專利名稱：一種高純度他克莫司的制備方法
他克莫司為白色結(jié)晶，熔點(diǎn)127 129°C，旋光度-84. 4° (c=l. 02，三氯甲烷)。溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，難溶于己烷或石油醚，不溶于水。
他克莫司具有抑制抗體的產(chǎn)生和移植物的排斥作用及白細(xì)胞介素IL-2、IL-3和干擾素IFN-r的產(chǎn)生(海峽藥學(xué)，2010，22 (11) :148 150)。他克莫司的免疫抑制作用比環(huán)孢素A(CsA)強(qiáng)50 100倍(中華器官移植雜志，2000，21 (4) :245 247)，因而大大降低了臨床使用劑量，可降低原治療費(fèi)用1/3 1/2，同時(shí)不良反應(yīng)也明顯降低，用于心臟、肺臟移植有很好效果。
美國專利US2006142565報(bào)道了一種純化他克莫司的方法，該方法將他克莫司的提取液通過XAD1180樹脂三次純化后，收集他克莫司純度高的部分，用乙酸乙酯萃取后濃縮，加入乙酸乙酯、環(huán)己烷和水進(jìn)行結(jié)晶，并重復(fù)結(jié)晶2 3次，得到HPLC純度為99. 84%的他克莫司產(chǎn)品，收率僅為32. 6%。該方法步驟繁瑣，需用樹脂進(jìn)行3次純化后，再用溶劑結(jié)晶 2 3次，收率很低。
Lee 等(Lee S Y, et al. J Microbinl. Bintechnol. 1997, 7, 278 281)報(bào)道了他克莫司發(fā)酵液用二氯甲烷萃取，萃取液濃縮后再用乙酸乙酯結(jié)晶。該方法的缺點(diǎn)是萃取劑二氯甲烷不但毒性大，而且沸點(diǎn)低，萃取劑回收率低，造成生產(chǎn)成本較高。Arai ( ARAI一種局純度他克莫司的制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及藥品原料的制備方法，具體涉及到一種從發(fā)酵菌絲體中分離純化他克莫司的制備方法。
背景技術(shù)：
他克莫司(tacrolimus),又名FK506,是一種從筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)產(chǎn)生的23元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類的免疫抑制劑，分子式為C44H69NO12，分子量為 804. 02，結(jié)構(gòu)式如下M. . J. Antibint. Ser. A 1959,13,46 56)描述了一種他克莫司的制備方法，用丙酮萃取發(fā)酵液后將萃取液濃縮，得到他克莫司的粗晶體，然后再用甲醇對他克莫司的粗晶體的溶液結(jié)晶。該方法的缺點(diǎn)是他克莫司在甲醇溶液中非常容易生成11，11’ -二甲氧基他克莫司，造成結(jié)晶收率低，雜質(zhì)含量高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種高純度的他克莫司的制備工藝，該方法工藝簡單、質(zhì)量可靠，收率高，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)藥用級(jí)他克莫司原料的生產(chǎn)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種高純度他克莫司的制備方法，包括以下步驟1)用體積百分濃度為80 95%的極性溶液對他克莫司發(fā)酵液分離所得的菌絲體進(jìn)行浸泡，然后再對浸泡液進(jìn)行固液分離得到他克莫司浸提液，2)再將此他克莫司浸提液用水稀釋至極性溶液體積百分濃度為25% 40%，然后將稀釋后的浸提液通過大孔脫色樹脂柱進(jìn)行脫色處理，得他克莫司脫色液；3)將他克莫司脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，然后用極性溶劑與水的混合溶液對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行梯度解吸，得到他克莫司一次解吸液；4)濃縮一次解吸液，并用乙酸乙酯或者乙酸丁酯萃取，然后分液并濃縮乙酸乙酯相或者乙酸丁酯相，得到他克莫司粗提物；5)將他克莫司粗提物用極性溶劑溶解，注入納米聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，將濃度大于98. 5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；7)將上述二次解吸液濃縮并加入有機(jī)溶劑結(jié)晶，然后固液分離干燥后即得到他克莫司精粉。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟I)的浸泡過程中每千克菌絲體加入2 4升 85 95%的極性溶液。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟2)脫色處理中所使用的大孔脫色樹脂柱為 LX-900或者LSA-700大孔脫色樹脂柱；所述步驟3)中大孔吸附樹脂柱為XF-800或者DlOl 大孔吸附樹脂柱。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟3)中對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的體積百分濃度分別為40 50%和80% 90%本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟6)中對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的體積百分濃度分別為45 55%和80% 85%。
