專利名稱：經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及成骨蛋白(osteogenic protein)的領(lǐng)域,制備經(jīng)改善的成骨蛋白的方法，及利用成骨蛋白治療患者的方法。
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背景技術(shù)：
胱氨酸結(jié)細(xì)胞因子超家族分成數(shù)個(gè)亞家族，包括轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFii)蛋白、糖蛋白激素、血小板衍生生長因子樣(H)GF樣)蛋白、神經(jīng)生長因子(NGF)、及成神經(jīng)細(xì)胞瘤中的分化篩選選擇基因畸變(DAN)家族(例如Cerberus)。其中TGF β超家族包含大約43個(gè)成員，分成三個(gè)亞家族，包括:TGFi3、活化素及骨形態(tài)發(fā)生蛋白/生長分化因子蛋白(BMP/⑶F)。TGF-β超家族成員包含典型的胱氨酸結(jié)拓?fù)?。也就是說，胱氨酸結(jié)是六個(gè)半胱氨酸殘基的非尋常排列的結(jié)果。所述結(jié)是由半胱氨酸1-4、半胱氨酸2-5之間的鍵以及形成環(huán)的間插序列所組成，在半胱氨酸3-6之間的雙硫鍵通過該環(huán)。這些蛋白質(zhì)的活性形式是同型二聚體或異二聚體。在各種情況中，單體拓?fù)涫怯砂腚装彼峤Y(jié)及額外的半胱氨酸穩(wěn)定，導(dǎo)致額外的鏈內(nèi)鍵及/或介導(dǎo)與另一蛋白單位的二聚化。見Kingsley, 1994, Genes Dev.8:133-146 ；Lander et al，2001，Nature 409:860_921。BMP/⑶F是TGF-β蛋白超家族中為數(shù)最多的成員。BMP/⑶F超家族包括但不限于 BMP2、BMP3 (成骨素)、BMP3b (⑶F-10)、BMP4 (BMP2b)、BMP5、BMP6、BMP7 (成骨蛋白-1 或 0P1)、BMP8 (0P2)、BMP8B (0P3)、BMP9 (⑶F2)、BMP10、BMPll (⑶Fl I)、BMP12 (⑶F7)、BMP13 (⑶F6、CDMP2)、BMP15 (⑶F9)、BMP16、⑶F1、⑶F3、⑶F5 (CDMPUMP52)及⑶F8 (肌肉抑制素(myostatin))。BMP有時(shí)是指成骨`蛋白(0P)、生長分化因子(GDF)、或軟骨衍生性型態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)。BMP也存在于其他動(dòng)物物種。另外，在人族群的不同成員之間可能存在一些BMP序列的等位基因差異。天然表達(dá)的BMP是原蛋白質(zhì)(pro-protein),其包含長的原結(jié)構(gòu)域、一或多個(gè)切割位點(diǎn)及成熟結(jié)構(gòu)域。此原蛋白質(zhì)接著藉由細(xì)胞機(jī)制處理以產(chǎn)生二聚體的成熟BMP分子。該原結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為有助于BMP的正確折迭及處理。另外，在一些但非所有的BMP中，該原結(jié)構(gòu)域可能與該成熟結(jié)構(gòu)域非共價(jià)結(jié)合，且可能作為伴護(hù)子，也可能作為抑制子(例如Thics etal., Growth Factorsl8:251-9(2001))。BMP信號(hào)傳導(dǎo)是當(dāng)BMP 二聚體與二個(gè)I型及二個(gè)II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合時(shí)被啟動(dòng)。I型受體包括但不限于ALK-1 (Activin rcccptor-Likc Kinasel (活化素受體樣激酶I))、ALK-2 (亦稱為ActRla或ActRI)、ALK-3 (亦稱為BMPRIa)及ALK-6 (亦稱為BMPRIb)。II型受體包括但不限于ActRIIa(亦稱為ActRII)、ActRIIb及BMPRII。人基因組包含12個(gè)受體絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，包括7個(gè)I型及5個(gè)II型受體，所有這些受體皆與 TGF-β 傳訊有關(guān)(Manning et al., Science298:1912-34 (2002)，該文獻(xiàn)的揭示內(nèi)容以參照方式納入本發(fā)明)。因此，由12個(gè)受體及43個(gè)超家族成員可知，至少某些TGF-β超家族成員與相同受體結(jié)合。在BMP結(jié)合之后，該II型受體使該I型受體磷酸化，該I型受體使轉(zhuǎn)錄因子的Smad家族的成員磷酸化，且使該Smad轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并活化數(shù)種基因的表達(dá)。BMP是TGF-β超家族中為數(shù)最多的成員，他們控制一組廣泛的細(xì)胞性及發(fā)育性過程，諸如胚胎模式形成及組織特異化，亦能促進(jìn)傷口愈合及成人組織的修復(fù)過程。BMP最初是藉由彼等誘導(dǎo)骨及軟骨形成的能力而被分離。BMP傳訊可在骨折及相關(guān)組織傷害時(shí)被誘導(dǎo)，以導(dǎo)致骨再生及修復(fù)。改變對(duì)BMP受體的親和性的BMP分子將具有相較于該原始蛋白質(zhì)改善的生物活性。這些BMP包括具有增加活體內(nèi)活性的蛋白質(zhì)，且可能提供用于(除其它者外)組織再生、修復(fù)、及類似者的潛能改善的治療劑，其中藉由在較低的蛋白量下提供較高或經(jīng)改變的活性，以提供改善的蛋白質(zhì)治療劑。發(fā)明概沭本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，其在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于對(duì)應(yīng)的野生型BMP與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)政變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。