專利名稱：一種提取植物總蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取植物總蛋白的方法。
背景技術(shù)：
樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵因素，樣品制備的質(zhì)量幾乎直接決定下游分析的結(jié)果。理想的樣品制備方法應(yīng)當(dāng)可以最大限度的溶解全部蛋白質(zhì)，同時可以將蛋白質(zhì)降解、修飾與非蛋白質(zhì)類物質(zhì)污染降低到最小，并具備良好的重復(fù)性。尤其是對于植物組織，其中不但富含大量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，富含蛋白酶與氧化酶，而且還含有大量多糖和次生代謝產(chǎn)物(例如脂類、酚類、淀粉等)，這些不利因素都導(dǎo)致難以獲得無污染、無修飾、完整高質(zhì)量的植物細(xì)胞蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取植物總蛋白的方法，特備是一種提取番茄植株韌皮部總蛋白的方法。本發(fā)明提供的提取植物總蛋白的方法，包括如下步驟( I)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末；(2)取步驟(I)得到的粉末，加入蛋白質(zhì)提取緩沖液并振蕩勻漿，然后加入Tris飽和酚進(jìn)行提取，取有機(jī)相；(3)取步驟(2)得到的有機(jī)相，與蛋白質(zhì)沉淀液混合后靜置，然后離心收集沉淀；(4)取步驟(3)得到的沉淀，依次進(jìn)行甲醇清洗、丙酮清洗和冷凍干燥，得到植物總蛋白。所述蛋白質(zhì)提取緩沖液的制備方法具體如下將500mmol Tris_HCl、50mmolEDTA、700mmol蔗糖和IOOmmol KCl溶于水并用水定容至1L，調(diào)pH至8. 0，使用前加入β-巰基乙醇和各種蛋白酶，使得巰基乙醇的濃度為2% (體積百分含量)、糜蛋白酶的濃度為I. 5 μ g · ml'嗜熱菌蛋白酶的濃度為O. 8g · ml'木瓜蛋白酶的濃度為Iyg · ml、鏈霉蛋白酶的濃度為I. 5μ g · ml'胰酶的濃度為15μ g · ml'胰蛋白酶的濃度為O. 2 μ g · ml'所述蛋白質(zhì)沉淀液的制備方法具體如下將乙酸銨溶于甲醇，并用甲醇定容，使得乙酸銨的濃度為O. Imol · L'所述植物材料具體可為番茄韌皮部。每2g所述植物材料可加入O. 2g PVPP0所述步驟(2)的具體步驟可為取Ig步驟(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min(可間隔時間振蕩，以充分反應(yīng))，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取有機(jī)相。所述步驟(2)的具體步驟可為取Ig步驟(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min(可間隔時間振蕩，以充分反應(yīng))，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取出有機(jī)相后再加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取有機(jī)相。所述步驟(3)的具體步驟可為每管加入250 μ L步驟(2)得到的有機(jī)相和ImL所述蛋白質(zhì)沉淀液，漩渦混勻，-20°C靜置10小時。所述甲醇清洗具體可進(jìn)行三次，每次的步驟為每管得到的沉淀加入500 μ L 4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4°C、10000g離心lOmin，棄掉上清液；所述丙酮清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為每管得到的沉淀加入500 μ L 4 °C預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4 °C、IOOOOg離心IOmin,棄掉上清液。以上任一所述的番爺具體可為番爺品種CM (Lycopersicon esculentumL.cvCastIemart)。
本發(fā)明提供的提取植物總蛋白的方法是對現(xiàn)有的酚-甲醇法的改進(jìn)，主要改進(jìn)點在于(I)在樣品研磨破碎過程中添加PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)來吸附酚類物質(zhì)，，而不是常規(guī)使用的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，PVP為可溶性物質(zhì)，易溶于酚-甲醇提取法的水相，難以去除，從而會干擾第一相等點聚焦電泳，而PVPP為不溶性物質(zhì)，在提取過程中吸附酚類物質(zhì)后可以通過離心去除，不會干擾下游分析過程；(2)當(dāng)植物細(xì)胞破碎的時候，細(xì)胞中的蛋白水解酶就會被釋放出來并被激活，使得各個蛋白組分被降解掉，導(dǎo)致電泳結(jié)果復(fù)雜化并影響最終的結(jié)果分析，針對此問題，通過對蛋白水解酶的降解避免蛋白水解酶對各個蛋白組分的降解，將非正常的蛋白質(zhì)降解或修飾降到最低水平，最大限度的保持植物材料中的蛋白質(zhì)的活性與自然特性。


