植物微小核糖核酸的提取、制備及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物微小核糖核酸的提取、制備及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物及其用途，所述的植物功能性microRNA是來(lái)源于某一植物的內(nèi)源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】植物微小核糖核酸的提取、制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及提取植物HIiCT0RNA的方法及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]微小核糖核酸(microRNA、miRNA或miR)是一類(lèi)長(zhǎng)約19至23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，在進(jìn)化上高度保守。MicroRNA通過(guò)識(shí)別靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯序列，與之不完全互補(bǔ)，從而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯。作為mRNA強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子，microRNA與生理活動(dòng)密切相關(guān)，涉及生物個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞調(diào)亡及能量代謝等生命活動(dòng)；同時(shí)，microRNA也與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展存在緊密聯(lián)系。
[0003]目前，對(duì)植物microRNA研究都集中在microRNA對(duì)植物本身的調(diào)控作用，包括對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫活動(dòng)的作用。對(duì)研究成果的應(yīng)用則集中于對(duì)植物物種的改良，如調(diào)節(jié)農(nóng)作物在其食用部分對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的表達(dá)。
[0004]專(zhuān)利PCT/CN2010/000677公開(kāi)了源自水稻的MIR164對(duì)植株根系的調(diào)控作用，提出構(gòu)建包括MIR164序列的核酸片段，并將其轉(zhuǎn)入水稻植株，從而獲得根系比普通水稻強(qiáng)大的轉(zhuǎn)基因水稻。專(zhuān)利PCT/IB2010/055600公開(kāi)了上調(diào)包括MIR156的若干microRNAs可提高植物對(duì)環(huán)境脅迫因素的耐受能力，進(jìn)而提高植物的生物質(zhì)、活力和產(chǎn)量。
[0005]目前，現(xiàn)有的研究?jī)H限于植物HiiCT0RNA對(duì)植物本身生理活動(dòng)的調(diào)控作用，但植物microRNA對(duì)動(dòng)物的生理活動(dòng)的調(diào)控作用以及對(duì)植物microRNA的提取還有待研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種具有調(diào)控非植物靶基因的功能的植物microRNA或含有所述microRNA的植物提提取物及其制法和用途。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒定植物功能性microRNA的方法。
[0008]在本發(fā)明第一方面中，提供了一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，所述的植物功能性microRNA是來(lái)源于某一植物的內(nèi)源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控包括抑制(下調(diào))靶基因的表達(dá)、促進(jìn)(上調(diào))靶基因的表達(dá)。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括:藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物；更佳地包括:金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)、胡楊、豇豆、棉花、大白菜或馬鈴薯。
[0012]優(yōu)選地，所述植物為金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)或胡楊；更優(yōu)選地，所述植物為金銀花。[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA種類(lèi)(如豐度列前20位，更佳地前10位的microRNA種類(lèi))。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA包括選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440, MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIRl56 j\ MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914(表 I)。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的植物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的植物提取物包括植物的枝、葉、根、花、果和/或莖的提取物。
[0017]在本發(fā)明第二方面中，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的分離的植物功能性mi croRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物的用途,它(a)用于制備調(diào)控非植物革巴基因的組合物；或(b)用于制備治療非植物靶基因相關(guān)疾病的藥物。
[0018]在另一優(yōu)選例中 ，所述非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因是病原體(包括細(xì)菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述非植物靶基因相關(guān)疾病包括:腫瘤(如肝癌、肺癌);急慢性傳染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如結(jié)核、細(xì)菌性肺炎等的細(xì)菌性疾病，以及病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液與造血系統(tǒng)疾病、如心腦血管疾病的循環(huán)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病)。[0021 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA包括MIR2911。更佳地，所述的藥物用于治療病毒性感冒。