在一方面中，該蛋白選自BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8 或 BMP9。在另一方面中，該蛋白在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A、II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B、I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域及上述結(jié)構(gòu)域的任何組合內(nèi)包含至少一種突變。本發(fā)明亦提供一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含氨基酸序列，該氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP2與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。

在一方面中，該突變在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于SEQ ID勵(lì):1序列的￥33汴36、!139和？41處的突變。在另一方面中，該突變是在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于SEQ ID勵(lì):1序列的￥33、？361(、？361 、!1394和？4謂的突變。在又一方面中，該突變是在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:1序列的E83、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99處的突變。在另一其他方面中，該突變是在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:1序列的E83K、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I 的突變。在另一方面中，該突變是在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:1 序列的 H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77和V80處的突變。在又一方面中，該突變是在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:1 序列的 H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P 和 V80A 的突變。在另一其他方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID勵(lì):1序列的各氨基酸!144、？48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77 和 V80 的突變。在另一方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77 和 V80 的突變，其中這些突變是 H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P 及 V80A。在又一方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 處的突變。在另一方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 處的突變，其中這些突變是 V331、P36K、H39A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 及 V99L.
在另一其他方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 的突變。在又一方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 的突變，其中這些突變是 V331、P36K、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 及 V99L.
在又一方面中，該蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 的突變，其中這些突變是 V331、P36R、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 及 V99L.
在另一方面中，該蛋白以不超過約2nM的Kd與ALK2受體結(jié)合，以不超過約2nM的Kd與ALK3受體結(jié)合，以不超過約InM的Kd與ALK6受體結(jié)合，以不超過約2nM的Kd與ActRIIA受體結(jié)合，以不超過約0.5nM的Kd與ActRIIB受體結(jié)合，且以不超過約3.5nM的Kd與BMPRIIA受體結(jié)合。在一方面中，該蛋白另包含不位于該I型或II型結(jié)合區(qū)內(nèi)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸突變。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:8至73中任一者的