圖I為實施例I中的電泳圖。 圖2為對比例I中的電泳圖。圖3為對比例2中的電泳圖。圖4為對比例3中的電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。用于實施例的番爺品種為CM (Lycopersicon esculentum L. cv Castlemart);參考文獻(xiàn)張立寧，程繼鴻，楊瑞，孫中華，吳春霞，王紹輝。茉莉酸合成相關(guān)基因Spr2與LePrs在番茄抗根結(jié)線蟲中的作用.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44 (19) :4022-4028。糜蛋白酶(Chymotrypsin):美國sigma公司；Cat. No. :C1012。嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)美國 sigma 公司；Cat. No. :T7902。木瓜蛋白酶(Papain)美國 sigma公司；Cat. No. :76218。鏈霉蛋白酶(Pronase):美國 sigma 公司；Cat. No. :P4806。胰酶(Pancreatin):美國 sigma 公司；Cat. No. :P3292)。膜蛋白酶(Trypsin):美國 sigma 公司；Cat. No. :T9201。CHAPS，即3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，購自美國sigma公司，貨號為C9426。DTT即二硫蘇糖醇，購自美國BIO-RAD公司，貨號為161-0611。Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)，購自美國BIO-RAD公司，貨號為163-1113。PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮):購自美國sigma公司，貨號為P6755。PVP (聚乙烯吡咯烷酮)購自美國sigma公司，貨號為PVP I。實施例I、番茄總蛋白的提取(本發(fā)明保護(hù)的改進(jìn)的酚-甲醇法)蛋白質(zhì)提取緩沖液的制備方法將500mmol Tris_HCl、50mmol EDTA、700mmol鹿糖和IOOmmol KCl溶于水并用水定容至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 0，4°C保存，使用前加入β -巰基乙醇和各種蛋白酶，使得巰基乙醇的濃度為2% (體積百分含量)、糜蛋白酶的濃度為I. 5 μ g · ml'嗜熱菌蛋白酶的濃度為O. 8g · πιΓ1、木瓜蛋白酶的濃度為I μ g · ml'鏈霉蛋白酶的濃度為I. 5μ g · ml'胰酶的濃度為15μ g · ml'胰蛋白酶的濃度為O. 2 μ g · ml'蛋白質(zhì)沉淀液的制備方法將乙酸銨溶于甲醇，并用甲醇定容至 O.Imol · ΙΛ -20°C 保存。蛋白質(zhì)裂解液的制備方法將6mol尿素、2mol硫脲、20mmol CHAPS和O. Olg溴酹藍(lán)溶于水，并用水定容至1L，-20°C保存，使用前加入DTT和Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)，使得DTT的濃度為65mmol · L'Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)的濃度為O. 5g/100ml。一、番茄總蛋白的提取取番茄植株的韌皮部進(jìn)行總蛋白的提取，具體步驟如下I、取2g番茄植株的韌皮部，加入O. 2g PVPP及少量石英砂，用液氮研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取I. Og粉末，轉(zhuǎn)入15mL Falcon管(Falcon管A)中。2、加入3mL蛋白質(zhì)提取緩沖液，震蕩使其充分混勻，加入3mL Tris飽和酚，旋渦混勻后，4°C放置30min (期間震蕩兩次)，然后4°C、IOOOOg離心15min，小心吸取兩相提取液中含有酚的上層于新的Falcon管(Falcon管B)中(注意務(wù)必小心不要吸入中間的白色夾層)。3、在完成步驟2的Falcon管A中加入3mL Tris飽和酚，旋渦混勻后，4°C放置30min(期間震蕩兩次)，然后4°C、IOOOOg離心15min，小心吸取兩相提取液中含有酚的上層于新的Falcon管(Falcon管C)中(注意務(wù)必小心不要吸入中間的白色夾層)。4、合并Falcon管B和Falcon管C中的液體，混勻后分裝入I. 5mL的tube管中(250 μ L/tube 管)。5、向步驟4得到的每個tube管中加入ImL蛋白質(zhì)沉淀液，漩渦混勻，_20°C靜置10小時。6、將步驟5得到的tube管4°C、6000g離心5min，棄掉上清液；每管加入500 μ L4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4°C、10000g離心lOmin，棄掉上清液；每管加入500μ L 4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4°C、10000g離心lOmin，棄掉上清液；每管加入500yL 4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，40C、IOOOOg離心lOmin，棄掉上清液。7、將步驟6得到的tube管中每管加入500 μ L 4°C預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4°C、IOOOOg離心lOmin，棄掉上清液；每管加入500 μ L 4°C預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4°C、IOOOOg離心lOmin，棄掉上清液；每管加入500 μ L 4°C預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4°C、10000g離心IOmin,棄掉上清液。8、將步驟7得到的tube管中的沉淀用真空冷凍干燥機(jī)制成干粉，_70°C保存。
二、提取效果鑒定向步驟一的8得到的每個tube管加入100 μ L蛋白質(zhì)裂解液，漩渦混勻多次，直到所有蛋白溶解，將所有tube管中的液體合并至一個離心管中，40C、IOOOOg離心20min，收集上清液并進(jìn)行雙向凝膠電泳，具體步驟如下I、等電聚焦電泳(I)取出冷凍保存的IPG預(yù)制膠條(17cm)，于室溫下放置lOmin。(2)沿著聚焦盤的邊緣線性加入樣品1000 μ g0(3)當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤中后，用鑷子去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。
