專利名稱：Gnrh(促性腺激素釋放激素)肽衍生物的制作方法
GNRH (促性腺激素釋放激素)肽衍生物
本申請是申請?zhí)枮?00780026537. 3，申請日為2007年5月I日，發(fā)明名稱為“GNRH (促性腺激素釋放激素)肽衍生物”的中國專利申請的分案申請。技術(shù)領(lǐng)域
本申請涉及用于藥物的試劑、組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及與GnRH肽相關(guān)的試劑。
背景技術(shù)：
在人類中至少存在兩種形式的促性腺激素釋放激素(GnRH)。雖然對GnRH II的生物學(xué)作用知之甚少，但是我們知道GnRH I是哺乳動物繁殖的神經(jīng)內(nèi)分泌控制的中心調(diào)節(jié)子。從下丘腦神經(jīng)元釋放的GnRH I與垂體前葉(anterior pituitary)中的它的特異性的、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)相結(jié)合，最終促進促性腺激素的合成和釋放(Kaiser等人，1997 ； Millar等人,2004)。GnRH另外還對垂體外組織(extra-pituitary tissues)和幾種類型的癌癥，特別是生殖系統(tǒng)癌癥具有效應(yīng)。在這些腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了激素的mRNA和受體，在體外和體內(nèi)已經(jīng)表明GnRH對細胞生長的直接的抑制(Limonta等人,2003和Grundker等人， 2002進行了綜述)。對這個新型作用的研究是非常新的，產(chǎn)生了相反的數(shù)據(jù)收集。例如，在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)兩個不同的結(jié)合位點和藥理學(xué)上不同的受體，這引起一些研究者建議第二種受體亞型(命名為II型，以與I型垂體受體相對)(Enomoto等人,2004 ；Grundker等人， 2004 ；Neill等人，2004)。但是，雖然在一些靈長類中已經(jīng)克隆了 II型受體，但是在人類中還沒有發(fā)現(xiàn)功能性替代亞型(Morgan等人，2003)。而且，在婦科癌癥中發(fā)現(xiàn)的mRNA和cDNA 對應(yīng)于I型受體(Limonta等人，2003)。
GnRH調(diào)節(jié)其抗增殖作用的分子機制也是一個爭論的問題。一些證據(jù)表明，不像垂體受體(其結(jié)合至Gq) (Grundker等人,2002 ；Limonta等人,2003),在腫瘤中表達的受體主要結(jié)合至Gi。其他待激活的多種細胞內(nèi)途徑已經(jīng)被命名，包括生長因子作用的下調(diào) (通過生長因子及其受體表達的減少和磷酸化酪氨酸磷酸酶的激活)、Akt和60s核糖體磷酸化蛋白的抑制(分別抑制細胞生存和蛋白合成)和幾個促有絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)的激活(Grundker 2001 ;Chen等人，2002Kim 等人,2004b ;Kimura等人，1999 ;Kraus等人,2004Tanaka等人,2003)。細胞生長調(diào)節(jié)之上的 GnRH暴露的結(jié)果毫無疑問由細胞類型(規(guī)定細胞內(nèi)的內(nèi)容和類固醇激素對增殖的依賴性)、 治療體制和其他的(有時為未明的)因素決定。
GB 2，237，571A涉及促性腺激素釋放激素類似物。Folkers等人(1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，82:1070-1074)涉及與促黃體化激素釋放激素生物學(xué)等價的十肽。 Millar等人(1989，J. Biol. Chem. ,35:21007-21013)涉及脊椎動物促性腺激素釋放激素的嵌合類似物。
以前已經(jīng)將GnRH肽用于治療增殖性失調(diào)(通過調(diào)節(jié)垂體腺的激素釋放)，例如癌癥。但是，最近證明抗增殖也是配體的一個內(nèi)在特性，其能夠優(yōu)先激活特定的信號級聯(lián)反應(yīng)，該事件被稱為配體誘導(dǎo)的選擇性信號傳導(dǎo)的事件(LISS) (Maudsley等人，2004 ； Millar&Pawson，2004)。這解釋了被刻畫為拮抗劑的配體是如何通過相同的受體進行對其他細胞類型細胞的細胞生長抑制，因為他們不激活垂體受體。迄今為止，鑒定出極少的具有這些特性的配體。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人確定了與細胞生長抑制相關(guān)的GnRH I和GnRH II肽的結(jié)構(gòu)性要求并令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，GnRH I和GnRH II肽的抗增殖活性可通過取代肽序列中的特定氨基酸殘基來進行調(diào)節(jié)。
人類GnRH I的肽序列(使用氨基酸殘基的三字符密碼子進行顯示)為PG1U-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH20
人類GnRH II的肽序列(使用氨基酸殘基的三字符密碼子進行顯示)為pGlu_His -Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH20
特別地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在GnRH I肽序列的位置5和/或7和/或8取代氨基酸殘基(特別地在位置8除去精氨酸殘基)可導(dǎo)致增強的抗增殖活性。而且，在GnRH II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸殘基可導(dǎo)致增強的抗增殖活性。這個令人驚奇的發(fā)現(xiàn)提供了用于治療抗增殖性失調(diào)(例如癌癥)的有力的和選擇性試劑。
相應(yīng)地，在第一個方面，本發(fā)明提供了用于藥物的包含以下肽序列的試劑
pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro-A，其中
a) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或
b) Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或
c) Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或
d) Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或
e) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或
f) Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ；
且其中A選自
Z ;或
azaGly ;或
azaGly. Z ;或
DAla. Z ;或
Glu. Z ;或
DAla-Glu. Z ;或
DAla-DAla. Z ;或
β Ala. Z ;或
Pro ;或
Pro. Z
DAla-Gly. Z ;或
Gly. Z,
其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
優(yōu)選地，Z具有小于200的分子量，優(yōu)選為小于150，優(yōu)選為小于100。優(yōu)選地，Z是 NHR’，其中R’是H或C1至C4烷基或者Z是0R”，其中R” C1至C4烷基。優(yōu)選地，Z是酰胺。 優(yōu)選地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。
縮寫“pGlu”代表經(jīng)修飾的氨基酸，焦谷氨酸鹽(pyroglutamate )。
優(yōu)選地,A是azaGly. NH2?？s寫“azaGly”代表氮雜甘氨酸(azaglycine),其中C-H 基團被氮原子所取代。縮寫“azaGly. NH2”代表氮雜甘氨酸的酰胺化形式。
優(yōu)選地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2?？s寫 “DAla. NH2” 和 “Glu. NH2” 代表分別 D-丙氨酸殘基和谷氨酸鹽殘基的酰胺化形式。
優(yōu)選地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。
優(yōu)選地，A是β Ala. NH2?？s寫“ β Ala”代表β -丙氨酸，丙氨酸的一種經(jīng)修飾的形式，其中氨基基團位于相對于羧基基團的β (貝塔)位置。縮寫“i3Ala.NH2”代表β-丙氨酸的氨?；问?。
優(yōu)選地，A是Pro. Z，其中Z選自NH2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N- 丁胺。
縮寫“Gly. NH2”代表甘氨酸殘基的酰胺化形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑在其C末端含有不帶電的C末端殘基，這可通過用C末端基團例如NH2或NHEt (N-乙胺)進行修飾來實現(xiàn)。
“試劑”包括鹽(例如有機或無機酸加成鹽)、酯和包含或由本發(fā)明的肽序列組成的分子的的溶劑化物。應(yīng)該認識到，本術(shù)語還包括與相關(guān)試劑具有相同的生物學(xué)功能和/或活性的衍生物。而且，對于本發(fā)明的目的來說，該術(shù)語也包括相關(guān)試劑的前藥(例如酯)。術(shù)語“前藥”包括任何物質(zhì)組合物，其經(jīng)口服或非腸道使用之后，可在體內(nèi)代謝而形成實驗可測數(shù)量的和在預(yù)先確定的服藥時間內(nèi)的相關(guān)試劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑鞒能夠可逆地或非可逆地結(jié)合至GnRH受體，且優(yōu)選地能夠選擇性地結(jié)合至GnRH受體?！斑x擇性結(jié)合”包括本發(fā)明試劑能夠以相對于另一個多肽強至少十倍的能力結(jié)合至GnRH受體；優(yōu)選為強至少50倍，更優(yōu)選為強至少100倍。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑在生理條件下結(jié)合至GnRH受體，例如，在體內(nèi)。
本發(fā)明的試劑可進一步由一個或一個以上部分組成或包含一個或一個以上部分， 該部分能夠?qū)⒈景l(fā)明的試劑靶向或者定位于靶細胞(例如癌細胞)和/或增加本發(fā)明試劑的半衰期(t72)。因此，這樣的部分可增加本發(fā)明試劑的功效。優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的試劑在肽序列的位置6包含或者由D-氨基酸(優(yōu)選為D-Lys或D-Glu或D-Asp或D-Cys)組成時可包括一個或一個以上部分，因為那些氨基酸殘基特別易于進行修飾。
優(yōu)選地，一個或一個以上部分是類固醇激素分子(包括例如孕酮、睪丸激素、雌二醇或皮質(zhì)醇)，且偶聯(lián)至D-氨基酸的側(cè)鏈。類固醇激素分子能夠結(jié)合血漿蛋白且被表明可降低 GnRH 肽的代謝清除(Ratcliffe 等人，2006, Endocrinology, 147:571-9)。在 W02004/08725中描述了偶聯(lián)至類固醇激素的GnRH肽，這里引入作為參考?；蛘?，一個或一個以上部分為維生素，例如微生素B12和維生素D，且偶聯(lián)至D-氨基酸的側(cè)鏈。已經(jīng)表明維生素可改善GnRH肽的口服的生物利用率(Russell-Jones等人，1995, Bioconjug. Chem., 6:34-42 ；Russell-Jones 等人，1995, Bioconjug. Chem. ,6:459-465)。
優(yōu)選地，一個或一個以上部分不影響和/或不顯著性地影響本發(fā)明的試劑結(jié)合至并激活GnRH受體的能力。