氨基酸序列。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:36的氨基酸序列。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:37的氨基酸序列。本發(fā)明包括一種生產(chǎn)經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP蛋白的方法，該BMP蛋白在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于對(duì)應(yīng)的野生型BMP與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。該方法包括將編碼該蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中、在生產(chǎn)該蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞及純化該蛋白。在一方面中，該核酸包含選自SEQ ID N0:74至139中任一者的核酸序列的序列。本發(fā)明包括一種經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP6蛋白，其包含氨基酸序列，該氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP6與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。
在一方面中，該突變是在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4序列的I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68處的突變。在另一方面中，該突變是在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:4 序列的 K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和1124處的突變。在又一方面中，該突變是在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中該突變是至少一種選自對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 4 序列的 S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99 和 PlOO 處的突變。在另一方面中，該突變是對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4序列的各氨基酸殘基I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68處的突變。在另一其他方面中，該突變是氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4的各氨基酸殘基K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123 和 1124 處的突變。在又一方面中，該突變是對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO:4的各氨基酸殘基S72、N76、A77、H78、M79、 N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99 和 P100處的突變。在另一方面中，該經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP6蛋白包含氨基酸序列，該氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP6與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合，該BMP6蛋白另包含不位于該I型或II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸突變。本發(fā)明包括一種經(jīng)分離的核酸分子，其包含編碼選自SEQ ID N0:8至73的序列的氨基酸序列的核苷酸序列。在一方面中，該核酸編碼包含氨基酸序列的蛋白，該氨基酸序列選自SEQ IDNO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID N0:36和SEQ ID NO:37的序列、本發(fā)明包括一種經(jīng)分離的核酸分子，其包含編碼選自SEQ ID N0:74至139的核苷酸序列。在一方面中，該核酸包含選自SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 102和SEQID NO: 103的核苷酸序列。本發(fā)明包括一種生產(chǎn)經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP6蛋白的方法，該BMP6蛋白包含氨基酸序列，該氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP6與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)
八
口 ο該方法包括將編碼該蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中、在生產(chǎn)該蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞及純化該蛋白。本發(fā)明包括一種在有治療需要的患者中治療骨流失相關(guān)性骨疾病的方法。該方法包括投予治療有效量的經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP蛋白至患者藉以治療該患者的骨疾病，該BMP蛋白在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于對(duì)應(yīng)的野生型BMP蛋白與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。本發(fā)明包括一種在有治療需要的患者中治療纖維化的方法。該方法包括投予治療有效量的經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP蛋白至患者藉以治療纖維化，該BMP蛋白在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于對(duì)應(yīng)的野生型BMP與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。本發(fā)明包括一種誘導(dǎo)組織中的骨形成的方法。該方法包括使該組織與經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP蛋白接觸藉以誘導(dǎo)在該組織中的骨形成，該BMP蛋白在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于對(duì)應(yīng)的野生型BMP與該I型或II型受體的結(jié)合，該突變賦予經(jīng)改變的與該I型或II型BMP受體的結(jié)合。附圖簡沭為了說明本發(fā)明的目的，在圖式中描繪本發(fā)明的某些實(shí)施方案。然而，本發(fā)明并不限于在圖式中所描繪的實(shí)施方案的精確安排及儀器設(shè)備。

