專利名稱：抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的dna疫苗的制作方法
抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的DNA疫苗本申請(qǐng)是本申請(qǐng)是2003年3月21日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?3806701. 3 (PCT/ US2003/008810)，發(fā)明名稱為“抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的DNA疫苗”申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)是2000年1月27日提交的美國(guó)申請(qǐng)09/941974的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其要求 1999年1月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/117680的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)也對(duì)更早提交的臨時(shí)申請(qǐng)系列享有優(yōu)先權(quán)，分別是2002年3月22日提交的60/367128和2002年7月26日提交的 60/398985。
背景技術(shù)：
目前，有四種已知的腎綜合征出血熱(HFRS)相關(guān)的漢坦病毒屬病毒漢坦病毒 (HTNV)，多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)，普馬拉病毒(PUUV)，和漢城病毒(SEOV)。因?yàn)橥ǔ２煌臐h坦病毒屬病毒僅是由一個(gè)主要的嚙齒類宿主攜帶，因此，漢坦病毒屬病毒的分布一般就局限在那個(gè)宿主的范圍(Schmal john和Hje 11 e 1997年的綜述，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。黑線姬鼠(Apodemus agrarius)攜帶的HTNV在亞洲發(fā)現(xiàn)；黃頸鼠 (Apodemus flavicollis)攜帶的 DOBV 和歐鼠(Clethrionomys glareolus)攜帶的 PUUV 在歐洲發(fā)現(xiàn)。SEOV比其它任何已經(jīng)識(shí)別的漢坦病毒屬病毒散布得更廣泛，因?yàn)樗乃拗鳎胀ǖ亩际写笫?褐家鼠(Rattus norvegicus))可以在全世界范圍發(fā)現(xiàn)。在美洲，新的世界范圍的漢坦病毒屬病毒都和高致命疾病漢坦病毒肺癥候群 (HPS)的爆發(fā)相關(guān)。(Schmaljohn 和 Hjellel997 年的綜述，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。 這種疾病的特征是發(fā)熱，血管滲漏，從而導(dǎo)致非心源性肺水腫，接著出現(xiàn)休克。由絕大部分流行于北美和南美的漢坦病毒屬病毒，辛諾柏病毒(SNV)，安地斯病毒(ANDV)所引起的HPS 致死病例分別是30-50%。漢坦病毒屬(布尼亞病毒科)中的病毒都是包膜病毒，所含的基因組由三個(gè)單鏈 RNA區(qū)段組成，根據(jù)大小分別命名為大(L)，中(M)，小(S)區(qū)段(參考Schmaljohn 1996年的綜沭《布尼亞病毒科(TheBunyaviridae)》,R. M. Elliott編輯，紐約，Plenum出版社， 63-90頁(yè))。漢坦病毒屬病毒的L區(qū)段編碼依賴RNA的RNA聚合酶，M區(qū)段編碼兩個(gè)包膜糖蛋白(Gl和G2)，而S區(qū)段編碼核殼蛋白質(zhì)(N)。從細(xì)胞培養(yǎng)物或嚙齒類動(dòng)物大腦中，開(kāi)發(fā)了許多滅活的HFRS疫苗，并在亞洲進(jìn)行 7 測(cè)試(Lee 等人，1990，Arch. Virol.，增刊 1，35-47 ；Song 等人，1992，Vaccine 10， 214-216 ；Lu等人，1996，J. Med. Virol. 49，333-335)。傳統(tǒng)病毒滅活疫苗的缺點(diǎn)包括在病毒的生長(zhǎng)和操作中要求適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)。為了克服這些缺點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了涉及重組DNA技術(shù)的疫苗方法，包括痘苗載體疫苗(Schmaljohn 等人，1990，J. Virol. 64，3162-3170 ；Schmaljohn 等人， 1992，Vaccine 10，10-13 ；Xu 等人，1992，Am. J. Trop. Med. Hyg. 47，397-404)，在細(xì)菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白亞基疫苗(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，Arch. Virol. 130,365-376 ；Lundkvist 等人，1996，Virology 216，397-406)，和基于乙肝核心抗原的重組疫苗(Ulrich 等人，1998，Vaccine 16，272-280)。用表達(dá)HTNV或SEOV的M區(qū)段的重組痘苗接種，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，保護(hù)嚙齒類動(dòng)物不受HTNV和SEOV的感染，這表明僅僅對(duì)G1-G2的免疫反應(yīng)就能對(duì)動(dòng)物起保護(hù)作用(Schmaljohn 等人，1990，同上，Xu 等人，1992，同上，Chu 等人，1995，J. Virol. 69， 6417-642 。相似地，用在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的G1-G2蛋白接種(桿狀病毒重組系統(tǒng))，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，保護(hù)倉(cāng)鼠不受HTNV的感染(Schmaljohn等人，1990，同上)。在痘苗和桿狀病毒系統(tǒng)這兩種情況下，G1-G2接種比單獨(dú)用Gl或G2接種提供的保護(hù)更完全(Schmaljohn 等人，1990，同上)。在前述疫苗研究中，中和抗體對(duì)G1-G2的應(yīng)答與保護(hù)相關(guān)聯(lián)，表明中和抗體在預(yù)防漢坦病毒屬病毒感染中發(fā)揮了重要的作用。被動(dòng)轉(zhuǎn)移特異于Gl或G2的中和單克隆抗體(MAbs)能保護(hù)倉(cāng)鼠免受HTNV感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Arikawa等人， 1992，J. Gen. Virol. 70，615-6 )，支持了這樣的觀點(diǎn)，即中和抗體單獨(dú)也能發(fā)揮保護(hù)作用。N蛋白在防止?jié)h坦病毒屬病毒感染中也發(fā)揮了重要作用。用在細(xì)菌，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的N蛋白接種，或用作為嵌合的乙型肝炎病毒(HBV)核心粒子的N蛋白接種能保護(hù)嚙齒類動(dòng)物免受漢坦病毒屬病毒感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，同上，Lundkvist等人，1996，同上，Ulrich等人，1998，同上)。