專利名稱：新的腸球菌和鏈球菌菌株及細(xì)菌素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用新的產(chǎn)細(xì)菌素的腸球菌和鏈球菌菌株和/或由這些菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素控制動物、特別是家禽中的疾病。本發(fā)明還涉及新細(xì)菌素，所述新細(xì)菌素的氨基酸序列，以及涉及生產(chǎn)所述新細(xì)菌素的腸球菌或鏈球菌，并涉及乳球菌屬的誘導(dǎo)者菌株。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及含有所述新細(xì)菌素和/或生產(chǎn)它們的腸球菌或鏈球菌的治療組合物，以及所述治療組合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食用未正確處理的家禽產(chǎn)品已經(jīng)導(dǎo)致人的腸疾病。早已認(rèn)識到沙門氏菌 (Salmonella spp.)是這類疾病的致病菌，最近認(rèn)識到彎曲桿菌(Campylobacter spp.)，特別是空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)也被牽連其中。這兩種微生物都可以定植于家禽的胃腸道中，而對這些鳥類沒有任何有害效果，雖然一些已被定植的鳥類可以被檢測到， 但無癥狀的帶菌者可以在生產(chǎn)和處理過程中自由傳播這些微生物，導(dǎo)致進(jìn)一步感染活的鳥類和尸體。家禽在食物供應(yīng)中作為沙門氏菌和彎曲桿菌的原始貯主(Jones等，Journal of Food Protection(食品保護(hù)雜志)，第M卷，No. 7，502-507，1991年7月)。在養(yǎng)成生產(chǎn)期間預(yù)防在活家禽中的定植可以消除家禽污染的問題。許多因素促成細(xì)菌在動物消化道內(nèi)的定植和繼續(xù)存在。這些因素已被 Savage (Progress in Food and Nutrition Science (食品禾口營養(yǎng)禾斗學(xué)進(jìn)展)，第 7 卷， 65-74,1983)詳盡地評述。在這些因素中所包括的是(1)胃酸度(Gilliland，Journal of Food Production (食品生產(chǎn)雜志)，第 42 卷，164-167，1979) ； (2)膽汁鹽(Sharpe 禾口 Mattick，Milchwissenschaft,第 12 卷，348—349，1967 ；Floch 等，American Journal of Clinical Nutrition (美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志)，第 25 卷，1418-1426，1972 ;Lewis 和 Gorbach, Archives of Internal Medicine (內(nèi)科學(xué)檔案)，第 130 卷，545-549，1972 ； Gilliland 和 Speck，Journal of Food Protection (食品保護(hù)雜志)，第 40 卷，820-823， 1977) ；Hugdahl 等，Infection and Immunity (感染和免疫)，第 56 卷，1560-1566，1988)； (3)蠕動；(4)消化酶(Marmur, Journal of Molecular Biology (分子生物學(xué)雜志)，第 3 卷，208-218，1961) ； (5)免疫響應(yīng)；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它們生產(chǎn)的抗菌化合物。前四種因素取決于宿主的表現(xiàn)型，可能不是實(shí)際上可控的變量。胃腸(GI)道的免疫響應(yīng)不易調(diào)節(jié)。涉及本源微生物及其代謝物的因素取決于GI道的正常菌群?？刂茝澢鷹U菌和/或沙門氏菌的定植的一種可能的方法是通過使用競爭性排斥 (CE)。Nurmi 和 Rantala(Nature (自然)，第 241 卷，210-211，1973)證明通過將來自健康家禽腸內(nèi)物質(zhì)的細(xì)菌管飼給微生物群落還沒有建成的年幼的雛雞(chick)抵抗沙門氏菌定植，有效控制沙門氏菌的感染。給雛雞施用不確定的CE制備物加速新孵出鳥類的消化道菌群的成熟，并提供由成年雌禽向其后代傳送微生物群落的自然過程的替代者。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)地調(diào)查的結(jié)果提供通過給雛雞施用正常微生物群落控制彎曲桿菌的優(yōu)點(diǎn)的證據(jù)； 降低的鳥群受彎曲桿菌感染的頻率(Mulder和Bolder，IN Colonization Control of human bacterial enteropathogens in poultry (胃#中入細(xì)lift生 1 ;) 原#^制)；L. C. Blankenship(編)，Academic Press，加利福尼亞圣地亞哥，359-363，1991)以及降低的被定植的鳥類的糞便中空腸彎曲桿菌(C. jejuni)水平已有報道(Mern，Poultry Science (家禽科學(xué))，第 73 卷，402-407，1994)。Schoeni 和 Wong (Appl. Environ. Microbiol.，第 60 卷，1191-1197，1994)報道了通過一起應(yīng)用碳水化合物添加劑和三種已被識別的拮抗劑(差異檸檬酸桿菌(CitrcAacter diversus) 22,克雷伯氏月市炎桿菌(Klebsiellapneumoniae) 23 禾口大腸桿菌(Escherichia coli)25)顯著減少了肉仔雞(broiler)中空腸彎曲桿菌的定植。也有在用嗜酸乳酸桿菌 (Lactobacillus acidophilus)禾口屎鏈球菌(Streptococcus faecium)的家禽分離培養(yǎng)物治療以后，感染肉仔雞的腸內(nèi)樣品中空腸彎曲桿菌顯著減少的證據(jù)(Morishita等，Avian Diseases (禽類疾病)，第 41 卷，850-855，1997)。Snoeyenbos等(美國專利號4，335，107，1982年6月)通過凍干糞便并厭氧培養(yǎng)這種制備物開發(fā)了預(yù)防沙門氏菌定植的競爭性排斥(CE)微生物群落技術(shù)。Mikola等(美國專利號4，657，762，1987年4月)用腸道糞便和盲腸內(nèi)容物作為CE微生物群落源用于預(yù)防沙門氏菌定植。Stern等(美國專利號5，451，400，1995年9月和美國專利號6，241，335， 2001年4月)公開一種粘膜CE組合物以保護(hù)家禽和家畜抵抗沙門氏菌和彎曲桿菌的定植， 其中預(yù)先洗滌的盲腸的粘蛋白層被刮下，被刮下的刮屑保持在無氧環(huán)境中，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。 Nisbet等(美國專利號5，478，557，1996年12月)公開了一種確定的益生菌，其可以得自各種家養(yǎng)動物，是通過連續(xù)培養(yǎng)直接由成年目標(biāo)動物的糞便、盲腸和/或大腸內(nèi)容物產(chǎn)生的分批培養(yǎng)物獲得的。微生物生產(chǎn)多種證明有抗細(xì)菌性質(zhì)的化合物。一類這樣的化合物，細(xì)菌素，由殺菌蛋白組成，其作用機(jī)制類似于離子載體抗生素。細(xì)菌素通常具有抵抗與其生產(chǎn)者密切相關(guān)的菌種的活性。它們在由復(fù)雜微生物種群，例如腸道，口腔或其他上皮表面分離出的細(xì)菌菌種中的廣泛存在表明細(xì)菌素可能在細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的種群動態(tài)方面具有調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌素被定義為由細(xì)菌生產(chǎn)的具有生物活性蛋白部分和殺菌作用的化合物(Tagg等， Bacteriological Reviews (細(xì)菌學(xué)評論)，第40卷，722-256，1976)。