圖1 (包含A至C圖)顯示各種野生型及經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP氨基酸序列的排比，并顯示(以方框框起)這些蛋白中可能與I型及II型受體交互作用有關(guān)的區(qū)域。圖1A顯示野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8及BMP9的氨基酸序列排比。圖1B顯示各種經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP的氨基酸序列排比，其中該對(duì)應(yīng)的野生型BMP是BMP2。圖1C顯示各種經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP6分子的氨基酸序列排比，其中該對(duì)應(yīng)的野生型BMP是BMP6。圖2以結(jié)構(gòu)模型顯示與二個(gè)I型及二個(gè)II型BMP受體結(jié)合的野生型BMP2同型二聚體。圖3(包含A及B圖)以結(jié)構(gòu)模型顯示在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(圖3A)及大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞(圖3B)中 生產(chǎn)的人BMP2的組氨酸門擋(doorstop) (H54)的位置。圖4(包含A及B圖)說明聚糖系鏈基的位置及潛在的組氨酸(His)門擋。圖4A顯示皆在CHO生產(chǎn)的BMP2中的呈非門擋方向的聚糖系鏈基(在N56處的N-連接聚糖)及組氨酸54，以及該聚糖系鏈基與R16的交互作用。圖4B顯示在BMP6中的聚糖系鏈基(在N80處的N-連接聚糖)及H78處的非門擋構(gòu)型的組氨酸，以及對(duì)應(yīng)BMP2中的R16的R39。圖片上方是BMP2(11-KSSCKRHP)與 BMP6 (35-KTACRKHE)的序列排比，其顯示 BMP2與BMP6之間的對(duì)應(yīng)氨基酸。圖5(包含A至D圖)顯示在純化BMP及經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP的過程中的各種步驟。圖5A的層析圖顯示使用ccllufine硫酸酯管柱的BMP的梯度洗脫液。圖5B為含有來自ccllufinc硫酸酯管柱步驟的樣本組分的考馬斯(Coomassic)染色SDS-PAGE(左側(cè)為非還原，右側(cè)為還原)膠體。圖5C的層析圖顯示來自制備型逆向純化步驟的特性。圖為藉由制備型逆相純化步驟獲得的含有BMP樣本組分的考馬斯(Coomassie)染色SDS-PAGE (左側(cè)為非還原，右側(cè)為還原)膠體。圖6 (包含A至D圖)顯示經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE蛋白膠體，其中包含經(jīng)純化的BMP2野生型及各種如各膠體圖片上方所示的突變。這些膠體是于非還原(圖6A及6B)及還原(圖6C及6D)條件下進(jìn)行分析。圖7顯示在C2C12肌原母細(xì)胞中的堿性磷酸酶分析結(jié)果，其比較野生型BMP2及BMP2/6異二聚體與各種如圖例所示的經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP的成骨活性。圖8顯示表示Smad活性的C2C12BMP-反應(yīng)元件螢光素酶(BRE-螢光素酶)分析的結(jié)果，其顯示BMPE相較于BMP2具有更強(qiáng)的傳訊及相當(dāng)于BMP2/6的傳訊。圖9(包含A及B圖)顯示由各種BMP媒介的異位骨形成。圖9A顯示異位骨的量(計(jì)算為羥磷灰石的毫克數(shù)；mg HA)，其是由肛CT分析測定經(jīng)植入所示劑量(0.1或0.5 μ g)的所示BMP(BMP2、BMPE、及BMP2/6)的各只肢體。圖9B顯示異位骨的量(計(jì)算為涇磷灰石的毫克數(shù))、其是由μ CT分析測定經(jīng)植入所示劑量(0.1或0.5yg)的所示BMP (BMP2、BMPG, BMPA及BMPF)的各只肢體。呈現(xiàn)的資料是來自2個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)。圖10 (包含A至D圖)是放射影像，其顯示在4及8周的非人靈長動(dòng)物(NHP)的腓骨切除模型的結(jié)果。放射影像顯示7只代表性NHP的腓骨，這些動(dòng)物分別接受0.5mg/ml (250 μ g總遞送BMP/肢體)的BMPE及BMPGo每只NHP在對(duì)側(cè)肢體接受相同劑量的WTBMP2。圖1OA及IOB分別顯示各圖上方標(biāo)明的NHP于4周及8周的放射影像，該影像顯示BMPE相較于BMP2野生型的效應(yīng)。圖1OC及IOD分別顯示各圖上方標(biāo)明的NHP于4周及8周的放射影像，該影像顯示BMPG相較于BMP2野生型的效應(yīng)。圖11顯示BMP-E治療肢與BMP-2治療的對(duì)側(cè)肢的骨體積比較。圖12顯示于C2C12肌原母細(xì)胞中的堿性磷酸酶測試結(jié)果，其比較野生型BMP2及BMP-GER、BMP-GEP、及BMP2/6異二聚體的成骨活性。圖13顯示異位骨的量(計(jì)算為羥磷灰石的毫克數(shù))，其是由扯CT分析測定經(jīng)植入所示劑量(0.05 或 0.25 μ g)的所示 BMP (BMP2、BMP2/6、BMP-E, BMP-GER 及 BMP-6)的各只肢體。