用表達(dá)S區(qū)段的重組痘苗病毒接種得到的結(jié)論比較少。表達(dá)HTNV S區(qū)段的構(gòu)建體并不能保護(hù)倉(cāng)鼠免受HTNV的感染，可能是因?yàn)镹的表達(dá)水平低(Schmaljohn等人，1990)；而表達(dá)SEOV S區(qū)段的構(gòu)建體能保護(hù)四種沙鼠中的三種免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。相似的，自從20世紀(jì)90年代中葉分離第一株HPS相關(guān)漢坦病毒屬病毒以來(lái)，抵御 HPS、基于基因疫苗的基礎(chǔ)研究就一直在進(jìn)行。有報(bào)道認(rèn)為候選DNA疫苗包括SNV M基因的大約500核苷酸序列，或全長(zhǎng)的S基因，是小鼠的免疫原(Miaradwaj等人，1999，Vaccine 17，2836-43)，而且在鹿鼠感染模型中能起到一些保護(hù)作用，免受SNV的感染 haradwaj等人，2002，J. Gen, Virol. 83，1745-1751)。這種保護(hù)被推測(cè)是細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)闆](méi)有令人信服的證據(jù)表明這些構(gòu)建體能誘導(dǎo)中和，或其他保護(hù)性抗體反應(yīng)。因此，現(xiàn)在不是很清楚單獨(dú)G1，單獨(dú)G2，或者糖蛋白的片段是否誘導(dǎo)出中和抗體， 并且防止感染。用只含有Gl或G2的重組桿狀病毒感染的細(xì)胞裂解產(chǎn)物以及只表達(dá)Gl或 G2的重組痘苗病毒接種，都不能誘導(dǎo)中和抗體，并且在倉(cāng)鼠感染模型中不能表示出完全的保護(hù)作用Gchmaljohn等人，1990)。盡管這些痘苗疫苗表示出了一些潛能，但重組的痘苗病毒疫苗和基于痘苗的疫苗表示出了一些不足，包括散布感染的能力，尤其是在無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體中，因?yàn)樵撘呙缬苫畈《窘M成。同樣，用這些病毒接種會(huì)導(dǎo)致病灶(痘疤)，這種病灶中含有感染的病毒。這些病灶的病毒會(huì)無(wú)意地向其他部位(如眼睛)或別的個(gè)體擴(kuò)散。此外，痘苗載體疫苗在以前接種過(guò)天花疫苗的人中具有很弱的免疫原性(McClain等人，2000，J.Med. Virol. 60，77-85)?；诙幻绲囊呙绲钠渌秉c(diǎn)包括由于淋巴結(jié)腫脹而導(dǎo)致的不適以及在接種部位留下疤痕。發(fā)明概述在本報(bào)告中，我們介紹了一種新的重組DNA疫苗方法，它涉及用表達(dá)單個(gè)漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段cDNA的裸露DNA接種。裸露DNA接種涉及到將帶有目的基因的質(zhì)粒 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到受接種者的組織中(參考Robinson和^Torres，1997，Semin. Immunol. 9， 271-283 ；禾口 Gregoriadis, 1998，Pharm, Res. 15，661-670)。這種疫苗方法比亞單位疫苗有優(yōu)點(diǎn)，亞單位疫苗不能誘導(dǎo)對(duì)防止已經(jīng)出現(xiàn)的感染或疾病所必需的細(xì)胞毒性反應(yīng)。DNA疫苗接種模仿從頭合成抗原，并且用活的疫苗獲得I型MHC限制的抗原呈遞，而沒(méi)有病原菌感染的危險(xiǎn)。此外，這種DNA疫苗方法允許疫苗進(jìn)入粘膜組織，粘膜組織能幫助抵抗病毒導(dǎo)入，因?yàn)椴《镜倪M(jìn)入可能通過(guò)粘膜組織。在我們的申請(qǐng)中，目的基因就是漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段，它被哺乳動(dòng)物或病毒啟動(dòng)子控制(例如巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子)，這些啟動(dòng)子有助于裸露DNA基因產(chǎn)物在受接種者細(xì)胞中的表達(dá)。這種胞內(nèi)表達(dá)能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(Robinson和 Torres, 1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。DNA轉(zhuǎn)移的方法包括接種針接種，口腔或肺部給藥，以及通過(guò)粒子轟擊法接種(即基因槍)。用這些方法中的每一種進(jìn)行DNA疫苗接種都能誘導(dǎo)出針對(duì)許多不同的病原菌，包括眾多病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)(Robinson和 Torres, 1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。然而，迄今為止，還沒(méi)有證明DNA疫苗能誘導(dǎo)抗?jié)h坦病毒屬病毒的免疫反應(yīng)，以及防止?jié)h坦病毒屬病毒感染。在本報(bào)告中，我們證明了用裸露的SEOV M或S基因組區(qū)段接種能誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物 SEOV特異的抗體反應(yīng)。更重要的是，我們還證明了用SEOV M區(qū)段接種能誘導(dǎo)中和抗體，并保護(hù)倉(cāng)鼠免受SEOV感染。也是在本申請(qǐng)中，我們報(bào)道了 HTNV M DNA疫苗的開(kāi)發(fā)。這種疫苗表達(dá)HTNV的Gl 和G2蛋白，誘導(dǎo)倉(cāng)鼠產(chǎn)生中和抗體，防止倉(cāng)鼠感染HTNV，SEOV和D0BV。此外，我們還證明了 SEOV MJPHTNVM DNA疫苗在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中能誘導(dǎo)高效價(jià)的中和抗體反應(yīng)。此外，我們介紹了第一個(gè)基于ANDV M基因的DNA疫苗的開(kāi)發(fā)和檢測(cè)，這種疫苗能誘導(dǎo)中和，或者其他保護(hù)性抗體反應(yīng)。這是意料之外的結(jié)果，因?yàn)樵撘呙缭趥}(cāng)鼠中既沒(méi)有免疫原性，也不是保護(hù)性的，而在獼猴中是免疫原性和保護(hù)性的。此外，對(duì)另外兩種HPS相關(guān)的漢坦病毒屬病毒辛諾柏病毒和黑渠港病毒的交叉保護(hù)作用是明顯的。本申請(qǐng)也介紹了一種漢他/安地斯病毒雙M基因的漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，含有HTNV和ANDV的M基因。這種疫苗在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中表示出免疫原性和保護(hù)作用。 這是第一個(gè)設(shè)計(jì)用來(lái)防止所有漢坦病毒屬病毒的DNA疫苗，包括HPRS相關(guān)和HPS相關(guān)的， 這些病毒能引起嚴(yán)重的疾病。