幾個因素決定本發(fā)明試劑的抗增殖活性，包括對GnRH受體的親和力以及和分娩信號途徑相關(guān)細胞內(nèi)機制的受體的結(jié)合。因此，本發(fā)明試劑的抗增殖活性不是單單由對 GnRH受體的親和力決定的，例如，本發(fā)明的兩個試劑可顯示出不同的抗增殖活性但是對于 GnRH受體具有相同的親和力。
GnRH受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其具有七個跨膜結(jié)構(gòu)域(7TM)。例如 Tsutsumi 等人(1992, Mol. Endocrinol. ,6:1163-1169)和 Kakar 等人(1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.，189:289-295)和 Chi 等人(1993，Mol. Cell. Endocrinol.，91:R1_6)描述了這樣的受體的克隆和鑒定。
確定GnRH肽(或其類似物)與GnRH受體結(jié)合的方法包括競爭性結(jié)合測試，如 Tsutsumi 等人(1992, Mol. Endocrinol. ,6:1163-1169)和 Kakar 等人(1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.，189:289-295)和 Chi 等人(1993，Mol. Cell. Endocrinol.，91:R1_6)所描述。簡單來說，在那個方法中，用I125來標(biāo)記感興趣的肽或其類似物，在表達GnRH受體的全細胞中或在包含GnRH受體的膜中存在未標(biāo)記肽的情況下來測定結(jié)合。
在第二個方面，本發(fā)明提供了用于藥物的包含以下肽序列的試劑
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr/His-Gly-Leu/Trp-R4-Pro-A
其中R4是除了精氨酸以外的任何氨基酸，且A選自
Z ;或
azaGly ;或
azaGly. Z ;或
DAla. Z ;或
Glu. Z ;或
DAla-Glu. Z ;或
DAla-DAla. Z ;或
β Ala. Z ;或
Pro ;或
Pro. Z ;或
DAla-Gly. Z ;或
Gly. Z,
其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
優(yōu)選地，Z具有小于200的分子量，優(yōu)選為小于150，優(yōu)選為小于100。優(yōu)選地，Z是NHR’，其中R’是H或C1至C4烷基或者Z是0R”，其中R”是C1至C4烷基。優(yōu)選地，Z是酰胺。優(yōu)選地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。
Try/Hi s包括，在肽序列的位置5存在氨基酸酪氨酸(Tyr )或氨基酸組氨酸(His)。
Leu/Trp包括，在肽序列的位置7存在氨基酸亮氨酸(Leu )或氨基酸色氨酸(Trp )。
優(yōu)選地，A 是 azaGly. NH2。
優(yōu)選地，A 是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。
優(yōu)選地，A 是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。
優(yōu)選地，A 是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。
優(yōu)選地，A是PAla. NH2。
優(yōu)選地，A Pro. Z，其中Z選自順2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N-丁胺。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了試劑，其中R4選自丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、 谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、 絲氨酸、色氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。
術(shù)語“氨基酸”包括任何同時具有與α -碳原子結(jié)合的羧基(-C00H)和氨基(-NH2) 基團的水溶性有機化合物的基團。氨基酸可由通式R-CH(NH2)COOH代表，其中R基團是氫或有機基團，且決定了任何特定氨基酸的特性。關(guān)于α-碳原子的四個不同基團的四面體排列使氨基酸具有光學(xué)的活性。兩個光學(xué)鏡像被稱為L-異構(gòu)體和D-異構(gòu)體。通常，只有 L-氨基酸為蛋白質(zhì)的組成物。優(yōu)選地，本發(fā)明的第一個和第二個方面中的試劑的GnRH受體結(jié)合性部分由L-氨基酸組成。
在肽鍵形成的過程中，氨基酸組合在一起形成短鏈(肽)或長鏈(多肽)。眾所周知， 蛋白質(zhì)由大約20種不同比例的常見的氨基酸組成。其序列決定了蛋白質(zhì)的形狀、特性和生物學(xué)作用。肽或多肽鏈中的氨基酸殘基通常以其在鏈中的位置編號來表示，在鏈的N末端的氨基酸被編為第I個位置(即位置I)。
在第三個方面，本發(fā)明提供了包含以下肽序列或由以下肽序列組成的試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-X-LTrp-LTyr-LPro-A，其中X是D-氨基酸殘基，且A選自
Z ;或
azaGly ;或
azaGly. Z ;或
DAla. Z -M
Glu. Z ;或
DAla-Glu. Z ;或
DAla-DAla. Z ;或
PAla.Z;或
Pro ;或
Pro. Z ;或
DAla-Gly. Z ;或
Gly. Z,
其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
優(yōu)選地,本發(fā)明提供了用途,其中X選自D-精氨酸、D-賴氨酸、D-色氨酸、D-賴氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-絲氨酸。
優(yōu)選地，A是 azaGly. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。
優(yōu)選地，A是 β Ala. NH2。
優(yōu)選地，A Pro. Z，其中Z選自NH2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N-丁胺。
在第四個方面，本發(fā)明提供了包含選自以下肽序列的試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途CN 102977188 A說明書6/36 頁
i) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ；
ii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LTyr-LPro-A ；
iii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LGln-LPro-A ；
iv) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LLeu-LPro-A ；
v) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；
v-B ) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LArg-LPro-A ；
vi) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；
vii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；
viii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ；
ix) pLGlu-LHi s-LTrp-LSer-LHi s-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ；
x) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；
xi) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LLeu-LArg-LPro-A ；
xii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTyr-LLeu-LArg-LPro-A ；
xiii) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DAla-LTrp-LTyr-LPro-A ；
xiv) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A,
其中Y是DAla. NH2或Z ;且A選自
Z ;或
azaGly ;或
azaGly. Z ;或
DAla. Z ;或
Glu. Z ;或
DAla-Glu. Z ;或
DAla-DAla. Z ;或
β Ala. Z ;或
Pro ;或
Pro. Z ;或
DAla-Gly. Z ;或
Gly. Z，
其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
優(yōu)選地，Z具有小于200的分子量，優(yōu)選為小于150，優(yōu)選為小于100。優(yōu)選地，Z是 NHR’，其中R’是H或(^至(4烷基或者Z是0R”，其中!^”是仏至匕烷基。優(yōu)選地，Z是酰胺。優(yōu)選地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。
優(yōu)選地，A是 azaGly. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH20
優(yōu)選地，A是 PAla. NH2。
優(yōu)選地，A是Ρι .Ζ，其中Z選自ΝΗ2、Ν-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N-丁胺。
以上所列肽(viii)的一個具體實施方式
在序列的位置9包含氨基酸殘基Pro. NHEt，其中縮寫代表經(jīng)過在C末端加入N-乙胺修飾的脯氨酸。12
優(yōu)選對肽(viii)來說Y是NHEt。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在肽中Pro. NHEt的存在導(dǎo)致抗增殖活性的增加。
優(yōu)選地，本發(fā)明的第三和第四個方面所述的試劑由L-氨基酸組成，在位置6有D氨基酸。