圖14顯示異位骨的量(計(jì)算為羥磷灰石的毫克數(shù))，其是由肚CT分析測定經(jīng)植入所示劑量(o0.05 或 0.25μ g)的所示 BMP (BMP2、BMP2/6、BMP-E、BMP-GER 及 BMP-6)的各只肢體。這些結(jié)果來自與圖13所示者分開的實(shí)驗(yàn)。圖15 (包含A及B圖)是放射影像及漫CT影像，其顯示在5及10周的非人靈長動(dòng)物(NHP)的腓骨楔形骨切除模型的結(jié)果。圖15A顯示得自NHP腓骨楔形骨切除模型的5周放射影像。圖15A顯示4只代表性NHP的腓骨影像，這些NHP的-肢體在5周接受0.5mg/ml (250 μ G總BMP遞送/肢)的BMP-GER，對(duì)側(cè)肢體接受WTBMP-2。圖15Β顯示相同肢體在10周的uCT影像，其顯示每只動(dòng)物的BMP-GER治療肢相較于ΒΜΡ2治療對(duì)側(cè)肢具有大型骨痂。圖16 (包含A至C圖)說明比較BMP-GER治療肢與ΒΜΡ-2治療對(duì)側(cè)肢的強(qiáng)度(圖16Α)、硬度(圖16Β)及骨痂體積(圖16C)。圖17 (包含A至C圖)顯示3只非人靈長動(dòng)物(NHP)經(jīng)0.5mg/ml的BMP-GER治療的腓骨隨時(shí)間愈合的放射影像，對(duì)側(cè)肢以1.5mg/ml的BMP-2治療，在楔形缺損模型后使用磷酸鈣基底骨水泥作為載劑。圖17A(上圖)顯示I號(hào)NHP的左臂經(jīng)0.5mg/ml GER治療的下列結(jié)果:第I及2圖分別顯示在剛開始時(shí)間點(diǎn)的LAT(側(cè)面)及AP(前后)影像:第3及4圖分別顯示在2周的LAT及AP影像；第5及6圖分別顯示在4周的LAT及AP影像；第7及8圖分別顯示在6周的LAT及AP影像；第9及10圖分別顯示在7周的LAT及AP影像；第11及12圖分別顯示在8周的LAT及AP影像:圖17A(下圖)顯示I號(hào)NHP的右臂經(jīng)1.5mg/ml BMP-2治療的下列結(jié)果:第I及2圖分別顯示在剛開始時(shí)間點(diǎn)的LAT(側(cè)面)及AP (前后)影像；第3及4圖分別顯示在2周的LAT及AP影像；第5及6圖分別顯示在4周的LAT及AP影像；第7及8圖分別顯示在6周的LAT及AP影像；第9及10圖分別顯示在7周的LAT及AP影像；第11及12圖分別顯示在8周的LAT及AP影像；圖17B顯示2號(hào)NHP的結(jié)果，其說明如圖17A中的I號(hào)NHP ;及圖17C顯示3號(hào)NHP的結(jié)果，其說明如圖17A中的I號(hào)NHP。圖18是結(jié)構(gòu)模型圖，其顯示BMP-E及BMP-6WT晶體結(jié)構(gòu)的代表圖及比較。強(qiáng)調(diào)所解出的聚糖長度的差異，顯示被解出的BMPE的聚糖是遠(yuǎn)長于BMP6所被解出者。這表示該BMPE聚糖相較于BMP6聚糖是更具有構(gòu)型限制性，因此可在此模型中顯像(rendered)較多的聚糖。BMPE及BMP6 二者的組氨酸門擋殘基是呈現(xiàn)類似的非門擋構(gòu)型。同樣地，穩(wěn)定該BMPE聚糖的精氨酸聚糖“系鏈”是以虛線表示，虛線代表該精氨酸與該聚糖的交互作用。圖19是圖18所示的BMPE及BMP6的組氨酸門擋及精氨酸系鏈比較的放大圖。此圖顯示BMPE的H54組氨酸殘基與BMP6的相等組氨酸的類似構(gòu)型，二者皆位于非門擋位置。此圖亦顯示該R16系鏈(經(jīng)由該BMPE聚糖的交互作用)使該聚糖更為堅(jiān)固因此由該模型提供更多細(xì)節(jié)，相較于BMP6的較為“松散”及較無限制的聚糖使較少的BMP6聚糖可見于此模型。此模型圖亦顯示呈現(xiàn)聚糖的N-連接的BMPE的天冬酰胺N56的類似位置，及在相等及類似位置的BMP6的天冬酰胺。該圖亦說明BMPE EllO的潛在的額外聚糖系鏈交互作用，由在該氨基酸殘基與該聚糖遠(yuǎn)端之間的虛線表示。所解出的聚糖長度的差異是經(jīng)強(qiáng)調(diào)，其顯示相較于具有淡色陰影的BMPE的較長聚糖顯像，較少的深色BMP6聚糖可被解出，這表示該BMPE聚糖是較為構(gòu)型約束，因此在結(jié)構(gòu)分析時(shí)顯示較多細(xì)節(jié)。圖20顯示使用C2C12肌原母細(xì)胞的堿性磷酸酶分析結(jié)果，比較BMP_2、BMPE及BMP-6與彼等的經(jīng)Endo-H處理的去糖基化(Dcgly.)對(duì)應(yīng)物的成骨活性。圖21說明顯示BMPE的結(jié)構(gòu)模型，其顯示在R16處的聚糖系鏈基的位置，并顯示在該精氨酸(R16)與谷氨酸(E110，對(duì)應(yīng)BMP2的E109)殘基之間的穩(wěn)定交互作用。該圖顯示R16及EllO 二者皆與該第三(β_甘露糖)及第四(α-甘露糖)聚糖基團(tuán)形成多重氫鍵。該圖亦顯示Η54潛在“門擋”的位置及提供該聚糖的N-連接位點(diǎn)的天冬酰胺56 (Ν56)。圖22顯示使用C2C12肌原母細(xì)胞的堿性磷酸酶分析結(jié)果，該分析比較BMP-E與BMP-E-NR及BMP-GER與BMP-GER-NR在增加劑量的Noggin (ΒΜΡ-2的天然抑制劑)存在時(shí)的成骨活性。該資料顯示包含衍生自活化素的序列的BMP-GER-NR并不會(huì)受到即使高濃度的Noggin的抑制,但是BMP-GER對(duì)于Noggin的抑制敏感。因此,添加衍生自活化素的序列使BMP-GER變成具有Noggin抗性(NR)、這`些結(jié)果顯示至少在此活體外試驗(yàn)中，對(duì)Noggin具敏感性的BMP-GER及BMP正在經(jīng)衍生自活化素的序列取代該蛋白的C端區(qū)域后變成具有Noggin 抗性(NR)。圖23顯示由免疫組織化學(xué)(IHC)測定的經(jīng)特定劑量的所示BMP處理的大鼠異位植入物的骨得分。該資料顯示當(dāng)BMP.GER的C端序列被衍生自活化素的序列取代時(shí)(NR)，該分子的骨形成活性是經(jīng)大幅減低。因此，該資料顯示BMP-GER-NR在活體內(nèi)的活性遠(yuǎn)低于BMP-GER。圖24顯示由免疫組織化學(xué)(IHC)測定的經(jīng)特定劑量的所示BMP處理的大鼠異位植入物的骨得分。