胺樹脂所合成的肽與按相似合成方法使用Sieber酰胺樹脂所合成的那些肽面對面直接比較的圖。根據本文所述的方法，產生長度從5個氨基酸至30個氨基酸變動的肽，并且測量合成產率。對于每種肽長度(本圖y_軸下報道)，使用Rink酰胺樹脂時的產率百分數(如X-軸所示)由頂部標度代表并且使用Sieber酰胺樹脂時的產率百分數由底部標度代表。對于合成的每種肽，即一個5氨基酸序列，兩個8氨基酸序列、一個用一個或多個多巴胺部分修飾的8氨基酸序列和一個30氨基酸序列，使用Sieber酰胺樹脂導致更高產率％。
[0136]圖2:描述使用Sieber酰胺樹脂合成一個5氨基酸肽時在2g至2200g規(guī)模上合成產率再現性的圖。如報道,對于每個規(guī)模,一致地實現約80%的合成產率。
[0137]圖3:描述基于相對于Sieber酰胺樹脂，使用Rink酰胺樹脂合成一個8氨基酸肽和一個30氨基酸肽時所使用材料的相對成本的圖。由頂部標度代表基于用于下述這些肽的材料的相對成本，其中使用用于一個8氨基酸肽和一個30氨基酸肽的Rink酰胺樹脂合成所述這些肽，而由每種肽的底部標度代表使用Sieber酰胺樹脂時的相同肽的相對成本。如報道，使用Sieber酰胺樹脂的相對成本小于使用Rink酰胺樹脂的相對成本。
[0138]大部分逐步固相合成需要使用聚苯乙烯樹脂以合成肽酰胺。Rink酰胺樹脂在固相肽合成中用于利用Fmoc-保護的氨基酸制備肽酰胺。可以使用常見酰胺鍵形成方法實現第一氨基酸的偶聯。肽序列在堿性或中性條件下在Rink酰胺樹脂上裝配，隨后在酸性條件下從樹脂切下完成的肽。一般使用大于80% TFA v/v從Rink酰胺樹脂切下肽。(Stathopoulos, P.；Papas, S.和 Tsikaris, V.，J.Pept.Sc1.，2006，12:227-37)。更強的酸或更高濃度的TFA有時從聚苯乙烯支持物切下一些Rink接頭并且將有色雜質引入切割的產物中。因而，對于一些肽，使用Rink酰胺樹脂的合成產率傳統(tǒng)上是低的。Rink樹脂的例子是:
[0139]
【權利要求】
1.一種使用逐步固相Fmoc-化學法合成治療肽的方法，包括步驟: (a)在偶極非質子溶劑中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或FmocSieber酰胺樹脂); (b)使用哌啶在偶極非質子溶劑中的溶液去保護Fmoc基團； (c)在用偶極非質子溶劑去保護Fmoc后洗滌樹脂； (d)通過在偶極非質子溶劑中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑然后添加堿并攪拌，活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂； (e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂； (f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基脲榻'四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同偶極非質子溶劑中的堿作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸； (g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂； (h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成； (i)使用切割混合 物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈； U)過濾來自樹脂的切割混合物；和 (k)蒸發(fā)濾液并且用有機溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中偶極非質子溶劑是二甲基甲酰胺(DMF)。
3.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中所述堿是叔胺堿，并且優(yōu)選地是N，N-二異丙基乙胺(DIEA)。
4.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中所述切割混合物包含TFA溶液，一種或多種清除劑和二氯甲烷(DCM)，其中所述清除劑選自三異丙基硅烷(TIPS)、三乙基硅烷(TES)、苯酚、苯甲醚、茴香硫醚、水、乙二硫醇(EDT)U-十二硫醇、二硫蘇糖醇(DTT)和吲哚，條件是TFA在所述切割混合物中的百分數不超過25%。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述清除劑選自TIPS、TES、苯甲醚和水。
6.根據權利要求5所述的方法，其中當移除Boc和tBu側鏈保護基時，所述切割混合物包含15至25% v/v的TFA與2.5至12% v/v的TIPS并且切割混合物的剩余部分用DCM補足至100%。
7.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中所述從Sieber酰胺樹脂切下所述肽與去保護所述側鏈保護基同時發(fā)生。
8.根據前述權利要求任一項所述的合成治療肽的方法，其中使用DMF中的哌啶以DMF中所述哌唳濃度小于20% (v/v)開始從樹脂移除Fmoc基團。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟f中，使用偶聯試劑組合偶聯氨基酸殘基，其中所述偶聯試劑組合的組分選自TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA，并且更優(yōu)選地選自 HCTU/DIEA 和 TBTU/HOBt/DIEA。
10.根據前述權利要求任一項所述的方法，包括連續(xù)步驟: (a)在二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹Fmoc-Sieber樹脂(也稱作Sieber酰胺樹脂或FmocSieber酰胺樹脂)； (b)使用DMF中的哌啶溶液去保護Fmoc基團； (c)在用DMF去保護Fmoc后洗滌樹脂； (d)通過在DMF中溶解Fmoc-氨基酸和偶聯試劑隨后添加N，N-二異丙基乙胺(DIEA)并攪拌，活化Fmoc-氨基酸以便偶聯于去保護的樹脂； (e)將活化的Fmoc-氨基酸溶液充入反應器中的樹脂； (f)使用(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽)(HCTU)或2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基脲銷 四氟硼酸鹽(TBTU)/1-羥基苯并三唑(HOBt)連同DMF中的N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)作為偶聯試劑，偶聯活化的Fmoc-氨基酸； (g)在每次Fmoc-氨基酸偶聯后洗滌樹脂； (h)重復步驟(b)-(g)直至肽形成； (i)使用切割混合物從樹脂切下所需的肽，而同時去保護氨基酸側鏈； U)過濾來自樹脂的切割混合物；和 (k)蒸發(fā)濾液并且用有機溶劑沉淀及部分純化來自濃縮溶液的粗產物以產生部分純化的肽。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述肽是生長抑素、鈴蟾肽、VIP、PACAP, GHRH、胰高血糖素、降鈣素、肽YY、神經調節(jié)肽B、PTH、PTHrP, PTH2、GLP-1、硬骨魚緊張肽-11、生長激素釋放肽、黑皮質素、MIS、LHRH、adropin、GIP、神經肽Y、IGF-1、多巴胺-生長抑素嵌合體和ACTH的類似物。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述肽是生長激素釋放肽的類似物。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述生長激素釋放肽的類似物是H-1np-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2o
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述肽是多巴胺-生長抑素嵌合體的類似物。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述多巴胺-生長抑素嵌合體的類似物是
【文檔編號】C07K1/04GK104080795SQ201280062490
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權日:2011年12月23日
【發(fā)明者】F·赫利, K·韋格納, P·弗雷 申請人:益普生制造愛爾蘭有限公司