人源化cd52抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人CD52的新型人源化抗體，以及其在治療或預(yù)防人疾病的方法中的用途。
【專利說明】人源化CD52抗體
[0001]本發(fā)明涉及抗人CD52的新人源化抗體，以及其在治療或預(yù)防人疾病的方法中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]CD52是一種糖基化的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的細(xì)胞表面蛋白，豐富存在于多種正常和惡性的淋巴樣細(xì)胞上，特別是B細(xì)胞和T細(xì)胞(Gilleece et al,Blood82807-812(1993) ；Hale et al, J Biol Regul HomeostAgents,15p386-391(2001) ；Rodig et al, Clin Cancer Resl2,p7174_7179(2006))。CD52在髓樣細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)上以較低的水平表達(dá)，在成熟的自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血液干細(xì)胞上幾乎不表達(dá)。CD52還由附睪和輸精管中的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，被精子在通過生殖道的過程中獲得(Hale et al, ibid, ; Domagala et al, MedSci Monit7p325-331 (2001))。⑶52的確切生物學(xué)功能尚不清楚，但一些證據(jù)表明，其可能涉及 T 細(xì)胞遷移和共刺激(Masuyama et al, J Exp Medl89979_989 (1999) ; Watanabe etal, Clin Immunol120247-259 (2006))。
[0003]Campath-1H (阿侖珠單抗、Campath?、MabCampath?)是人源化的人`
CD52單克隆抗體，其表現(xiàn)出強(qiáng)的體外抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補體依賴的細(xì)胞毒性(⑶C)。⑶52存在于至少95%的全部人外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上(Hale G.et al., The CAMPATH-lantigen (CD52).Tissue Antigensl990, 35:118-127)。Campath-1H識別由成熟CD52蛋白的羧基端四個氨基酸和帶負(fù)電荷的GPI錨的一部分組成的表位。由于其顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，Campath-1H能夠在體內(nèi)耗盡⑶52陽性細(xì)胞，并且經(jīng)批準(zhǔn)用于慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的一線和三線治療。已經(jīng)評估了 Campath-1H在治療一些自身免疫性疾病中的效用，所述自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、肌炎、韋格納氏病和糖尿病。對Campath-1H的最前沿的研究是在治療復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(MS)方面。這些研究顯示，與人干擾素β-la相比，復(fù)發(fā)的時間顯著改善(Rebif? (即β干擾素-la))。
[0004]Campath-1H的主要限制是免疫原性，所述免疫原性在高達(dá)70%的患者中誘導(dǎo)了抗體(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic, ed.Zhiqiang An(2009)ISBN:978-0-470-11791-0)o為了改善CD52抗體的臨床效用，非常需要在患者中與顯著的免疫原性沒有關(guān)聯(lián)的改良CD52抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及對人⑶52 (hu⑶52)有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了以至少10_8M的平衡解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人CD52的人源化抗體。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人⑶52的人源化抗體，所述人源化抗體具有IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的抗體重鏈或使用突變的IgG恒定區(qū)，特別是增強(qiáng)ADCC (抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)或CDC (補體依賴細(xì)胞毒性)的恒定區(qū)。本發(fā)明還提供了其中抗體輕鏈?zhǔn)荎輕鏈的人源化抗體。所述人源化抗體可由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，所述人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼如SEQ ID N0:20-SEQ ID N0:28列出的其可變區(qū)中的蛋白質(zhì)序列。