其他特性可以包括 (1)窄譜抑制活性，集中于密切相關(guān)的菌種；(2)與特定的細(xì)胞受體結(jié)合；以及(3)質(zhì)粒攜帶細(xì)菌素生產(chǎn)和宿主細(xì)胞細(xì)菌素免疫性的遺傳決定簇。不完全確定的拮抗性物質(zhì)被稱為 “細(xì)菌素樣物質(zhì)”。一些有效對抗革蘭氏陽性菌、相反不對抗革蘭氏陰性菌的細(xì)菌素，具有較廣譜的活性。已有建議術(shù)語細(xì)菌素，當(dāng)用于描述由革蘭氏陽性菌生產(chǎn)的抑制劑時，應(yīng)滿足 (1)是一種肽和( 具有殺菌活性的最低標(biāo)準(zhǔn)(Tagg等，同上)。乳酸細(xì)菌是最重要的益生菌微生物之一。它們是革蘭氏陽性的，不產(chǎn)生孢子的，過氧化氫酶陰性的缺乏細(xì)胞色素的生物。它們是厭氧但耐氧的、有復(fù)雜營養(yǎng)要求的、 耐酸的以及嚴(yán)格可發(fā)酵的，并以乳酸作為糖發(fā)酵的主要終產(chǎn)物。產(chǎn)乳酸細(xì)菌包括乳酸桿菌(Lactobacillus)菌禾中，雙歧桿菌(Bifidobacterium)菌禾中，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，倉鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),嗜酸芽孢乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus),嗜熱鏈球菌(Str印tococcus thermophilus)等。這些菌種在其中廣泛存在細(xì)菌素方面是受到特別關(guān)注的，也廣泛應(yīng)用于發(fā)酵奶、食品和肉加工工業(yè)中。它們在食品的保存和風(fēng)味特征中的作用已有詳盡記載。大部分由這些菌種生產(chǎn)的細(xì)菌素僅僅具有抵抗其他乳酸細(xì)菌的活性，但有幾種顯示出對較大種系差異的革蘭氏陽性菌以及，在特定條件下，對革蘭氏陰性菌的抗菌活性。乳酸桿菌已被廣泛研究其拮抗劑的生產(chǎn)。其中包括充分定性的細(xì)菌素 (DeKlerk, Nature(自然)，第 214 卷，609，1967 ；Upreti 和 Hinsdill, Anticmicrob. Agents Chemother.第七卷，139-145,1975 ；Barefoot 禾口 Klaenhammer, Anticmicrob. Agents Chemother.第 45 卷，1808-1815,1983 ；Joerger 禾口 Klaenhammer, Journal of Bacteriology (細(xì)菌學(xué)雜志)，第167卷，439-446，1986)；可能的細(xì)菌素樣物質(zhì)(Vincent 等，Journal of Bacterioll (細(xì)菌雜志)，第78卷，479，1959)，和其他與細(xì)菌素不必然相關(guān)的拮抗劑(Vakil 和 Shahani, Bacteriology (細(xì)菌學(xué))，Proc. 9，1965 ；Hamdan 禾口 Mikolajcik, Journal of Antibiotics (抗生素雜志)，第 8 卷，631-636，1974 ；Mikolajcik 和 Hamdan，Cultured Dairy Products (發(fā)酵乳制品)，1975，第 10 頁；以及 Shahni 等， Cultured Dairy Products Journal (發(fā)酵乳制品雜志)，第 11 卷，14-17，1976)。Klaenhammer (FEMS, Microbiol. Rev.(微生物學(xué)綜述)，第 12 卷，39-86，1993)將當(dāng)時所知的乳酸細(xì)菌細(xì)菌素分為四個主要類別第I類一羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是< 5kDa的小肽，含有不常見的氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸。它們受到特別關(guān)注是因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬τ谄渌?xì)菌素而言非常廣譜的活性。實(shí)例包括乳酸鏈球菌素(Nisin)、乳酸鏈球菌素Ζ、串珠菌素 (carnocin)U149、產(chǎn)乳桿菌素(Iacticin) 481、和產(chǎn)乳桿菌素5。第II類一小的不含羊毛硫氨酸的肽一類非均質(zhì)的< IOkDa的小肽。這一類包括具有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。第III類——大的熱不穩(wěn)定的> 30kDa的蛋白質(zhì)。實(shí)例是Helveticin。第IV類——含有額外部分例如脂類和碳水化合物的復(fù)雜細(xì)菌素-蛋白質(zhì)。Raczek(2002年11月28日公布的美國專利申請US2002/0176910)公開了使用含有活著或死亡的分泌細(xì)菌素的微生物、或者細(xì)菌素自身或其組合形式的組合物以與農(nóng)業(yè)牲畜的飼料一起使用。在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域里描述了各種產(chǎn)細(xì)菌素的腸球菌和鏈球菌屬以及其細(xì)菌素。然而，本發(fā)明提供新的組合物，其含有至少一種新的腸球菌和鏈球菌和或至少一種由所述新菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素；一種使用所述的菌株和/或細(xì)菌素的方法、所述新菌株、所述新細(xì)菌素的氨基酸序列以及其使用方法，所有這些與相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的菌株、細(xì)菌素以及使用方法是不相同的
發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的是提供至少一種產(chǎn)新細(xì)菌素的新的腸球菌和鏈球菌菌株。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供具有NRRL B-30745識別特征的新的倉鼠鏈球菌 (Streptococcus cricetus)0本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有NRRL B-30746識別特征的新的倉鼠鏈球菌 (Streptococcus cricetus)菌株。本發(fā)明的另一目的是提供由新的腸球菌和鏈球菌的菌株生產(chǎn)的新的細(xì)菌素。本發(fā)明的一個目的是提供一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素， 所述腸球菌或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746和NRRL B-30745組成的組的菌株的識別特征。本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素50-52。本發(fā)明也可以提供具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的細(xì)菌素。本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素760。本發(fā)明也可以提供具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的細(xì)菌素。本發(fā)明的又一目的是提供具有NRRL B-30746的識別特征的分離的屎腸球菌菌株。 本發(fā)明還提供具有NRRL B-30745的識別特征的分離的倉鼠鏈球菌菌株。