專利名稱：赭曲霉毒素a雜交瘤細(xì)胞株和抗體與復(fù)合免疫吸附劑和免疫親和柱與試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株、由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其應(yīng)用，由該抗體制得的免疫吸附劑，以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱和試劑盒，及其它們在純化黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物，是一組以二吠喃香豆素為基本結(jié)構(gòu)的化合物。目前已分離鑒定出12種，尤其是黃曲霉毒素B1,B2,GijG2^M1和M2為強污染物質(zhì)，廣泛存在于糧食谷物和飼料及其加工品中，在目前已知的兩百多種真菌毒素中毒性最強、污染頻率最高。黃曲霉毒素具有誘導(dǎo)突變、抑制免疫和致癌的作用。黃曲霉毒素作用的靶器官主要是肝臟，被公認(rèn)為致肝癌物質(zhì)，即使食用含有低水平的黃曲霉毒素食物，長期食用的人其肝臟也將受到損害。國際癌癥中心將其定為一類致癌劑。雜色曲霉素是由雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等產(chǎn)生的一種具有致癌性的真菌毒素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于黃曲霉毒素前體物質(zhì)，可與DNA形成加合物。雜色曲霉素產(chǎn)生菌及雜色曲霉素在世界各地糧食及飼料中的污染很常見。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我國各地糧食中雜色曲霉素的污染非常普遍，其中以小麥最明顯，污染率最高可達(dá)100%。雜色曲霉素可能與胃癌、肝痛的發(fā)生密切相關(guān)。赭曲霉毒素是由赭曲霉和純綠青霉產(chǎn)生的一種霉菌腎毒素,可分為A和B兩種類型，赭曲霉毒素A的毒性較大。赭曲霉毒素在4°C的低溫下赭曲霉即可產(chǎn)生具有毒害作用濃度的赭曲霉毒素。動物攝入Ippm體重劑量的赭曲霉毒素A可在5-6天致死。常見的病變是腎小管上皮損傷和腸道淋巴腺體壞死。飼喂含Ippm濃度赭曲霉毒素的日糧3個月可引起動物煩渴、尿頻、生長遲緩和飼料利用率降低；飼喂含量低至200ppb的日糧數(shù)周可檢測到腎損傷。其他的臨床癥狀還有腹瀉、厭食和脫水。有時臨床癥狀不明顯，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地區(qū)，動物在屠宰時惟一可觀察到的病變是腎蒼白、堅硬。目前，黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的檢測方法主要有薄層層析法，酶聯(lián)免疫法(ELISA)，免疫親和層析-液相色譜法，免疫親和層析-熒光光度法等。其中，薄層層析法要接觸大量的標(biāo)準(zhǔn)品，不利于實驗者的健康，而且靈敏度很低。酶聯(lián)免疫法，只適用于定性檢測，很容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的現(xiàn)象。而免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測許多商品中的黃曲霉毒素的含量。由于該方法靈敏特異，而且不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷等，應(yīng)用越來越廣泛。免疫親和層析方法的關(guān)鍵在于選擇一種高效特異的抗體，但是，利用現(xiàn)有技術(shù)中的液液提取、固相萃取、加熱蒸發(fā)濃縮等方法的添加回收率均較低，對后續(xù)的檢測步驟造成很強的基質(zhì)效應(yīng)，并且現(xiàn)有技術(shù)中沒有能夠同時純化待處理基質(zhì)中6種黃曲霉毒素(BpB2、Gp G2, M1和M2)、雜色曲霉 素和和赭曲霉毒素A的免疫吸附介質(zhì)，而能夠同時純化分析多種病毒素顯然能夠提高檢測的效率。
因此，當(dāng)務(wù)之急，是要制備出性能穩(wěn)定、特異的免疫吸附劑，并建立一種經(jīng)濟(jì)、快捷、精確、安全，并且能同時純化6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞株、由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，由該抗體制得的免疫吸附劑及其在純化和檢測赭曲霉毒素A中的應(yīng)用，以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱(IAC)和試劑盒，及其它們在純化以及檢測黃曲霉毒素B2、Gp G2、MpM2、雜色曲霉素和赫曲霉毒素A中的應(yīng)用，以及具體提供一種純化黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2>M1, M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法和一種檢測黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。本發(fā)明的第一方面是提供一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5505。該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。本發(fā)明的第二方面是提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗赭曲霉毒素A的抗體。

本發(fā)明的第三方面是提供上述單克隆抗體在純化和檢測赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四方面是提供一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCCN0.5506分泌得到的單克隆抗體。本發(fā)明的第五方面是提供一種裝載有上述免疫吸附劑的免疫親和柱。本發(fā)明的第六方面是提供一種含有上述免疫吸附劑或上述免疫親和柱的試劑盒；優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，所述保存液優(yōu)選為含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液。本發(fā)明的第七方面是提供上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A中至少一種中的應(yīng)用。本發(fā)明的第八方面是提供一種純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，該方法包括，使含有黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的液體樣品通過上述免疫親和柱，使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素Bp B2、Gp G2、MpM2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至該免疫親和柱上，然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、M1, M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種。本發(fā)明的第九方面是提供一種檢測黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括，⑴根據(jù)上述純化黃曲霉毒素GyMp M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，得到待測液，所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來而得到的溶液；(2)使所述待測液進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性或定量檢測。本發(fā)明通過開發(fā)出性能穩(wěn)定、特異的單克隆抗體，實現(xiàn)了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的同時純化和檢測。由實施例的結(jié)果可以看出，對牛奶樣品和飼料樣品的檢測中,添加回收率都在70-110%之間，RSD均小于6%。表明本發(fā)明的方法完全滿足對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、Mp M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A純化和檢測的分析要求。