[0006]本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CD52的人源化抗體，其中已經(jīng)對所述抗體可變區(qū)進(jìn)行了選擇或修飾以排除一個或多個人CD4+T細(xì)胞表位。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CD52的人源化抗體，其中已經(jīng)主要通過融合完全來自現(xiàn)有的人抗體可變區(qū)序列的序列片段形成所述抗體可變區(qū)。
[0007]本發(fā)明還提供了如下的本發(fā)明人源化⑶52抗體，其包含重鏈⑶Rl、⑶R2和CDR3 氨基酸序列(分別為 “RYGMS，”(SEQ ID N0.5) , “MMKTKGGRTYYPDSVKG，”(SEQ IDN0.6)和“DGYY” (SEQ ID N0.7))以及輕鏈CDRl、CDR2和CDR3氨基酸序列(分別為“KSSQSLLHSDGKTYLN，” (SEQ ID N0.8)，“LVSKLDS，” (SEQ ID N0.9)和“WQGTHLWT’” (SEQID N0.10))。本發(fā)明還提供了如下的本發(fā)明人源化CD52抗體，其包含對應(yīng)SEQ ID NO:20-24的重鏈可變區(qū)用于重鏈，和SEQ ID N0:25-28用于輕鏈。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了如下的本發(fā)明人源化CD52抗體，其包含對應(yīng)SEQ ID NO: 22的重鏈可變區(qū)氨基酸序列用于重鏈和SEQ ID NO:28 。
[0008]本發(fā)明的人源化抗體可以由任何上述CDR序列SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.10和這些CDR序列中改變一個或多個氨基酸不顯著減少與人CD52的結(jié)合的小變體(minorvariant)組成。人源化抗體可通過將所述⑶R序列與來自人可變區(qū)框架的序列連接在一起來產(chǎn)生，其中這種框架序列來源于單個或多個其他人抗體可變區(qū)框架序列。通常，這種人可變區(qū)框架序列會包括造成所述人源化抗體與CD52的最佳結(jié)合或改善結(jié)合的一個或多個突變。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述人源化抗體中的這種人可變區(qū)框架序列完全來源于其他人抗體可變區(qū)中的序列，如EP1844074所述。這些序列包含來自其他人抗體可變區(qū)的序列的聯(lián)結(jié)片段，以及人恒定區(qū)。特別地，這種人源化抗體還含有完全來源于其他人抗體可變區(qū)CDR序列的CDR序列，包括來源于其他人CDR的CDR序列的聯(lián)結(jié)片段，以及人恒定區(qū)，從而產(chǎn)生其中可變區(qū)序列完全來源于其他人抗體可變區(qū)的序列與人恒定區(qū)的人源化抗體，這產(chǎn)生“全人”抗體。
[0009]本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CD52的人源化抗體，其中所述人源化抗體由原核或真核細(xì)胞產(chǎn)生，尤其是來自于哺乳動物細(xì)胞系的真核細(xì)胞，尤其是CHO或NSO細(xì)胞。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人⑶52的人源化抗體，其為Fab片段或單鏈Fv (scFv)。本發(fā)明還提供了多特異性蛋白，其包括至少一種來自序列SEQ ID N0:20至24 (用于重鏈)和SEQ IDNO: 25至28 (用于輕鏈)的人源化抗體，其中所述多特異性蛋白特異性結(jié)合人⑶52，此外還與一個或多個其他分子結(jié)合或相互作用?？梢园ㄔ诿糠N多特異性抗體內(nèi)的不同抗體或蛋白可以彼此共價或非共價連接。
[0010]本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含特異性結(jié)合人CD52的人源化抗體(為蛋白質(zhì)性抗體或編碼所述抗體的基因)和可藥用載體。所述藥物組合物還可包含與所述人源化抗體連接或非連接的一種或多種化學(xué)治療劑。
[0011]本發(fā)明提供了一種用于治療CLL和其他白血??；一些自身免疫性疾病——包括多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、肌炎、韋格納氏病和糖尿??；以及器官移植排斥和移植物抗宿主病的方法，在每種情況中所述方法包括給予所述患者有效劑量的可也特異性結(jié)合人CD52的人源化抗體(作為蛋白質(zhì)性抗體或編碼所述抗體的基因)，其中所述抗體可引起CD52+靶細(xì)胞例如B細(xì)胞和T細(xì)胞的破壞或凋亡。另外，本發(fā)明還提供了一種診斷上述疾病的方法，例如通過給予連接可檢測標(biāo)簽上的人源化抗體和確定所述人源化抗體的體內(nèi)結(jié)合，以提供檢測例如在局部腫瘤塊或炎性病變中的CD52+細(xì)胞的基礎(chǔ)?；蛘?，本發(fā)明的人源化抗體可作為檢測疾病的工具用于CD52+細(xì)胞的體外測試，其還可用于抗體的體外試驗，所述抗體可結(jié)合在治療上使用的所述人源化抗體。因此，本發(fā)明的這種人源化抗體可在體內(nèi)和體外用作診斷劑或治療劑。