本發(fā)明提供一種治療組合物，包括(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌定植水平的有效量的至少一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識別特征；以及(b)合適的治療載體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述治療組合物中所述細(xì)菌素具有選自由SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO 2或其混合物組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供一種用于動物的治療性飼料，包括(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的至少一種由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的分離的細(xì)菌素，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746, NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識別特征，(b)治療載體，以及(c)動物飼料。本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述治療性飼料中所述至少一種細(xì)菌素具有選自由SEQ ID NO U SEQ ID NO 2及其混合物組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供通過向動物施用治療組合物而至少降低由至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，所述組合物包括至少一種產(chǎn)新細(xì)菌素的新的腸球菌和鏈球菌的菌株、至少一種由新的腸球菌和鏈球菌的菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素或所述新菌株和 /或所述新細(xì)菌素的組合。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是通過向動物施用治療組合物而至少降低由至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有NRRL保藏號B-30746的識別特征的新的腸球菌的菌株、具有NRRL保藏號B-30745的識別特征的新的鏈球菌的菌株及其混合物。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供通過向動物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素50-52。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供通過向動物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素760。本發(fā)明的另一目的是提供通過向動物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，所述組合物包括由具有識別特征NRRL B-30746的新的腸球菌的菌株、具有識別特征NRRL B-30745的新的鏈球菌的菌株及其混合物生產(chǎn)的細(xì)菌素。本發(fā)明提供一種用于至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，包括將至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的包括至少一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素以及治療載體的治療組合物施用給動物，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746.NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識別特征。在另一實(shí)施方案中，所述的細(xì)菌素具有選自由SEQ ID NO U SEQ ID NO 2及其混合物組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供乳球菌屬(Lactococcus)誘導(dǎo)者菌株，所述誘導(dǎo)者菌株通過提高生產(chǎn)者菌株的細(xì)菌素的產(chǎn)量。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供具有識別特征NRRL B-30744的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的誘導(dǎo)者菌株。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了具有 NRRLB-30744的識別特征的乳酸乳球菌的分離菌株。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供通過生產(chǎn)者菌株提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，其中所述生產(chǎn)者菌株與乳球菌誘導(dǎo)者菌株共培養(yǎng)。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供通過生產(chǎn)者菌株提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，其中所述生產(chǎn)者菌株與具有NRRL B-30744的識別特征的乳球菌菌株共培養(yǎng)。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供一種用于由細(xì)菌提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，包括(a)向產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌的培養(yǎng)物中添加細(xì)菌素提升量的乳酸乳球菌以形成共同培養(yǎng)物，所述乳酸乳球菌具有NRRL B-30744的識別特征，以及(b)在大約37°C培養(yǎng)所述的共同培養(yǎng)物。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供用于純化細(xì)菌素的方法，所述方法包括收獲培養(yǎng)液以及細(xì)胞作為分開的樣本，通過用含有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫來分離已經(jīng)吸附到生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者菌株兩者的細(xì)胞表面上的細(xì)菌素，接著通過用疏水作用色譜一步離子交換色譜分離培養(yǎng)液中的細(xì)菌素。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供一種用于分離細(xì)菌素的方法，其包括 (a)共同培養(yǎng)產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌以在培養(yǎng)介質(zhì)中生產(chǎn)細(xì)菌素，(b)通過離心收獲所述培養(yǎng)介質(zhì)和細(xì)胞以獲得上清液和細(xì)胞小團(tuán)，(c)將所述含細(xì)菌素的上清液應(yīng)用于疏水作用色譜柱以獲得分離的細(xì)菌素制備物，(d)在洗脫緩沖液中溫育所述來自步驟b的所述細(xì)胞小團(tuán)以形成第一混合物，(e)通過離心從所述細(xì)胞小團(tuán)與所述緩沖液分離細(xì)胞，(f)通過離子交換色譜從所述緩沖液分離細(xì)菌素。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述離子交換色譜使用Superose SP FF柱。本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)將從以下說明中變得明顯。微生物的保藏倉鼠鏈球菌(Sti^ptococcuscricetus)，標(biāo)明為 NRRL B-30745 (菌株 760)； 屎腸球菌(Enterococcus faecium)標(biāo)明為NRRL B-30746 (菌株50-5 以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)標(biāo)明為NRRL B-30744(菌株320)已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2004年5月3日保藏于美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心專利培養(yǎng)物保藏中心(國家