檢測(cè)這種漢他/安地斯病毒雙M基因漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，pWRG/HA-M在獼猴中的免疫原性。這種疫苗能誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，該反應(yīng)能中和漢坦病毒和安地斯病毒(參看表8)。在單一的倉(cāng)鼠實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)這種質(zhì)粒和安地斯病毒質(zhì)粒相似， 因?yàn)樗趥}(cāng)鼠中不能誘導(dǎo)抗體反應(yīng)。然而，它在猴子中能誘導(dǎo)中和抗體的事實(shí)表明它在人體中能誘導(dǎo)中和抗體。此外，本申請(qǐng)也介紹了一種漢坦病毒屬病毒免疫球蛋白組合物，這種組合物有預(yù)防或治療作用，與漢坦病毒屬病毒接觸后，能防止?jié)h坦病毒屬病毒感染，和/或能治療漢坦病毒屬病毒疾病。目前，沒(méi)有特異的藥物或免疫治療手段來(lái)治療HPS或HFRS疾病，或施用給可能暴露在漢坦病毒屬病毒中或患漢坦病毒屬病毒疾病的人。本發(fā)明的漢坦病毒屬病毒免疫球蛋白組合物由多克隆抗血清組成，這種血清來(lái)自接種了 DNA疫苗的動(dòng)物/人群，DNA 疫苗包括一種能表達(dá)安地斯病毒和/或漢坦病毒M基因的質(zhì)粒。這種多克隆血清含有中和抗體，能預(yù)防安地斯病毒和/或漢坦病毒。不像常規(guī)的多克隆免疫血清產(chǎn)品，用在本發(fā)明的方法(產(chǎn)生靈長(zhǎng)類動(dòng)物抗體的受接種者的DNA疫苗接種)并不涉及活病毒，而且不要求識(shí)別從漢坦病毒屬病毒疾病中幸存下來(lái)的患者。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗含有漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種SEOV漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗含有如SEQ ID NO :1所示的SEOV M基因組區(qū)段或如SEQ ID NO :2所示的SEOV S 區(qū)段。本發(fā)明也涉及HTNV漢坦病毒屬病毒DNA疫苗，這種疫苗包括HTNVM基因組區(qū)段，如 Genebank登錄號(hào)M14627的2-3565這一段延伸序列所示。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及到ANDV DNA 疫苗，它包括ANDV M基因組區(qū)段，如Genebank登錄號(hào)AF291703的2-3671這一段延伸序列所示。本發(fā)明也涉及到HTNV/ANDV疫苗，這種疫苗含有SEQ ID NO :3的HTNV M基因組區(qū)段和SEQ ID NO :4的ANDV M基因組區(qū)段。上面介紹的漢坦病毒屬病毒DNA片段可以單獨(dú)作為DNA疫苗的一部分呈遞給供試者，或者和其他漢坦病毒屬病毒DNA片段一起呈遞給供試者，而不管它們是組合在相同還是不同的構(gòu)建體上。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在供試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)防止?jié)h坦病毒屬病毒的方法，該方法包括給供試者施用一種含有漢坦病毒屬病毒基因組區(qū)段的DNA片段。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)提供SEOV M或S基因組區(qū)段來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)防止SEOV病毒的方法，通過(guò)提供HTNV M基因組區(qū)段來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)防止HTNV病毒的方法，通過(guò)提供ANDV M 基因組區(qū)段來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)防止ANDV病毒的方法。交叉保護(hù)防止別的漢坦病毒屬病毒如漢坦病毒和多布拉伐病毒或辛諾柏病毒和黑渠港病毒也是本發(fā)明的一個(gè)目的。提供一種DNA疫苗也是本發(fā)明的一個(gè)目的，該疫苗是漢坦病毒M基因DNA疫苗與安地斯病毒M基因DNA疫苗的結(jié)合，通過(guò)給供試者提供這種DNA疫苗，使每個(gè)M基因在供試者中表達(dá)，從而誘導(dǎo)抗HFRS和HFS漢坦病毒屬病毒的免疫反應(yīng)，并能防止所有能引起嚴(yán)重疾病的漢坦病毒屬病毒。漢坦病毒M基因或安地斯病毒M基因可以單獨(dú)給藥，即通過(guò)單獨(dú)的載體給藥，或者如本發(fā)明的一個(gè)方面所介紹的那樣可以結(jié)合在同一個(gè)載體上。此外，為了制造一種多價(jià)的疫苗，可以將別的漢坦病毒屬病毒，如普馬拉病毒的M基因區(qū)段同漢坦病毒DNA疫苗以及安地斯DNA疫苗結(jié)合，這種多價(jià)病毒能提供額外的保護(hù)，防止?jié)h坦病毒屬病毒感染。在本發(fā)明的一個(gè)方面，DNA疫苗的轉(zhuǎn)移方法是在一個(gè)小的載體粒子上涂上DNA疫苗，通過(guò)粒子轟擊法將涂有DNA疫苗的粒子轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的表皮組織。這個(gè)方法適用于將DNA 疫苗轉(zhuǎn)移到表皮或粘膜組織，或轉(zhuǎn)移到外周血細(xì)胞，而且可以在接種個(gè)體中用于誘導(dǎo)體液， 細(xì)胞介導(dǎo)的，以及是分泌的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的DNA疫苗本質(zhì)上是安全的，給藥時(shí)不痛苦，而且不會(huì)給接種的個(gè)體帶來(lái)不利的副作用。此外，本發(fā)明不要求生長(zhǎng)或使用漢坦病毒屬病毒，這會(huì)通過(guò)空氣懸浮粒子傳輸進(jìn)行擴(kuò)散。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種靈長(zhǎng)類動(dòng)物多克隆血清組合物，這種組合物含有中和抗體，針對(duì)至少一種，優(yōu)選的是兩種或多種漢坦病毒屬如安地斯病毒和/或漢坦病毒的M區(qū)段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在功能上和上述抗體等效的抗體。這些功能上等效的抗體和上下文介紹的抗體基本上共享至少一種主要功能特性，包括體外免疫反應(yīng)活性，預(yù)防性給藥或治療用給藥時(shí)能防止?jié)h坦病毒屬病毒攻擊，競(jìng)爭(zhēng)Gl和/或G2上同一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。抗體可以是諸如IgG，IgM，或IgA中的任何一類或諸如IgGl，IgG2a以及別的本領(lǐng)域已知的亞類中的任何一亞類。此外，可以通過(guò)任何方法來(lái)制造抗體，如噬菌體展示，或在任何生物或細(xì)胞系中制造抗體，包括細(xì)菌，昆蟲(chóng)，哺乳動(dòng)物或別的能產(chǎn)生具所需特征的抗體，如人源化抗體的細(xì)胞類型或細(xì)胞系。將來(lái)自不同物種的Fab部分和Fc部分結(jié)合在一起也能形成抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明血清或抗體混合物給需要這種治療的供試者來(lái)治療或預(yù)防漢坦病毒屬病毒感染。