[0012]本發(fā)明的人源化抗體可包括多種抗體同種型或其混合物，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、IgAsec、IgD、IgE或這些IgG的突變形式例如可增強(qiáng)與Fe受體(例如，Horton et al.，Bloodll6 (2010)ρ3004_3012)或補體(例如，Natsume et al., CancerRes68(2008)p3863-3872)的結(jié)合的突變。通常，人源化抗體包括IgGl重鏈恒定區(qū)和κ輕鏈恒定區(qū)。所述人源化抗體可以是全長(例如IgGl/K抗體)或可以僅包括抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F (ab') 2、Fv 或 scFv 片段)。
[0013]本發(fā)明的一些人源化⑶52抗體可以通過一個或多個以下特性來表征:a)對人CD52的特異性(特異性結(jié)合人CD52) ；b)對人CD52的結(jié)合親和力具有至少10-8Μ的平衡解離常數(shù)(Kd)。
[0014]在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的人源化抗體或抗原結(jié)合部分的核酸分子。因此，本發(fā)明還涵蓋了包含本發(fā)明的編碼抗體的核酸的重組表達(dá)載體和用這種載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及通過培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的抗體的方法。
[0015]可將本發(fā)明的人CD52的人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(例如Fab)衍生化或連接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白質(zhì)(例如Fab’片段)。例如，可將本發(fā)明的人源化抗體的抗體或抗原結(jié)合部分功能化地連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價連接或以其他方式)至一個或多個其他分子實體。例如，可將所述人源化CD52抗體或其抗原結(jié)合片段綴合至治療部分，例如細(xì)胞毒類藥、有酶活性的毒素或其片段、放射性同位素、治療性核酸或小分子抗癌藥。還可將本發(fā)明的抗體綴合至細(xì)胞毒性藥物，例如用細(xì)胞毒性試劑(例如1311)進(jìn)行放射性標(biāo)記，或者可以將其偶聯(lián)至核糖體失活蛋白例如假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE38片段、植物或細(xì)菌毒素例如蓖麻毒素、蓖麻毒素的α鏈、皂草素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素或假單胞菌外毒素A(Kreitman and Pastan(1998)Adv.Drug Delivery Rev.31:53)。
[0016]在另一方面，本發(fā)明提供了組合物例如藥物組合物和診斷組合物，其包含可藥用載體和特異性結(jié)合人CD52的至少一種本發(fā)明的人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。一些組合物還可包含本發(fā)明的人源化抗體或抗原結(jié)合部分的結(jié)合物。這類組合物還可包含與作為單獨分子的一種或多種其他生物活性分子的結(jié)合物，例如至少一種本發(fā)明的人源化單克隆抗體與另一生物活性分子的結(jié)合物，或者可結(jié)合在同一分子內(nèi)與一個或多個其他生物活性分子的結(jié)合物，例如為雙特異性或多特異性分子，為兩個或多個本發(fā)明的人源化抗體的結(jié)合物或為與一個或多個其他生物活性分子的結(jié)合物。
[0017]對于體內(nèi)方法，可向人受試者給予所述人源化抗體或其抗原結(jié)合部分(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子)，所述人受試者患有CD52+細(xì)胞相關(guān)的疾病或患有可通過使用本發(fā)明的人源化抗體的治療而改善或預(yù)防的疾病。
[0018]還可與其他已知療法(例如抗癌療法、自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療法、多發(fā)性硬化癥的療法)結(jié)合給予本發(fā)明的人源化單克隆抗體組合物。因此，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的癌癥或炎性疾病的方法，其包括向所述受試者給予治療有效量的人源化抗體的藥物組合物以及藥物載體。
[0019]在另一方面，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的抗體在體外或體內(nèi)檢測樣品中人CD52抗原的存在的方法，例如用于診斷人CD52相關(guān)疾病。在一些方法中，這通過在允許形成本發(fā)明的人源化多克隆抗體和人CD52的復(fù)合物的條件下，使待測樣品和對照樣品一起，與所述人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(或雙特異性或多特異性分子)接觸來實現(xiàn)。然后，檢測測試樣品中的復(fù)合物形成(例如使用ELISA)，所述測試樣品和對照樣品之間復(fù)合物形成的任何統(tǒng)計學(xué)顯著的增加都指示所述測試樣品中人CD52抗原的存在。