(National Center for Agricultural Utilization Research, 1815
7N.University Street, Peoria,Illinois 61604)。


圖IA和IB是顯示SDS-PAGE (IA)和等電聚焦(IB)后對細(xì)菌素760直接檢測的照片。圖2A和2B是顯示SDS-PAGE (2A)和等電聚焦QB)后對細(xì)菌素50_52直接檢測的照片。
具體實(shí)施例方式腸感染在人類中的重要性已經(jīng)被日益充分地認(rèn)識到。家禽污染和人類感染之間的關(guān)系也已有詳盡記載。通過干預(yù)家禽加工廠消除這種健康危險的能力也是眾所周知的。在肉仔雞生產(chǎn)和加工過程中，含有病原體的糞便物被轉(zhuǎn)移到肉上，并繼續(xù)存在于加工食品的廚房中。競爭性生物的代謝物可能有助于控制例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和沙門氏菌的病原體。已經(jīng)從肉仔雞的盲腸和嗉囊粘膜表面分離出了新的拮抗菌株。鑒定的拮抗劑的天然組分是具有廣譜拮抗活性的低分子量肽，細(xì)菌素。本發(fā)明提供新的腸球菌菌株、新的鏈球菌菌株、新的乳球菌菌株、新的細(xì)菌素，所述細(xì)菌素的氨基酸序列、含有所述新的細(xì)菌素和/或生產(chǎn)所述新的細(xì)菌素的菌株的治療組合物、以及使用這些新的治療組合物的方法。本發(fā)明還提供生產(chǎn)和純化所述新的細(xì)菌素的方法。屎腸球菌，NRRL B-30746，是一種兼性需氧菌和革蘭氏陽性球菌，并且能夠在約 37°C生長。所述菌株在營養(yǎng)瓊脂或平板計數(shù)瓊脂上生長產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C 微需氧培養(yǎng)約M小時后，所述的菌落直徑約2mm。倉鼠鏈球菌，NRRL B-30745,是一種兼性需氧菌和革蘭氏陽性球菌，并且能夠在約 37°C生長。所述菌株在營養(yǎng)瓊脂或平板計數(shù)瓊脂上生長產(chǎn)生規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養(yǎng)約M小時后，所述的菌落直徑約1mm。分離的腸球菌和鏈球菌用于生產(chǎn)新菌素活性的篩選是在接種由不同的所關(guān)注的目標(biāo)細(xì)菌的營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行的。其他試驗(yàn)菌株在約37°C需氧條件下培養(yǎng)約 18- 小時。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假結(jié)核耶爾森菌 (Y. pseudotuberculosis)在約需氧條件下培養(yǎng)約18- 小時。抵抗空腸彎曲桿菌的活性試驗(yàn)是在由空腸彎曲桿菌接種的含約5%細(xì)胞溶解血液(lysed blood)的彎曲桿菌瓊脂上進(jìn)行的。血的使用在本領(lǐng)域普通技術(shù)中是充分的并且包括例如羊、馬等。抵抗空腸彎曲桿菌的活性試驗(yàn)在約5% O2、約10% CO2以及約85% N2的微需氧條件下在約42°C進(jìn)行約 24-48小時。約0. Iml的懸浮在生理鹽水中的所述拮抗細(xì)菌被涂布到MRS瓊脂上并溫育約 24-48小時。約0. 5cm3的MRS瓊脂立方體被切下并轉(zhuǎn)移到由細(xì)胞溶解血液、約10微克/毫升的利福平、約2. 4U/ml的多粘菌素補(bǔ)充的、并由約IO7個空腸彎曲桿菌細(xì)胞接種的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上。平板在約42°C微需氧條件下溫育約M-48小時。通過測量生長抑制的區(qū)域評價活性。評價用于細(xì)菌素生產(chǎn)的發(fā)現(xiàn)為拮抗性的分離物。由硫酸銨從拮抗菌株的培養(yǎng)物中沉淀制備粗抗微生物制備物(CAPs)，所述拮抗菌株在約37°C需氧條件下在約10%的布氏肉湯和細(xì)菌素增強(qiáng)量的用作誘導(dǎo)者的乳酸乳球菌(菌株320 ；NRRL-30744)中生長約14小時。細(xì)菌素增強(qiáng)量的誘導(dǎo)者定義為與沒有誘導(dǎo)者菌株時培養(yǎng)的生產(chǎn)者菌株相比至少提高了生產(chǎn)者菌株的細(xì)菌素生產(chǎn)所需的誘導(dǎo)者細(xì)菌的量。共培養(yǎng)物中誘導(dǎo)者對生產(chǎn)者菌株的濃度比的實(shí)施例是約10 1(誘導(dǎo)者生產(chǎn)者)。所述培養(yǎng)物然后在約2，500Xg下離心約10 分鐘。拮抗肽通過硫酸銨沉淀、用Superose 12HR凝膠過濾、用kpharose SP FF陽離子交換色譜的組合從上清液中分離。分泌的細(xì)菌素可能與共培養(yǎng)物一起吸附到生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者細(xì)胞兩者的細(xì)胞表面上。為了獲取這些細(xì)菌素，由離心步驟所得的細(xì)胞小團(tuán)與具有約0.7% NaCl,pH約8. 0的磷酸鹽緩沖液構(gòu)成的洗脫緩沖液混合?；旌显搼腋∫翰赜s20分鐘， 接著在約10，OOOg離心約15分鐘。經(jīng)在Superose SP FF上的離子交換色譜從上清液分離細(xì)菌素。由SDS-PAGE電泳確定所述肽的分子量。由等電聚焦確定所述肽的pis。采用例如 49IcLC自動測序儀(Applied Biosystems, Inc.)由Edman降解確定氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”意為至少兩個或更多個氨基酸或氨基酸類似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸類似物可以通過肽鍵相連。在另一個實(shí)施方案中，所述氨基酸可以通過其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結(jié)構(gòu)構(gòu)型，包括線性、分支，或環(huán)狀構(gòu)型。 本文所用的術(shù)語“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體兩者，以及氨基酸類似物。本發(fā)明的肽衍生物和類似物包括但不限于包含作為一級氨基酸序列的肽的全部或部分氨基酸序列的那些，所述肽的全部或部分氨基酸序列包括其中用功能等同的氨基酸殘基替換序列中的殘基從而導(dǎo)致保守氨基酸替換的改變的序列。