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供被動(dòng)疫苗用于治療或預(yù)防漢坦病毒屬病毒感染，這種疫苗包括治療或預(yù)防有效量的能防止?jié)h坦病毒屬病毒疾病的本發(fā)明抗體以及可藥用的載體或賦型劑。本發(fā)明的另一個(gè)目是提供一種用于診斷漢坦病毒屬病毒感染的方法，即通過(guò)使用本發(fā)明的抗體測(cè)試樣品中漢坦病毒屬病毒的存在。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的含有本發(fā)明抗體的用于檢測(cè)漢坦病毒屬病毒感染的免疫探針和檢測(cè)試劑盒。對(duì)于免疫探針，抗體直接或間接地連接到合適的報(bào)告分子如酶或放射性核素上。檢測(cè)試劑盒包括一個(gè)容器，容器中容納了一或多種本發(fā)明的抗體，還包括抗體使用說(shuō)明書(shū)，目的是使抗體結(jié)合到漢坦病毒屬病毒形成免疫復(fù)合物，并檢測(cè)免疫復(fù)合物的形成，這樣就將免疫復(fù)合物的存在與否和漢坦病毒屬病毒的存在與否聯(lián)系起來(lái)了。附圖簡(jiǎn)述參考下列說(shuō)明書(shū)，隨附的權(quán)利要求書(shū)及附圖，可以更好的理解本發(fā)明的特征，方面以及優(yōu)點(diǎn)，這些附圖是

圖1 裸露SEOV DNA表達(dá)構(gòu)建體。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增SEOV M或S基因組區(qū)段， 并將其克隆到 PWRG7077 的 NotI 和 BamHI 位點(diǎn)(PowderJect Vaccines 公司，Madison, Wisconsin，在khmaljohn等人1997年的文章中介紹了，同上)。pffRG7077的特征和以前介紹的PWRG1602的特征相似(Dimmock,N. J.，1995,Med. Virol. 5 :165)，并且包括一個(gè)人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(CMV IE啟動(dòng)子)和內(nèi)含子A，牛生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)錄終止子，多腺苷酸化信號(hào)序列(BGH pA)，以及卡那霉素抗性基因。CMV IE啟動(dòng)子巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子和內(nèi)含子A，BGHpA 牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)，KAN 卡那霉素抗性基因。圖 2A和 2B :pWRG/SE0_M(SEQ ID NO 3)和 pWRG/SEO-S (SEQID NO 4)的瞬時(shí)表達(dá)。 A)在轉(zhuǎn)染了 SEOV M或S構(gòu)建體的單層COS細(xì)胞中進(jìn)行IFAT。轉(zhuǎn)染了 pWRG/7077的單層細(xì)胞用作陰性對(duì)照?？筍EOV多克隆兔抗血清用作一級(jí)抗體。B)用所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，放射性標(biāo)記的表達(dá)產(chǎn)物用抗SEOV多克隆兔血清進(jìn)行免疫沉淀。kDa大小的分子標(biāo)準(zhǔn)(MW)表示在左邊，而SEOV G1，G2和N蛋白的位置表示在右邊。圖3A和;3B:通過(guò)基因槍或接種針肌內(nèi)接種了裸露SEOV DNA的小鼠的抗體反應(yīng)(ELISA)。用ELISA評(píng)估通過(guò)基因槍或接種針肌內(nèi)接種了 pWRG/SEO-M(圖A)或 pWRG-SEO-S (圖B)的抗體反應(yīng)。接種了陰性對(duì)照質(zhì)粒PWRG7707的小鼠通過(guò)兩次ELISA進(jìn)行評(píng)估。預(yù)放血前的血清，第一次接種(Ivacc)后4周收集的血清，第二次接種(2vaCC)后 4周收集的血清，最后一次接種(3vaCC)后3周收集的血清在一次試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)。符號(hào)表示的是單個(gè)小鼠血清樣品雙重檢測(cè)的平均值。圖4 接種了裸露SEOV DNA的小鼠的中和抗體反應(yīng)。在用基因槍或接種針肌內(nèi)注射(接種針)進(jìn)行第三次接種后3周收集的小鼠血清樣品進(jìn)行PRNT。柱形表示的是接種了所示免疫原的單個(gè)小鼠血清。加熱滅活血清(56°C，30分鐘)，并且在5%豚鼠補(bǔ)體存在的情況下進(jìn)行試驗(yàn)。PRNT5(I%效價(jià)表示成導(dǎo)致噬菌斑減少50%時(shí)最高血清稀釋度的倒數(shù)。圖5 接種pWRG/SEO-M能交叉保護(hù)防止?jié)h坦病毒感染。根據(jù)下面介紹的方法用pWRG/SEO-M或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7707)對(duì)分組倉(cāng)鼠接種，每組倉(cāng)鼠4_5只。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的漢坦病毒攻擊倉(cāng)鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對(duì)攻擊前和攻擊后的血清樣品進(jìn)行評(píng)估，方法是通過(guò)抗NELISA檢測(cè)核殼的抗體，以及通過(guò)漢坦病毒噬菌斑降低中和測(cè)驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)漢坦病毒中和抗體。ELISA效價(jià)表示的是使得OD值比背景OD值+標(biāo)準(zhǔn)差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50%效價(jià)表示的是在血清缺乏的情況下導(dǎo)致噬菌斑數(shù)目減少50%的最低稀釋度倒數(shù)。圖6 用pffRG/SEO-M接種能交叉保護(hù)防止多布拉伐病毒感染。根據(jù)介紹的方法， 用pWRG/SEO-M或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7077)對(duì)分組倉(cāng)鼠進(jìn)行接種，每組5只倉(cāng)鼠。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的多布拉伐病毒攻擊倉(cāng)鼠。攻擊后28天，獲得攻擊后血清樣品。對(duì)攻擊前和攻擊后的血清樣品進(jìn)行評(píng)估，方法是通過(guò)抗N ELISA檢測(cè)核殼的抗體，以及通過(guò)多布拉伐病毒噬菌斑降低中和測(cè)驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)多布拉伐病毒的中和抗體。ELISA效價(jià)表示的是使得OD值比背景OD值+標(biāo)準(zhǔn)差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50%效價(jià)表示的是在血清缺乏的情況下導(dǎo)致噬菌斑數(shù)目減少50%的最低稀釋度倒數(shù)。漢城病毒攻擊前的中和抗體效價(jià)(由疫苗誘導(dǎo))也被檢測(cè)。