(4)將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上，使得膠條的正極(標(biāo)有+)對應(yīng)于聚焦盤的正極。(5 )在每根膠條上覆蓋2_3mL礦物油。(6)對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。按表I設(shè)置等電聚焦程序并進(jìn)行等電聚焦電泳。表117cm膠條等電聚焦程序設(shè)置
權(quán)利要求
1.一種提取植物總蛋白的方法，包括如下步驟 (1)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末； (2)取步驟(I)得到的粉末，加入蛋白質(zhì)提取緩沖液并振蕩勻漿，然后加入Tris飽和酚進(jìn)行提取，取有機(jī)相； (3)取步驟(2)得到的有機(jī)相，與蛋白質(zhì)沉淀液混合后靜置，然后離心收集沉淀； (4)取步驟(3)得到的沉淀，依次進(jìn)行甲醇清洗、丙酮清洗和冷凍干燥，得到植物總蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)提取緩沖液的制備方法如下將500mmol Tris-HCl、50mmol EDTA>700mmol 鹿糖和 IOOmmol KCl 溶于水并用水定容至 1L,調(diào)節(jié)PH至8.0，使用前加入β-巰基乙醇和各種蛋白酶，使得巰基乙醇的濃度為2%、糜蛋白酶的濃度為I. 5μ g · ml—1、嗜熱菌蛋白酶的濃度為O. 8g · ml—1、木瓜蛋白酶的濃度為1μ g πιΓ1、鏈霉蛋白酶的濃度為I. 5μ g -ml'胰酶的濃度為15 μ g · ml'胰蛋白酶的濃度為 O. 2 μ g · HiF1O
3.如權(quán)利I或2所述的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)沉淀液的制備方法如下將乙酸 >銨溶于甲醇，并用甲醇定容，使得乙酸銨的濃度為O. Imol · L'
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述植物材料為番茄韌皮部。
5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于每2g所述植物材料加入O.2gPVPPo
6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取Ig步驟(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取有機(jī)相。
7.如權(quán)利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取Ig步驟(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取出有機(jī)相后再加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL Tris飽和酚并混勻，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg離心15min，吸取有機(jī)相。
8.如權(quán)利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為每管加入250 μ L步驟(2)得到的有機(jī)相和ImL所述蛋白質(zhì)沉淀液，漩渦混勻，_20°C靜置10小時。
9.如權(quán)利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述甲醇清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為加入500yL 4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4°C、10000g離心lOmin，棄掉上清液；所述丙酮清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為加入500μ L 4°C預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4°C、10000g離心IOmin,棄掉上清液。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述甲醇清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為每管加入500yL 4°C預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4°C、10000g離心lOmin，棄掉上清液；所述丙酮清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為每管加入500yL 4°C預(yù)冷的丙酮,鏇渦混勻，4°C、10000g離心IOmin,棄掉上清液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取植物總蛋白的方法，特備是一種提取番茄植株韌皮部總蛋白的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟(1)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末；(2)取粉末，加入蛋白質(zhì)提取緩沖液并振蕩勻漿，然后加入Tris飽和酚進(jìn)行提取，取有機(jī)相；(3)取有機(jī)相，與蛋白質(zhì)沉淀液混合后靜置，然后離心收集沉淀；(4)取沉淀，依次進(jìn)行甲醇清洗、丙酮清洗和冷凍干燥，得到植物總蛋白。本發(fā)明提供的方法主要改進(jìn)點在于(1)在樣品研磨破碎過程中添加PVPP來吸附酚類物質(zhì)，在提取過程中吸附酚類物質(zhì)后可以通過離心去除，不會干擾下游分析過程；(2)提取過程中添加多種蛋白酶，最大限度的保持植物材料中的蛋白質(zhì)的活性與自然特性。
文檔編號C07K1/30GK102924566SQ20121044742
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者王紹輝, 楊瑞, 郝敬虹, 邢佳毅 申請人:北京農(nóng)學(xué)院