例如，所述序列中的一個或更多個氨基酸殘基可以由具有相似極性的另外的氨基酸取代，所述氨基酸起功能等同物的作用，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸的替代物可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸， 色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門冬酰胺，和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸，和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這種改變不會顯著影響聚丙酰胺凝膠電泳確定的表觀分子量或等電點(diǎn)。非保守氨基酸替換也可以被引入以替換氨基酸，使之具有特別偏好的性質(zhì)。例如，Cys可以被引入到可能的位置以與另一個Cys形成二硫橋。Pro可以因其特別的平面結(jié)構(gòu)而被引入。本發(fā)明的肽可以被化學(xué)合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽縮合(peptide condensation)技術(shù)，或任何其組合制備，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原創(chuàng)的固相程序的標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)、中和、耦聯(lián)和洗滌方法(J.Am. Chem. Soc，第 85 卷，2149-21M，1963)的標(biāo)準(zhǔn) Boc (N° -氨基保護(hù)的 _t_ 丁基氧羰基)氨基酸樹脂，或堿敏感的Na-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino 和Han，J. Org. Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他『-保護(hù)的基團(tuán)。固相肽合成可以用本領(lǐng)域的普通技術(shù)(參見例如Mewart 禾口 Young, Solid Phase Synthesis (固相合成)，第二版,Pierce Chemical Co. , Rockford, 111.，1984 ；Fields 和 Noble, Int. J. Pept. Protein Res.，第 35 卷，161-214，1990)或用自動合成儀完成。根據(jù)本發(fā)明，所述多肽和新的細(xì)菌菌株可以以治療可接受的載體形式局部地、腸道外地、經(jīng)粘膜地(例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸或經(jīng)皮)給藥。本發(fā)明的肽如果需要的話可以被修飾以增加所述肽穿過細(xì)胞膜的能力，所述修飾例如通過增加所述肽的疏水性質(zhì)、將所述肽作為載體的共軛物(例如針對某特定受體的配體)引入，等等。本發(fā)明還提供將目標(biāo)分子綴合(conjugate)到本發(fā)明的肽上的操作。本發(fā)明目的的目標(biāo)分子意指當(dāng)體內(nèi)給藥時定位到期望的一個或多個位置的分子。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，所述的目標(biāo)分子可以是肽或蛋白、抗體、凝集素、碳水化合物，或類固醇。目標(biāo)分子可以是目標(biāo)細(xì)胞上受體的肽配體或者抗體，例如單克隆抗體。為促進(jìn)交聯(lián)，所述抗體可以被簡化為重和輕鏈雜合二聚物，或者F(ab' )2片段可以被簡化，并通過還原的巰基交聯(lián)到所述的肽上。本發(fā)明的另一方面涉及提供治療組合物。所述組合物可以是針對口、鼻、肺給藥、 注射等等。所述治療組合物包括有效量的至少一種本發(fā)明的細(xì)菌素以及其衍生物和/或至少一種新的菌株以至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平，以及可接受的稀釋劑、防腐劑、 增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。稀釋劑可以包括例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽的緩沖液；添加劑例如可以包括去污劑和增溶試劑，例如吐溫80，聚山梨酯80等；抗氧化劑包括例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉等等；防腐劑可以包括，例如Thimersol、苯甲醇等等；以及增量物質(zhì)例如乳糖、甘露糖醇等等。本發(fā)明的治療組合物可以被并入聚合化合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乳酸、 聚羥基乙酸等)特殊制備物中，或并入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體包封包括各種聚合物的包封。多種高分子載體可以用來包含和/或遞送一種或更多種上面討論的治療劑，包括例如可生物降解和不可生物降解的組合物兩者?？缮锝到獾慕M合物的代表性實(shí)例包括白蛋白、膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、淀粉、纖維素(甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、醋酸琥珀酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素)、 酪蛋白、右旋糖苷、多糖、纖維蛋白原，聚(D，L乳酸)、聚(D，L-乳酸-共聚-甘醇酸)、聚 (乙交酯)、聚(羥基丁酸酯)、聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)、聚酯、聚(羥基戊酸)、 聚二氧環(huán)己酮、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(蘋果酸)、聚(羥基丙二酸)、聚酸酐、聚磷腈、聚(氨基酸)及其共聚物(一般地，見Ilium, L.，Davids, S. S.(編輯)的"Polymers in Controlled Drug Delivery (受控藥物遞送中的聚合物)”，Wright，Bristol，1987 ； Arshady, J. Controlled Release (受控釋放雜志)17 :1-22,1991 ；Pitt, Int. J. Phar.(國際藥物雜志)59 :173-196,1990 ；Holland 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)4 155-0180，1986)。不可降解的聚合物的代表性實(shí)施例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物、硅橡膠、丙烯酸聚合物(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcynoacrylate))、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(尼龍6，6)、聚氨酯、聚(酯聚氨酯)、聚(醚聚氨酯)、聚(酯-脲)、聚醚(聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧丙烷)、Plur0nicS 和聚(四亞甲基二醇))、硅橡膠和如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醋酸鄰苯二甲酸乙烯酯的乙烯基聚合物等)。也可以開發(fā)陰離子(如海藻酸鹽、角叉菜膠、羧甲基纖維素和聚(丙烯酸))或陽離子(例如，殼聚糖、聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺以及聚烯丙胺)(一般地，見 Dunn 等，J. Applied Polymer Sci.(應(yīng)用聚合物雜志)50 :353_365，1993 ；Cascone 等人，J. Materials Sci. =Materials in Medicine (材料科學(xué)醫(yī)藥材料)5 :770_774，1994 ； Shiraishi 等，Biol. Pharm. Bull.