[0020]本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，在其中所述人源化抗體結(jié)合人CD52抗原的所有情況中，本發(fā)明的人源化抗體，除了本文描述的那些之外，會具有另外的用途或組合物，因此這種用途和組合物應(yīng)被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，可對本發(fā)明的人源化抗體的可變區(qū)序列(SEQ ID N0:20至SEQ ID NO:28)或本發(fā)明的人源化抗體的CDR(SEQ ID N0:5至SEQ ID NO: 10)作出改變，所述改變不會顯著改變本發(fā)明人源化抗體的特性，因此應(yīng)認(rèn)為這種變體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，在所述人源化抗體的可變區(qū)或CDR序列內(nèi)的這種改變應(yīng)被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要這種改變與本發(fā)明的所述人源化序列有顯著同源性。例如，可確定變體核酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其包括含有SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO: 19的序列或含有通過其在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核酸雜交的能力而確定為與SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO: 19基本相同的序列。在一個實施方案中，可通過核酸序列在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明范圍內(nèi)核酸(例如SEQ ID N0:11至SEQ ID NO: 19)雜交的能力確定其在本發(fā)明的范圍內(nèi)(例如與SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO: 19基本相同)。術(shù)語“雜交”是指當(dāng)具體核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(例如總細(xì)胞或文庫DNA或RNA)中時，分子與該序列在嚴(yán)格雜交條件下的結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，其中至少以約10倍背景檢測到所述具體核苷酸序列。嚴(yán)格雜交條件被選擇為例如比具體序列在確定離子強(qiáng)度PH下的熱解鏈點(Tm)低5-10°C。還應(yīng)理解，為了增強(qiáng)ADCC和⑶C，可在重鏈恒定區(qū)對本發(fā)明的人源化抗體作出修改。為了增強(qiáng)ADCC，可通過在一些哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)所述人源化抗體來生成所述抗體的巖藻糖耗盡形式，所述哺乳動物細(xì)胞包括變異型CHO細(xì)胞系、Lecl3 (Shields et al.，JBiol Chem277 (2002) p26733 - 26740)、大鼠雜交瘤細(xì)胞系、YB2/0 (Shinkawa et al., JBiol Chem278 (2003)p3466 - 3473)和敲除 FUT8 (a_l，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的 CHO 細(xì)胞系(Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng87 (2004)p614_622)。可選擇地，可使用在重鏈恒定區(qū)中的突變以增強(qiáng) ADCC，例如 Shields et al., J Biol Chem276 (2001) p6591-6604和 Lazar et al,.Proc Natl Acad Sci U S A2006; 103 (2006) p4005 - 4010 所描述的。可選擇地，可使用在重鏈恒定區(qū)中的突變以增強(qiáng)CDC，例如使用混合的人IgGl/IgG3同種型的抗體(Natsume et al.,同上)。
[0021]根據(jù)別處的先例特別是根據(jù)對Campath-1H的臨床研究(Zhiqiang An,同上),本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，與人CD52抗原結(jié)合的抗體在患者中從根本上來說是免疫原性的，可能由于CD52抗體所固有的細(xì)胞毒性，所述CD52抗體作為針對來自所述抗體的CD4+T細(xì)胞表位的共刺激信號起作用，從而導(dǎo)致CD4+T輔助細(xì)胞應(yīng)答和免疫原性。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解,如通過對人血液的體外研究(參考實施例9)所確定的， 本發(fā)明的抗體出人意料地沒有這種⑶4+T輔助細(xì)胞應(yīng)答，并且具有低⑶4+Τ細(xì)胞應(yīng)答(在人T細(xì)胞測定中，<=4%Τ細(xì)胞應(yīng)答)的這種⑶52抗體是新的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]在【專利附圖】

