專利名稱：一種生產(chǎn)酵母核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)酵母核糖核酸的方法。
背景技術(shù)：
核糖核酸(RNA)普遍存在于動物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，與蛋白質(zhì)生物合成有密切的關(guān)系。微生物來源的RNA及其降解產(chǎn)物核苷酸在醫(yī)藥、食品、保健品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有重要的應(yīng)用價值。酵母核酸又稱為酵母RNA，是從天然酵母中提取的核糖核酸。酵母由于種屬不同，自身所含的核酸(RNA)由3-15%不等，核酸是重要的遺傳物質(zhì)，對生命體的意義非常重大，因此近年來，國內(nèi)外一些酵母生產(chǎn)的大公司，都先后依靠自身的酵母資源對酵母進(jìn)行深加工綜合利用，生產(chǎn)酵母核酸產(chǎn)品。國內(nèi)關(guān)于從酵母菌體提取核糖核酸(RNA)的研究較多。酵母RNA提取主要分3步進(jìn)行1、使核蛋白從細(xì)胞中溶出；2、使雜蛋白變性沉淀；3、等電點(diǎn)沉淀，使核酸與提取液分 離，得到RNA上清液，再調(diào)RNA等電點(diǎn)，使RNA沉淀，經(jīng)干燥得到成品。目前應(yīng)用較多的方法為濃鹽法、稀堿法等。濃鹽法中氯化鈉或者氯化銨等鹽分投入量非常大，一般按照提取溶液10%濃度加入，這樣一方面導(dǎo)致經(jīng)提取核酸后的脫核酵母中鹽分含量極高，達(dá)到20%以上，使其作為飼料銷售困難，產(chǎn)品易吸潮，使RNA的綜合生產(chǎn)成本提高，另一方面，高溫高鹽導(dǎo)致離心機(jī)不銹鋼轉(zhuǎn)鼓腐蝕嚴(yán)重，一臺離心機(jī)目前售價20萬人民幣左右，轉(zhuǎn)鼓是其核心部件，一旦腐蝕整臺設(shè)備報廢，2年不到便需更換一次。如我國專利申請?zhí)?00810228812. 6核糖核酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法中使用的氯化鈉含量是提取液的8-10%。還有如申請?zhí)?01010168980. 8 —步法提取單細(xì)胞蛋白中的核糖核酸和細(xì)胞壁多糖的方法中使用的氯化鈉的濃度為5-18%。申請?zhí)?00810246981. 2選育高核酸酵母、用高核酸酵母制備核糖核酸的方法中使用的氯化鈉濃度為10%。稀堿法工藝，如申請?zhí)?01110080162. 7高密度發(fā)酵高核熱帶假絲酵母生產(chǎn)核糖核酸的方法中強(qiáng)堿氫氧化鈉的使用量是酵母干重的10%，申請?zhí)?9106596. 2利用酒廠廢酵母生產(chǎn)5'-核苷酸的方法中也是使用高濃度堿。利用稀堿法一方面生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的含堿廢水，在后續(xù)的等電點(diǎn)酸沉淀環(huán)節(jié)需消耗比濃鹽法更大量的酸，更為重要的是，使用稀堿法生產(chǎn)的很多“無頭”磷末端缺失的核酸，不利于對核酸需求量最大的核苷酸工業(yè)中5 ;-核苷酸的制備，并且稀堿法核酸顏色相當(dāng)深。稀堿法操作需很小心，堿容易使核糖核酸分子內(nèi)的酯鍵斷裂而成為2 '，3'-核苷酸，使核糖核酸降解而影響收得率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)酵母核糖核酸的方法，包括如下步驟A、取酵母泥，干燥，加水配置成10%濃度酵母粉漿，調(diào)節(jié)pH至2. 0-4.0 ;B、將酵母粉漿調(diào)節(jié)pH至7. 0-8. 0，加熱至高溫提取2_3小時；C、再降溫至常溫，調(diào)節(jié)pH至4. 0-5. 0，分離，得到含粗RNA的輕相和含酸性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相；D、將含粗RNA的輕相，調(diào)節(jié)pH至8_10，50°C靜置保溫30分鐘，分離，得到含RNA的輕相和含堿性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相；E、將含R NA的輕相調(diào)節(jié)pH至7. 