本發(fā)明的試劑包括GnRH I和/或GnRH II肽的氨基酸序列的經(jīng)修飾的版本。本發(fā)明的試劑的肽序列可通過固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式來合成,如Lu等人(1981)J. Org. Chem. 46，3433和這里的參考文獻所描述。臨時性N-氨基保護通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團來提供。使用N，N- 二甲基中的20%哌啶對這個高度堿敏感的保護性基團進行重復(fù)切割。 側(cè)鏈官能團可作為其丁醚(在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁酯(在谷氨酸和天冬氨酸的情況下)、丁氧基羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲游基衍生物(在半胱氨酸的情況下)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情況下)來進行保護。當(dāng)谷氨酰胺或天冬酰胺為C末端殘基時，使用4，4’ -二甲氧基二苯甲基基團進行側(cè)鏈官能團的保護。固相支持物是基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，該聚合物由三個單體所組成，即二甲基丙烯酰胺(骨架單體)、雙丙烯酰乙烯(交聯(lián)體)和丙烯酰肌氨酸甲酯(官能化試劑)。所用的肽至樹脂可切割相連試劑為酸敏感的4-羥基甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺(使用逆N，N-環(huán)己基-碳二亞胺/I-羥基苯并三唑介導(dǎo)的偶聯(lián)程序進行添加)之外，所有的氨基酸衍生物作為其預(yù)先進行的對稱的酐衍生物進行添加。所有的偶聯(lián)和去保護反應(yīng)以茚三酮、三硝基苯磺酸或同中子異荷素(isotin)測試程序進行監(jiān)視。合成完成之后，通過用含有50%凈化劑的95%的三氟乙酸處理把肽從樹脂支持物上切割下來 (同時伴隨除去側(cè)鏈保護基團)。通常使用的凈化劑為乙基二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，提取選擇取決于所合成肽的組成氨基酸。在真空中通過蒸發(fā)除去三氟乙酸，然后用二乙醚進行研碎形成粗肽。通過簡單的提取程序(凍干水相)來除去任何的凈化劑，使粗肽不含凈化劑。 用于妝合成的試劑通?？捎?Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK 獲得。純化可通過任何一個技術(shù)或其組合例如體積排阻色譜、例子交換色譜和(主要的)反相高壓液相色譜來進行?？赏ㄟ^薄層色譜、反相高壓液相色譜、酸性水解后氨基酸分析和快原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析來對肽進行分析。
本發(fā)明試劑的肽序列也可使用液相方法進行合成，如化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。
本發(fā)明試劑的肽序列可包含或由仿肽(peptidomimetic)化合物組成。術(shù)語“仿肽”是指模擬作為治療性試劑的特別肽的構(gòu)象和所需特征的化合物，但是可避免不需要的特征。例如，嗎啡是可經(jīng)口服使用的化合物，是肽內(nèi)啡肽(endorphin)的仿肽。
通常，由于缺少口服生物可利用率和蛋白水解降解，與肽相關(guān)的治療性應(yīng)用受到限制。通常，例如，在體內(nèi)肽迅速被外肽酶和內(nèi)肽酶所降解，導(dǎo)致通常很短的生物學(xué)半衰期。 作為潛在的治療性試劑的肽的另一個缺陷是它們?nèi)鄙倏诜锟衫寐省Ｔ谖改c道中蛋白水解酶對肽的降解可能是一個重要的形成因素。但是，由于已認識到即使是小的環(huán)肽(其不會被快速代謝失活)卻也表現(xiàn)出較差的口服生物可利用率，這使得問題更加復(fù)雜。這可能是由于較差的跨腸道膜轉(zhuǎn)運以及通過肝提取而從血液中快速清除然后分泌至腸。這些觀察暗示多個酰胺鍵可干擾口服生物可利用率。認為當(dāng)肽藥物經(jīng)口服使用時，連接肽中氨基酸殘基的肽鍵可能斷裂分開。
設(shè)計和合成仿肽有一些不同的方法。在一個方法中，例如由Sherman和Spatola, J. Am. Chem. Soc.，112:433 (1990)所披露的，一個或一個以上的酰胺鍵以實質(zhì)上等排的方式被各種化學(xué)官能基團所替代。這種樓梯式方法已取得一些成功已經(jīng)獲得活性類似物。在一些情況下表明這些類似物具有相對于其天然產(chǎn)生的同類物較長的生物學(xué)半衰期。但是， 這個方法有局限性。很少能實現(xiàn)對一個以上的酰胺鍵的替換。所以，產(chǎn)生的類似物在分子的其他位置仍然容易對酶失活。當(dāng)替代肽鍵時，優(yōu)選為新的連接部分具有與肽鍵相同的電荷分布和實質(zhì)上相同的平面性。
逆反仿肽(其中肽鍵是反的)可通過本領(lǐng)域已知的方法來合成，例如在Μ ζ 等人(1997) J. Immunol. 1593230-3237中所描述的。這個方法包括產(chǎn)生含有變化的假肽， 該變化包括骨架但不包括側(cè)鏈的方向。逆反肽(其含有NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵)對于蛋白質(zhì)水解有更高的抗性。以前曾經(jīng)合成了一些GnRH肽的逆反仿肽(Fromme, 2003, Endocrinology,144:3262-9)。
在另一個方法中，使用了各種未編碼或經(jīng)修飾的氨基酸例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸來對哺乳動物肽進行修飾?；蛘撸俣樯锘钚缘臉?gòu)象通過共價修飾(例如環(huán)化或通過引入Y -內(nèi)酰胺或其他類型的橋)進行穩(wěn)定。參見,例如Veber等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75:2636 (1978)和 Thursell 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm.，111:166(1983)。
眾多合成策略中的一個常見主題為將一些環(huán)形部分引入基于肽的框架。環(huán)形部分限制了肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)象空間，這經(jīng)常引起肽對特定的生物學(xué)受體的增高的親和力。這個策略的另一個附加好處為將環(huán)形部分引入肽也可形成對細胞肽酶具有減少的敏感性的肽。
—個合成環(huán)形穩(wěn)定化仿肽的方法為關(guān)環(huán)復(fù)分解(ring closing metathesis, RCM)。這個方法包括以下步驟合成肽前體并將其與RCM催化劑相接觸以產(chǎn)生構(gòu)象限制性肽。合適的肽前體可含有兩個或兩個以上未飽和C-C鍵。該方法可使用固相肽合成技術(shù)來進行。在這個具體實施方式
中，將前體(其被錨定于固體支持物)與RCM催化劑相接觸，然后從固體支持物上切割產(chǎn)物以產(chǎn)生構(gòu)象限制性肽。
另一個由 D. H. Rich 在 Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds.， Elsevier (1986)所披露的方法通過應(yīng)用酶抑制劑設(shè)計中的轉(zhuǎn)換態(tài)類似物概念來涉及肽模擬物。例如，已知staline的仲醇模擬胃蛋白酶底物的易斷裂酰胺鍵的四面體轉(zhuǎn)換態(tài)。但是，轉(zhuǎn)換態(tài)類似物概念與激素激動劑/拮抗劑設(shè)計無明顯關(guān)聯(lián)。
為了避免疑慮，沒有必要將肽序列中的氨基酸殘基用標(biāo)準(zhǔn)肽鍵連接。例如，如上所討論，氨基酸殘基可通過逆反肽鍵來連接，或者可通過其他鍵(模擬標(biāo)準(zhǔn)肽鍵的鍵距和空間方向)來連接起來。
本發(fā)明的試劑的肽序列可使用本領(lǐng)域已知的方法例如HPLC和色譜來合成然后純化。
在第五個方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明第三個或第四個方面所定義的試劑用于藥物的用途。因此，試劑可被包裝和呈現(xiàn)為藥物用途。
在第六個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第一個或第二個方面所述試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途。
“增殖性失調(diào)”包括任何關(guān)于以不適宜速率和/或在個體的機體中不適宜位置的細胞增殖和/或生長的病狀，例如癌癥、生殖性癌癥、良性前列腺增生、子宮內(nèi)膜異位、子宮纖維化。
應(yīng)該認識到由于本發(fā)明的試劑能夠引起程序性細胞死亡(即細胞凋亡)和細胞周期停滯，該試劑可用于防止和/或減少細胞增殖，從而可用于治療任何有關(guān)不適宜細胞增殖和/或生長的病狀。
優(yōu)選地，增殖性失調(diào)為動物的癌癥，更優(yōu)選地，癌癥為生殖性癌癥。
優(yōu)選地,動物為人類,但是可以是任何哺乳動物例如家養(yǎng)哺乳動物(優(yōu)選為具有農(nóng)業(yè)上或商業(yè)上重要性的，包括雞、貓、狗、豬、綿羊、母牛、馬)。
更優(yōu)選地，癌癥選自婦科癌癥、前列腺癌、良性前列腺增生、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌。在本發(fā)明的這個方面的特別優(yōu)選的具體實施方式
中，癌癥為前列腺癌或良性前列腺增生。
所有表達GnRH受體的癌癥均可使用本發(fā)明的試劑進行潛在地治療。優(yōu)選地，癌癥為生殖性癌癥(包括前列腺、子宮內(nèi)膜、子宮頸、卵巢和乳癌)，這些均表達GnRH受體。其他的表明表達GnRH受體的癌癥包括黑素瘤、胰腺癌和胃癌，除別的以外。優(yōu)選地，癌癥選自婦科癌癥、前列腺癌、良性前列腺增生、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳癌、黑素瘤、胰腺癌、 胃癌。
可在不表達GnRH受體的細胞中誘導(dǎo)GnRH受體的表達和/或在表達GnRH受體的細胞中(其表達水平太低以致于不能使用本發(fā)明的試劑用于治療)增加GnRH受體的表達。 一旦在一個或一個以上細胞中將GnRH受體的水平誘導(dǎo)和/或增加至適合于使用本發(fā)明的試劑進行治療的水平，則可使用本發(fā)明的試劑對一個或一個以上細胞進行治療。
誘導(dǎo)細胞中基因表達的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，可通過激活一個或一個以上對轉(zhuǎn)錄啟動子(其對控制細胞中基因組拷貝的GnRH基因的表達有作用)或其元件來誘導(dǎo)細胞中GnRH受體的表達?；蛘撸墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將包含編碼GnRH受體序列(具有或沒有能夠知道GnRH受體表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件)的聚核苷酸分子(例如cDNA或載體)引入細胞中并在其中進行表達。例如，可通過將聚核苷酸分子偶聯(lián)至配體(配體能夠與靶細胞上或靶細胞中表達的受體相結(jié)合)把聚核苷酸分子引入靶細胞(例如癌細胞)。例如，可將聚核苷酸分子通過聚賴氨酸結(jié)合而偶聯(lián)至EGF配體從而把聚核苷酸分子引入表達EGF (內(nèi)皮細胞生長因子)的一些癌細胞。或者，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法通過病毒載體(例如腺病毒)將聚核苷酸分子引入細胞。
檢測細胞蛋白表達的方法在本領(lǐng)域是熟知的。適合于檢測GnRH受體表達的方法包括原位雜交和/或PCR以檢測編碼GnRH受體的mRNA的存在、放射性配體結(jié)合以檢測 GnRH受體蛋白的存在和有關(guān)能夠特異性地與GnRH受體結(jié)合的抗體的方法(例如，免疫雜交、免疫組化、免疫熒光和ELISA)。
在第七個方面，本發(fā)明提供了防止和/或減少一個或一個以上細胞增殖的方法， 該方法包括將有效量的根據(jù)本發(fā)明第一個或第二個或第三個或第四個方面所述試劑與一個或一個以上細胞結(jié)合。
“有效量”包括足以減少一個或一個以上細胞(例如癌細胞)增殖的本發(fā)明的試劑的數(shù)量。可在體外通過使用在實施例中所描述的方法來確定有效量(例如，用于監(jiān)測細胞存活率、胸苷攝入、磷脂酰肌醇積累和配體結(jié)合親和力的方法)。
優(yōu)選地，細胞為人類或動物體的細胞。更優(yōu)選地，動物是任何哺乳動物例如家養(yǎng)哺乳動物(優(yōu)選為具有農(nóng)業(yè)上或商業(yè)上重要性的，包括雞、貓、狗、豬、綿羊、母牛、馬)。
在第八個方面，本發(fā)明提供了包含選自如下肽序列的試劑
w) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ；
x ) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ；
y) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ；
z) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A ；
其中，Y是DAla. NH2或Z ;且A選自
Z;或
azaGly ;或
azaGly. Z ;或
DAla. Z -M
Glu. Z -M
DAla-Glu. Z ;或
DAla-DAla. Z ;或
Mla.Z;或
Pro ;或
Pro. Z -M
DAla-Gly. Z ;或
Gly. Z,
其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
優(yōu)選地，Z具有小于200的分子量，優(yōu)選為小于150，優(yōu)選為小于100。優(yōu)選地，Z是 NHR’，其中R’是H或C1至C4烷基或者Z是0R”，其中R”是C1至C4烷基。優(yōu)選地，Z是酰胺。優(yōu)選地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。
優(yōu)選地，A是 azaGly. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。
優(yōu)選地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。
優(yōu)選地，A是 β Ala. NH2。
優(yōu)選地，A Pro. Z，其中Z選自NH2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N-丁胺。
在第九個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含治療上有效量的根據(jù)本發(fā)明第八個方面所述的試劑和藥學(xué)上可接受的載體。
“治療上有效量”包括足以防止和/或減少待治療細胞(例如癌細胞)增殖的本發(fā)明的試劑的數(shù)量?？稍隗w外通過使用在附隨的實施例中所描述的方法來確定有效量(例如， 用于監(jiān)測細胞存活率、胸苷攝入、磷脂酰肌醇積累和配體結(jié)合親和力的方法)。“治療性效應(yīng)”是指任何減輕和/或預(yù)防個體中與疾病相關(guān)的病狀、疾病或病狀的效應(yīng)。用于確定本發(fā)明所述試劑、組合物或藥物的治療性效應(yīng)的合適的檢測對于醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。
“藥學(xué)上可接受的”包括制劑為無菌的和無熱原的。合適的藥學(xué)載體在藥劑學(xué)領(lǐng)域是熟知的。載體必須是“可接受的”，即與本發(fā)明的試劑相兼容且對其接受者無害。通常，載體是水或鹽(無菌的和無熱原的)，但是，也可使用其他的可接受的載體。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可使用注射的緩釋藥物輸送系統(tǒng)進行輸送。 這些經(jīng)特異設(shè)計以減少注射頻率。這樣的系統(tǒng)的例子為Nutropin D印ot，其將重組人類生長激素(rhGH)以生物可降解微小球形成膠囊，一旦注射，可在一段持續(xù)時期內(nèi)緩慢釋放 rhGH。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可通過外科手術(shù)植入的設(shè)備(其直接將藥物釋放到所需位置)來使用。例如，Vitrasert將更昔洛韋(GANCICLOVIR)直接釋放到眼睛以治療CMV視網(wǎng)膜炎。將這個毒性試劑直接應(yīng)用到疾病位置可達到有效的治療而沒有藥物的顯著性的全身副作用。
也可使用電穿孔治療(electroporation therapy,EPT)系統(tǒng)來使用本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物。向細胞傳輸脈沖電場的設(shè)備增加了細胞膜對藥物的通透性，產(chǎn)生顯著性增強的細胞內(nèi)藥物輸送。
也可通過電引入(electroincorporation, EI)來輸送本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物。當(dāng)皮膚表面的直徑達到30微米的小顆粒經(jīng)歷與電穿孔中相同或相似的電脈沖時會發(fā)生EI。在EI中，這些顆粒被驅(qū)使穿過角質(zhì)層而到達皮膚的更深層?？梢运幬锘蚧?qū)︻w粒進行裝載或包被，或者可簡單地作為“子彈”，子彈在皮膚上產(chǎn)生孔，藥物可進入孔。
輸送本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物的替代方法為熱敏感的ReGel注射系統(tǒng)。在體溫以下，ReGel是可注射液體，而在體溫時，它立即形成凝膠庫，緩慢消蝕并溶解入已知的、安全的、生物可降解的聚合物。當(dāng)生物聚合物溶解時活性物質(zhì)隨時間而被輸送。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可經(jīng)口服輸送。過程采用體內(nèi)維生素B12 口服攝取系統(tǒng)來來共傳輸?shù)鞍缀碗摹Ｍㄟ^采用維生素B12攝取系統(tǒng)，本發(fā)明所述核酸、分子和藥物組合物可穿過腸壁。在維生素B12類似物和藥物之間合成了復(fù)合體，該復(fù)合體保留了對復(fù)合體的維生素B12部分中的內(nèi)在因子(intrinsic factor, IF)的顯著性親和力，同時保留了復(fù)合體的活性物質(zhì)的顯著性生物活性。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可通過“特洛伊肽(Trojan peptide)”引入到細胞中。有一類被稱為penetratins的多肽,其具有轉(zhuǎn)移特性,能夠攜帶親水性化合物穿過細胞膜。這個系統(tǒng)允許直接將寡聚肽靶向細胞質(zhì)和細胞核，可以是非細胞類型特異性的和高效的。參見 Derossi 等人(1998), Trends Cell Biol 8,84-87。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述藥物和/或藥物組合物為單位劑量，其含有日劑量或單位、日亞劑量或其合適部分的活性成分。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物通常通過口服或任何非腸道途徑以藥物組合物(包含藥學(xué)上可接受的劑型的活性物質(zhì)，任選的為非毒性的有機或無機酸或堿、加成鹽的形式)的形式來使用。組合物可以不同的劑量使用，取決于順序以及待治療的病人，以及施藥途徑。
在人類治療中，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可單獨使用，但通常是與合適的藥學(xué)賦形劑、稀釋劑或載體(根據(jù)想要的施藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實踐來進行選擇)混合使用。
例如，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可以藥片、膠囊、胚珠、酏劑、溶液或懸浮液的形式(可包含芳香劑或著色劑)經(jīng)口、口腔或舌下使用，用于立即、遲緩或經(jīng)控制的釋放應(yīng)用。也可通過海綿體注射(intracavernosal injection)來使用本發(fā)明所述試劑、藥17
合適的藥片可含有賦形劑例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸，崩解劑例如淀粉(優(yōu)選為玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲纖維素鈉(Croscarmellose Sodium)和一些復(fù)合娃酸鹽，以及成粒黏合劑例如聚乙烯卩比咯燒酮、羥基丙基甲基纖維素(HPMC)、羥基-丙基纖維素(HPC)、蔗糖、凝膠和阿拉伯樹膠。另外， 可包括潤滑劑例如硬脂酸錳、硬脂酸、山崳酸甘油酯和云母。
也可在凝膠膠囊中使用相似類型的固體組合物作為填充物。在這個方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、牛奶糖或高分子量的聚乙二醇。對于水性懸浮液和/或酏劑來說，本發(fā)明的試劑可與下列相組合各種甜味劑或芳香劑，著色物或染料，乳化劑和/或懸浮劑以及稀釋劑例如水、乙醇、聚乙二醇和甘油或其組合。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物也可經(jīng)非腸道使用，例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、頭顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下，或者他們可通過浸劑技術(shù)使用。最好以無菌水性溶液的形式來使用，無菌水性溶液可包括其他物質(zhì)，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使該溶液與血液等壓。如果必要，水性溶液應(yīng)該經(jīng)過合適地緩沖(優(yōu)選為至pH為3至9)。在無菌條件下制備合適的非腸道制劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)容易地實現(xiàn)。
適合于非腸道使用的藥物和藥學(xué)組合物包括水性和非水性無菌注射溶液(可包含抗氧化物、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，這使得制劑與預(yù)期的接受者的血液等壓)，和水性和非水性無菌懸浮液(可包含懸浮劑和增厚劑)。藥物和藥物組合物可以單位劑量或多劑量容器的形式呈現(xiàn)，例如密封的安瓿和小瓶，可貯存于凍干(凍干，lyophilised)的條件下，只需要在使用瞬前加入無菌液體載體，例如用于注射的水)。臨時注射溶液和懸浮液可從以前描述的類型的無菌粉末、顆粒和藥片來制備。
對于人類病人口服和非腸道使用，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物的日劑量水平通常為每個成人10 μ g至500mg (即大約O. I μ g至5mg/kg,假設(shè)成人為IOOkg),以單獨或分開的劑量使用。
因此，例如，本發(fā)明所述試劑的藥片或膠囊可含有合適劑量的活性試劑以單獨施藥或每次施藥兩次或兩次以上(作為合適的)。在任何情況下臨床醫(yī)生將確定什么劑量的試劑對任何個體病人是最合適的，這將根據(jù)特定病人的年齡、體重和反應(yīng)而變化。上述劑量是一般情況下的示例性劑量。當(dāng)然會有這樣的實例高或低劑量范圍是有益的，這落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物也可經(jīng)鼻內(nèi)或通過吸入使用，可以干粉吸入器或氣霧劑噴霧器(來自加壓的容器、泵、噴霧器或霧化器，使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、羥基氟烷烴例如1，I, I, 2-四氟乙烷(HFA 134A3或 1，I, I, 2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3))、二氧化碳或其他合適的氣體)的形式方便的輸送。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單元可通過提供閥來確定以輸送計量的數(shù)量。加壓的容器、泵、噴霧器或霧化器可含有活性試劑的溶液或懸浮液，例如使用乙醇和作為溶劑的推進劑的混合物，還可含有潤滑劑例如失水山梨醇三油酸酯(sorbitan trioleate)。用于吸入器或吹入器的膠囊和彈藥筒(從例如凝膠制備而來)可制成含有本發(fā)明所述試劑和合適的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
