具有三個(gè)發(fā)色團(tuán)的發(fā)光鑭系元素螯合物及其用途
【專利摘要】本申請(qǐng)公開(kāi)了式(I)的具有鑭系元素例如銪的發(fā)光鑭系元素螯合物、以及相應(yīng)的發(fā)光鑭系元素螯合配體。本申請(qǐng)還公開(kāi)了包含與所述發(fā)光鑭系元素螯合物綴合的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物(例如抗體)的能檢測(cè)的分子、以及進(jìn)行生物特異性結(jié)合測(cè)定的方法、這樣的能檢測(cè)的分子在利用特異性發(fā)光的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法測(cè)定的基于特異性生物親和性的結(jié)合測(cè)定中的用途、以及與所述發(fā)光鑭系元素螯合物綴合的固體載體材料。
【專利說(shuō)明】具有三個(gè)發(fā)色團(tuán)的發(fā)光鑭系元素螯合物及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及將連接至生物特異性反應(yīng)物的新型的含有三個(gè)發(fā)色團(tuán)的鑭系元素螯合物以及其在各種測(cè)定(分析，assay)中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]使用長(zhǎng)壽命發(fā)射的發(fā)光鑭系元素螯合物的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法(TRF)已經(jīng)被應(yīng)用于許多特異性結(jié)合測(cè)定例如免疫測(cè)定、DNA雜交測(cè)定、受體結(jié)合測(cè)定、酶法測(cè)定、生物成像例如免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定或者基于細(xì)胞的測(cè)定中，以測(cè)量非常低濃度的所需的被分析物。此外，鑭系元素螯合物已經(jīng)被用于磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射斷層成像(PET)中。
[0003]對(duì)于TRF應(yīng)用，最佳的標(biāo)記物必須滿足若干個(gè)要求。首先，它必須在基態(tài)和激發(fā)態(tài)兩者中都是光化學(xué)穩(wěn)定的，并且它必須是動(dòng)力學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定的。激發(fā)波長(zhǎng)必須是盡可能高的，優(yōu)選超過(guò)300nm。它必須具有有效的陽(yáng)離子發(fā)射，即，高的發(fā)光產(chǎn)額(yield)(激發(fā)系數(shù)X量子產(chǎn)率，ε Φ)。觀察到的發(fā)光衰減時(shí)間必須是長(zhǎng)的，并且螯合物必須具有良好的水溶性。為了標(biāo)記的目的，它必須具有反應(yīng)性基團(tuán)以容許與生物特異性結(jié)合反應(yīng)物的共價(jià)連接，并且經(jīng)標(biāo)記的生物分子的親和性和非特異性結(jié)合性質(zhì)必須得以保持。
[0004]挑戰(zhàn)是制備在一個(gè)分子中滿足所有要求的螯合物標(biāo)記物，且因此，通常在適宜的標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)中進(jìn)行一些折衷。作為其結(jié)果，已經(jīng)進(jìn)行許多嘗試(參見(jiàn)例如BioconjugateChem.，20(2009)404中的綜述)以調(diào)節(jié)適合用于時(shí)間分辨熒光測(cè)定法應(yīng)用的螯合物標(biāo)記物的光物理性質(zhì)。
[0005]改善發(fā)光強(qiáng)度的一種通常采用的方法是制備在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中具有組合的若干個(gè)獨(dú)立的發(fā)色團(tuán)部分的螯合物配體，這提供高的穩(wěn)定性和發(fā)光量子產(chǎn)率。Takalo，H.，etal.，1996，Helv.Chim.Acta.，79，789公布了包含兩個(gè)和三個(gè)單獨(dú)的4-(苯基乙炔基)吡啶的螯合物。鑭系元素螯合物和螯合配體的更新的實(shí)例是例如EP1447666、W02010/055207、W02010/006605和W02008/020113中公開(kāi)的那些?；趯?duì)環(huán)狀氮雜大環(huán)(azamacrocycle)(例如D0TA)的螯合物穩(wěn)定性研究，觀察到相對(duì)于開(kāi)鏈螯合物(例如DPTA)更高的穩(wěn)定性，且因此，關(guān)于公開(kāi)的具有三個(gè)發(fā)色團(tuán)的螯合物的主要焦點(diǎn)在于束縛至不同發(fā)色團(tuán)的氮雜大環(huán)。
[0006]最近，對(duì)于利用若干個(gè)1-羥基-2-吡啶酮和水楊酰胺基團(tuán)的開(kāi)鏈配體，已觀察到高的鑭系元素螯合物穩(wěn)定性，盡管這些公開(kāi)的螯合物通常是八齒的并且不包含用于與鑭系元素離子配位的羧酸，但是已經(jīng)得到了高的發(fā)光和穩(wěn)定性。然而，那些鑭系元素螯合物僅僅具有中等的總摩爾吸光系數(shù)，即，在4個(gè)發(fā)色團(tuán)的情況下低于27，000，而例如，取決于發(fā)色團(tuán)上的取代基，具有僅僅一個(gè)苯基乙炔基吡啶子單元的螯合物通常具有25，000-35, OOOcnT1的吸光系數(shù)(Latva, M, et al., 1997, J.Luminescence, 75, 149)。