0，然后加入溶液體積4%重量的活性白土，靜置；F、用壓濾機(jī)壓濾，濾液泵入等電點(diǎn)沉淀罐，加入6摩爾每升的鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2. 0-3. 0，沉淀，去除上清液，用等體積pH為2. 0-3. O的酸水清洗一遍，去除上清液；G、將RNA沉淀物加水配置成3-4%濃度RNA溶液，重復(fù)步驟F，獲得粗RNA沉淀，力口入乙醇，攪拌，靜置，去除上清液；H、將沉淀，干燥，粉碎過80目篩得酵母核糖核酸，或?qū)⒊恋砑铀渲瞥蓾舛?-4%, pH為7. O的溶液，醇沉或干燥得到核糖核酸鈉鹽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述方法還可以進(jìn)一步包括以下步驟A、取酵母泥，干燥，加水配置成10%濃度酵母粉漿，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，靜置；B、將靜置后的酵母粉漿用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0，加熱至高溫提取2-3小時；C、再降溫至10攝氏度，調(diào)節(jié)pH至4. 8，用分離機(jī)去除酸性蛋白和酵母細(xì)胞，得到含粗RNA的輕相和含酸性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相，將分離的重相干燥得到脫核酵母;D、將含粗RNA的輕相，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8_10，50°C靜置保溫30分鐘，用分離機(jī)去除堿性蛋白和酵母細(xì)胞，重相干燥得到脫核酵母；E、將含RNA的輕相調(diào)節(jié)pH至7. 0，然后加入溶液體積4%重量的活性白土，靜置；F、用壓濾機(jī)壓濾，濾液泵入等電點(diǎn)沉淀罐，加入6摩爾每升鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2. 0，沉淀，排除上清，用等體積pH為2. O的酸水清洗一遍，去除上清液；G、將RNA沉淀物加水配置成3_4%濃度RNA溶液，重復(fù)步驟F，獲得粗RNA沉淀，然后加入乙醇，攪拌10分鐘，靜置，去除上清液；H、將沉淀，干燥，粉碎過80目篩得酵母核糖核酸，或?qū)⒊恋砑铀渲瞥蓾舛?%，pH為7. O的溶液,醇沉或干燥得到核糖核酸鈉鹽。本發(fā)明采用了活性白土作為脫色劑和澄清劑?；钚园淄潦怯谜惩?主要是膨潤土)為原料，經(jīng)無機(jī)酸化處理，再經(jīng)水漂洗、干燥制成的吸附劑，外觀為乳白色粉末，無臭，無味，無毒，吸附性能很強(qiáng)，能吸附有色物質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)。本發(fā)明將其應(yīng)用到粗RNA液中脫色和澄清，使用方法是將粗RNA液置于吸附罐，真空從罐底吸入活性白土。這樣便于活性白土和RNA溶液中各物質(zhì)充分接觸，有利于充分吸附多糖和雜蛋白。雜質(zhì)經(jīng)活性白土吸附后，成品的濁度顯著下降，產(chǎn)品易干燥，干燥過程時間縮短。同時本發(fā)明還采用兩步等電點(diǎn)沉淀，比現(xiàn)有技術(shù)的一步等電點(diǎn)沉淀核酸溶液，進(jìn)一步提高了 RNA的純度。進(jìn)一步的，為降低核酸中的無機(jī)鹽雜質(zhì)和成品中的灰分，本發(fā)明在每次酸沉后對沉淀的粗RNA泥進(jìn)行酸水洗，提高RNA的純度。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟A選用啤酒廠5代以內(nèi)的酵母泥，10°C以內(nèi)保溫槽車運(yùn)抵車間，在5小時內(nèi)進(jìn)行干燥。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述酵母可以是啤酒酵母、高核酸含量(38%)面包酵母、酒精酵母或熱帶假絲酵母等。酵母來源必須新鮮且幼嫩，無論是啤酒廠的廢棄酵母泥或者自己發(fā)酵的面包酵母或假絲酵母。這樣核糖核酸含量高，得到這些原材料后，必須立即加工，避免酵母細(xì)胞自溶，核糖核酸在自身磷酸二酯酶的降解下成為小分子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟A所述的干燥采用滾筒或者噴霧干燥方式。