【附圖說明】中，術(shù)語2Ε8或ANTOl可互換地用于來源于2Ε8小鼠單克隆抗體的小鼠嵌合的或人源化的抗體。
[0023]圖1顯示用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)嵌合的和人源化的抗體的質(zhì)粒載體，所述嵌合的和人源化的抗體包含ΡΑΝΤ17 (用于重鏈)和ρΑΝΤ13 (用于輕鏈)。
[0024]圖2顯示與結(jié)合NSO⑶52-相比，2Ε8小鼠單克隆抗體結(jié)合用人⑶52轉(zhuǎn)染的NSO細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。用抗-小鼠IgG-PE綴合抗體染色，Y軸表示來自PE的信號。
[0025]圖3顯示與Campath-1H相比,嵌合2Ε8的稀釋物結(jié)合Hut78細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。用抗-人IgG-PE綴合抗體染色。
[0026]圖4顯示，在嵌合2E8和Campath-1H競爭結(jié)合Hut78細(xì)胞中，使用Campath-1H-PE的競爭流式細(xì)胞分析。
[0027]圖5顯示，在使用REH靶細(xì)胞進(jìn)行的嵌合2E8和Campath-1H的ADCC測定中，用作效應(yīng)細(xì)胞的5份人PBMC樣品的平均細(xì)胞毒性。
[0028]圖6——除了 2份 單獨的PBMC用嵌合2E8和Campath-1H的稀釋物和高表達(dá)REH靶細(xì)胞之外，同圖5。
[0029]圖7——除了在使用嵌合2E8和Campath-1H的稀釋物以及高表達(dá)REH靶細(xì)胞的CDC測定中使用人補體之外，同圖6。
[0030]圖8顯示，在用生物素化的嵌合2E8競爭中，結(jié)合人源化2E8變體的競爭性⑶52肽 ELISA。
[0031]圖9顯示人源化變體和Campath-1H的稀釋物結(jié)合REH細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。
[0032]圖10顯示在使用REH靶細(xì)胞進(jìn)行的人源化2E8變體和Campath-1H的ADCC測定中，用作效應(yīng)細(xì)胞的4份人PBMC樣品的平均細(xì)胞毒性。
[0033]圖11顯示使用高⑶52表達(dá)的RH!靶細(xì)胞和人補體時，人源化2E8變體和Campath-1H 的 CDC。
[0034]圖12顯示，在嵌合2E8、Campath-1H和選擇的變體競爭性結(jié)合REH細(xì)胞中，使用Campath-1H-PE的競爭性流式細(xì)胞分析。
[0035]圖13顯示通過細(xì)胞凋亡和壞死測量的人⑶52抗體對REH細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性效
應(yīng)
[0036]圖14顯示移植了 Raji人伯基特淋巴瘤細(xì)胞、然后用Campath-1H和一線(lead)人源化 2E8 變體 VH3/VK4 (V 區(qū) SEQ ID N0.22 和 28)處理的 SCID 小鼠的 Kaplan - Meier 曲線圖。
實施例
[0037]除非另有說明，根據(jù)制造商的說明書使用實施例中提到的可商購試劑。在實施例和整個說明書中通過ECACC登錄號識別的細(xì)胞的來源是英國索爾茲伯里的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Cultures, ECACC)。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員之一所通常理解的含義相同。下文描述了示例性的方法和材料，然而與本文描述的那些類似或等價的方法和材料也可用于實施或測試本發(fā)明。所述材料、方法和實施例僅是示例性的，不意欲對范圍進(jìn)行限制。
[0038]實施例1:小鼠單克隆抗體生成
[0039]定制合成了⑶52肽(GQNDTSQTSSPSC))，并將其經(jīng)馬來酰亞胺基己?；?N羥基琥拍酰亞胺接頭(Mimotopes, ffirral, Cheshire UK)綴合至KLH或BSA,使所述肽N末端處于游離狀態(tài)。Raji和HuT78獲自ECACC。如下產(chǎn)生表達(dá)⑶52的NSO細(xì)胞系:PCR擴(kuò)增編碼人CD52的DNA (NCBI參考序列:NM_001803.2)(全長序列——包括N-末端信號肽、C-末端取代的GP1-錨信號肽和成熟的GP1-錨定的表面肽)，將其經(jīng)BglII和EagI位點亞克隆到PANT抗體表達(dá)載體(圖1a)中。所述⑶52基因的轉(zhuǎn)錄在CMV I/E啟動子(US5168062和US5385839,愛荷華大學(xué)(University of 1wa))的控制下。所述pANT表達(dá)質(zhì)粒包含在SV40啟動子控制下的突變型dhfr小基因(Simonsen&Levinsonl983，PNAS80:2495-2499)、用于在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇的PolyA序列以及用于原核細(xì)胞選擇的(6-內(nèi)酰胺酶(ApK)基因和用于在原核細(xì)胞中增殖的pMBl復(fù)制起點。