(生物藥物快報)16 (11) :1164-1168,1993 ；Thacharodi 和RaoJnt，l J. Pharm.(國際藥物雜志)120 :115_118，1995 ;Miyazaki 等，Int，1 J. Pharm. (國際藥物雜志)118 =257-263,1995)。聚合物載體可以塑造成具有期望的釋放特征和/或特定的期望性質(zhì)的各種形式。例如，聚合物載體可以制成一旦暴露給特定的觸發(fā)事件例如PH就釋放治療劑的形式(見，例如，在藥物中的聚合物III (Polymers in Medicine III)，Heller等 "Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems (以化學(xué)的方式自調(diào)節(jié)的藥物遞送系統(tǒng))”，Elsevier Science Publisher B. V.，阿姆斯特丹，1988，第 175-188 頁；Kang 等人，J. Applied Polymer Sci.(應(yīng)用聚合物科學(xué)雜志)48 :343_354，1993 ;Dong 等人， J. Controlled Release (受控釋放雜志)19 171-178，1992 ；Dong和Hoffman，J. Controlled Release (受控釋放雜志)15 141-152，1991 ；Kim 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志) :143-152,1994 ；Corne jo-Bravo 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)33 :223-229,1995 ；Wu 和 Lee, Pharm. Res.(藥物研究)10(10) :1544-1547, 1993 ；Serres 等人，Pharm. Res.(藥物研究)I3 O) :196-201,1996 ；在 Gurny 等人編車t 的 Pulsatile Drug Delivery ( fj/t ^ M ^ M M )中 Peppas ^ "Fundamentals of pH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems (pH _胃禾口iUif _胃白勺: . 礎(chǔ))，，，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft GmbH,斯圖加特，1993，第 41-55 頁； 在 Peppas 禾口 Langer 編輯的 Biopolymers 1(生物聚合物 I)中 Doelker 的"Cellulose Derivatives (纖維素衍生物)，，1993，Springer-Verlag，柏林)。代表性的pH敏感聚合物的實(shí)施例包括聚丙烯酸以及其衍生物(包括，舉例來說，均聚物，例如聚氨基羧酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸，這些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和例如以上討論的丙烯酰類單體(acrylmonomer)的共聚物)。其他pH敏感的聚合物包括多糖例如醋酸鄰苯二甲酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素、醋酸偏苯三酸 (trimellilate)纖維素；以及殼聚糖。還有其他的pH敏感的聚合物包括pH敏感的聚合物和水溶性聚合物的任何混合物。相似地，聚合物載體可以被制成溫度敏感的形式(見，例如，Chen等人在受控釋放生物活性材料國際會議論文集22 :167-168中的“Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery (用于陰道藥物遞送的接枝到生物黏附的聚丙烯酸骨架上的新型溫敏普朗尼克水凝膠)”，Controlled Release Society, Inc. , 1995 ； Okano在受控釋放生物活性材料國際會議論文集22 :111-112中的”Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery(用于時間控制藥物釋放的刺激相應(yīng)水凝膠的分子設(shè)計)”Controlled Release Society, Inc.，1995 Johnston 等人 Pharm. Res.(藥物研究)9 (3) :425-433,1992 ；Tung, Int ‘ 1 J. Pharm.(國際藥物雜志)107 :85-90,1994 ；Harsh 和 Gehrke，J. ControlledRelease (受控釋放雜志)17 :175-186,1991 ；Bae 等人，Pharm. Res.(藥物研究)8 ) :531-537, 1991 ；Dinarvand 禾口 D ‘ Emanuele, J. Controlled Release(受控釋放雜志)36 221-227,1995 ；Yu 禾口 Grainger, “ Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels Poly N-isopropylacryIamide-co-sodium aerylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Physicochemical Characterization (新型熱敏型兩親性凝膠聚 N-異丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸鈉-共聚-n-N-烷基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)合成和物理化學(xué)表征)”，Oregon Graduate Institute of Science & Technology 化學(xué)和生物科學(xué)系，，俄勒岡州，比弗頓，第 820-821 頁；Zhou 和 Smid, "Physical Hydrogels of Associative Star Polymers(締合型星狀聚合物的物理水凝膠)”，紐約州立大學(xué)環(huán)境科學(xué)和林業(yè)學(xué)院化學(xué)系聚合物研究所，紐約州錫拉丘茲(Syracuse)，第822-823頁；Hoffman等人，"Characterizing Pore Sizes and Water' Structure 'in Stimuli-Responsive Hydrogels (刺激響應(yīng)性水凝膠中孔徑和水’結(jié)構(gòu)’的表征)”，華盛頓大學(xué)生物工程中心， 華盛頓州西雅圖，第擬8 頁；Yu 和 Grainger，"Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks :Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels (交聯(lián)N-異丙基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)中的熱敏膨脹行為陽離子、陰離子和兩性水凝膠)”，Oregon Graduate Institute of Science & ^Technology 化學(xué)和生物科學(xué)系，俄勒岡州比弗頓，第 829-830 頁；Kim 等人，Pharm. Res.(藥物研究)9(3) :283-290,1992 ；Bae 等人，Pharm. Res.(藥物研究)，8(5) :624-628,1991 ；Kono 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)30 :69-75,1994 ；Yoshida 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)32 97-102,1994 ；Okano 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)36 :125-133,1995 ； Chun 和 Kim，J. Controlled Release (受控釋放雜志)38 :39-47,1996 ；D ‘ Emanuele 和 Dinarvand, Int ‘ 1 J. Pharm.(國際藥物雜志)118 :237-242,1995 ；Katono 等人， J. Controlled Release (受控釋放雜志)16 :215-228,1991 ；在 Migliaresi 等人編輯的 "Polymers in Medicine ( El^ψ) ΙΙΓ' Φ Hoffman ^ "Thermally Reversible