[0022]在本發(fā)明第三方面中，提供了一種組合物，其包含(a)藥學(xué)上可接受的載體或食品學(xué)上可接受的載體以及(b)本發(fā)明第一方面所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物由或基本上由組分(a)和(b)構(gòu)成。
[0024]在另一優(yōu)選例中，組分(b)的含量為組合物總重量0.01_99wt%，較佳地0.l-90wt% (按 microRNA 計(jì))。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述組合物的制備方法包括步驟:將所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而形成所述的組合物。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA來(lái)自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物，并且調(diào)控選自下組的非植物靶基因:細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
[0028]在另一優(yōu)選例中,所述的植物功能性microRNA來(lái)自金銀花、蔣藍(lán)、草大青、馬藍(lán)或胡楊。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0029]在本發(fā)明第四方面中，提供了一種體外非治療性調(diào)控非植物靶基因表達(dá)的方法，其中，非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因，所述方法包括步驟:在本發(fā)明第一方面所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培養(yǎng)含所述靶基因的生物材料，從而調(diào)控所述非植物靶基因的表達(dá)。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的靶基因是病原體(包括細(xì)菌、病毒、衣原體等)的基因。[0031 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物材料包括病毒、細(xì)胞、組織。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA來(lái)自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA來(lái)自金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)或胡楊。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0034]在本發(fā)明第五方面中，提供了一種植物功能性microRNA的鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能，所述方法包括步驟:
[0035](I)提供某一植物的提取物；
[0036](2)檢測(cè)所述提取物中植物內(nèi)源性microRNA的種類(lèi)或水平；
[0037](3)將被檢測(cè)到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進(jìn)行比對(duì)和分析，從而鑒定出具有調(diào)控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因包括基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括藥用植物，果蔬植物。
[0042]在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中挑選提取物中豐度列前20位(更佳地前10位)的microRNA種類(lèi)進(jìn)行比對(duì)和分析。
[0043]在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中挑選比值Lm/La≥130% (較佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA種類(lèi)進(jìn)行對(duì)比和分析，其中Lm為某一植物microRA在提取物中的豐度(或水平)，La為所述植物總microRNA的平均豐度(或水平)。
[0044]在本發(fā)明第六方面中，提供了一種由本發(fā)明第五方面所述的方法所鑒定出的植物功能性microRNA分子。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述microRNA分子包括MIR2911。
[0046]在本發(fā)明第七方面中，提供了一種制備組合物的方法，包括步驟:
[0047]人工合成本發(fā)明第六方面所述的植物功能性microRNA分子；以及
[0048]將所述的植物功能性microRNA分子與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而形成組合物。
[0049]在本發(fā)明第八方面中，提供了一種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制備治療病毒性感冒的藥物。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的提取物(未濃縮或濃縮)中含0.01_100nM(較佳地0.1-20ηΜ)的 MIR2911。
[0051]在本發(fā)明第九方面中，提供了一種預(yù)防或治療疾病的方法，其中所述疾病是與非植物靶基因相關(guān)的疾病，所述方法包括步驟:給需要的對(duì)象施用本發(fā)明第一方面所述分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本發(fā)明第三方面所述的組合物，從而預(yù)防或治療所述的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象包括哺乳動(dòng)物(如人)。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
[0054]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0055]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0056]圖1顯示植物microRNA在金銀花水提液中Solexa測(cè)序結(jié)果。