本發(fā)明所述極性溶劑的進(jìn)一步限定在于所述極性溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇的其中一種。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述納米聚合物微球?qū)游鲋械募{米聚合物微球是納米聚苯乙烯微球或者納米聚苯乙烯衍生物微球。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述聚合物納米微球?yàn)镻S-30型納米聚合物微球或PSA-30型納米聚合物微球。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟7)中的有機(jī)溶劑為丙酮或乙酸丁酯，丙酮或乙酸丁酯的加入量為濃縮后的二次解吸液體積的2 8倍。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于所述步驟7)中的二次解吸液濃縮后的他克莫司濃度為 120mg/mL 150mg/mLo
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于本發(fā)明的制備高純度他克莫司的方法工藝簡單、質(zhì)量可靠，收率高，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)藥用級(jí)他克莫司原料。本發(fā)明的方法中通過使用大孔脫色樹脂對他克莫司浸提液進(jìn)行脫色，可以有效去除他克莫司浸提液中大部分的色素，提高浸提液的澄清度和質(zhì)量。通過再次使用大孔吸附樹脂對他克莫司進(jìn)行富集和純化，進(jìn)一步摒棄了發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的干擾，提高目的產(chǎn)物的質(zhì)量。再通過使用納米聚合物微球分離純化他克莫司，可大幅度提高產(chǎn)品的純度。大孔吸附樹脂與納米聚合物微球解吸過程均采用非連續(xù)的梯度解吸法，低濃度的解吸劑可除去大部分色素和強(qiáng)極性雜質(zhì)，之后采用高濃度的解吸劑解吸，使解吸液的質(zhì)量得到大幅的提高。利用本發(fā)明的方法所得的他克莫司純度可達(dá)99. 5%以上，全程總收率大于70%。
本發(fā)明的方法通過使用定量的高濃度的極性溶液對他克莫司菌絲體進(jìn)行浸泡，使菌絲體中所帶有的他克莫司發(fā)酵液的色素及其它雜質(zhì)與菌絲體充分分離，便于后續(xù)的脫色及去雜處理。本發(fā)明解吸所用的極性溶劑以及結(jié)晶用的有機(jī)溶劑均可以使用常規(guī)溶劑，它們毒性小，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I :他克莫司的液相色譜圖；圖2 :他克莫司的13C-NMR圖譜；圖3 :他克莫司的1H-NMR圖譜；圖4 :他克莫司的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例僅用于闡述實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。除非特別言明，本發(fā)明中所有百分比均為體積百分比。
本發(fā)明所使用的他克莫司發(fā)酵液為華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司用微生物培養(yǎng)手段得到的。乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯等試劑均為市售。XF-800、D101型大孔吸附樹脂，山東東大化學(xué)工業(yè)公司。LX-900，LSA-700型脫色樹脂，西安藍(lán)曉科技有限公司。聚合物納米微球?yàn)樘K州納微科技公司生產(chǎn)。本發(fā)明使用的高效液相色譜儀為996型檢測器，515泵(Waters公司)。
實(shí)施例I首先是取發(fā)酵單位為487μ g/mL的他克莫司發(fā)酵液10L，將他克莫司發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，使他克莫司發(fā)酵液固液分離，得到3. Ikg菌絲體。在此菌絲體中加入95%的乙醇溶液6.2L，浸泡、攪拌I小時(shí)后對此溶液進(jìn)行真空抽濾，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀釋上述他克莫司浸提液至乙醇體積百分濃度為30%，將此經(jīng)稀釋的浸提液通過裝量為500mL 的LX-900大孔脫色樹脂柱進(jìn)行脫色，所得的脫色液再導(dǎo)入XF-800大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，所用大孔吸附樹脂柱的樹脂裝量為500mL，導(dǎo)入的流速750mL/h。然后將吸附有他克莫司的XF-800樹脂柱先用750mL體積濃度為40% (V/V)的乙醇水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗滌， 然后再用濃度為85%的乙醇水溶液作為流動(dòng)相洗滌至他克莫司洗脫完畢，洗滌過程中控制乙醇水溶液的流速為750mL/h，這樣即得到他克莫司的一次解吸液。
將上述他克莫司一次解吸液進(jìn)行減壓濃縮，然后再用乙酸乙酯萃取、分液，然后再將所得的乙酸乙酯相濃縮，得到他克莫司粗提物6. Sg。將他克莫司粗提物用34mL乙醇溶解，將溶液注入至500mL的PS-30型納米聚合物微球?qū)游鲋?，然后首先?00mL體積濃度為45%的乙醇水溶液作為流動(dòng)相洗滌，再用體積濃度為80%的乙醇水溶液作為流動(dòng)相洗滌， 直至他克莫司解吸完畢；解吸過程中分段收集PS-30柱下解吸液，并分段對PS-30型柱下液進(jìn)行HPLC檢測，將他克莫司濃度大于等于98. 5%的解吸液合并，即得二次解吸液。將所得的二次解吸液減壓濃縮成30mL，此時(shí)溶液中的他克莫司濃度為138mg/mL，然后向此濃縮液中加入240mL乙酸丁酯，混勻后，靜置結(jié)晶8h，然后經(jīng)過濾、干燥，即得他克莫司精粉3. 55g。 他克莫司精粉HPLC純度為99. 58%，生產(chǎn)過程中的總收率未72. 59%。