利用滾筒或者噴霧干燥方式在將酵母干燥過程中，對酵母細(xì)胞完整性造成一定的破壞，在酵母細(xì)胞再度復(fù)水過程中，細(xì)胞通透性得到改善，并且在提取前，本發(fā)明將酵母細(xì)胞酸化(調(diào)整PH為3.0)，因?yàn)辂}酸對酵母細(xì)胞壁中的某些成分(主要是多糖和蛋白質(zhì))的作用，改變這些物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使原來結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松，細(xì)胞內(nèi)容物更易泄露出來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟B中采用板式換熱器將物料瞬間升溫至95度，在含蒸汽夾套的提取罐中保溫提取2小時。升溫提取過程中，常規(guī)加熱是利用提取罐的蒸汽夾套加熱，本發(fā)明采用板式換熱器快速將物料溫度從室溫提升到95°C以上，避免提取罐整體加熱時，在60-75°C耗時過長，因?yàn)榇穗A段是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶的適宜酶解溫度，容易使RNA酶解成小分子的核苷酸和核苷，降低收率。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟C中使用板式換熱器將物料換熱至10°C左右， 換熱器中通冰鹽水。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟C或步驟D中中用分離機(jī)進(jìn)行酸性/堿性蛋白和酵母細(xì)胞的去除?，F(xiàn)有技術(shù)中在核蛋白從酵母中抽提出來以后，直接利用酵母分離機(jī)分離脫核酵母。本發(fā)明調(diào)節(jié)pH至4. 8附近，分離出大量的酸性蛋白，然后再調(diào)整PH8-10，利用DP500型或類似碟片式分離機(jī)分離去除堿性蛋白，大大降低了 RNA中蛋白質(zhì)的含量，因此RNA成品純度高。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述將步驟C或步驟D中獲得重相泵入滾筒干燥設(shè)備進(jìn)行干燥得到脫核酵母。該脫核酵母含鹽量極低，可用于飼料和進(jìn)一步制備其他生化原料。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟F或步驟G中需分別將濾液和鹽酸冷卻到5-10°C，然后混合。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟G中所加入的乙醇為粗RNA沉淀的3倍體積95%以上濃度的乙醇。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟G中去除上清液可先用真空吸取上清廢液，沉淀用真空抽濾缸抽濾殘存的廢液。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述步驟G中可采用真空濃縮后醇沉或噴霧干燥獲得核糖核酸鈉鹽。本發(fā)明的核糖核酸提取過程中不外加氯化鈉、氯化銨等鹽類用于改變細(xì)胞的滲透壓，也不加高濃度的氫氧化鈉等堿類物質(zhì)來抽提核糖核酸，提純環(huán)節(jié)利用兩次調(diào)整PH來去除大部分酸性蛋白和堿性蛋白，利用活性白土吸附劑來吸附雜蛋白及多糖物質(zhì)，二次利用等電點(diǎn)沉淀核糖核酸，因此經(jīng)抽提核糖核酸后的脫核酵母粉含鹽量極低，適合于用于飼料，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的酸堿廢水也顯著降低。生產(chǎn)制備的核糖核酸純度高，顏色極淺，呈乳白色，核糖核酸磷末端結(jié)構(gòu)完好，適合于核酸下游工業(yè)5丨-核苷酸的制備，也可制備溶解性能優(yōu)異，低溫即可溶解，溶解后透明的高純度核糖核酸鈉鹽。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :選用啤酒廠5代以內(nèi)的酵母泥，10°C以內(nèi)保溫槽車運(yùn)抵車間，在5小時內(nèi)采用滾筒干燥或者噴霧干燥工藝將啤酒酵母泥干燥制成啤酒酵母粉，在投料罐中用水常溫將此酵母粉配成10%濃度酵母粉漿，用6mol/L鹽酸調(diào)整漿料pH為3. O左右，靜置30分鐘。然后用6mol/L氫氧化鈉調(diào)整漿料pH為7. 