所述表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌(E.coli)XLl-blue中增殖(Stratagene Cat.N0.200130)。通過電穿孔轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞和將細(xì)胞置于使用200nM氨甲喋呤進(jìn)行的選擇下來獲得穩(wěn)定的CD52表達(dá)細(xì)胞系。培養(yǎng)細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用流式細(xì)胞術(shù)測試⑶52表達(dá)。將高⑶52表達(dá)的細(xì)胞系冷凍并按如下所述用于免疫小鼠。 [0040]雌性Balb/c小鼠通過腹腔內(nèi)(intraperoneal)(腹腔內(nèi))注射完全弗氏佐劑(CFA)中50ug⑶52肽-KLH綴合物來初次免疫，或者用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中I X IO6個表達(dá)⑶52的RAJI細(xì)胞來初次免疫。四周后，通過腹腔內(nèi)注射PBS中IO6個HUT-78細(xì)胞對所有小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，兩周后再加強(qiáng)注射。四周后，所有小鼠接受了第三次加強(qiáng)免疫，用腹腔內(nèi)注射PBS中3X IO6個表達(dá)⑶52的NSO細(xì)胞進(jìn)行。隨后以兩周的間隔腹腔內(nèi)注射PBS中IO7個表達(dá)⑶52的NSO細(xì)胞進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，一些小鼠還被給予5ug⑶52肽-KLH的進(jìn)一步加強(qiáng)免疫。
[0041]骨髓瘤融合的前三天，給予顯示出最高抗體滴度的兩只小鼠腹腔內(nèi)加強(qiáng)免疫(PBS中IO7個表達(dá)CD52的NSO細(xì)胞)。融合當(dāng)天，處死所述兩只小鼠，取出脾，將來自每個完整脾的細(xì)胞收集起來，在無血清培養(yǎng)基中洗滌，然后分成兩等份樣品。通過PEG介導(dǎo)的融合，將一半的所述脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，另一半與P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞融合。板1-4含有所述融合細(xì)胞，板5-8含有所述P3X63Ag8U.1細(xì)胞。完全融合培養(yǎng)基包含DME M、2 %L -谷氨酰胺、I %青霉素-鏈霉素、10 %胎牛血清、5 %B r i CIO n e雜交瘤克隆培養(yǎng)基(National Institute for Cellular Biotechnology, Dublin, Ireland)和次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT)。將得到的融合物接種至96孔板，每孔200uL。將剩余的未鋪板的融合細(xì)胞在培養(yǎng)物中穩(wěn)定長達(dá)3天，然后將其冷凍并保存在液氮中。將鋪板的融合細(xì)胞在37°C、5%C02下培養(yǎng)2周，轉(zhuǎn)移到96孔板，并如下所述使用⑶52肽-KLH ELISA測試分泌的CD52抗體的存在。將來自于24個免疫陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用CD52肽ELISA、基于NSO-⑶52細(xì)胞的ELISA和流式細(xì)胞術(shù)測試⑶52特異性抗體。
[0042]對于所述CD52 肽 ELISA, ELISA 板(VWR, Lutterworth, UK)在 4 °C 下用 PBS 中100 u L/孔的0.5u g/mL的CD52肽-KLH、CD52肽-BSA,僅KLH或僅BSA包被過夜。洗滌板，并將其用150 u L/孔的含2%BSA的PBS封閉。將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或純化的抗體在PBS/2%BSA中稀釋，向每個板加入100 μ L，然后在室溫下孵育I小時。將板用PBS-吐溫(0.05%)洗滌三次，并用100 μ I/孔的綴合辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠Ig (Fab-特異性)(Sigma-Aldrich)孵育I小時。將板用PBS-吐溫洗滌三次，然后加入SigmaFast OPD底物(Sigma-Aldrich)并在室溫下在黑暗中孵育以顯色。通過加入50 μ L的3Μ HCl終止反應(yīng)。使用Dynex酶標(biāo)儀(Dynex, Worthing, UK)在490nm下讀板。CD52肽特異的雜交瘤細(xì)胞是結(jié)合⑶52肽-KLH和⑶52肽-BSA而不結(jié)合僅KLH或僅BSA的那些。