優(yōu)選為將氣霧劑或干粉制劑安排成每個計量的劑量或“一陣噴煙”含有合適數(shù)量的本發(fā)明所述試劑以輸送于病人?？梢哉J識到氣霧劑的每日總劑量將在病人之間變化，可以單獨劑量或更通常為以一天之中分開的劑量來使用。臨床醫(yī)生將決定精確的劑量。劑量可與用于藥物布舍瑞林(Buserelin)或布舍瑞林乙酸鹽(合成的GnRH類似物，用于治療前列腺癌和/或良性前列腺增生)的劑量(如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知)類似。
或者，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可以栓劑或子宮托的形式使用，或者他們可以洗劑、溶液、面霜、藥膏或隔離劑的形式在局部應(yīng)用。本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物也可經(jīng)皮膚使用，例如，通過使用透皮貼劑。他們也可通過眼睛途徑使用，特別是用于治療眼睛疾病。
對于眼科用途，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可被制成等壓的、pH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌的鹽的微粉化懸浮液，或優(yōu)選地，制成等壓的、PH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌的鹽的溶液，任選為與防腐劑例如氯化苯二甲烴銨(Benzalkonium Chloride)。或者,他們可制成藥膏例如凡士林 (petrolatum)。
對于局部應(yīng)用到皮膚，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物可被制成合適的含有活性試劑藥膏，活性試劑懸浮于或溶解于例如以下一個或一個以上物質(zhì)的混合物礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯試劑、乳化蠟和水?；蛘?，它們可被制成合適的洗劑或面霜，懸浮于或溶解于例如以下一個或一個以上物質(zhì)的混合物 礦物油、山梨醇酐單硬脂酸酯(sorbitan monostearate)、聚乙二醇、液體石臘、聚山梨醇酷60、十六醇酷臘(cetyl ester wax)、嫁臘硬脂醇(cetearyl alcohol)、2_辛基十二醇 (2-octyldodecanol )、苯甲基醇和水。
適合于在口中局部使用的制劑包括錠劑(lozenge)，其包含在香味基底(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)中的活性成分；錠劑(pastille)，其包含在惰性基底(例如凝膠和甘油，或鹿糖和阿拉伯樹膠)中的活性成分；以及漱口劑(mouth-wash),其包含在合適的液體載體中的活性成分。
通常，在人類中，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物優(yōu)選為通過口服或非腸道使用，這最為方便。
對于獸醫(yī)上的應(yīng)用，本發(fā)明所述試劑、藥物和藥物組合物根據(jù)通常獸醫(yī)實踐作為合適的可接受的制劑來使用，且獸醫(yī)外科醫(yī)生將確定對特定動物來說最合適的劑量制度和施藥途徑。
便利地，制劑為藥學(xué)制劑。
有利地，制劑為獸醫(yī)制劑。
在第十個方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，方法包含或由下列組成向有需要的個體使用有效量的根據(jù)本發(fā)明第一個和/或第二個和/或第三個和/或第四個方面所述試劑和/或根據(jù)本發(fā)明第八個方面所述藥物組合物。
有利地，本發(fā)明所述試劑可靶向腫瘤和/或癌細胞和/或直接向腫瘤和/或癌細胞使用。在一個特別優(yōu)選的具體實施方式
中，癌癥為前列腺癌或良性前列腺增生。
在第十一個方面，本發(fā)明提供了治療增殖性失調(diào)的方法，方法包含或由下列組成 向有需要的個體使用有效量的根據(jù)本發(fā)明第一個和/或第二個和/或第三個和/或第四個方面所述試劑和/或根據(jù)本發(fā)明第八個方面所述藥物組合物。
優(yōu)選地，治療增殖性失調(diào)的方法被用戶化或裁制成適合于特定個體和將被負責(zé)治療醫(yī)生來治療的失調(diào)癥。但是，本發(fā)明所述試劑的有利之處在于它們實質(zhì)上表現(xiàn)出無副作用(如果有一些的話)，因此允許使用普通方法來治療一系列增殖性失調(diào)。
在第十二個方面，本發(fā)明提供了鑒定具有一個或以上對于使用本發(fā)明第一個和/ 或第二個和/或第三個和/或第四個方面所述試劑和/或根據(jù)本發(fā)明第八個方面所述藥物組合物進行的治療具有潛在易感性的細胞的個體的方法，該方法包含或由以下步驟組成
a)提供來自待測個體的樣品，樣品包含一個或一個以上細胞；
b)將樣品與本發(fā)明第一個和/或第二個和/或第三個和/或第四個方面所述試劑和/或根據(jù)本發(fā)明第八個方面所述藥物組合物相組合；
c)確定一個或一個以上細胞的增殖水平；
d)在試劑和/或藥物組合物防止和/或減少一個或以上細胞增殖的情況下，鑒定具有一個或以上對于治療具有潛在易感性的細胞的個體。
優(yōu)選地，細胞為癌細胞。
分子和細胞生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白本發(fā)明所述試劑可被用于鑒定對于使用如此處定義的試劑和/或如此處定義的藥物組合物進行的治療具有潛在易感性的細胞(例如癌細胞)。例如，本發(fā)明所述試劑(與本發(fā)明所述方法和在隨附實施例中所描述的方法相一致)可被用作診斷性反應(yīng)劑以檢測在一個測試樣品中在一個或一個以上細胞(例如癌細胞)中是否存在一個或一個以上GnRH受體，并監(jiān)測一個或一個以上細胞的增殖是否被本發(fā)明所述試劑所防止和/或減少。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說清楚的是鑒定在一個或一個以上細胞中是否存在一個或一個以上GnRH受體和對一個或一個以上細胞增殖的防止和/或減少可用來指征這樣的細胞將對于使用本發(fā)明所述試劑和/或藥物和/或藥物組合物進行的治療具有易感性。
從待測個體中獲得包含一個或一個以上細胞(例如癌細胞)的樣品的方法對醫(yī)藥和外科領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，可通過取得組織或器官的活組織檢查或通過吸取液體材料(例如血液、淋巴或腹膜液)來獲得。這樣的方法用于例如篩選乳癌和卵巢癌個體。
在第十三個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第一個和/或第二個和/或第三個和/或第四個方面所述試劑的方法，該方法包括或由化學(xué)合成肽序列的步驟組成。合成如此處定義的試劑的方法包括如上所述的那些。


優(yōu)選地，將通過提及以下圖示來描述包括本發(fā)明的一些方面的非限定性實施例。
圖IA :表達GnRHR的四個不同的HEK293細胞系(具有或缺少C末端尾巴)和野生型細胞經(jīng)過GnRH I持續(xù)處理5天之后，GnRH I對細胞數(shù)目的效應(yīng)。在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。每條曲線為至少三個單獨實驗的和，其中每個點以三次重復(fù)進行確定，顯示了 S.E.M作為誤差條。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化(hGnRHR:人類 GnRHR ；hGnRHR/cfGnRHR :帶有鯰魚 GnRHR 尾巴的人類 GnRHR ；rGnRHR :大鼠 GnRHR ；rGnRHR/ TRHR :帶有大鼠TRHR尾巴的的大鼠GnRHR)。注意在除了 GnRHR受體之外的所有的GPCR中存在的加入的細胞內(nèi)尾巴消除了 GnRH I的抗增殖效應(yīng)。
圖IB :在兩個表達rGnRHR (左邊)或rGnRHR/TRHR (右邊)的HEK293細胞系中由 IOOnM的GnRH I引起的ERK的激活圖譜。條帶顯示了在代表性western雜交中使用特異性抗-磷酸化ERK1/2抗體在全細胞裂解物中獲得的信號。每個柱狀圖中的條形代表從至少兩個獨立實驗獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)，S.E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中的最大的ERK 激活對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖2A :暴露于IOOnM的GnRH I或GnRH II的HEK293/rGnRHR細胞中胸苷攝入的時間過程。對照細胞未經(jīng)處理。所顯示的圖標(biāo)為至少兩個單獨實驗的代表，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E. M作為誤差條顯示。以最大的胸苷攝入對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖2B :暴露于 IOOnM 的 GnRH I (左邊)或 GnRH II (右邊)的 HEK293/rGnRHR 細胞中PARP (細胞調(diào)往的標(biāo)志)切割的時間過程。條帶顯示了在代表性western雜交中使用特異性抗-經(jīng)切割PARP抗體在全細胞裂解物中獲得的信號。所顯示的數(shù)據(jù)為至少兩個獨立實驗的代表。
圖 3 :在 HEK293/rGnRHR 細胞中由 GnRH I (A)或 GnRH II (B)所誘導(dǎo)的對 PARP 切割的抑制。在完全細胞培養(yǎng)液中以IOOnM的激動劑和不同的化學(xué)抑制劑(對于個體的濃度參見方法部分)對細胞進行共處理48小時。然后，制備粗細胞裂解提取物，用特異性的抗-經(jīng)切割PARP抗血清免疫雜交確定PARP的切割。柱狀圖中的每個條形代表從至少三個獨立實驗獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)，S. E. M作為誤差條顯示。
圖4A :HEK293/rGnRHR細胞中GnRH I和GnRH II的競爭性結(jié)合曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大的特異性結(jié)合對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4B :HEK293/rGnRHR細胞中GnRH類似物的競爭性結(jié)合曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大的特異性結(jié)合對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖5A HEK293/rGnRHR細胞中GnRH I和GnRH II的總磷酸肌醇積累曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大反應(yīng)對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖5B :HEK293/rGnRHR細胞中GnRH類似物的總磷酸肌醇積累曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大反應(yīng)對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6A :HEK293/rGnRHR細胞中GnRH I和GnRH II的抗增殖曲線。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S.E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6B :HEK293/rGnRHR細胞中GnRH類似物的抗增殖曲線。細胞以激動劑持續(xù)處理 5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖7A HEK293/hGnRHR細胞中GnRH I和GnRH II的總磷酸肌醇積累曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大反應(yīng)對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖7B :HEK293/hGnRHR細胞中GnRH類似物的總磷酸肌醇積累曲線。