0，板式換熱器(上海滬滔換熱設(shè)備有限公司，型號BR6)將物料瞬間升溫至95度，在含蒸汽夾套的提取罐中保溫提取2小時。提取完畢，使用板式換熱器(內(nèi)通冰鹽水)將物料換熱至10°C左右，用6mol/L鹽酸調(diào)整物料pH為4. 8。然后用廣州重型機(jī)械廠D424酵母分離機(jī)進(jìn)行酸性蛋白和酵母細(xì)胞的去除，得到含粗RNA的輕相和含酸性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相，重相泵入滾筒干燥設(shè)備進(jìn)行干燥得到鹽分含量極低的脫核酵母，用于飼料和進(jìn)一步制備其他生化原料。含粗RNA的輕相，用6mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH為8_10，50°C靜置保溫30分鐘，用DP500型或類似碟片式分離機(jī)進(jìn)行堿性蛋白的去除，重相堿性蛋白泵入滾筒干燥設(shè)備進(jìn)行飼料加工。含RNA的輕相轉(zhuǎn)移到吸附罐，并將pH調(diào)整到7. 0，然后加入溶液體積4%重量的活性白土(活性白土使用前70°C以上干燥8小時)，加入方式是利用真空從吸附罐罐底的出料口吸入,靜置20分鐘后。采用廂式壓濾機(jī)壓濾，濾液泵入等電點(diǎn)沉淀罐，將此物料和6摩爾每升鹽酸分別冷卻到5-10°C，然后混合，使混合液的pH為2. 0，沉淀5小時，排除上清，用等體積pH為2. O酸水清洗一遍，真空小心吸出上清。將RNA沉淀物轉(zhuǎn)移到溶解罐，用自來水配置成3-4%濃度RNA溶液(期間用6mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH為7. O)，泵入等電點(diǎn)沉淀罐，將此物料和6摩爾每升鹽酸分別冷卻到5-10°C，然后混合，使混合液的pH為2. 0，沉淀5小時，排除上清，用等體積pH為2. O酸水清洗一遍，真空小心吸出上清。將上述粗RNA沉淀泵入醇洗罐，加入3倍體積95 %以上濃度食用乙醇,攪拌10分鐘，靜置I小時，真空吸取上清廢液。沉淀用真空抽濾缸抽濾殘存的廢液，抽濾完后的RNA裝入金屬小盤，厚度小于3毫米，小盤置于真空干燥箱中低溫干燥8小時，干燥后的物料粉碎至80目左右得成品RNA，亦可將抽濾完后的RNA配制成濃度4%左右，pH為7. O的溶液，真空濃縮后醇沉或噴霧干燥得到溶解性能極佳的核糖核酸鈉鹽。連續(xù)生產(chǎn)數(shù)據(jù)RNA純度(越高越好)，RNA濁度(越低越好)，蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量(越
低越好)是主要考察指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)酵母核糖核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟 A、取酵母泥，干燥，加水配置成10%濃度酵母粉漿，調(diào)節(jié)pH至2.0-4. O ； B、將酵母粉漿調(diào)節(jié)pH至7.0-8. 0，加熱至高溫提取2-3小時； C、再降溫至常溫，調(diào)節(jié)pH至4.0-5. 0，分離，得到含粗RNA的輕相和含酸性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相； D、將含粗RNA的輕相，調(diào)節(jié)pH至8-10，50°C靜置保溫30分鐘，分離，得到含RNA的輕相和含堿性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相； E、將含RNA的輕相調(diào)節(jié)pH至7.0，然后加入溶液體積4%重量的活性白土，靜置； F、用壓濾機(jī)壓濾，濾液泵入等電點(diǎn)沉淀罐，加入6摩爾每升的鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2.0-3.0， 沉淀，去除上清液，用等體積PH為2. 0-3. O的酸水清洗一遍，去除上清液； G、將RNA沉淀物加水配置成3-4%濃度RNA溶液，重復(fù)步驟F，獲得粗RNA沉淀，加入こ醇，攪拌，靜置，去除上清液； H、將沉淀，干燥，粉碎過80目篩得酵母核糖核酸，或?qū)⒊恋砑铀渲瞥蓾舛?_4%，pH為7. O的溶液，醇沉或干燥得到核糖核酸鈉鹽。