該資料顯示當(dāng)BMP-E的C端序列被衍生自活化素的序列取代時(shí)(NR)，該分子的骨形成活性是經(jīng)大幅減低，事實(shí)上該活性完全消失。發(fā)明詳沭本發(fā)明關(guān)于“經(jīng)設(shè)計(jì)的”骨形態(tài)發(fā)生蛋白，在本文稱為“經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP”、“經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白”及“經(jīng)設(shè)計(jì)的蛋白”。本發(fā)明的經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP可能對(duì)應(yīng)野生型未經(jīng)修飾的BMP的氨基酸序列，諸如但不限于BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8及BMP9。在特定實(shí)施方案中，該經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP當(dāng)與彼的對(duì)應(yīng)野生型BMP比較時(shí)顯示經(jīng)改變的與I型及/或II型BMP受體的結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，該經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP當(dāng)與彼的對(duì)應(yīng)BMP比較時(shí)可能經(jīng)修飾以具有經(jīng)改變的半衰期、免疫原性或任何藥物動(dòng)力學(xué)/藥物藥效學(xué)(PK/PD)參數(shù)。定義除非本文另外加以定義，關(guān)于本發(fā)明所使用的科學(xué)性及技術(shù)性用語應(yīng)具有該領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所通常了解的意義、另外，除非內(nèi)文另外要求，單數(shù)用語應(yīng)包括復(fù)數(shù)意義且復(fù)數(shù)用語應(yīng)包括單數(shù)意義。一般來說，與本文所描述的細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng).分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、基因?qū)W以及蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)和雜交有關(guān)所使用的命名法及技術(shù)是該領(lǐng)域所廣為周知且經(jīng)常使用者。本發(fā)明的方法及技術(shù)通常根據(jù)該領(lǐng)域所廣為周知的方法進(jìn)行，除非另外說明否則如同本說明書各處引述及討論的各種一般性及更具體的參考文獻(xiàn)所述。這些參照文獻(xiàn)包括例如 Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2001)、Ausubel et al., Current Protocolsin Molecular Biology, John wiley&Sons, NY(2002)、及 Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY(1990)，彼等以參照方式納入本發(fā)明。酶反應(yīng)及純化技術(shù)是根據(jù)制造商說明書，以該領(lǐng)域經(jīng)常完成或本文所描述的方式進(jìn)行。與本文所述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥化學(xué)有關(guān)所使用的命名和實(shí)驗(yàn)室方法及技術(shù)是該領(lǐng)域所廣為周知且經(jīng)常使用者。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、醫(yī)藥制備、醫(yī)藥調(diào)制、醫(yī)藥遞送及患者治療。如在本發(fā)明的使用，下列用語各具有與在本節(jié)中相關(guān)的意義。冠詞“a”及“an”在本文被用來指稱一或超過一個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞的文法對(duì)象。舉例來說，“一元件”是指一個(gè)元件或超過一個(gè)元件。在此申請案中，“或”的使用代表“及/或”、除非另外說明。習(xí)用標(biāo)記在本文是用來描述多肽序列:多肽序列的左手端是氨基端；多肽序列的右手端是羧基端。本發(fā)明所使用的該20種習(xí)用的氨基酸及彼等的縮寫遵照習(xí)慣用法。見 Immuno]ogy—A Synthesis(2nd Edition, E.S.Golub and D.R.Gren, Eds., SinauerAssociates, Sunderland, Mass.(1991))、其以參照方式納入本文。本發(fā)明所使用的氨基酸是以彼等的全名、對(duì)應(yīng)彼等的三字母代碼或?qū)?yīng)彼等的一字母代碼表示，如下所示:
權(quán)利要求
1.經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP蛋白，其在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于相應(yīng)的野生型BMP與I型或II型受體的結(jié)合，所述突變賦予經(jīng)改變的與I型或II型BMP受體的結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白選自BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8和BMP9。
3.權(quán)利要求1的蛋白，其在下列結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含至少一種突變: a.1I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A ; b.1I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B ; c.1型結(jié)合結(jié)構(gòu)域；及 d.上述結(jié)構(gòu)域的任何組合。