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以每個數(shù)據(jù)系列中最大反應(yīng)對計數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8A :HEK293/hGnRHR細胞中GnRH I和GnRH II的抗增殖曲線。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S.E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8B :HEK293/hGnRHR細胞中GnRH類似物的抗增殖曲線。細胞以激動劑持續(xù)處理 5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖9 :肽24、26和28對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖10 :肽21對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖11 :肽4和6對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖12 :肽11和27對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖13 :肽10、11、15和23對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個,其中每個點代表三次重復(fù)的平均值,S. E. M作為誤差條顯示。以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖14 :肽13,65和66對HEK293/hGnRH細胞增殖的抑制(如表3中所指定)。細胞以激動劑持續(xù)處理5天，然后在臺盼藍溫育之后，使用血球計對活細胞進行計數(shù)。曲線代表至少三個獨立實驗中的一個，其中每個點代表三次重復(fù)的平均值，S. E.M作為誤差條顯示。 以未經(jīng)處理的細胞數(shù)目對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
本說明書中對以前發(fā)表的文獻的列舉或討論不應(yīng)該被認為是承認該文獻為現(xiàn)有技術(shù)的一部分或者是公知常識。
為了更完全的描述本申請相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，在本申請中引用了幾個公開和專利文獻。這些引用中每個均在這里引入作為參考。
具體實施方式
實施例I-實驗數(shù)據(jù)
材料和方法
材料
GnRH I 和GnRH II 購買自 Sigma-Aldrich Co. Ltd. (Poole,Dorset,UK)。經(jīng)改造的 GnRH 類似物購買自 Roger Roeske (University of Indiana, Indianapolis, USA)?？?憐酸化 ERK1/2 和抗 ERK2 抗血清購買自 New England Biolabs (UK) Ltd. (NEB ；Hitchin, Herts, UK)?？?經(jīng)切割聚[ADP核糖]聚合酶(PARP)抗體(Asp214/Gly215 ;人類特異性的)購買自 Cell Signalling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA)。所有的二抗購買自 Sigma?；瘜W(xué)抑制劑JNK抑制劑II、TO98059 (MEK抑制劑)、SB203580 (p38MAPK抑制劑)、 渥曼青霉素(wortmannin) (PI-3K抑制劑)、除莠霉素A (herbimycin A)(酪氨酸激酶抑制劑)、PP2 (Src 抑制劑)、AG1478 (EGFR 抑制劑)、U_73122 (PLC 抑制劑)、Ro-31_8220 (PKC 抑制劑)和G0 6983 (PKC 抑制劑)購買自 Calbiochem (Calbiochem/Merck Biosciences Ltd.； Nottingham, East Midlands, UK),而 PTX(Gi 抑制劑)來自 BiomoKBiomol International ； Exeter, Devon, UK)、2_APB (2氨基乙基-二苯基硼酸鹽)(IP3誘導(dǎo)的Ca2+釋放的抑制劑) 來自Sigma。
細朐培養(yǎng)
表達不同的GnRH受體構(gòu)建體的穩(wěn)定的HEK293細胞系屬于實驗室貯藏且已用于其他的研究(例如Heding等人，1998)。細胞在37°C下加濕的5%C02空氣中在補充了 10%胎牛血清、2%谷氨酸鹽和1%青霉素(10, 000單位/ml) /鏈霉素(10, 000 μ g/ml)的Dulbecco’ s modified Eagles medium (DMEM) (Sigma)中保持。細胞在37°C下在含有血清的培養(yǎng)液中以不同的分子濃度和時間長度進行處理，如圖解中所標(biāo)示。所用的用于研究PARP切割機理的化學(xué)抑制劑的濃度為5 μ M JNK抑制劑ΙΙ、20μΜ PD98059、20yM SB203580、25nM渥曼青霉素、200ng/ml PTX、I μ M 除莠霉素 Α、5 μ M ΡΡ2、10 μ MAG1478、5 μ M U-73122、IOOnM Ro-31-8220、I μ M Go 6983 和 20 μ M 2-APB。
免疫雜交
在6孔板中刺激細胞之后，將細胞單層置于冰上，在冰冷的Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液(DPBS)中洗滌兩次并在基于NP-40的溶解緩沖液(5mM HEPES、O. 25M NaCl, O. 5%NP-40、10% 甘油、2mM EDTA, pH8. OUmM PMSF、0. 01mg/ml 亮抑酶肽(leup印tin)、ImM Na2 VO4進行裂解。通過離心(15，OOOrpm) 15分鐘對溶解層進行澄清。將50 μ I等分試樣的澄清全細胞裂解液與等體積的2x Laemmli樣品緩沖液混合，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離并轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜(NEN Life Sciences/PerkinElmer Life and Analytical Sciences ；Beaconsfield, Bucks, UK)。這些膜在 4% 的牛血清白蛋白、50mM Tris-HCl，pH 7. 0,0. 05%Tween_20和O. 05%NP_40封閉溶液中進行封閉。磷酸化的ERK1/2以 1: 1，000稀釋的抗-磷酸化特異性ERKI/2兔子多克隆抗體(NEB)進行檢測。細胞凋亡通過 4°C下以1:1，000稀釋的抗-經(jīng)切割PARP兔子多克隆抗體溫育PVDF膜并緩慢振動過夜進行檢測。通過接下來的將針對未磷酸化形式的ERK2(NEB)的抗血清應(yīng)用到一抗剝離(primary antibody-stripped)的免疫雜交來對這些反應(yīng)的程度進行標(biāo)準(zhǔn)化。在所用的情況下使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG(Sigma)作為二抗。使用酶聯(lián)化學(xué)突光(Amersham Biosciences Ltd.； St. Giles, Bucks, UK)進行蛋白顯不并使用 Typhoon9400Phosphorimager 進行定量。
細胞存活性和數(shù)目
對于第一個方法，將表達不同的GnRH受體構(gòu)建體的HEK293細胞植于12孔PLL包被的板，每孔50，000個細胞(1ml)，持續(xù)暴露于GnRH培養(yǎng)5天，每天加入新鮮的肽。用血球計對臺盼藍排除的細胞進行計數(shù)。對于第二個方法，將細胞植于96孔板，每孔5，000個細胞(100μ 1)，用和以前所描述過的完全相同的方法進行處理。直接向每個孔加入10μ I WST-I 反應(yīng)試劑(Roche Diagnostics Ltd. ；Lewes, East Sussex, UK), 37°C下 3 小時之后， 使用微量滴定板ELISA讀數(shù)器在450nm處(在690nm處作參考)針對背景對照讀出吸光度。
胸苷攝入測定
除去24孔PLL包被的板中細胞生長的培養(yǎng)液，向每個孔加入完全新鮮培養(yǎng)液中的0. 5 μ Ci的[3Η]胸苷(Amersham)。溫育過夜，然后除去培養(yǎng)液，以Iml PBS洗滌細胞三次，置于室溫下0. 5ml 0. INNaOH中15分鐘。然后將提取物轉(zhuǎn)移至閃爍小瓶，加入 2ml 的 Optiphase “HiSafe 3” 雞尾酒(PerkinElmer),在 liquid scintillationl450ffallac Micro Beta TriLux counter 中對 3H 計數(shù)進行測定。
結(jié)合測試
80pM[125I] [His5, D_Trp6]GnRH I 與表達 GnRH 受體的 HEK293 的特異性結(jié)合計算為在各種未標(biāo)記配體不存在和存在的情況下，GnRH I結(jié)合數(shù)量的差異。在含有80pM放射性配體(100，OOOcpm)和10-6-10-12M未標(biāo)記配體的結(jié)合緩沖液(IOmM HEPES,在DMEM中含 1%BSA)中溫育生長于12孔PLL包被的板中的細胞單層。在4°C下溫育4小時后達到平衡。 然后在0. IMNaOH中裂解細胞,在1261Wallac MultiGamma counter中測定提取物中的放射活性。
總磷酸肌醇的積累
以不含肌醇的DMEM (Sigma)中的I μ Ci/ml myo_[H3]肌醇(Amersham)對生長于 12孔PLL包被的板中的穩(wěn)定表達不同的GnRH受體的HEK293細胞進行預(yù)標(biāo)記48小時。在實驗?zāi)翘欤詼y試緩沖液(140mM NaCl、20mM HEPES、8mM glucose,4mM KClUmM MgCl2UmM CaCl2Umg/ml BSA)洗滌細胞，以IOmM LiCl (在測試緩沖液中)預(yù)溫育細胞30分鐘，以不同濃度的肽(在同樣的緩沖液中)在37°C下刺激細胞I個小時。通通過除去培養(yǎng)液來終止溫育，在冰冷的IOmM蟻酸中裂解細胞30分鐘。以陰離子交換樹脂(AG 1_X8，Bio-Rad) 使用IM蟻酸銨和0. IM蟻酸通過色譜來提取磷酸肌醇。向最終洗脫液中加入液體閃爍劑， 在計數(shù)器中測定[3Η]磷酸肌醇。
數(shù)據(jù)分析
條形圖和曲線通過Prism 3. O (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)來獲得。用非線性回歸分析來確定IC50和EC50值。曲線在單位點模型中進行最優(yōu)擬合。所顯示的圖代表至少三個獨立實驗的一個，其中每個點代表三次重復(fù)數(shù)值的平均值，作為誤差條顯示平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M)，除非另有指明。以圖示說明中所指明的對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化。
結(jié)果
缺少C末端尾巴是對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞生長抑制的受體要求