Hydrogels Containing Biologically Active Species (含生物活性物種的熱可逆水凝膠)”，Elsevier Science Publisher B. V.，阿姆斯特丹，1988，第 161-167頁；在第三屆藥物遞送系統(tǒng)新進(jìn)展國際研討會，猶他州鹽湖城，1987年2月M-27日，第四7-305頁，Hoffman 的"Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics (在治療學(xué)和診斷學(xué)中熱可逆聚合物和水凝膠的應(yīng)用)” ；Gutowska 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)22 :95-104,1992 ；Palasis 和 Gehrke, J. Controlled Release (受控釋放雜志)18 :1-12,1992 ；PaavoIa 等人，Pharm. Res.(藥物研究)12(12) 1997-2002，1995)。 熱膠凝聚合物的代表性實(shí)施例以及其凝膠溫度(LCST(攝氏度))包括均聚物， 例如聚(N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19. 8 ；聚(N_n-丙基丙烯酰胺)，21. 5 ；聚(N-甲基-N-異丙基丙烯酰胺)，22. 3 ；聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)二8. O ；聚(N-異丙基丙烯酰胺)，30.9 ；聚(N，n-二乙基丙烯酰胺)，32.0 ；聚(N-異丙基甲基丙烯酰胺)，44. O ；聚(N-環(huán)丙基丙烯酰胺)，45. 5;聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50.0;聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰胺)， 56.0 ；聚(N-環(huán)丙基甲基丙烯酰胺)，59.0 ；聚(N-乙基丙烯酰胺)，72. O。此外，熱膠凝聚合物可以由制備以上兩種(多種)單體之間的共聚物而制得，或者通過組合這些均聚物和其他的水溶性聚合物而制備，所述水溶性聚合物例如丙烯酰類單體(例如，丙烯酸及其衍生物，例如甲基丙烯酸、丙烯酸酯和其衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺，以及N-n-丁
12基丙烯酰胺)。其他熱膠凝聚合物的代表性實(shí)施例包括纖維素醚衍生物，例如羥丙基纖維素，41攝氏度；甲基纖維素，55攝氏度；羥丙基甲基纖維素，66攝氏度；以及乙基羥乙基纖維素和普朗尼克類，如F-127，10-15攝氏度；L-122，19攝氏度；L_92，26攝氏度；L_81，20攝氏度；以及1^-61，對攝氏度。可以通過本發(fā)明的聚合物載體制成各種形式，包括例如棒形的設(shè)備、小丸、厚片或膠囊(見，例如，Goodell等人，Am. J. Hosp. Pharm.(美國醫(yī)院藥學(xué)雜志)43 :1454-1461, 1986 ； 在 Biomedical Polymer, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical he (生物醫(yī)學(xué)聚合物，生物醫(yī)學(xué)用途的聚合物材料和藥物)中的Langer等人，"Controlled release of macromolecules from polymers (從聚合物受控釋放大分子)”，Goldberg, Ε. P.，Nakagim, Α.編輯，Academic Press，第 113-137 頁，1980 ；Rhine 等人，J. Pharm. Sci.(藥物科學(xué)雜志)69 :265-270,1980 ；Brown 等人，J. Pharm. Sci.(藥物科學(xué)雜志)72 :1181-1185,1983 ；以及 Bawa 等人，J. Controlled Release (受控釋放雜志)1 259-267，1985)。治療劑可以通過包藏(occlusion)在聚合物基質(zhì)中，通過共價連接而束縛，或者包封在微膠囊里而被連接。在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療組合物以非膠囊配方形式提供，所述非膠囊配方形式例如微球(尺寸從納米到微米)，各種尺寸的糊劑和細(xì)絲 (thread)、膜和噴霧。本發(fā)明的另一方面是提供治療組合物和動物飼料。本發(fā)明的治療組合物如上所述可以用聚合物載體包覆并隨后通過任何已知的將其施用于飼料的方法添加至飼料，所述的已知方法例如通過機(jī)械混合、噴霧等等。所述治療組合物包括，一用量的至少一種細(xì)菌素， 所述的用量對至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平是有效的，例如約0. 5克的一種或多種細(xì)菌素/100克，約1. 25克的聚合物載體(例如聚乙烯基吡咯烷酮)/100克， 以及約8. 6 %的稀釋劑(例如水/100克)，與可消化的任意顆粒狀組分混合，所述可消化的顆粒狀物包括，碾磨玉米籽粒、研磨谷粒(例如燕麥、小麥、蕎麥)、研磨水果(例如梨) 等。然后所述治療組合物以對至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平有效的量被添加到任意種類的動物飼料中，所述的有效的量例如，舉例來說細(xì)菌素對飼料的比例約1 10到約 1 100。為了本發(fā)明的目的，動物飼料的實(shí)例包括青飼料、青貯飼料、干青飼料、根、塊莖、 肉質(zhì)果、谷粒、種子、啤酒糟(brewer’ s grain)、果渣、啤酒酵母、蒸餾殘渣、碾磨副產(chǎn)品、生產(chǎn)糖、淀粉或油的副產(chǎn)品，以及各種食物廢料。該產(chǎn)品可以添加到用于牛、家禽、兔、豬、或羊飼養(yǎng)等的動物食料中?？梢耘c其他飼料添加劑混合用于這些家畜。下述實(shí)施例僅僅是為了進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，并非要限制由權(quán)利要求確定的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從約1. 0克肉仔雞的盲腸的粘膜表面分離出的兩種新的拮抗菌株，屎腸球菌菌株 50-52 (NRRL B-30746)以及倉鼠鏈球菌菌株760 (NRRL B-30745)，被懸浮在約IOml滅菌的 0. 85% (w/v)的鹽溶液(生理鹽水)中并加熱到約80°C約15分鐘。約0. IOml的約1 50 以及1 2500的懸浮液被鋪展涂布到平板計數(shù)瓊脂或MRS瓊脂上。平板在微需氧條件下在約37°C溫育約M小時。具有不同形態(tài)的菌落在MRS瓊脂上劃線。這些培養(yǎng)物在微需氧條件下在約37°C溫育約M小時。