[0057]圖2A是小鼠灌胃金銀花水提液后，金銀花microRNA在不同時(shí)間點(diǎn)血清中表達(dá)量的Real-time PCR結(jié)果。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為Oh (O小時(shí))、2h(2小時(shí))、4h(4小時(shí))、6h(6小時(shí))。
[0058]圖2B是小鼠灌胃金銀花水提液后，金銀花microRNA在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟和肺中表達(dá)量的Real-time PCR結(jié)果。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為Oh (O小時(shí))、5h (5小時(shí))、IOh (10小時(shí))、15h (15小時(shí))、20h(20小時(shí))、25h(25小時(shí))。
[0059]圖3顯示MIR2911預(yù)測(cè)祀基因的序列分析結(jié)果。mfe表示候選祀基因的最低折疊自由能，mfe絕對(duì)值越大，候選靶基因與Peu-MIR2911序列匹配度越高。
[0060]圖4顯示熒光素酶檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因的結(jié)果。預(yù)測(cè)基因包括ADV基因、HPIV基因、HlNl基因、H5N1基因。
[0061]圖5A是利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因ADV5在MDCK細(xì)胞中的含量。
[0062]圖5B是利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因HlNl在MDCK細(xì)胞中的含量。
[0063]圖5C是利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因H5N1在MDCK細(xì)胞中的含量。
[0064]圖5A、圖5B和圖5C中，“未感染”代表未侵染流感病毒的細(xì)胞；“感染未處理”代表侵染流感病毒且未用任何藥物處理的細(xì)胞；“MIR2911”代表侵染流感病毒且用MIR2911處理的細(xì)胞；“NC”代表侵染流感病毒且用MIR2911的無(wú)義序列RNA處理的細(xì)胞；“達(dá)菲”代表侵染流感病毒且用達(dá)菲(奧塞米韋，特異性流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制藥)處理的細(xì)胞。
[0065]圖6顯示MIR2911在轉(zhuǎn)染MIR2911的HEK 293T細(xì)胞分泌的載有MIR2911的細(xì)胞微粒子中的Real-time PCR結(jié)果。以未轉(zhuǎn)染MIR2911的HEK 293T細(xì)胞分泌的細(xì)胞微粒子作為對(duì)照MV。[0066]圖7A是流感病毒ADV在載有MIR2911的細(xì)胞微粒子處理的HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)量。[0067]圖7B是流感病毒HlNl在載有MIR2911的細(xì)胞微粒子處理的HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)量。[0068]圖7A和圖7B中，以感染流感病毒后不作處理作為空白對(duì)照和未載有MIR2911的細(xì)胞微粒子處理的ffiK 293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。[0069]圖8A顯示小鼠飲用金銀花水提液、金銀花水提液+anti_MIR2911 ( 口服組)、灌肺金銀花水提液+ant1-MIR2911(灌肺組)后，感冒病毒ADV在肺表達(dá)的Real-time PCR結(jié)果。[0070]圖SB顯示小鼠飲用金銀花水提液、金銀花水提液+anti_MIR2911 ( 口服組)、灌肺金銀花水提液+ant1-MIR2911 (灌肺組)后，感冒病毒HlNl在肺表達(dá)的Real-time PCR結(jié)果。[0071]圖9顯示服用金銀花水提液后，人血液中MIR2911的Real-time PCR結(jié)果。[0072]檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為0h(0小時(shí))、lh(l小時(shí))、2h(2小時(shí))、3h(3小時(shí))、4h(4小時(shí))、5h(5小時(shí))、6h (6小時(shí))。
【具體實(shí)施方式】[0073]本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)一種穩(wěn)定存在于植物提取物中的可分離的植物內(nèi)源性microRNA或含有所述microRNA的植物提取物,可用于調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)所述內(nèi)源性miCToRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而用于調(diào)控動(dòng)物的生理病理活動(dòng)。因此，可用于指導(dǎo)制備藥物或功能性食物等。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。[0074]如本文所用，“osa”表示水稻；“peu”表示胡楊。[0075]分離的植物功能性microRNA[0076]本發(fā)明所述的植物功能性microRNA為所述植物內(nèi)源性的microRNA,可穩(wěn)定存在于該植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中。優(yōu)選為所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA種類(lèi)(如豐度列前20位，更佳地前10位的microRNA種類(lèi))。此外，本發(fā)明的microRNA包括各種形式，例如pr1-microRNA、pre-mi croRNA 以及 microRNA 成熟體。[0077]所述植物功能性microRNA的例子包括(但并不限于)選自表1的一種或多種microRNA,尤其是選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916。[0078]在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物；較佳地包括金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)、胡楊、豇豆、棉花、大白菜或馬鈴薯；更佳地，所述植物為金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)或胡楊；最佳地，所述植物為金銀花。[0079]本發(fā)明所述含所述植物功能性microRNA的提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物，例如植物的枝、葉、根、花、果和/或莖的提取物。[0080]提取方法(植物提取物的制法)[0081]本發(fā)明所述的植物microRNA的提取方法主要采用溶劑提取法，即采用溶劑從植物中提取其microRNA。其中，所述的溶劑包括水、親水性溶劑、或其組合。所述組合包括:在水中添加適量的親水性溶劑或在親水性溶劑中添加適量的水。應(yīng)理解，溶劑中還可添加適量的輔助試劑，如pH調(diào)節(jié)劑(如酸或堿)等。