附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式
一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:圖1為黃曲霉毒素B1'B2、G1'G2、M1和M2標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖；圖2為雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖；圖3為赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞株OTA-El 1B8CGMCC N0.5505。該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，分類命名為抗赭曲霉毒素A單克隆抗體細(xì)胞株。本發(fā)明還提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗赭曲霉毒素A的抗體。本發(fā) 明的上述單克隆抗體可應(yīng)用于純化和檢測赭曲霉毒素A。本發(fā)明中上述雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法。S卩，首先將赭曲霉毒素A半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備作為免疫原，然后將該免疫原對小鼠進(jìn)行免疫，通過將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細(xì)胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中，所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原與載體蛋白的相對用量可以為本領(lǐng)域常規(guī)選擇，例如，所述免疫原與載體蛋白的摩爾比為5-8: I。具體地，本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以包括以下步驟:(I)制備赭曲霉毒素A免疫原將2mg赭曲霉毒素A (OTA)加入到500 μ L丙酮中，加入4mg CDI，得到第一溶液。將8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸鹽緩沖液中，得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中，室溫反應(yīng)2天,反應(yīng)后溶液在4°C條件下,用PBS溶液透析3天。(2)制備雜交瘤細(xì)胞和抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取適量赭曲霉毒素A免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進(jìn)行免疫，之后佐劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余均為腹腔注射。免疫結(jié)束后處死小鼠，取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合:將脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞按照10: I的比例進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。雜交瘤細(xì)胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到對赭曲霉毒素A有很好的特異性反應(yīng)的細(xì)胞。最后篩選出分泌赭曲霉毒素A抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCCN0.5505，制備出單克隆抗體。本發(fā)明提供一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體(抗體A)和由雜交瘤細(xì)胞株Afla-D12A1CGMCC N0.5506 (該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，分類命名為抗雜色曲霉素黃曲霉毒素單克隆抗體細(xì)胞株)分泌得到的單克隆抗體(抗體B)。其中，抗體B為抗黃曲霉毒素B2、Gp G2、M1, M2,和雜色曲霉素中至少一種的抗體。本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5506和抗體B的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法。即，首先將黃曲霉毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備作為免疫原，然后將該免疫原對小鼠進(jìn)行免疫，通過將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細(xì)胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中，所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原與載體蛋白的相對用量可以為本領(lǐng)域常規(guī)選擇，例如，所述免疫原與載體蛋白的摩爾比為5-8: I。具體地，本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以包括以下步驟:(I)制備黃曲霉毒素免疫原將4mg黃曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中，加入40yL 10%的H2SO4，在56°C攪拌反應(yīng)4h，將反應(yīng)所得產(chǎn)物蒸干后，加入5mL H2O,用25mL氯仿提取兩次，然后用20mL H2O洗滌有機層，保留有機層，蒸去有機溶劑，得到黃色固體產(chǎn)物。取1.0mg黃色固體產(chǎn)物，向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mL PBS中溶解20mgBSA)，在 37°C 下反應(yīng) 30min ;加入 100 μ L 6.5mM 的 NaHB4,在 4°C 反應(yīng) 30min ;加入 50 μ L0.1N的HC1，除去過量的NaHB4。在4°C條件下，用PBS溶液透析3天，制得免疫原，即黃曲霉毒素 B1-BSA(Aflatc)Xin B1-BSA)。本發(fā)明中，所述固相載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種適用于與抗體進(jìn)行偶聯(lián)的固相載體，包括但不限于纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠中的至少一種，優(yōu)選為溴化氰(CNBr)活化的瓊脂糖凝膠；所述瓊脂糖凝膠的濃度可以為常規(guī)的各種選擇，如4%。該CNBr活化的瓊脂糖凝膠可以以干粉形式商購獲得，如購自美國GE公司，使用時，加入酸溶液進(jìn)行溶脹即可，該酸處理方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在此不再贅述。