菌株760在約37°C在MRS瓊脂上生長約M小時。所述菌株是兼性需氧菌和革蘭氏陽性球菌，可以在約37°C和45°C間生長。所述菌株在營養(yǎng)瓊脂或平板計數(shù)瓊脂上生長， 在約37°C需氧溫育約M小時后產(chǎn)生規(guī)則圓形、低凸起、略灰色的菌落，具有波狀邊緣，直徑約為2mm。菌株760的生物化學(xué)性質(zhì)由APJ 50CLH系統(tǒng)確定(Bio-Merieux，法國)。所述菌落分解乳糖、甘露醇、核糖、水楊苷、山梨糖醇、海藻糖、阿拉伯糖和蜜二糖。它略微水解棉子糖和菊糖(inulin)，不水解精氨酸和七葉苷。其不能α和β溶血。其在約6. 5%氯化鈉存在下不生長。該菌株是過氧化氫酶陰性的。菌株50-52在約37°C在MRS瓊脂上培育約M小時。所述菌株是兼性需氧菌和革蘭氏陽性球菌，能夠在營養(yǎng)瓊脂或平板計數(shù)瓊脂上生長，在約37°C需氧溫育約M小時后產(chǎn)生不規(guī)則圓形、低凸起、略灰色的菌落，具有波狀邊緣，直徑約為1mm。菌株50-52的生物化學(xué)性質(zhì)由EN-Coccus試驗(yàn)確定。所述菌株分解精氨酸、阿拉伯糖和甘露醇；不水解山梨糖、 山梨糖醇、蜜二糖、棉子糖和meticitose。其在約6. 5%氯化鈉存在下生長。用于評價菌株50-52和760拮抗活性的目標(biāo)細(xì)菌包括空腸彎曲桿菌(C. jejuni) NCTC11168，腸炎沙門氏菌(S. enteritidis)以及大腸桿菌(E. coli)0157:H7的分離物。在約5% O2、約10% CO2以及約85% N2的微需氧條件下，將空腸彎曲桿菌的培養(yǎng)物在含約5% 的部分細(xì)胞溶解血液的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上在約42°C下生長約M-48小時。其他的菌株在營養(yǎng)瓊脂上在約37°C下培育約M小時。評價分離物對彎曲桿菌的拮抗活性。將約 0. 2ml生理鹽水的懸浮液涂布到MRS瓊脂上并在約37°C溫育約M小時。切下約0. 5cm3的 MRS瓊脂立方塊并轉(zhuǎn)移到每塊板用約5% -10%的部分細(xì)胞溶液血液、約10mg/ml的利福平和約2. 5u/ml的多粘菌素補(bǔ)充的、用約IO7個細(xì)胞的空腸彎曲桿菌接種的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上。平板在如上面所描述的微需氧條件下在約42°C下溫育約對-48小時。通過測量空腸彎曲桿菌抑制區(qū)域的直徑的大小來評價拮抗活性。實(shí)施例2 由兩種拮抗菌株腸球菌50-52和鏈球菌760的培養(yǎng)物提取粗抗微生物制備物。在37°C下將拮抗物在約250ml的10 %的布氏肉湯中與誘導(dǎo)者菌株乳酸乳球菌菌株320(NRRLB-30744，如上)一起在需氧條件下培育約14小時。生產(chǎn)者菌株的濃度是約 106CFU/mL而誘導(dǎo)者菌株是約107CFU/mL。所得的培養(yǎng)物在約2，500Xg離心約10分鐘，去掉大部分活細(xì)胞。傾析掉的上清液與約60%的飽和硫酸銨混合并在約4°C溫育約M小時以沉淀細(xì)菌素化合物。在以約10，OOOXg離心約20分鐘后，沉降物被重新懸浮在約1. 5ml約 IOmM pH約7. 0的磷酸鈉緩沖液中，并對約2. 5L相同的緩沖液滲析過夜。所得溶液被稱為粗抗微生物制備物(CAP)。所述制備物的樣本通過經(jīng)過0. 22微米孔徑的濾膜(Millipore， 馬薩諸塞州貝德福德，USDA)滅菌。表1顯示使用和不使用誘導(dǎo)者菌株的細(xì)菌素生產(chǎn)。表1 使用和不使用誘導(dǎo)者菌株乳酸乳球菌菌株320的細(xì)菌素生產(chǎn)
權(quán)利要求
1.一種分離的由鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素，所述鏈球菌菌株具有NRRL B-30745的菌株的識別特征。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌素，具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
3.具有NRRLB-30745的識別特征的分離的倉鼠鏈球菌菌株。
4.一種治療組合物，包括(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌定植水平的有效量的至少一種分離的由鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素，所述鏈球菌菌株具有NRRL B-30745的菌株的識別特征；以及(b)合適的治療載體。
5.如權(quán)利要求4所述的治療組合物，其中所述細(xì)菌素具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
6.一種用于動物的治療性飼料，包括(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的一種由鏈球菌菌株生產(chǎn)的分離的細(xì)菌素，所述鏈球菌菌株具有NRRL B-30745的菌株的識別特征，(b)治療載體，以及(c)動物飼料。
7.如權(quán)利要求6所述的治療性飼料，其中所述一種細(xì)菌素具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
8.一種用于至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物中的定植水平的方法，包括將至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的包括至少一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素以及治療載體的治療組合物施用給動物，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746.NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識別特征。
9.如權(quán)利要求8所述的方法其中所述的細(xì)菌素具有選自由SEQID NO 1、SEQ ID N02 及其混合物組成的組的氨基酸序列。
10.具有NRRLB-30744的識別特征的乳酸乳球菌的分離菌株。
11.一種用于由細(xì)菌提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，包括(a)向產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌的培養(yǎng)物中添加細(xì)菌素提升量的乳酸乳球菌以形成共同培養(yǎng)物， 所述乳酸乳球菌具有NRRL B-30744的識別特征，以及(b)在大約37°C培養(yǎng)所述的共同培養(yǎng)物。
12.一種用于分離細(xì)菌素的方法，其包括(a)共同培養(yǎng)產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌以在培養(yǎng)介質(zhì)中生產(chǎn)細(xì)菌素，(b)通過離心收獲所述培養(yǎng)介質(zhì)和細(xì)胞以獲得上清液和細(xì)胞小團(tuán)，(c)將所述含細(xì)菌素的上清液應(yīng)用于疏水作用色譜柱以獲得分離的細(xì)菌素制備物，(d)在洗脫緩沖液中溫育所述來自步驟b的所述細(xì)胞小團(tuán)以形成第一混合物，(e)通過離心從所述細(xì)胞小團(tuán)與所述緩沖液分離細(xì)胞，(f)通過離子交換色譜從所述緩沖液分離細(xì)菌素。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述離子交換色譜使用SuperoseSP FF柱。
全文摘要
使用由新的腸球菌和鏈球菌菌株生產(chǎn)的新的腸球菌和鏈球菌細(xì)菌素來至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動物、尤其是禽類中的定植水平。
文檔編號C07K1/18GK102504017SQ201110410068
公開日2012年6月20日 申請日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者B·葉魯斯拉諾夫, E·斯韋托奇, E·米特西韋奇, I·米特西韋奇, J·萊恩, N·斯特恩, V·佩雷列金, V·列夫查克 申請人:國家應(yīng)用微生物和生物技術(shù)研究中心, 由農(nóng)業(yè)部部長代表的美利堅合眾國