據(jù)我們所知，抑制表達GnRH同類受體的細胞生長的能力是只在GnRH中所清晰描述的特性，由于I類GnRH受體(GnRHR)是唯一的缺少細胞內(nèi)C末端尾巴的G蛋白偶聯(lián)受體，我們假設(shè)GnRH抑制細胞生長的能力是由GnRHR的這個獨特的特點所賦予的。我們比較了 GnRH I對四種不同的HEK293細胞系(穩(wěn)定表達人類GnRHR、大鼠GnRHR和兩種嵌合受體，所述嵌合受體包含具有鯰魚GnRHR尾巴的人類GnRHR和具有TRH受體(TRHR)尾巴的大鼠GnRHR)以及野生型HEK293細胞生長的效應(yīng)。在GnRH I持續(xù)處理5天之后通過對細胞進行計數(shù)來確定細胞生長。加入C末端尾巴抑制了 GnRH I對兩種表達嵌合體的細胞系的效應(yīng)(圖1A)。GnRH I沒有抑制過量表達鯰魚GnRHR或TRHR的HEK293細胞的生長 (數(shù)據(jù)未顯示)。我們未能檢測野生型HEK293細胞(內(nèi)源地表達腎上腺素的、LPA和內(nèi)皮素(endothelin)受體)經(jīng)他們相應(yīng)的激動劑刺激后對生長的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。所有提及的受體表達通過結(jié)合測試或western雜交來確定(數(shù)據(jù)未顯示)。我們也排除了 II類 GnRHR的存在，因為135-18肽(其為I類受體拮抗劑但是為II類受體激動劑)阻斷了 GnRH I的抗增殖效應(yīng)，且未誘導(dǎo)磷酸肌醇的累積或者對這些細胞的生長抑制。
ERK脫敏圖譜
由于不存在C末端尾巴，GnRHR不迅速脫敏，這導(dǎo)致延長的PLCβ激活(例如 McArdle 2002)。我們決定研究缺少迅速脫敏是否對其他的與GnRH的抗增殖/細胞凋亡特性更加相關(guān)的反應(yīng)同樣適用。表達大鼠GnRHR或大鼠GnRHR/TRHR嵌合體的HEK293細胞以 IOOnM GnRH I進行不同時間的處理,通過western雜交來確定ERK的激活。如圖IB中所示，在表達缺少C末端尾巴的細胞中ERK的激活更加持續(xù)。
DNA合成的抑制伴隨的細胞凋亡產(chǎn)牛細胞牛長的抑制
我們研究了 GnRH對表達大鼠受體的HEK293細胞的生長抑制是由于對細胞增殖的抑制還是由于細胞凋亡的誘導(dǎo)。在一個方面，我們使用了有放射活性的胸苷攝入基因組來追蹤96小時內(nèi)的細胞增殖。相對于未經(jīng)處理的細胞來說，以GnRHI和更清楚的，GnRH II (IOOnM)持續(xù)處理減少了 DNA復(fù)制(圖2A)。在另一個方面，我們通過監(jiān)測聚[ADP-核糖]聚合酶(PARP)(其為caspase 3的底物)檢測了細胞凋亡。使用這個結(jié)果，GnRH II (IOOnM) 誘導(dǎo)的細胞凋亡在第一次處理之后24小時立即確定地表現(xiàn)出來，而GnRH I在同樣的條件下至少需要48小時來誘導(dǎo)對PARP的切割(圖2B)。在細胞質(zhì)中經(jīng)切割的PARP的增加與細胞核中經(jīng)切割的PARP的增加成比例(數(shù)據(jù)未顯示)，所以為了技術(shù)上的簡便，我們只是常規(guī)地檢測了澄清的全細胞裂解物。
細胞凋亡的分子機理
利用在HEK293/rGnRHR細胞系中的PARP檢測所獲得的相對迅速和強烈的信號的優(yōu)勢，我們使用一大組化學(xué)抑制劑研究了介導(dǎo)這個效應(yīng)的細胞內(nèi)機理。以亞匯合 (subconfluence)來培養(yǎng)細胞,在完全培養(yǎng)液中在抑制劑不存在或存在的情況下以IOOnM 激動劑對細胞進行處理48小時。然后，將細胞裂解并以特異性抗經(jīng)切割PARP抗體進行 western雜交，如以前所解釋的那樣。如圖3中所示，五個抑制劑阻斷了超過50%的總的由激動劑誘導(dǎo)的 casp-一 ° 激活；即 PD98059 (17±6 ; 14± 13)、除莠霉素 A (9±1;41±4)、 PP2 (20±4;18±2) Go 的83 (47±22 ;35± 18)和 AG1478 (13± 10 ;18± 11)(括號中的數(shù)字為剩余的分別由GnRH I和GnRH II誘導(dǎo)的PARP的切割的平均值土S. E. M. )。JNKII抑制劑也減少了由GnRH I和GnRH II誘導(dǎo)的細胞凋亡，但是程度較低(84±29 ;72 ±22)。順便提及，一些抑制劑的結(jié)果應(yīng)該經(jīng)過仔細的分析，因為細胞毒性(SB203580和2-APB其本身引起顯著性PARP切割)或在個別測試中巨大的差異性(SB203580、PTX和渥曼青霉素)。
類似物相對于細胞生長抑制的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系
因此，GnRH II似乎在誘導(dǎo)同樣的細胞系的抗增殖和細胞凋亡上比GnRH I更加有效。十肽GnRH I和GnRH II在三個氨基酸上不同，因此GnRH II可看做是GnRH I的類似物。我們決定研究GnRH的類似物相對于其抗增殖/細胞凋亡效應(yīng)的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，由此建立第一個這個類型的報告。將三個不同的氨基酸(即His5、Trp7和Tyr8)個別地引入或成對地引入GnRH I序列中，產(chǎn)生介于GnRH I和GnRH II中間的六個不同的結(jié)構(gòu)類似物。
通過確定在持續(xù)5天暴露于肽之后的細胞數(shù)目來評估抗增殖/細胞凋亡。平行地， 將這個反應(yīng)與經(jīng)典的由GnRH肽誘導(dǎo)的Gq偶聯(lián)的ΡΙΧβ激活(通過非常明確的磷酸肌醇沉積程序進行測定)相比較。在兩個ΗΕΚ293細胞系(一個為表達大鼠受體的，另一個為表達人類受體的)中確定了兩個結(jié)果。在研究中包括了人類細胞系，因為這個物種可能具有更高的臨床相關(guān)性，其非常低的受體表達可更好的反映體內(nèi)腫瘤狀態(tài)。事實上，由于結(jié)合較弱，不能夠確定類似物在這個細胞系上的精確的親和力。
所有的類似物的親和力準(zhǔn)確地與它們的刺激磷酸肌醇積累的能力相關(guān)，但是不與它們的產(chǎn)生抗增殖/細胞凋亡的能力相關(guān)(表1-2，圖4-8)。為了解釋這一點，在大鼠受體上，GnRH I比GnRH II的激活PLC β的能力強4. 7倍，但是GnRH II的誘導(dǎo)細胞死亡的能力強13. O倍(表1，圖5Α和6Α)。類似地，在人類受體上，GnRH I比GnRH II的激活PLC β 的能力強6. 2倍，但是GnRH II的誘導(dǎo)細胞死亡的能力強6. 7倍(表2，圖7Α和8Α)，[His5] GnRH I表現(xiàn)出比GnRH I更高的親和力(表1，圖4B)，導(dǎo)致對所研究的兩個反應(yīng)來說更好的能力(表I-2，圖5B、6B、7B和8B )。明顯地，這個類似物是曾經(jīng)描述過的抗增殖/細胞凋亡性試劑中最強的。向GnRH I中引入Trp7沒有改變天然肽的親和性和激活PLCβ的能力(表 1-2，圖4Β、5Β和7Β)。但是，[Trp7]GnRH I比GnRH I的抑制表達大鼠和人類受體的細胞生長分別強9. I倍和19. 3倍(表1-2，圖6B和8B)。GnRH I中的Arg8被Tyr8取代是唯一的改變，這個改變導(dǎo)致產(chǎn)生最具選擇性的抗增殖/細胞凋亡類似物。在大鼠受體上，[Tyr8] GnRH I與GnRH I相比，其刺激PLC β的能力弱27. 3倍，但是抑制細胞生長的能力強4. 2倍 (表1，圖5Β和6Β)。類似地，在人類受體上，這個類似物刺激PLC β的能力弱23. 7倍，但是抑制細胞生長的能力強10. 7倍，同樣是相對于天然肽來說(表2，圖7Β和SB)。顯著地，雖然這個類似物表現(xiàn)出非常低的親和性(表1，圖4Β)，它仍然比GnRH I具有更強的產(chǎn)生細胞死亡的能力。在位置5引入His的兩個雙突變肽，即[His5, Trp7]GnRH I和[His5, Tyr8] GnRH I，表現(xiàn)出的表型大致上可由單一取代來解釋。因此，[His5，Trp7]GnRH I具有與GnRH I相似的親和性和刺激PLC β的能力，但是具有改善的抗增殖/細胞凋亡能力(表1-2，圖 4Β、5Β、6Β、7Β 和 8Β)。[His5, Tyr8]GnRH I 表現(xiàn)出介于 GnRH I 和[Tyr8]GnRH I 之間的特點(表1-2，圖4B、5B、6B、7B和8B)。由于Tyr8取代而喪失的親和力和接下來的降低的刺激 ΡΙΧβ的能力似乎可通過His5的引入(His5的引入引起單一 [His5]GnRH I類似物中增加的親和性)而部分獲得恢復(fù)。如所預(yù)料的，[His5，Tyr8]GnRH I比GnRH I (和[Tyr8]GnRH I)的抑制細胞生長的能力強。最后，[Trp7，Tyr8]GnRH I的特點幾乎和[Tyr8]GnRHI的一樣(表 1-2，圖 4B、5B、6B、7B 和 8B)。
表I. HEK293/rGnRHR細胞中天然的和突變的GnRH肽的IC50值(來自競爭性結(jié)合實驗)和對于磷酸肌醇(IP)積累的EC50值和對細胞生長的抑制
權(quán)利要求
1.一種包含選自以下肽序列的試劑w) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ； x)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ； y) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ； z) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A ； 其中，Y是NHEt或NH2或DAla. NH2或Z ;且A選自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或 DAla-Glu. Z ;或 DAla-DAla. Z ;或 3 Ala. Z ;或 Pro ;或 Pro. Z ;或 DAla-Gly. Z ;或 Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑，其中Z是NH2或NHEt。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑，其中肽序列選自wl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. NHEt ；xl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；yl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；zl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH20
4.一種用于藥物的包含肽序列pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro_A的試劑，其中 a)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或 b)Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 c)Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或 d)Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 e)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或f)Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ； 且其中A選自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或.3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