4.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP2與所述I型或II型受體的結(jié)合，所述突變賦予經(jīng)改變的與所述I型或II型BMP受體的結(jié)合。
5.權(quán)利要求4的蛋白，其中所述突變選自: a.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID勵(lì):1序列的￥33、？36、!119和？41處的突變； b.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID 勵(lì):1序列的￥331、？361(、？361 、!139六和？4謂； c.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi) 的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1 序列的 E83、S85、M89、L92、E94、E96、K97 和 V99 處的突變; d.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1序列的E83K、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I; e.在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1 序列的 H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77和V80處的突變；及 f.在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1 序列的 H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P 和 V80A 的突變。
6.權(quán)利要求4的蛋白，其中該蛋白包含選自如下的多種突變: a.對(duì)應(yīng)于SEQ ID 勵(lì):1序列的！144、？48、六52、053、1^55、557、恥8、569、￥70、于町1后插入單一氨基酸、S72、K73、174、A77和V80的各個(gè)氨基酸處的突變； b.(a)的蛋白，其中所述多種突變是!1440、？485、452隊(duì)0534、1^551、5574、恥8!1、56禮、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P 和 V80A ； c.對(duì)應(yīng)于SEQ ID 勵(lì):1序列的￥33、卩36、!139、585、]\189、1^2』94』96、1(97和￥99的各個(gè)氨基酸處的突變； d.(c)的蛋白，其中所述多種突變是 V331、P36K、H39A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 和 V99I: e.對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1 序列的 V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于 N71 后插入單一氨基酸、572、1(73、174、六77、￥80、585、]\189、1^92』94』96、1(97 和 V99的各個(gè)氨基酸處的突變；f.(e)的蛋白，其中所述多種突變是￥331、？361(、!1394、!1440、？485^52隊(duì)0534、1^55皿、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 和 V99I ;及 g.(e)的蛋白、其中所述多種突變是￥331、？361 、!1394、!1440、？485^52隊(duì)0534、1^55皿、S57A、N68H、S69L、V70M、于 N71 后插入 P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N 和 V99I。
7.權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白以不超過約2nM的Kd與ALK2受體結(jié)合，所述蛋白以不超過約2nM的Kd與ALK3受體結(jié)合，所述蛋白以不超過約InM的Kd與ALK6受體結(jié)合，所述蛋白以不超過約2nM的Kd與ActRIIA受體結(jié)合，所述蛋白以不超過約0.5nM的Kd與ActRIIB受體結(jié)合，且所述蛋白以不超過約3.5nM的Kd與BMPRIIA受體結(jié)合。
8.權(quán)利要求1的蛋白，其還包含不位于I型或II型結(jié)合區(qū)內(nèi)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸突變。
9.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其選自包含SEQID NO:8至73中的任意氨基酸序列的蛋白。
10.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含SEQID NO: 12的氨基酸序列。
11.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含SEQID N0:14的氨基酸序列。
12.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含SEQID NO:36的氨基酸序列。
13.經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，其包含SEQID NO:37的氨基酸序列。