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 A、取酵母泥，干燥，加水配置成10%濃度酵母粉漿，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，靜置； B、將靜置后的酵母粉漿用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱至高溫提取2-3小時； C、再降溫至10攝氏度，調(diào)節(jié)pH至4.8，用分離機(jī)去除酸性蛋白和酵母細(xì)胞，得到含粗RNA的輕相和含酸性蛋白及酵母細(xì)胞的脫核酵母的重相，將分離的重相干燥得到脫核酵母; D、將含粗RNA的輕相，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8-10，50°C靜置保溫30分鐘，用分離機(jī)去除堿性蛋白和酵母細(xì)胞，重相干燥得到脫核酵母； E、將含RNA的輕相調(diào)節(jié)pH至7.0，然后加入溶液體積4%重量的活性白土，靜置； F、用壓濾機(jī)壓濾，濾液泵入等電點(diǎn)沉淀罐，加入6摩爾每升鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2.0，沉淀，排除上清，用等體積pH為2. O的酸水清洗一遍，去除上清液； G、將RNA沉淀物加水配置成3-4%濃度RNA溶液，重復(fù)步驟F，獲得粗RNA沉淀，然后加入こ醇，攪拌10分鐘，靜置，去除上清液； H、將沉淀，干燥，粉碎過80目篩得酵母核糖核酸，或?qū)⒊恋砑铀渲瞥蓾舛?%，pH為7.O的溶液，醇沉或干燥得到核糖核酸鈉鹽。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟A所述的干燥采用滾筒或者噴霧干燥方式。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟B中采用板式換熱器將物料瞬間升溫至95度，在含蒸汽夾套的提取罐中保溫提取2小吋。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟C中使用板式換熱器將物料換熱至IO V左右，換熱器中通冰鹽水。
6.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干，步驟C或步驟D中用分離機(jī)進(jìn)行酸性/堿性蛋白和酵母細(xì)胞的去除。
7.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干，將步驟C或步驟D中獲得重相泵入滾筒 干燥設(shè)備進(jìn)行干燥得到脫核酵母。
8.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟F或步驟G中需分別將濾液和鹽酸冷卻到5-10°C，然后混合。
9.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干，步驟G中所加入的こ醇為粗RNA沉淀的3倍體積95%以上濃度的こ醇。
10.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟G中去除上清液的方法可先用真空吸取上清廢液，沉淀用真空抽濾缸抽濾殘存的廢液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)酵母核糖核酸的方法，該方法中核糖核酸提取過程不外加氯化鈉、氯化銨等鹽類用于改變細(xì)胞的滲透壓，也不加高濃度的氫氧化鈉等堿類物質(zhì)來抽提核糖核酸，提純環(huán)節(jié)利用兩次調(diào)整pH來去除大部分酸性蛋白和堿性蛋白，利用活性白土吸附劑來吸附雜蛋白及多糖物質(zhì)，二次利用等電點(diǎn)沉淀核糖核酸，因此經(jīng)抽提核糖核酸后的脫核酵母粉含鹽量極低，適合于作為飼料，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的酸堿廢水也顯著降低。生產(chǎn)制備的核糖核酸純度高，顏色極淺，呈乳白色，核糖核酸磷末端結(jié)構(gòu)完好，適合于核酸下游工業(yè)5＇-核苷酸的制備，也可制備溶解性能優(yōu)異，低溫即可溶解，溶解后可得透明的高純度核糖核酸鈉鹽。
文檔編號C07H1/08GK102796732SQ20121029957
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者楚大波 申請人:楚大波