5.一種用于藥物的包含妝序列 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr/His_Gly-Leu/Trp-R4-Pro-A的試劑，其中R4是除了精氨酸以外的任何氨基酸，且A選自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其中R4選自丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、色氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項所述的試劑，其中Z是NH2或NHEt。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項所述的試劑，其中肽序列選自 al) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH2 ；bl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；cl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2 ；dl) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；el) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2或f I) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH20
9.一種包含以下肽序列的試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途pLGlu-LHi s-LTrp-LSer-LHi s-X-LTrp-LTyr-LPro-A，其中 X 是 D-氨基酸殘基，且 A 選自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z， 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中X選自D-精氨酸、D-賴氨酸、D-色氨酸、D-賴氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-絲氨酸。
11.一種包含選自以下肽序列的試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途i)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ；ii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LTyr-LPro-A ；iii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LGln-LPro-A ；iv)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LLeu-LPro-A ；v)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；v-B ) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LArg-LPro-A ；vi)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；vii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；viii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ；ix)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ；x)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；xi)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LLeu-LArg-LPro-A ；xii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTyr-LLeu-LArg-LPro-A ；xiii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DAla-LTrp-LTyr-LPro-A ；xiv)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A， 其中Y是NHEt或NH2或DAla. NH2或Z ;且A選自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu.Z ;或 DAla-Glu. Z ;或 DAla-DAla. Z ;或 3Ala. Z ;或 Pro ;或 Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項所述的用途，其中Z是NH2或NHEt。
13.一種用于藥物的如權(quán)利要求9至12任一項所定義的試劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑，其中肽序列選自i-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；ii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；iii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LGln-LPro-Gly. NH2 ；iv-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LLeu-LPro-Gly. NH2 ；v-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；v-2)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LArg-LPro-Gly. NH2 ；vi-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DTrp-LTrp-LArg-LPro-Gly. NH2 ；vii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DLys-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；viii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. NHEt ；ix-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；x-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LArg-LPro-Gly. NH2 ；xi-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；xii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTyr-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；xiii-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DAla-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；xiv-1)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-Gly. . NH20
15.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的試劑在制備用于治療增殖性失調(diào)的藥物中的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求9至12任一項或15所述的用途，其中所述的增殖性失調(diào)為動物的癌癥。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述的癌癥為生殖性癌癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的用途，其中所述的動物選自人、雞、貓、狗、豬、綿羊、母牛、馬。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18任一項所述的用途，其中所述的癌癥選自婦科癌癥、前列腺癌、良性前列腺增生、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌。
20.一種防止和/或減少一個或一個以上細胞增殖的方法，該方法包括將有效量的如權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑與一個或一個以上細胞結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中細胞是人類或動物體的細胞。
22.一種藥物組合物，其包含治療上有效量的如權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑和藥學(xué)上可接受的載體。
23.一種治療癌癥的方法，該方法包括向有需要的個體使用有效量的如權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑和/或如權(quán)利要求22所述的藥物組合物。
24.一種治療增殖性失調(diào)的方法，該方法包括向有需要的個體使用有效量的如權(quán)利要求i至14任一項所定義的試劑和/或如權(quán)利要求22所述的藥物組合物。
25.一種鑒定具有一個或以上對于使用如權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑和/或如權(quán)利要求22所述的藥物組合物進行的治療具有潛在易感性的細胞的個體的方法，該方法包含以下步驟 a)提供來自待測個體的樣品，樣品包含一個或一個以上細胞； b)將樣品與權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑和/或如權(quán)利要求22所述的藥物組合物結(jié)合； c)確定一個或一個以上細胞的增殖水平； d)在試劑和/或藥物組合物防止和/或減少一個或以上細胞增殖的情況下，鑒定具有一個或以上對于治療具有潛在易感性的細胞的個體。
26.根據(jù)權(quán)利要求20或25所述的方法，其中細胞為癌細胞。
27.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求I至14任一項所定義的試劑的方法，包括化學(xué)合成肽序列的步驟。
28.一種實質(zhì)上如這里所描述的包含GnRH受體結(jié)合部分的試劑的用途。
29.一種實質(zhì)上如這里所描述的試劑。
30.一種實質(zhì)上如這里所描述的防止和/或減少一個或一個以上細胞或癌細胞增殖的方法。
31.一種實質(zhì)上如這里所描述的藥物組合物。
32.—種實質(zhì)上如這里所描述的治療增殖性失調(diào)或癌癥的方法。
33.一種實質(zhì)上如這里所描述的鑒定具有一個或以上對于治療具有潛在易感性的細胞或癌細胞的個體的方法。
34.一種實質(zhì)上如這里所描述的用于鑒定預(yù)防和/或減少細胞增殖的試劑的方法。
35.一種實質(zhì)上如這里所描述的產(chǎn)生試劑的方法。
全文摘要
本申請涉及GNRH(促性腺激素釋放激素)肽衍生物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，取代GnRH I(促性腺激素釋放激素)肽序列的位置5和／或7和／或8的氨基酸殘基，以及特別地除去位置8的精氨酸殘基可引起增強的抗增殖活性。而且，在GnRH II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸殘基可引起增強的抗增殖活性。這個令人驚奇的發(fā)現(xiàn)提供了用于治療抗增殖性失調(diào)例如癌癥的有力的和選擇性的試劑。
文檔編號C07K7/06GK102977188SQ20121044720
公開日2013年3月20日 申請日期2007年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者R·P·米勒, S·R·莫茲利, R·洛佩斯德馬圖拉納加門迪亞 申請人:醫(yī)療研究局