[0082]提取可以在任何適宜的溫度(如常溫~溶劑回流的溫度)下進(jìn)行，優(yōu)選采用浸潰法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)提取法等。
[0083]在提取過(guò)程中，可對(duì)植物進(jìn)行預(yù)處理，例如將植物粉碎或進(jìn)行酶處理(如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、以及夏合酶)等；也可對(duì)提取的混合物進(jìn)行后處理，如將植物用水進(jìn)行提取后，可在提取后的混合物中加入親水性溶劑(如乙醇等)，使得混合物經(jīng)陳化沉淀。
[0084]提取后得到的液體物可直接使用，也可進(jìn)行過(guò)濾、濃縮、干燥(如凍干)等處理后制得固體物，然后再使用。
[0085]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物microRNA的提取方法為水提法。
[0086]例如包括步驟:取適量金銀花，粉碎后，在一定溫度(如室溫~回流)下，將金銀花粉末置于水浴中，加熱若干次(如I~5次)，每次保溫一段時(shí)間(如0.1~10小時(shí))，收集液體，備用。
[0087]或包括步驟:取適量金銀花，粉碎后，在一定溫度(如室溫~回流)下，將金銀花粉末置于水浴中，加熱若干次(如I~5次)，每次保溫一段時(shí)間(如0.1~10小時(shí))，將提取液濃縮至一定體積后，加入適量乙醇，沉淀出大部分的粘液質(zhì)，過(guò)濾，收集濾液，備用。
[0088]檢測(cè)
[0089]對(duì)植物進(jìn)行提取后，收集植物提取物,檢測(cè)提取物中植物microRNA的種類(lèi)及其含量。所用的測(cè)試方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)方法，例如(但不限于)=Solexa測(cè)序技術(shù)，Real-time PCR、RT-PCR、微·陣列芯片、原位雜交、Northern Blotting、恒溫滾環(huán)擴(kuò)增、基于共軛聚合物的microRNA檢測(cè)等。
[0090]所述Solexa測(cè)序技術(shù)方法,優(yōu)選包括步驟:
[0091 ] 收集金銀花組織或湯藥樣本；
[0092]通過(guò)Trizol試劑提取樣本總RNA ；
[0093]進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；
[0094]將接頭引物(adaptor primer)酶聯(lián)在小RNA分子的3’與5，端；
[0095]純化的DNA直接用于集群生成,利用Illumina Genome Analyzer進(jìn)行測(cè)序分析。
[0096]Real-time PCR方法,優(yōu)選包括步驟:
[0097]提取樣本中總RNA，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；
[0098]用植物mi croRNA設(shè)計(jì)引物；
[0099]加入TaqMan探針或者熒光染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0100]檢測(cè)樣本中植物microRNA的量的變化。
[0101]鑒定
[0102]本發(fā)明提供了一種植物功能性microRNA鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能，包括步驟:
[0103](I)提供某一植物(包括藥用植物，果蔬植物)的提取物；
[0104](2)檢測(cè)所述提取物中植物內(nèi)源性microRNA的種類(lèi)或水平；
[0105](3)將被檢測(cè)到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進(jìn)行比對(duì)和分析，從而鑒定出具有調(diào)控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。[0106]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因包括基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因。優(yōu)選地，所述非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因；或所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0107]在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中挑選提取物中豐度列前20位(更佳地前10位)的microRNA種類(lèi)進(jìn)行比對(duì)和分析。
[0108]在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中挑選比值Lm/La≥130% (較佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA種類(lèi)進(jìn)行對(duì)比和分析，其中Lm為某一植物microRNA在提取物中的豐度(或水平)，La為所述植物總microRNA的平均豐度(或水平)。
[0109]由所述方法鑒定出的植物功能性microRNA分子包括MIR2911。
[0110]用途 [0111]本發(fā)明所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物具有如下多個(gè)應(yīng)用:
[0112]一、指導(dǎo)功能性組合物的開(kāi)發(fā)或制造
[0113]本發(fā)明所述組合物的活性成分為所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物。其中，所述的植物功能性microRNA (如MIR2911等)具有調(diào)控非植物靶基因的功能?？捎糜?a)制備調(diào)控非植物靶基因的組合物；或(b)制備治療非植物靶基因相關(guān)疾病的藥物。其中，所述的調(diào)控包括抑制(下調(diào))靶基因的表達(dá)、促進(jìn)(上調(diào))靶基因的表達(dá)。
[0114]在另一優(yōu)選例中，所述非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因；或所述的非植物靶基因是病原體(包括細(xì)菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0115]在另一優(yōu)選例中，所述非植物靶基因相關(guān)疾病包括:腫瘤(如肝癌、肺癌)；急慢性傳染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如結(jié)核、細(xì)菌性肺炎等的細(xì)菌性疾病，以及病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液與造血系統(tǒng)疾病、如心腦血管疾病的循環(huán)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病)。