實(shí)施例2本實(shí)施例首先是取發(fā)酵單位為491 μ g/mL的他克莫司發(fā)酵液30L，將他克莫司發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，使他克莫司發(fā)酵液固液分離，得到9. 4kg菌絲體。在上述菌絲體中加入85% 的異丙酮28. 2L，浸泡、攪拌I小時(shí)后對此溶液進(jìn)行真空抽濾，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀釋上述他克莫司浸提液至異丙酮體積百分濃度為25%，將此經(jīng)稀釋的浸提液通過裝量為2000mL的LSA-700大孔脫色樹脂柱進(jìn)行脫色，所得的脫色液再導(dǎo)入DlOl大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，所用大孔吸附樹脂柱的樹脂裝量為2000mL，脫色液導(dǎo)入的流速3000mL/ ho然后將吸附有他克莫司的DlOl樹脂柱用3000mL體積濃度為45% (V/V)的異丙醇水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗滌，然后再用濃度為90%的異丙醇作為流動(dòng)相洗滌至他克莫司洗脫完畢，洗滌過程中控制異丙醇流速為2000mL/h，這樣即得到他克莫司的一次解吸液。
將上述他克莫司一次解吸液進(jìn)行濃縮，然后再用乙酸丁酯萃取、分液，然后再將所得的乙酸丁酯相濃縮，得到他克莫司粗提物29. 46g。將他克莫司粗提物用150mL異丙醇溶解，將溶液注入至2000mL的PSA-30型納米聚苯乙烯衍生物微球?qū)游鲋校缓笫紫扔?2000mL濃度為50%的異丙醇作為流動(dòng)相洗滌，再用85%濃度的異丙醇作為流動(dòng)相洗滌直至他克莫司解吸完畢；解吸過程中分段收集PSA-30型柱下解吸液，并分段對PSA-30型柱下液進(jìn)行HPLC檢測，將他克莫司純度大于等于98. 5%的解吸液合并，即得二次解吸液。將二次解吸液減壓濃縮至85mL，使溶液中他克莫司濃度為146mg/mL，然后向此濃縮液中加入170mL 丙酮，混勻后，靜置結(jié)晶8h，然后經(jīng)過濾，干燥，即得他克莫司精粉10. 59g。他克莫司精粉 HPLC純度為99. 61%，總收率達(dá)到71. 61%。
實(shí)施例3本實(shí)施例首先是取發(fā)酵單位為476 μ g/mL的他克莫司發(fā)酵液50L，將他克莫司發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，使他克莫司發(fā)酵液固液分離，得到15. 2kg菌絲體。在上述菌絲體中加入90% 的甲醇60. 8L，浸泡、攪拌I小時(shí)后對此溶液進(jìn)行真空抽濾，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀釋上述他克莫司浸提液至甲醇體積百分含量為40%，將此經(jīng)稀釋的浸提液通過裝量為 2500mL的LX-900大孔脫色樹脂柱進(jìn)行脫色，所得的脫色液再導(dǎo)入DlOl大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，所用大孔吸附樹脂柱的樹脂裝量為2500mL，脫色液導(dǎo)入的流速3750mL/h。然后將吸附有他克莫司的DlOl樹脂柱先用2500mL體積濃度為50% (V/V)的甲醇水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗滌，再用濃度為80%的甲醇作為流動(dòng)相洗滌至他克莫司洗脫完畢，洗滌過程中控制甲醇流速為2500mL/h，這樣即得到他克莫司的一次解吸液。
將上述他克莫司一次解吸液進(jìn)行濃縮，然后再用乙酸乙酯萃取、分液，然后再將所得的乙酸乙酯相濃縮，得到他克莫司粗提物31. 2g。將他克莫司粗提物用156mL甲醇溶解， 將溶液注入至2500mL的PS-30型納米聚苯乙烯微球?qū)游鲋?，然后首先?500mL濃度為55%的甲醇作為流動(dòng)相洗滌，再用82%濃度的甲醇作為流動(dòng)相洗滌直至他克莫司解吸完畢；解吸過程中分段收集PS-30型柱下解吸液，并分段對PS-30型柱下液進(jìn)行HPLC檢測， 將他克莫司純度大于98. 5%的解吸液合并，即得二次解吸液。將二次解吸液減壓濃縮至 170mL,使溶液中他克莫司濃度為123mg/mL,然后向此濃縮液中加入1020mL乙酸丁酯,混勻后，靜置結(jié)晶8h，然后經(jīng)過濾，干燥，即得他克莫司精粉17. 09g。他克莫司精粉HPLC純度為 99. 64%,總收率達(dá)到71. 55%。
實(shí)施例I 3得到的菌絲體、他克莫司粗品及精粉的重量、HPLC純度及收率見表I。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，對菌絲體的浸泡過程中極性溶液可以是85 95%的任意濃度的極性溶液，浸提后再將浸提液稀釋到25% 40%的任意濃度范圍；乙醇使用量可以是每千克菌絲體加入2 4升的任意數(shù)值；對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行第一梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的極性溶劑濃度可以是40 50% (體積濃度)的任意濃度，對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行第二梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的極性溶劑濃度可以是 80% 90% (體積濃度)的任意濃度；對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行第一梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的濃度可以是45 55% (體積百分濃度)的任意濃度，對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行第一梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的濃度可以是80% 85% (體積百分濃度)的任意濃度；二次解吸液濃縮后的他克莫司濃度還可以是120mg/mL 150mg/mL的任意數(shù)值；有機(jī)溶劑丙酮或乙酸丁酯的使用量可以是濃縮后的二次解吸液體積的2 8倍的任意數(shù)值。