[0043]對于所述基于NSO-⑶52細(xì)胞的ELISAjf 3 X IO5個細(xì)胞/孔(NS0野生型或表達(dá)⑶52的NSO細(xì)胞)鋪開(plated out)在V型底96孔板中。將板離心，棄上清，將板在吸水紙上吸干。將雜交瘤細(xì)胞樣品以1:2的比例稀釋在FACS緩沖液(含有1%BSA和0.05%疊氮化鈉的D-PBS)中，然后將100 μ L轉(zhuǎn)移至各自含有NSO (板I)或NSO-⑶52 (板2)的兩個板中。在室溫下孵育I小時后，通過離心所述板和在兩次離心之間將所述細(xì)胞重懸在200 μ LFACS緩沖液中來洗滌板2次。離心后，將細(xì)胞在100 μ L含有以1:500稀釋的抗-小鼠IgG(Fab特異性)(Sigma)的FACS緩沖液中重懸。在室溫下孵育I小時后，通過離心和在PBS中重懸所述細(xì)胞來將板洗滌兩次。離心后，將細(xì)胞在50 μ LPBS中重懸，然后轉(zhuǎn)移至ELISA板。加入100 μ L TMB底物(Invitrogen)，在室溫下在黑暗中孵育以顯色。通過加入50 μ L3MHCl終止反應(yīng)。用Dynex酶標(biāo)儀在450nm下讀板。與NSO野生型細(xì)胞比較，⑶52特異性克隆是那些特異性結(jié)合NSO-⑶52細(xì)胞的克隆。[0044]對于流式細(xì)胞術(shù)，使用1:2稀釋的⑶52雜交瘤細(xì)胞抗體以及1:100稀釋的抗-小鼠IgG-PE綴合抗體(Sigma)，將3X IO5個NSO-⑶52細(xì)胞或野生型NSO細(xì)胞染色。小鼠IgG (Sigma)作為雜交瘤細(xì)胞內(nèi)存在的不同鼠同種型的單獨對照也被包含在內(nèi)。將細(xì)胞在4°C下染色I(xiàn)小時。還包含僅有抗-小鼠IgG-PE綴合抗體的對照。將細(xì)胞用FACS緩沖液洗漆2次,最后在FACS緩沖液中重懸,并使用Beckton Dickinson FACSCalibur (BectonDickinson, Oxford, UK)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。通過分析相關(guān)同種型對照抗體確定儀器設(shè)置。
[0045]從⑶52肽ELISA、基于NSO-⑶52細(xì)胞的ELISA和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，克隆了huCD52特異性雜交瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)物中擴(kuò)大，冷凍作為親本原種(parental stock)并保存在液氮中。將每種選出的雜交瘤細(xì)胞在克隆培養(yǎng)基中稀釋并以每3個孔I個細(xì)胞的細(xì)胞密度鋪于96孔板中?？寺∨囵B(yǎng)基包含DMEM、2%L-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清、5%BriClone雜交瘤克隆培養(yǎng)基和次黃嘌呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HT)。將培養(yǎng)物在37°C下在5%C02中維持2周，其中在培養(yǎng)物中I周后所述克隆的細(xì)胞接受新鮮培養(yǎng)基?？寺『?周，將所有接種孔的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板，并使用如前所描述的CD52肽ELISA和流式細(xì)胞術(shù)測試CD52抗體的存在。將陽性孔在培養(yǎng)物中擴(kuò)大并重新測試。將陽性孔進(jìn)一步擴(kuò)大并測試抗體同種型。將CD52抗體的陽性亞克隆冷凍，在液氮中保存，并用于生產(chǎn)單克隆抗體以進(jìn)行后續(xù)研究。
[0046]使用快速ELISA小鼠抗體同種型鑒定試劑盒(Perbio, Cramlington, UK)對單克隆抗體進(jìn)行同種型鑒定。在ImL蛋白A-瓊脂糖柱(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)上純化抗體。將管道和蛋白A柱用0.4MNa0H去熱原，然后進(jìn)行純化。將柱用20柱體積的pH7.4的PBS重新平衡。收獲雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，使用10XPBS將其調(diào)至I XPBS(pH7.4)并過濾除菌。將過濾的上清液以0.5mL/分鐘泵送通過蛋白A-瓊脂糖柱。用IXI3BS(PH7.4)洗滌柱，使用無菌0.1M檸檬酸鈉(pH3)洗脫IgG，收集了 0.9mL級分并用0.1mL的無菌IM Tris-HCl (pH9)中和。在無菌條件下，將所述產(chǎn)品緩沖液交換為PBS (pH7.4)以除去任何的洗脫緩沖液并濃縮所述樣品。濃縮之后，使用1.4的消光系數(shù)Ec (0.1%)通過0D280nm對抗體進(jìn)行定量。純化的抗體使用No vex NuPAGE電泳系統(tǒng)用4-12%NuPage凝膠(Invitrogen, Paisley, UK)和 MES 電泳緩沖液通過 SDS-PAGE 來分析。用 4XNuPAGE樣品緩沖液和β -巰基乙醇制備I μ g抗體并加熱。將所述凝膠用InstantBlue染色液(Expedeon, Cambridge, UK)染色并通過比較染色的帶與 PageRuler?Plus PrestainedProtein Ladder (Fermentas, York, UK)來估計分子大小。對每個抗體確定了兩條帶,不存在可檢測到的污染物。使如上所述的CD52肽流式細(xì)胞術(shù)檢測純化的抗體。從流式細(xì)胞分析(圖2)，證明了被稱為2E8的一線單克隆抗體選擇性結(jié)合NSO-⑶52細(xì)胞。
[0047]實施例2-可變區(qū)基因測序