14.生產(chǎn)權(quán)利要求1的蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在生產(chǎn)所述蛋白的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及純化所述蛋白。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述核酸包含選自SEQID NO: 74至139中的任一核酸序列的序列。
16.經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP6蛋白，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在至少一個(gè)I型或II型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一種突變，其中相較于野生型BMP6與I型或II型受體的結(jié)合，所述突變賦予經(jīng)改變的與I型或II型BMP受體的結(jié)合。
17.權(quán)利要求16的蛋白，其中所述突變選自: a.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域A內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4 序列的 I57、K60、G61、A63、N65、Y66 和 D68 處的突變; b.在II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4 序列的 K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123 和 1124 處的突變； c.在I型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，其中所述突變是至少一種選自如下的突變:對(duì)應(yīng)于SEQID NO: 4 序列的 S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99 和 PlOO 處的突變； d.對(duì)應(yīng)于SEQID N0:4序列的I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68處的各個(gè)氨基酸殘基的突變； e.對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID N0:4 的 K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和1124處的各個(gè)氨基酸殘基的突變；及 f.對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID N0:4 的 S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99或PlOO處的各個(gè)氨基酸殘基的突變。
18.權(quán)利要求16的蛋白，其還包含不位于所述I型或II型結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸突變。
19.分離的核酸分子，其包含編碼選自SEQID NO: 8至73的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的核酸，所述核酸編碼包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 37 的序列。
21.分離的核酸分子，其包含選自SEQID NO:74至139的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求21的核酸，所述核酸包含選自SEQID NO:78, SEQ ID NO:80、SEQ IDNO: 102和SEQ ID NO: 103的序列的核苷酸序列。
23.生產(chǎn)權(quán)利要求16的蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在生產(chǎn)所述蛋白的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及純化所述蛋白。
24.治療有需要的患者中與骨流失相關(guān)的骨疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求1的經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，由此治療所述患者中的骨疾病。
25.治療有需要的患者中纖維化的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求I的經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白，由此治療纖維化。
26.誘導(dǎo)組織中的骨形成方法，所述方法包括將所述組織與權(quán)利要求1的經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白接觸，由此誘導(dǎo)所 述組織中的骨形成。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)關(guān)聯(lián)受體具有改變的親和性的新型經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白、編碼該蛋白的核酸序列、以及使用其的方法。更優(yōu)選地，所述新型經(jīng)設(shè)計(jì)的成骨蛋白是經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP并且對(duì)關(guān)聯(lián)BMP受體具有改變的親和性。所述經(jīng)設(shè)計(jì)的BMP顯示出改變了的生物學(xué)特征并提供了潛在的新的有效療法。
文檔編號(hào)C07K14/51GK103079585SQ201180040389
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者S·P·貝拉斯, C·T·布朗, M·J·凱恩, V·P·卡拉布羅, Z·S·尤奧, R·V·P·馬蒂內(nèi), H·J·澤赫曼, J·M·沃茲尼 申請人:惠氏有限責(zé)任公司