[0007] 關(guān)于具有許多發(fā)色團(tuán)的螯合物和配體的眾所周知的挑戰(zhàn)是找到適宜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，其提供高的水溶性并同時(shí)對(duì)任何可能的生物過(guò)程是惰性的。已知，發(fā)色團(tuán)的加入降低配體和螯合物在水中的溶解性，增加在標(biāo)記過(guò)程期間生物特異性結(jié)合反應(yīng)物聚集體的形成和被標(biāo)記的生物分子的非特異性結(jié)合性質(zhì)。聚集體將產(chǎn)生純化問(wèn)題并降低被標(biāo)記的物質(zhì)的產(chǎn)率。而且，被標(biāo)記的生物分子的增加的非特異性結(jié)合將增強(qiáng)生物特異性測(cè)定的背景發(fā)光且因此降低測(cè)定靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及在發(fā)光的鑭系元素離子周圍具有三個(gè)單獨(dú)的發(fā)色團(tuán)并且給出格外高的信號(hào)水平的新型標(biāo)記物螯合物設(shè)計(jì)。
[0009]使用本發(fā)明的螯合物，可降低標(biāo)記程度而不損失信號(hào)，并且同時(shí)較低的標(biāo)記程度改善生物分子的親和性并減少在測(cè)定期間的非特異性結(jié)合。因此，較快的動(dòng)力學(xué)是可能的，并且觀察到較低的背景，其也可改善總體測(cè)定靈敏度。
[0010]本發(fā)明的第一方面涉及式(I)的發(fā)光鑭系元素螯合物，
[0011]
【權(quán)利要求】
1.式(I)的發(fā)光鑭系元素螯合物，
2.根據(jù)權(quán)利要求1的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述共軛基團(tuán)由一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)排列以彼此共軛的部分組成，各部分選自亞乙烯基(-CH=CH-)，亞乙炔基(-C = C-)，羰基(-C(=0)-),(雜)芳族環(huán)或環(huán)體系的二基(-Het/Ar-)例如亞苯基、亞聯(lián)苯基、亞萘基、亞吡啶基、亞吡嗪基、亞嘧啶基、亞噠嗪基、亞呋喃基、亞噻吩基、亞吡咯基、亞咪唑基、亞吡唑基、亞噻唑基、亞異噻唑基、亞噁唑基、亞異噁唑基、亞呋咱基、1，2，4-三唑-3，5-亞基和亞噁二唑基，其各自可為未取代的、R4-單取代的、R4, R5-二取代的、R4, R5, R6-三取代的、R4, R5, R6, R7-四取代的或者R4, R5, R6, R7, R8-五取代的，其中這樣的可能的取代基R4、R5> R6>R7 和 R8 各自獨(dú)立地選自 Ch2-烷基、-(CH2)0^6COOH, -(CH2)ch6COO' -(CH2)0^6SO3H, -(CH2)ch6SO3' -NHC (=0) R10, -NCH3C (=0) R10, -C (=0) NHR10, -C (=0) NCH3Rltl、-NHC (=0) NHRltl、-NHC (=S)NHR10、-C (=0) R10、-F、-C1、-Br、-1、羥基(-OH)、巰基(-SH)、_0R9、-SR9 和親水性基團(tuán)，并且其中 R9 選自 _CF3、-Ch2-烷基、-(CH2) hCOOH、- (CH2) ^6COO-, - (CH2) ^6SO3H, - (CH2) ^SCV、-NHC(=0) R10、-NCH3C (=0) R10、-C (=0) NHR10、-C (=0) NCH3R10' -NHC (=0) NHR10、-NHC (=S) NHR10、-C (=0)R10 和親水性基團(tuán)，其中 Riq 選自 Ch2-烷基、-(CH2) hCOOH、-(CH2)卜60)0-、-(CH2) ^6SO3H,和-(CH2) ^SO3-以及親水性基團(tuán)。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中GpG2和G3中的至少兩個(gè)獨(dú)立地是共軛基團(tuán)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中GpG2和G3各自獨(dú)立地是共軛基團(tuán)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述反應(yīng)性基團(tuán)Z包括疊氮基(-N3)、炔基(-C = CH)、烯基(-CH=CH2)、氨基(-NH2)、氨基氧基(-O-NH2)、羧基(-C00H)、醛基(-CH0)、巰基(-SH)、馬來(lái)酰亞胺基、或者它們的活化的衍生物，包括異氰酸酯基(-NC0)、異硫氰酸酯基(-NCS)、重氮基(-N+N)、溴代乙酰胺基、碘代乙酰胺基、反應(yīng)性的酯基、吡啶基_2_ 二硫基、或者6-取代的4-氯-1，3, 5- 二嗪-2-基氨基。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述反應(yīng)性基團(tuán)Z包含間隔基，所述間隔基是形成間距的二基，所述間隔基由一至五個(gè)部分形成，各部分選自:亞苯基、含有1-10個(gè)碳原子的亞烷基、亞乙炔基(-C = C-)、醚基(-0-)、硫醚基(-S-)、二硫基(-S-S-)、酰胺基(-C (=0) -NH-、-NH-C (=0) -、-C (=0) -NCH3-和-NCH3-C (=0)-)、硫脲基(-NH-C (=S) -NH-)和三唑基。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述共軛基團(tuán)獨(dú)立地選自苯基乙炔基、苯基、噻吩基和呋喃基，其各自可為取代的。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述親水性基團(tuán)包括單糖或二糖。