[0116]組合物
[0117]本發(fā)明所述組合物(包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物)可包含:(a)藥學(xué)上可接受的載體或食品學(xué)上可接受的載體；以及(b)活性成分。
[0118]優(yōu)選地，所述的組合物由或基本上由組分(a)和(b)構(gòu)成。
[0119]在另一優(yōu)選例中，組分(b)的含量為組合物總重量0.01_99wt%，較佳地0.l-90wt% (按 microRNA 計(jì))。
[0120]所述組合物的制備方法包括步驟:將所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而形成所述的組合物。
[0121]現(xiàn)以藥物組合物為例，對(duì)組合物作進(jìn)一步說(shuō)明:本發(fā)明的藥物組合物包含安全有效量范圍內(nèi)的活性成分及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有l(wèi)-2000mg活性成分/劑，更佳地，含有10-200mg活性成分/劑?；蛘吆?.01~100微摩爾活性成分/劑，較佳地為0.1~10微摩爾/劑；較佳地，所述的“一劑”為一口服液。[0122]“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤(rùn)滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫? )、潤(rùn)濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無(wú)熱原水等。
[0123]本發(fā)明組合物的給藥方式包括:口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道給藥。
[0124]本發(fā)明組合物的劑型包括:片劑、膠囊劑、粉劑、丸劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液、混懸液、乳劑、混懸劑、噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑、揮發(fā)性液體、注射液、粉針劑、外用溶液劑、洗劑、澆淋劑、搽劑、巴布膏劑、膏藥、橡膠膏劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏劑、含漱劑、舌下片劑或栓劑。 [0125]優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制備治療病毒性感冒的藥物。較佳地，所述的提取物(未濃縮或濃縮)中含0.01-1OOnM (較佳地 0.1_20ηΜ)的 MIR2911。
[0126]二、指導(dǎo)人工合成植物功能性microRNA
[0127]通過(guò)本發(fā)明所述的方法鑒定出植物中(尤其是植物提取中)存在的植物功能性microRNA,可直接指導(dǎo)技術(shù)人員對(duì)所述microRNA進(jìn)行人工合成,從而提高所述的microRNA的生產(chǎn)。并將合成的植物功能性microRNA分子與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而形成組合物。
[0128]三、體外非治療性調(diào)控非植物靶基因表達(dá)
[0129]在本發(fā)明所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培養(yǎng)含非植物靶基因(如細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因)的生物材料(包括病毒、細(xì)胞、組織)，從而實(shí)現(xiàn)體外調(diào)控所述非植物靶基因的表達(dá)
[0130]在另一優(yōu)選例中，所述的靶基因是病原體(包括細(xì)菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0131]在另一優(yōu)選例中，所述的植物功能性microRNA來(lái)自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物；較佳地，來(lái)自金銀花、菘藍(lán)、草大青、馬藍(lán)或胡楊；更佳地，所述植物功能性microRNA 包括 MIR2911。
[0132]四、疾病預(yù)防或治療方法
[0133]給需要的對(duì)象(如哺乳動(dòng)物或人))施用本發(fā)明所述分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本發(fā)明所述的組合物，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療與非植物靶基因相關(guān)的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因(包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因)的功能。
[0134]在另一優(yōu)選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0135]發(fā)明人通過(guò)對(duì)植物功能性microRNA及其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的存在形式、遞送途徑和功能等一系列研究，1.形成了一套高效、穩(wěn)定地提取植物功能性micix)RNA的方法，提供了一種包含植物功能性microRNA的植物提取物。2.發(fā)現(xiàn)了通過(guò)多種途徑(如攝食或靜脈注射等)，植物(如金銀花等)功能性microRNA可進(jìn)入動(dòng)物體并在血液中富集,并調(diào)節(jié)非植物靶基因，進(jìn)而參與動(dòng)物體(如人)的生理病理活動(dòng)。3.形成了一套鑒定植物功能性microRNA的方法,可用于指導(dǎo)選擇性合成植物功能性microRNA的方法,有利于加快該microRNA的生產(chǎn)；還可用于指導(dǎo)篩選富含植物功能性microRNA的藥材,有利于鑒別藥材的優(yōu)劣。4.形成了一套指導(dǎo)制造功能性食物或藥物的方法:4.1所述方法利用分離的植物功能性mi croRNA或包含植物功能性mi croRNA的植物提取物或篩選出的富含功能性mi croRNA的植物，可用于制造功能性食物或藥物等組合物；4.2所述方法通過(guò)提取植物microRNA并鑒定出植物功能性microRNA，并進(jìn)行所述植物功能性microRNA的人工合成，然后將人工合成的microRNA用于制造功能性食物或藥物。
[0136]本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)包括:
[0137]1.提供了一種分離的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物及其用途。所述microRNA為可調(diào)控非植物靶基因的表達(dá)，具有多種用途(如可作為中草藥有效成分的標(biāo)準(zhǔn)，有利于指導(dǎo)功能性組合物的開(kāi)發(fā)和制造等)。
[0138]2.提供了一種以分離的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物為活性成分的組合物。所述活性成分的作用機(jī)理明確，效果顯著，有利于對(duì)中醫(yī)藥的科學(xué)機(jī)制的探索，且制法簡(jiǎn)單、成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0139]3.提供了一種鑒定植物功能性microRNA的方法。
[0140]下面結(jié)合具體實(shí)施，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0141]實(shí)施例1使用Solexa`測(cè)序技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定存在于金銀花水提液中的植物microRNA
[0142]首先，利用水提法提取金銀花microRNA。取適量(50克)干燥金銀花藥材，在500ml (金銀花質(zhì)量與水體積比為1:10)水的100°C水浴下加熱0.5小時(shí)，提取液在60°C下減壓濃縮至原體積的1/10。收集濃縮及未濃縮金銀花水提液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0143]然后，使用Solexa測(cè)序技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定存在于經(jīng)上述步驟制備出的金銀花水提液中的植物microRNA, Solexa上樣量為IOyg RNA。經(jīng)測(cè)定,未濃縮水提液中總microRNA的濃度約為InM，濃縮水提液中總microRNA濃度約為ΙΟηΜ。
[0144]檢測(cè)結(jié)果顯示，金銀花水提液中穩(wěn)定存在多種植物miCToRNA，能被檢測(cè)到的包括表1中所列出的85種microRNA,其序列詳見(jiàn)表1。其中MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916 含量較高，MIR2911 的含量最高。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。表1中其他75種miRNA在提取物中檢測(cè)出拷貝數(shù)均較低(都在2-1000 之間)。
[0145]表1.穩(wěn)定存在于金銀花中且可檢測(cè)的microRNAs
[0146]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物,其特征在于，所述的植物功能性microRNA是來(lái)源于某一植物的內(nèi)源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能。
2.如權(quán)利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因。
3.如權(quán)利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植物包括:藥用植物、果蔬植物、觀(guān)賞植物。
4.如權(quán)利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物，其特征在于，所述的植物功能性microRNA包括選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIR156j、MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR 166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914。
5.如權(quán)利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植 物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
6.一種權(quán)利要求1所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物的用途，其特征在于，(a)用于制備調(diào)控非植物靶基因的組合物；或(b)用于制備治療非植物靶基因相關(guān)疾病的藥物。
7.一種組合物，其特征在于，包含(a)藥學(xué)上可接受的載體或食品學(xué)上可接受的載體以及(b)權(quán)利要求1所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
8.—種體外非治療性調(diào)控非植物靶基因表達(dá)的方法，其中，非植物靶基因包括細(xì)菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動(dòng)物基因，其特征在于，包括步驟:在權(quán)利要求1所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下,培養(yǎng)含所述靶基因的生物材料，從而調(diào)控所述非植物靶基因的表達(dá)。
9.一種植物功能性microRNA的鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調(diào)控非植物靶基因的功能，其特征在于，包括步驟: (1)提供某一植物的提取物； (2)檢測(cè)所述提取物中植物內(nèi)源性miCToRNA的種類(lèi)或水平； (3)將被檢測(cè)到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進(jìn)行比對(duì)和分析，從而鑒定出具有調(diào)控非植物靶基因的功能的植物功能性microRNA。
10.一種由權(quán)利要求9所述的方法所鑒定出的植物功能性microRNA分子。
11.一種制備組合物的方法，其特征在于，包括步驟: 人工合成權(quán)利要求10所述的植物功能性microRNA分子；以及將所述的植物功能性microRNA分子與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而形成組合物。
12.—種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，其特征在于，用于制備治療病毒性感冒的藥物。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK103589721SQ201210291378
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月15日
【發(fā)明者】張辰宇, 張峻峰, 曾科, 董磊 申請(qǐng)人:北京命碼生科科技有限公司