漢城病毒的PRNT80%值表示成空環(huán)。圖7 用pWRG/SEO-M接種不能交叉保護(hù)防止普馬拉病毒感染。根據(jù)介紹的方法，用 pWRG/SEO-M或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7077)對(duì)分組倉(cāng)鼠進(jìn)行接種，每組5只倉(cāng)鼠。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的普馬拉病毒攻擊倉(cāng)鼠。攻擊后28天， 獲得攻擊后血清樣品。對(duì)攻擊前和攻擊后的血清樣品進(jìn)行評(píng)估，方法是通過(guò)抗N ELISA檢測(cè)核殼的抗體，以及通過(guò)普馬拉病毒噬菌斑降低中和測(cè)驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)普馬拉病毒的中和抗體。ELISA效價(jià)表示的是使得OD值比背景OD值+標(biāo)準(zhǔn)差3大的最低稀釋度倒數(shù)。PRNT50% 效價(jià)表示的是在血清缺乏的情況下導(dǎo)致噬菌斑數(shù)目減少50%的最低稀釋度倒數(shù)。漢城病毒攻擊前的中和抗體效價(jià)(由疫苗誘導(dǎo))也被檢測(cè)。漢城病毒的PRNT80%值表示成空環(huán)。圖8 =HTNV Gl和G2的瞬時(shí)表達(dá)。用pWRG/HTN_M或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7077) 轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞，并在24小時(shí)后，用RIPA制備用于分析的放射性標(biāo)記的細(xì)胞裂解液。用抗 HTNV的多克隆小鼠超免疫腹水(HTNV HMAF)，即Gl特異的MAb (Mab 6D4)，或G2特異的 MAb (Mab-23G10)免疫沉淀表達(dá)產(chǎn)物。分子標(biāo)準(zhǔn)(M)在左邊表示成kDa大小，而Gl和G2的位置表示在右邊。圖9々，98，9(，90:有效表達(dá)61要求上游外源序列。(A)含有SEOV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/SEO-M的示意圖，表示的是載體NotI位點(diǎn)和SEOV Gl起始密碼子之間的核苷酸序列[SEQ ID NO 5]。NotI位點(diǎn)后是來(lái)自以前的克隆方法的24個(gè)外源的核苷酸[SEQ IDNO 6]，這些核苷酸后接的是SEOV M反基因組5’非編碼區(qū)，從位置2開(kāi)始。漢坦病毒屬病毒M 基因被克隆進(jìn)PWRG7077的NotI-BamHI位點(diǎn)，或NotI-BglII位點(diǎn)。G1/G2，編碼Gl和G2糖蛋白的開(kāi)放閱讀框，CMV IE內(nèi)含子A，巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子，后面接著內(nèi)含子A序列， KANr 卡那霉素抗性基因，BGH polyA 牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)。⑶外源序列的改變能影響SEOV Gl的表達(dá)。用pWRG/SEO-M (SEO-M)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :6)，或有如下變化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞去掉外源序列(0)；恢復(fù)外源序列(1-24)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 6)；反向放置外源序列(24-1)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 7)；去掉外源序列的3’部分(1-12)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :6的核苷酸1_12)；去掉外源序列的5’部分(13-24)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 6的核苷酸13-24)；在外源序列的 9，10位用CC取代AG (1-24)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ IDNO :6，這個(gè)序列的9，10位用CC 取代了 AG)。用多克隆兔抗SEOV抗體進(jìn)行免疫沉淀，抗SEOV抗體含有Gl特異的和G2特異的抗體(1)，或G2特異多克隆抗體池(3)。在載體的NotI位點(diǎn)和SEOV M基因非翻譯區(qū)的位置2之間的序列如圖所示。Δ表示外源序列被去掉了。有下劃線的GGATCTGC(SEQ ID NO 6的核苷酸1-8)是和Gl有效表達(dá)相關(guān)的最小未改變序列。(C)如果外源基因的1-8位核苷酸，GGATCTGC(SEQ ID NO 6的1_8位核苷酸)包括在NotI位點(diǎn)和SEOV M非編碼區(qū)之間，Gl就能恢復(fù)有效表達(dá)。用pWRG/SEO-M(SEO-M)或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，所述質(zhì)粒去掉了外源基因(0)；恢復(fù)了外源序列(1-24) (SEQ ID NO 6)；或外源序列截短了 (1-8) (SEQ ID NO 6的1-8位核苷酸)。用多克隆兔抗SEOV抗體進(jìn)行免疫沉淀，抗SEOV抗體含有Gl特異的和G2特異的抗體(1)，G1特異的MAb池O)，或G2特異的MAb-IlElO (3)。(D)去掉外源序列能影響HTNV Gl表達(dá)。用含HTNV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒，pWRG/HTN_M(x) (HTN-M)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :6)，或有下列變化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞去掉外源序列(0)；恢復(fù)外源序列(1-24)(在這欄中的序列對(duì)應(yīng)SEQID NO 6)。用抗HTNV的小鼠超免疫腹水進(jìn)行免疫沉淀，超免疫腹水含有Gl特異的和G2特異的抗體(1)，Gl特異的MAb池O)，或G2 特異的MAb-IlElO (3)。分子標(biāo)準(zhǔn)(M)在左邊表示成kDa大小，而Gl和G2的位置表示在右邊。圖 10 表達(dá) Gl 和 G2 的質(zhì)粒 pWRG/HTNV-M (χ)的示意圖。pWRG/HTNV-M (χ)采用了 hCMV立即早期啟動(dòng)子和外顯子1和2的5’非編碼區(qū)，在它們之間有一個(gè)天然插入的內(nèi)含子A。漢坦病毒M基因5'開(kāi)放閱讀框(ORF)之前有漢坦病毒M基因的非翻譯區(qū)(UTR)，而后面是漢坦病毒M基因的3’ -UTR。我們發(fā)現(xiàn)的外源序列對(duì)Gl有效表達(dá)是必要的，它介于內(nèi)含子A和漢坦病毒5’UTR之間。牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)(BGH polyA)有助于轉(zhuǎn)錄終止。質(zhì)粒骨架是PUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。