權(quán)利要求
1.一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)用體積百分濃度為80 95%的極性溶液對他克莫司發(fā)酵液分離所得的菌絲體進(jìn)行浸泡，然后再對浸泡液進(jìn)行固液分離得到他克莫司浸提液；2)再將此他克莫司浸提液用水稀釋至極性溶液體積百分濃度為25% 40%，然后將稀釋后的浸提液通過大孔脫色樹脂柱進(jìn)行脫色處理，得他克莫司脫色液；3)將他克莫司脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，然后用極性溶劑與水的混合溶液對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行梯度解吸，得到他克莫司一次解吸液；4)濃縮一次解吸液，并用乙酸乙酯或者乙酸丁酯萃取，然后分液并濃縮乙酸乙酯相或者乙酸丁酯相，得到他克莫司粗提物；5)將他克莫司粗提物用極性溶劑溶解，注入納米聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，將濃度大于等于98. 5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；7)將上述二次解吸液濃縮并加入有機(jī)溶劑結(jié)晶，然后固液分離干燥后即得到他克莫司精粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述步驟I) 的浸泡過程中每千克菌絲體加入2 4升85 95%的極性溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述步驟2) 脫色處理中所使用的大孔脫色樹脂柱為LX-900或者LSA-700大孔脫色樹脂柱；所述步驟3)中大孔吸附樹脂柱為XF-800或者DlOl大孔吸附樹脂柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述步驟3) 中對大孔吸附樹脂柱進(jìn)行梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的體積百分濃度分別為40 50%和80% 90%ο
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述步驟6) 中對納米聚合物微球?qū)游鲋M(jìn)行梯度解吸所使用的極性溶劑和水的混合溶液的體積百分濃度分別為45 55%和80% 85%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5任一項(xiàng)所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述極性溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇的其中一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或者5任一項(xiàng)所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于 所述納米聚合物微球?qū)游鲋械募{米聚合物微球是納米聚苯乙烯微球或者納米聚苯乙烯衍生物微球。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述聚合物納米微球?yàn)镻S-30型納米聚合物微球或PSA-30型納米聚合物微球。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于所述步驟7) 中的有機(jī)溶劑為丙酮或乙酸丁酯，丙酮或乙酸丁酯的加入量為濃縮后的二次解吸液體積的 2 8倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或者9任一項(xiàng)所述的一種高純度他克莫司的制備方法，其特征在于步驟7)中的二次解吸液濃縮后的他克莫司濃度為120mg/mL 150mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度他克莫司的制備方法。該方法包括將他克莫司菌絲浸提液通過大孔脫色樹脂脫色，然后將他克莫司脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附、解吸，濃縮解吸液后得到含有他克莫司的粗提物，粗提物用極性溶劑溶解，使用聚合物納米微球?qū)ζ溥M(jìn)行層析分離，再濃縮結(jié)晶干燥即得到高純度的他克莫司產(chǎn)品。本發(fā)明的制備高純度他克莫司的方法工藝簡單、質(zhì)量可靠，收率高，可以達(dá)到70%以上，溶劑消耗少，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)藥用級(jí)他克莫司原料的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D498/18GK102936253SQ20121044747
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者張雪霞, 段寶玲, 任風(fēng)芝, 李寧, 陳書紅, 劉進(jìn)懷, 李曉露, 李麗紅, 成曉迅, 林毅, 王海燕, 張艷立, 朱秀良, 董愛華 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司