當(dāng)使用凍干形式并含有添加劑的CNBr活化的瓊脂糖凝膠時，優(yōu)選在低PH值(如pH值為2-3)的條件下洗去添加劑，然后再與抗體進(jìn)行偶聯(lián)。所述將抗體A和抗體B與固相載體偶聯(lián)的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，具體地，該方法可包括:(I)用偶聯(lián)緩沖液溶解抗體，所述抗體為抗體A和抗體B，得到第一抗體溶液，(2)使所述第一抗體溶液與活化的固相載體接觸進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)液，(3)將偶聯(lián)液中偶聯(lián)后的固相載體轉(zhuǎn)移至濃度為0.05-1M的Tris-HCl緩沖液中靜置，以封閉偶聯(lián)液中偶聯(lián)后的固相載體上的殘留活性位點，(4)用洗滌液洗滌靜置后的固相載體，以去除未偶聯(lián)的抗體，得到洗滌后的固相載體，(5)用含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液清洗洗滌后的固相載體。本發(fā)明對所述抗體和固相載體的用量比例以及抗體A和抗體B的相對用量沒有特別的限定，一般地，使所述抗體與固相載體盡可能飽和偶聯(lián)，因此，所述抗體一般過量于固相載體。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)需要選擇抗體與固相載體的用量比。本發(fā)明中，所述抗體A、抗體B與固相載體的重量比優(yōu)選為1: 0.2-5: 5-10。本發(fā)明中所述偶聯(lián)緩沖液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種選擇，如0.1-0.3M的NaHCO3溶液，PH值可以為8-8.5。偶聯(lián)條件和偶聯(lián)方法可以為常規(guī)的選擇，如，可以在4_25°C條件下，采用翻轉(zhuǎn)式(end-over-end)的方法將抗體與固相載體充分均勻混合1_24小時。所述封閉和除去未偶聯(lián)的抗體的方法也可以為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。其中，所述在0.05-1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中靜置的條件可以為，在4_25°C下，靜置2_4小時。所述用洗滌液洗滌靜置后的固相載體中的洗滌液可以為低、高兩種PH值的緩沖液(如pH4.0的醋酸鹽緩沖液和PH8.0的Tris-HCl緩沖液)，所述洗滌的條件只要使得未偶聯(lián)的抗體基本被除去即可，一般地，按照依次用低、高PH的緩沖液洗滌的順序至少洗滌3個循環(huán)。可以通過測量未偶聯(lián)的抗體的量來計算兩種抗體總的偶聯(lián)率，偶聯(lián)率計算公式為:
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5505。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗赭曲霉毒素A的抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在純化和檢測赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。
4.一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5506分泌得到的單克隆抗體。
5.裝載有權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑的免疫親和柱。
6.含有權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和柱的試劑盒；優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，所述保存液優(yōu)選為含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液。
7.權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑、權(quán)利要求5所述的免疫親和柱、或權(quán)利要求6所述的試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素和赫曲霉毒素A中至少一種中的應(yīng)用。
8.—種純化黃曲霉毒素BpB2WpGyMpM2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，該方法包括，使含有黃曲霉毒素G2JpM2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的液體樣品通過權(quán)利要求5所述的免疫親和柱，使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、MpM2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至該免疫親和柱上，然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、G1 > G2> Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述含有黃曲霉毒素G2、M1、M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的液體樣品優(yōu)選為食品的液體提取物、飼料的液體提取物、生物樣品的液體提取物和中藥的液體提取物中的至少一種。
10.一種檢測黃曲霉毒素G2、M1、M2、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，該方法包括， (1)根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，得到待測液，所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2> G1^ G2> M1' M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來而得到的溶液； (2)使所述待測液進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性或定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC NO.5505和由該細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種免疫吸附劑，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC NO.5506分泌得到的單克隆抗體。以及裝載該免疫吸附劑的免疫親和柱。本發(fā)明還提供含有上述免疫吸附劑或免疫親和柱的試劑盒。以及上述免疫吸附劑、免疫親和柱、試劑盒在檢測黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。并具體提供了分離方法和檢測方法。本發(fā)明通過開發(fā)出性能穩(wěn)定、特異的單克隆抗體，實現(xiàn)了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的同時純化和檢測。
文檔編號C07K14/38GK103160471SQ20111040995
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者李為喜, 王雄, 鮑蕾, 許艷麗, 王步軍, 呂寧, 梁成珠, 果旗, 江帆, 王彥斐, 胡明勛, 鄧穎, 戚大海, 吳兆廣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京中檢維康技術(shù)有限公司, 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心