圖11 用表達(dá)HTNV Gl和G2的質(zhì)粒DNA接種能防止HTNV感染。這張圖結(jié)合了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一組倉(cāng)鼠(659-666)用pWRG/HTN-M接種，而第二組陰性對(duì)照(667-674)用載體質(zhì)粒PWRG7077接種。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一組倉(cāng)鼠(2101-2108) 用pWRG/HTN-M (χ)接種，而第二組陰性對(duì)照(2109-2116)沒(méi)有接種。最后接種后3周，收集攻擊前的血清，并用HTNV攻擊倉(cāng)鼠。攻擊后觀天收集攻擊后血清。用抗N ELISA檢測(cè)攻擊前和攻擊后血清中N特異的抗體，而用PRNT檢測(cè)中和抗體。每個(gè)倉(cāng)鼠攻擊前和攻擊后， 終點(diǎn)抗體效價(jià)如圖所示。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，攻擊前的同型PRNT8(I%效價(jià)按從最高到最低，從左到右進(jìn)行分類。圖12 :12A，12B，12C，12D和12E 交叉保護(hù)。倉(cāng)鼠用圖示質(zhì)粒(含有外源序列的 pffRG/SEO-M, pWRG/HTN-M (χ)或陰性對(duì)照質(zhì)粒)接種，然后用圖示的病毒攻擊。圖Α，圖B和圖C中的陰性對(duì)照倉(cāng)鼠用基于pWRG7077的質(zhì)粒接種，而圖D和圖E中的陰性對(duì)照倉(cāng)鼠不接種。用抗N ELISA檢測(cè)攻擊前和攻擊后血清樣品中的抗N抗體，并用PRNT檢測(cè)中和抗體。 同型病毒的PRNT8(I%效價(jià)和異型病毒的PRNT5(I%也檢測(cè)了。攻擊前和攻擊后，每個(gè)倉(cāng)鼠的終點(diǎn)抗體效價(jià)如圖所示。攻擊前的同型PRNT8(I%效價(jià)(從最高到最低，從左到右進(jìn)行分類)表示成帶符號(hào)的線。每只倉(cāng)鼠的識(shí)別代碼表示在X軸上。倉(cāng)鼠943，944，945和948的HTNV PRNT 和抗 N ELISA 數(shù)據(jù)以前發(fā)表了(Kamrud 等人，1999，Virology，263，209-219)。
圖13 用表達(dá)SEOV或HTNV Gl和G2的質(zhì)粒DNA接種，在獼猴中能誘導(dǎo)高效價(jià)的中和抗體反應(yīng)。根據(jù)所述方法中所示的路線，用pWRG/SE0-M(x)，pffRG/HTN-M(x)或rVV/ HTN-M+S接種獼猴。接種前收集血清樣品(P)，然后在第一次(1)，第二次(2)，和第三次(3) 接種后3周收集血清樣品。在最后一次接種后2個(gè)月(a)，4個(gè)月(b)，和6個(gè)月(c)后也收集血清。PRNT效價(jià)表示的是中和病毒噬菌斑數(shù)80%或50%血清稀釋度的倒數(shù)，每只猴子的識(shí)別代碼表示在各自的圖下面。圖14 猴子中中和抗體反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。由DNA疫苗接種所誘發(fā)的中和抗體反應(yīng)仍在最后接種后8個(gè)月的獼猴中檢測(cè)到了。用所示疫苗接種的獼猴在每次接種后3周放血， 然后在最后接種后2，4，6和8個(gè)月(分別是14，22，30和38周)放血。用PRNT對(duì)第一次接種后所示的周(0周)的同源中和抗體反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。每一條線代表一只猴子。第9周的數(shù)據(jù)在圖13也表示了。圖15 在倉(cāng)鼠/ANDV致死病模型中評(píng)估HFRS DNA疫苗。用pWRG/HTN_M (χ)或陰性對(duì)照質(zhì)粒PWRG7077接種倉(cāng)鼠，然后用ANDV攻擊。對(duì)于死亡的動(dòng)物，死亡日期用圓括號(hào)表示。從第一次攻擊后幸存下來(lái)的動(dòng)物繼續(xù)用ANDV進(jìn)行第二次攻擊。用PRNT對(duì)攻擊當(dāng)天 (攻擊前)，攻擊后4-6周(攻擊后)，以及第二次攻擊后28-48周(重新攻擊后)收集的血清樣品檢測(cè)HTNV和ANDV特異的MAbS。柱子表示PRNT效價(jià)。倉(cāng)鼠識(shí)別代碼(ID#) 68-91 以及501-523表示的是兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)；N表示沒(méi)有做。圖16 質(zhì)粒pWRG/AND-M的示意圖。pWRG/AND_M采用了 hCMV立即早期啟動(dòng)子和外顯子1和2的5'非編碼區(qū)，在它們之間有一個(gè)天然插入的內(nèi)含子A。安地斯病毒M基因開(kāi)放閱讀框(ORF)之前有安地斯病毒M非翻譯區(qū)(UTR)，而后面是安地斯病毒M基因的3’-UTR 序列。我們發(fā)現(xiàn)的外源序列對(duì)Gl有效表達(dá)是必要的，它介于內(nèi)含子A和安地斯病毒5’UTR 之間。牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)(BGH polyA)有助于轉(zhuǎn)錄終止。質(zhì)粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。圖 17A，17B 禾Π 17C :pWRG/AND_M 的表達(dá)。Α)用 pWRG/AND-M(+)或空的質(zhì)粒 pffRG7077(-)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，然后用阿根廷或美國(guó)的HPS康復(fù)期血清對(duì)來(lái)自COS細(xì)胞的放射標(biāo)記的蛋白進(jìn)行免疫沉淀。B)用pWRG/AND-M，pffRG7077轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，或用ANDV轉(zhuǎn)染 VeroE6細(xì)胞，然后用阿根廷(抗ANDV的人)的HPS康復(fù)期血清對(duì)來(lái)自COS細(xì)胞或Vero E6 細(xì)胞的蛋白進(jìn)行免疫沉淀。C)用pWRG/AND-M (χ) (H)或pWRG/AND(A)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，用指定的HTNV特異的MAbs，HTNV特異的小鼠超免疫腹水(HTN-poly)或阿根廷(AND-poly)的 HPS康復(fù)期血清對(duì)來(lái)自COS細(xì)胞的蛋白進(jìn)行免疫沉淀。+表示Gl或G2被免疫沉淀了，-表示沒(méi)有蛋白被免疫沉淀了，而*表示Gl和G2都被免疫沉淀了。分子標(biāo)準(zhǔn)(M)在左邊表示成kDa大小，而Gl，G2和N的位置表示在右邊。圖18A，18B和18C 漢坦病毒屬病毒DNA疫苗在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的免疫原性。 A)用pWRG/HTN-M(x)，pWRG/AND-M，或陰性對(duì)照質(zhì)粒接種獼猴。在第一次接種之前(P)，以及在第一次，第二次，第三次和第四次接種后3周分別收集血清。進(jìn)行HTNV-，ANDV-, BCCV-, 以及SNV特異的PRNT，并確定終點(diǎn)50 %和80 %的效價(jià)。