專利名稱：一種制備香蘭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和化學(xué)領(lǐng)域，具體為制備香蘭素的方法，特別是以異丁香酚為底物，用血紅蛋白制備香蘭素的方法。
背景技術(shù)：
香蘭素是香子蘭花莢中的典型香味物質(zhì)，廣泛存在于自然界中，如在香莢蘭豆、秘魯香膏、丁香花蕾油中均有發(fā)現(xiàn)。作為一種廣譜型高檔香料，香蘭素廣泛應(yīng)用于食品、香料及醫(yī)藥領(lǐng)域，具有很大的市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿?。目前市?chǎng)上的香蘭素主要有兩種來(lái)源(1)以愈創(chuàng)木酚和木質(zhì)素為原料，運(yùn)用化學(xué)法進(jìn)行合成；( 從植物材料中運(yùn)用蒸餾、萃取等方法獲得天然香蘭素?；瘜W(xué)合成法得到的香蘭素價(jià)格便宜，但是隨著生活水平的提高和對(duì)健康的日益關(guān)注，人們對(duì)化學(xué)合成的香蘭素的安全性始終存在懷疑，各國(guó)對(duì)化學(xué)食品添加劑使用的限制規(guī)定越來(lái)越嚴(yán)格，因此市場(chǎng)上對(duì)天然香蘭素的需求量呈上升趨勢(shì)。由于香莢蘭等植物來(lái)源有限，受產(chǎn)地和自然因素的影響比較大，產(chǎn)量少，培育和處理過(guò)程復(fù)雜，造成天然香蘭素的價(jià)格高昂。美國(guó)和歐洲的立法機(jī)構(gòu)認(rèn)為采用生物細(xì)胞或其中的組成部分(如生物酶)等生物資源所生產(chǎn)的物質(zhì)均屬于天然產(chǎn)物。為了解決天然香蘭素來(lái)源有限、價(jià)格高昂的問(wèn)題，近年來(lái)人們發(fā)展了運(yùn)用生物技術(shù)制備香蘭素的方法。生物技術(shù)方法可以利用微生物細(xì)胞或酶， 通過(guò)生物轉(zhuǎn)化或生物合成來(lái)制備香蘭素。1977年日本學(xué)者首次分離得到能夠?qū)⒍∠惴愚D(zhuǎn)化為香蘭素的微生物菌株，開(kāi)辟了生物法制備香蘭素新途徑。目前生物法制備香蘭素共有三條路線第一條是以阿魏酸為底物，運(yùn)用惡臭假單胞菌等微生物直接轉(zhuǎn)化制備香蘭素，或者采用兩步轉(zhuǎn)化工藝，首先由黑曲霉將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭酸，再由朱紅密孔菌將香蘭酸轉(zhuǎn)化為香蘭素。這條路線底物轉(zhuǎn)化濃度較高，是有發(fā)展?jié)摿Φ囊粭l路線。但是微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香草醛一般情況下香草醛只是代謝中間產(chǎn)物，會(huì)繼續(xù)降解而不易積累。另外由于阿魏酸的價(jià)格較高，利用這種方法生產(chǎn)出來(lái)的香蘭素價(jià)格也相對(duì)較高。第二條是以丁香酚或異丁香酚為底物，運(yùn)用微生物轉(zhuǎn)化制備香蘭素的方法，這一路線所需時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)量很低，還不具備競(jìng)爭(zhēng)力。第三條路線是以丁香酚或異丁香酚為底物，直接運(yùn)用酶催化的方法制備香蘭素， 這也是近年來(lái)的熱點(diǎn)發(fā)展方向之一。目前人們已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)香草醇氧化酶、脂肪酶、苯乙烯雙氧酶、脂氧合酶能夠催化丁香酚或異丁香酚制備香蘭素。從研究情況來(lái)看，雖然這些酶催化制備香蘭素的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，但底物價(jià)格低廉，且可以回收再利用，因此有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。為進(jìn)一步拓寬生物催化制備香蘭素的方法，有必要對(duì)其他生物酶轉(zhuǎn)化丁香酚或異丁香酚生產(chǎn)香蘭素的方法進(jìn)行深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以異丁香酚為底物，利用血紅蛋白催化制備香蘭素的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的采用血紅蛋白制備香蘭素的方法，包括下列步驟取血紅蛋白置于PH值為7 10 的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中，加入異丁香酚后，加入過(guò)氧化氫，在20 50°C 條件下恒溫振蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí)；磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液濃度為 0. 05 0. 2mol/L ；血紅蛋白與異丁香酚、過(guò)氧化氫的用量比為Ig 10 500mmol 0 IOmmol ； 優(yōu)選為 Ig 20 160mmol 0. 1 Immol ；反應(yīng)體系中血紅蛋白濃度為0. 01 50g/L，優(yōu)選為0. 04 5g/L ；異丁香酚的濃度為1 200mmol/L，優(yōu)選為10 160mmol/L ；；過(guò)氧化氫含量為0 50mmol/L，優(yōu)選為0. 1 lmmol/L ；振蕩反應(yīng)的速度為50 300轉(zhuǎn)/分，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為M 96小時(shí)。反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取、蒸干后得到目標(biāo)產(chǎn)物香蘭素。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于，采用血紅蛋白作為催化劑對(duì)異丁香酚進(jìn)行氧化反應(yīng)制備出香蘭素，香蘭素的產(chǎn)率可達(dá)45 %，遠(yuǎn)高于其他生物酶催化制備香蘭素的產(chǎn)率。催化劑來(lái)源廣泛，易于制備，價(jià)格低廉。反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)所需時(shí)間短，催化效果好。并且制備香蘭素過(guò)程無(wú)污染物排放，有利于保護(hù)環(huán)境，因此具有一定的工業(yè)應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取0.04g的血紅蛋白，懸浮于19.8ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L，pH 9.0)，加入1. 22mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過(guò)氧化氫溶液0. ^il，反應(yīng)混合物在30°C、160r/min 的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細(xì)管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應(yīng)72小時(shí)后，香蘭素的分析產(chǎn)率為45%。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。實(shí)施例2取0. 03g的血紅蛋白，懸浮于18ml Tri s_HCl緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入1. 83mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過(guò)氧化氫溶液^il，反應(yīng)混合物在30°C、200r/min 的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細(xì)管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應(yīng)72小時(shí)后，香蘭素的分析產(chǎn)率為34%。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，得到香實(shí)施例3取0. 02g的血紅蛋白，懸浮于20ml Tri s_HCl緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入3. 05mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過(guò)氧化氫溶液0. 02ml，反應(yīng)混合物在45°C、120r/ min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細(xì)管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應(yīng)60小時(shí)后，香蘭素的分析產(chǎn)率為23%。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，得到
香蘭素。實(shí)施例4
取0. 04g的血紅蛋白，懸浮于20ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 9. 0)，加入3. 05mmol異丁香酚，反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細(xì)管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應(yīng)72小時(shí)后，香蘭素的分析產(chǎn)率為22%。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。實(shí)施例5取0. 03g的血紅蛋白，懸浮于20ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)，加入1. 22mmol異丁香酚，反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細(xì)管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應(yīng)72小時(shí)后，香蘭素的分析產(chǎn)率為19%。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備香蘭素的方法，其特征在于，包括以下步驟取血紅蛋白和異丁香酚置于PH值為7 10的磷酸鹽緩沖溶液或TriS-HCl緩沖溶液中，加入過(guò)氧化氫，在20 50°C條件下恒溫振蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí)；血紅蛋白與異丁香酚、過(guò)氧化氫的用量比為Ig 10 500mmol 0 lOmmol。
2.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，血紅蛋白與異丁香酚、過(guò)氧化氫的用量比為 Ig 20 160mmol 0. 1 lmmol。
3.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中血紅蛋白的濃度為 0. 01 50g/L，異丁香酚的濃度為1 200mmol/L，過(guò)氧化氫的含量為0 50mmol/L。
4.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中血紅蛋白的濃度為 0. 04 5g/L，異丁香酚的濃度為10 160mmol/L，過(guò)氧化氫的濃度為0. 01 10mmol/L。
5.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中血紅蛋白的濃度為 0. 04 5g/L，異丁香酚的濃度為10 160mmol/L，過(guò)氧化氫的濃度為0. 01 10mmol/L。
6.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，振蕩反應(yīng)的速度為50 300轉(zhuǎn)/分。
7.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl 緩沖溶液濃度為0. 05 0. 2mol/L。
8.權(quán)利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，所述反應(yīng)時(shí)間為M 96小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備香蘭素的方法，是將血紅蛋白置于pH值為7～10的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中，加入異丁香酚后，滴加過(guò)氧化氫，在20～50℃條件下恒溫振蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3～96小時(shí)；血紅蛋白與異丁香酚、過(guò)氧化氫的用量比為1g∶10～500mmol∶0～10mmol。本方法的香蘭素產(chǎn)率可達(dá)45％，催化劑來(lái)源廣泛，易于制備，價(jià)格低廉。反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，條件溫和，時(shí)間短，催化效果好；并且無(wú)污染物排放，具有一定的工業(yè)應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)C07C47/58GK102367222SQ20111036394
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者徐毅, 白利杰, 陳建波 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)