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述親水性基團(tuán)包含間隔基，所述間隔基是形成間距的二基，所述間隔基由一至五個(gè)部分形成，各部分選自:亞苯基、含有1-10個(gè)碳原子的亞烷基、亞乙炔基(-C = C-)、醚基(-0-)、硫醚基(-S-)、二硫基(-S-S-)、酰胺基(-C (=0) -NH-、-NH-C (=0) -、-C (=0) -NCH3-和-NCH3-C (=0)-)、硫脲基(-NH-C (=S) -NH-)和三唑基。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中 任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物， (i)其中G1和G3各自是3，5-雙(羧基甲氧基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (?)其中Gp G2和G3各自是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H，R1和R3各自是親水性基團(tuán)，且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (iii)其中G1'G2和G3各自是苯基乙炔基，-A1和-A2中的一個(gè)是-H且-A1和-A2中的另一個(gè)是包含間隔基的反應(yīng)性基團(tuán)，且％、R2和R3各自是親水性基團(tuán)；或者 (iv)其中G1和G3各自是4-(羧基甲硫基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是_H, R1和R3各自是_H,且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (V)其中G1和G3各自是2，4-雙(羧基甲硫基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (vi)其中G1和G3各自是2，4，6-三(羧基甲氧基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-Ai和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (vii)其中G1和G3各自是呋喃-2-基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H，R1和R3各自是-H，且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (viii)其中G1和G3各自是噻吩-2-基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-1R1和R3各自是-H，且R2是反應(yīng)性基團(tuán)；或者 (ix)其中R1-G1 和 R3-G3 各自是(2，4- 二 (NaOOC-CH2-O-)苯基)乙炔基，G2 是(2- (NaOOC-CH2-O-)苯基)乙炔基，-A1和-A2各自是-H，且R2是反應(yīng)性基團(tuán)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)光鑭系元素螯合物，其中所述鑭系元素離子Ln3+選自銪(III)、鋱(III)、鏑(III)和釤(III)，優(yōu)選銪(III)。
12.能檢測(cè)的分子，其包含與如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所定義的式(I)的發(fā)光鑭系元素螯合物綴合的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的能檢測(cè)的分子，其中所述生物特異性結(jié)合反應(yīng)物選自抗體、抗原、受體配體、特異性結(jié)合蛋白、DNA探針、RNA探針、寡肽、寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸、經(jīng)修飾的多核苷酸、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖、磷脂、PNA、類固醇、半抗原、藥物、受體結(jié)合配體、和凝集素。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的能檢測(cè)的分子，其中所述生物特異性結(jié)合反應(yīng)物是抗體。
15.式(II)的鑭系元素螯合配體，
16.進(jìn)行生物特異性結(jié)合測(cè)定的方法，所述方法包括以下步驟: a)形成被分析物與通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的鑭系元素螯合物標(biāo)記的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物之間的生物復(fù)合物； b)用具有激發(fā)波長(zhǎng)的輻射激發(fā)所述生物復(fù)合物，由此形成激發(fā)的生物復(fù)合物；和 c)檢測(cè)由所述激發(fā)的生物復(fù)合物發(fā)出的發(fā)射輻射。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的能檢測(cè)的分子在利用特異性發(fā)光的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法測(cè)定的基于特異性生物親和性的結(jié)合測(cè)定中的用途。
18.固體載體材料，其與根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的式(I)的發(fā)光鑭系元素螯合物或者根據(jù)權(quán)利要求15的式(II)的鑭系元素螯合配體綴合。
【文檔編號(hào)】C07D213/40GK103890137SQ201280051442
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】H.塔卡洛, N.梅爾托拉 申請(qǐng)人:Dhr芬蘭公司