B)對(duì)用pWRG/AND-M接種四次之前(放血前)和之后(接種后)收集的猴子CH69的血清，利用轉(zhuǎn)染了 pWRG/AND-M的細(xì)胞放射標(biāo)記的裂解物，通過(guò)RIPA檢測(cè)其中的Gl和G2特異的抗體。人HPS-患者康復(fù)期血清 (抗-ANDV人)被用作抗-ANDV抗體的陽(yáng)性對(duì)照。分子標(biāo)準(zhǔn)(M)在左邊表示成kDa大小，而G1，G2和約70kDa(同一性未知)大小的蛋白的位置表示在右邊。C)每次接種后和第一次接種(0周)后的指定星期時(shí)，確定接種了 pWRG/HTN-M(x)或pWRG/AND_M的猴子的NAb 反應(yīng)。CH64，CH85和CH69在第0，3，6和12周時(shí)接種，而猴子90BD25在第0，3，6和9周接種。HTNV的NAb效價(jià)(實(shí)線)或ANDV (虛線)通過(guò)PRNT進(jìn)行確定。圖19 :pffRG/HA-M質(zhì)粒的示意圖。通過(guò)PCR從pWRG/AND-M中擴(kuò)增一個(gè)區(qū)域，并將其插入pWRG/HTN-M(x)的XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建成pWRG/HA-M。擴(kuò)增的區(qū)域(利用了能創(chuàng)造XbaI 位點(diǎn)的引物)包括CMV啟動(dòng)子，內(nèi)含子A，外顯子2，外源序列，安地斯病毒M5' -UTR，安地斯病毒M 0RF，安地斯病毒3’ -UTR以及BGH PolyA。對(duì)于別的縮寫(xiě)請(qǐng)參考前面的圖。詳細(xì)介紹在本申請(qǐng)中，介紹了用于個(gè)體接種防止?jié)h坦病毒屬病毒的組合物和方法。該方法包括將編碼漢坦病毒屬病毒抗原的DNA轉(zhuǎn)移到個(gè)體的細(xì)胞中，使得抗原在細(xì)胞中表達(dá)，從而在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。DNA疫苗接種涉及在體施用編碼抗原的多核苷酸，從而在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)生成正確折疊的抗原。將DNA疫苗導(dǎo)入細(xì)胞，將會(huì)促使和一種或多種病原菌蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白決定簇在細(xì)胞中表達(dá)。加工的結(jié)構(gòu)蛋白將會(huì)和正常細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原共同展示在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面。即便細(xì)胞介導(dǎo)的免疫不是防止感染的主要手段，它仍可能對(duì)解決已經(jīng)發(fā)生的感染是重要的。此外，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白也可以被抗原呈遞細(xì)胞獲得，從而引發(fā)全身性的體液抗體反應(yīng)。為了獲得要尋求的免疫反應(yīng)，能引起接種個(gè)體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)一或多個(gè)主要的病毒抗原決定簇的DNA疫苗構(gòu)建體是必需的。這可以通過(guò)如下方式來(lái)進(jìn)行確定病毒基因組中編碼病毒糖蛋白或衣殼成分的區(qū)域，并將這種編碼序列和能在受接種者細(xì)胞中表達(dá)其的啟動(dòng)子連接起來(lái)。此外，病毒基因組本身，或部分基因組也可以使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及到能編碼漢坦病毒屬病毒抗原的DNA或cDNA。漢坦病毒屬病毒的意思是指任何能引起腎綜合征出血熱(HFRS)的漢坦病毒屬病毒，如漢坦病毒(HTNV)，多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)，普馬拉病毒(PUUV)和漢城病毒(SEOV) 以及能引起漢坦病毒屬病毒肺癥候群(HPS)的漢坦病毒屬病毒，如辛諾柏病毒(SNV)，黑渠港病毒(BCCV)，長(zhǎng)沼病毒(BAYV)，紐約病毒(NYV)，安地斯病毒(ANDV)，Laguna Negra病毒 (LNV)，以及任何別的已知能在人類中引起疾病的漢坦病毒屬病毒。更具體一點(diǎn)，編碼兩種包膜糖蛋白(Gl和G2)的漢坦病毒屬病毒基因組M區(qū)段 (SEQ ID NO 1),以及編碼核殼蛋白的 S 區(qū)段(SEQIDN0 2)從 SEOV 菌株 SR-Il (Kitamura, T 等人，1983，Jpn. J. Med. Sci. Biol. 36，17-25)病毒基因組(Arikawa, J 等人，1990， Virologyl76,114-125)中推導(dǎo)出來(lái)。M區(qū)段(如SEQ ID NO 1中所示)，Genebank登錄號(hào)是M34882，對(duì)應(yīng)于漢城病毒(SR-Il)M基因2-3602位核苷酸。S區(qū)段(在SEQ ID NO 2), Genebank登錄號(hào)是M34881，對(duì)應(yīng)于漢城病毒(SR-Il)M基因2-1699位核苷酸。漢坦病毒(HTNV)編碼G1/G2的M區(qū)段對(duì)應(yīng)于漢坦病毒(菌株76-118)的2_3565 位核苷酸，漢坦病毒M序列已經(jīng)發(fā)表，登錄號(hào)是M14627。安地斯病毒編碼G1/G2的M區(qū)段對(duì)應(yīng)于安地斯病毒菌株Chile-9717869的2-3671位核苷酸，這個(gè)序列的Genebank登錄號(hào)是 AF291703。本發(fā)明也涉及到DNA或多核苷酸序列，它們包括別的漢坦病毒屬病毒的M或S基因區(qū)段，含有保護(hù)性的表位或抗原決定簇。這種表位是具有構(gòu)象的，包括Gl和/或G2的序列，因?yàn)镚l和G2的單克隆抗體表現(xiàn)出能中和病毒，并且在被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中能保護(hù)嚙齒類動(dòng)物。此外，N蛋白的氨基端具有高度的免疫原性，而且已經(jīng)有人表示，別的用氨基端區(qū)域接種的方法能起保護(hù)作用(Lundvist, 1996，同上，Ulrich, 1998，同上)。衍生的序列在物理形態(tài)上并不必衍生自核苷酸序列本身，而是通過(guò)任何方式產(chǎn)生，包括例如化學(xué)合成或DNA復(fù)制，或逆轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄，這些方法都是基于多核苷酸序列衍生區(qū)域的堿基序列提供的信息。此外，用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)對(duì)應(yīng)于標(biāo)明序列的區(qū)域結(jié)合進(jìn)行修飾，從而達(dá)到使用的意圖。本發(fā)明的序列能用在諸如雜交實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 這樣的診斷分析中，用來(lái)檢測(cè)漢坦病毒屬病毒。通過(guò)RT-PCR來(lái)克隆SEOV菌株SR-Il的M和S基因組區(qū)段，這種方法已經(jīng)在前面介紹了(Arikawa 等人，1990，Virology 176,114-125)。