[0048]使用RNAqueous_4PCR 試劑盒(Ambion, Warrington, UK)從 2E8 雜交瘤細(xì)胞提取總RNA，并將其用于合成cDNA。使用如表1所示的簡并小鼠前導(dǎo)序列引物(Sigma)和獨特恒定區(qū)引物(Sigma)通過PCR擴(kuò)增鼠免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變(V)區(qū)片段。將所得的PCR片段亞克隆至pGEM-T` Easy I載體系統(tǒng)(Promega, Southampton, UK)中，并使用載體特異性引物M13Forward (Sigma)對插入片段進(jìn)行測序。所有DNA測序由GeneserviceLtd, Cambridge, UK)進(jìn)行。所得的V區(qū)核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，相應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，分別為重鏈和輕鏈V區(qū)。
【權(quán)利要求】
1.一種⑶52抗體，其包含至少I個、2個、3個、4個或5個選自以下的⑶R序列: (i)包含序列RYGMS (SEQ ID N0:5)的 CDRHl (ii)包含序列MMKTKGGRTYYPDSVKG (SEQ ID NO:6)的 CDRH2 (iii)包含序列DGYY (SEQ ID N0:7)的 CDRH3 (iv)包含序列KSSQSLLHSDGKTYLN (SEQ ID NO:8)的 CDRLl ； (V)包含序列 LVSKLDS (SEQ ID NO:9)的 CDRL2 ;和 (vi)包含序列 WQGTHLWT (SEQ ID NO: 10)的 CDRL3。
2.—種⑶52抗體，其包含一個或多個選自SEQ ID NO: 20-24的可變區(qū)序列用于重鏈可變區(qū)，以及一個或多個選自SEQ ID NO:25-28序列用于輕鏈可變區(qū)。
3.一種⑶52抗體，其包含SEQ ID NO: 22用于重鏈可變區(qū)以及SEQ ID NO: 28用于輕鏈可變區(qū)。
4.權(quán)利要求1至3的CD52抗體，當(dāng)在具有人群的HLA-DR同種異型分布的50份人血樣中體外測試CD4+輔助T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)時，所述抗體引起〈=4%的T細(xì)胞應(yīng)答。
5.權(quán)利要求1至4的抗體，其中所述可變區(qū)序列完全來源于人抗體可變區(qū)中的序列。
6.權(quán)利要求5的抗體，所述抗體包含可變區(qū)和人恒定區(qū)。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述人重鏈恒定區(qū)是同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或者是突變的IgG恒定區(qū)，所述人輕鏈人`恒定區(qū)是同種型K。
8.權(quán)利要求6的抗體，其中所述人恒定區(qū)是IgGl和K。
9.權(quán)利要求6的抗體，其中所述人恒定區(qū)是IgG4和K。
10.權(quán)利要求1至5的抗體,其中所述抗體是scFv或Fab。
11.權(quán)利要求1至10的抗體，所述抗體是多特異性蛋白的組分，所述多特異性蛋白特異性結(jié)合人CD52，此外還結(jié)合一個或多個其他分子或與一個或多個其他分子相互作用。
12.—種編碼權(quán)利要求1-10任一項的抗體的多核苷酸。
13.—種含權(quán)利要求12的多核苷酸的載體。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
15.一種含有權(quán)利要求13或14的載體的宿主細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物。
19.一種包含權(quán)利要求1-11任一項的⑶52抗體的組合物。
20.一種包含權(quán)利要求12的多核苷酸或權(quán)利要求13或14的載體的組合物。
21.一種治療疾病的方法，所述疾病包括CLL和其他白血??；包括多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、肌炎和糖尿病的自身免疫性疾??；以及器官移植排斥和移植物抗宿主病，所述方法包括給予需要此類治療的受試者有效量的權(quán)利要求1至11任一項的抗體、權(quán)利要求12至14任一項的多核苷酸或權(quán)利要求19或20的組合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其還包括共給予有效量的化學(xué)治療劑。
23.權(quán)利要求21或22任一項的方法，其還包括共給予藥物載體。
24.一種使用權(quán)利要求1至11任一項的抗體檢測樣品中人CD52抗原的存在用于診斷人CD52相關(guān)疾病的方法。
25.一種使用權(quán)利要求12至14的多核苷酸或載體檢測樣品中人CD52抗原的存在用于診斷人CD52相關(guān)疾病的方法。
26.—種CD52抗體，當(dāng)在具有人群的HLA-DR同種異型分布的50份人血樣中體外測試CD4+輔助T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)時，所述抗體引起〈=4%的T細(xì)胞應(yīng)答。
【文檔編號】C07K16/28GK103649122SQ201280033384
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月1日
【發(fā)明者】T·D·瓊斯, R·G·E·霍爾蓋特, F·J·凱爾 申請人:安迪拓普有限公司