用 BglII 和 BamHI 將含有漢城病毒(SR-Il)M基因2-3602位核苷酸序列的DNA片段從YMIS/SR11-M中剪切下來(lái)(Arikawa, 1990，同上)。這個(gè)片段被連接到pWRG7077的BamHI位點(diǎn)，得到pWRG/SEO_M(SEQID NO 3)。 pffRG/SEO-M含有額外的核苷酸，它衍生自克隆載體桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體YMIS。利用EcoRI 從 pBSK+/SRlI-S(Arikawa，1990，同上)中剪切 DNA 片段，該 DNA 片段含有漢城病毒(SR-Il) S基因2-1699位核苷酸。用Klenow酶將該區(qū)段的限制性酶切位點(diǎn)鈍化，然后連接到用Klenow鈍化的pWRG7077的NotI位點(diǎn)(由Wisconsin，Madison的 Powderject 公司提供)，獲得 pWRG/SEO-S (SEQ ID NO 4)。pWRG/SEO-S 中含有衍生自克隆載體pBSKS+的額外的核苷酸。HTNV M DNA疫苗質(zhì)粒，pffRG/HTN-M(x) (SEQ ID NO :7)基本上是按下列方法構(gòu)建的。首先，用 BglII 將編碼 HTNV G1/G2 的 DNA 從 pTZ19RHTNMm(Schmaljohn 等人，1989，在 負(fù)鏈病毒的遺傳學(xué)禾口病原性(Genetics and pathogenicity of negative strand virus), D. Kolokofsky 和 B. Mahy 編輯，58-66 頁(yè)，Elsevier 出版社，Amsterdam)中剪切下來(lái)，并和用BamHI剪切的pWRG7077載體連接。這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)G2，但不表達(dá)Gl。我們發(fā)現(xiàn)，如果介于載體NotI克隆位點(diǎn)和SEOV M非編碼區(qū)(圖9A)之間的一段長(zhǎng)M堿基對(duì)(bp)的外源DNA 序列(SEQ IDNO 6)被去掉的話，SEOV M質(zhì)粒pWRG/SE0_M就不能有效地表達(dá)G1，于是我們解決了上面的問(wèn)題。這段外源DNA是在更早的SEOV基因克隆和亞克隆程序中獲得的。去掉了 Mbp序列的SEOV M構(gòu)建體不能表達(dá)Gl，但能表達(dá)G2(圖9B)。如果將這段Mbp的序列通過(guò)基因工程以正向，而不是反向重新連接到構(gòu)建體體中，G2的表達(dá)能恢復(fù)(圖9B)。 這個(gè)結(jié)果表明核苷酸序列，而不是核苷酸數(shù)目能影響Gl表達(dá)。為了繪制能有效表達(dá)Gl的序列，我們構(gòu)建了包括1-12位或13-M位核苷酸外源序列的載體。當(dāng)1-12位核苷酸，而不是13- 位核苷酸出現(xiàn)在質(zhì)粒中時(shí)，Gl被表達(dá)(圖9B)。我們注意到DNA 4_10位核苷酸 (TCTGCAG)和內(nèi)含子A的最后7個(gè)核苷酸(即剪切受體位點(diǎn))完全一樣(Menberg等人， 1984，J. Virol. 49，190-199)。將推定的剪切受體二核苷酸AG突變成CC,并不能影響Gl的表達(dá)，表明如果該區(qū)域參與了剪切，則并不依賴于保持內(nèi)含子A剪切位點(diǎn)序列的確切性(圖 9B)。我們構(gòu)建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的載體，并且發(fā)現(xiàn)這能有效地恢復(fù)Gl的表達(dá) (圖9C)。因此，我們確定位于介于載體NotI位點(diǎn)和SEOV M基因的5'非編碼區(qū)之間的序列GGATCTGC對(duì)于基于pWRG7077的DNA疫苗有效表達(dá)Gl是必需的。根據(jù)SEOV M中的發(fā)現(xiàn)，我們推定，DNA疫苗質(zhì)粒中包括外源HTNV M基因上游序列使得我們能解決DNA疫苗質(zhì)粒不能同時(shí)表達(dá)HTNV Gl和G2的問(wèn)題。我們構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)粒， 它包括外源HTNV M基因上游序列，而且如果我們這樣做的話，我們獲得了能表達(dá)Gl和G2 的克隆，pffRG/HTN-M(x)(圖9D和圖10)。當(dāng)去掉外源序列，不能表達(dá)G1，而當(dāng)恢復(fù)這段序列時(shí)，Gl又能有效地表達(dá)(圖9D)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了外源序列不僅對(duì)成功表達(dá)SEOV Gl是必需的，而且對(duì)成功表達(dá)HTNV Gl也是必需的。這個(gè)序列并不影響來(lái)自SEOV或HTNV的G2 的表達(dá)(圖9)。外源序列影響Gl表達(dá)，但不能影響G2表達(dá)的機(jī)制現(xiàn)在并不明了。為了構(gòu)建基于 ANDV M 基因的 DNA 疫苗質(zhì)粒 pWRG/AND-M (SEQ ID NO 8),從 ANDV 感染的Vero E6中分離病毒RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，包括根據(jù)已發(fā)表的SNV和 PUUV序列分別設(shè)計(jì)的正向和反向引物。正向引物包括一個(gè)NotI限制性位點(diǎn)(下劃線)和 M基因非編碼區(qū)上游的24個(gè)核苷酸，這24個(gè)核苷酸就是我們以前發(fā)現(xiàn)的在pWRG/HTN-M表達(dá)Gl時(shí)很重要的序列，這在上面已有介紹。純化cDNA，并在PCR反應(yīng)中作為模板。用NotI 和BamHI酶切PCR產(chǎn)物，并把酶切產(chǎn)物和用NotI和BamHI酶切的pWRG7077載體連接，得到 pWRG/AND-M。ANDV M基因的序列未知，因此，我們對(duì)M基因以及載體/插入連接處進(jìn)行了測(cè)序。菌株Chile-9717869的ANDV全長(zhǎng)M基因通過(guò)RT-PCR克隆到pWRG7077中，得到pWRG/ AND-M。我們對(duì)整個(gè)M基因開(kāi)放閱讀框進(jìn)行了測(cè)序。我們克隆的M基因的序列和已經(jīng)發(fā)表的，Genebank登錄號(hào)為AF291703的ANDVM基因序列幾乎完全一樣，這種情況并不奇怪，因?yàn)椴《痉蛛x株來(lái)自同一種嚙齒類動(dòng)物(Meisner等人，2002，Virus Res. 89，131-143)。在序列中有兩個(gè)腺嘌呤取代鳥(niǎo)嘌呤的變化。在位置1504的變化是沉默的，而在位置1840的改變卻導(dǎo)致了蘇氨酸取代597位的丙氨酸。制備了同時(shí)含有漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的構(gòu)建體。將漢坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，得到pWRG/HA-M(SEQ ID NO :9，圖19)。每個(gè)M 基因的側(cè)翼是巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和內(nèi)含子A(CMV內(nèi)含子Α)以及牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化位點(diǎn)。整個(gè)漢坦病毒和安地斯病毒M基因開(kāi)放閱讀框以及絕大部分5’和3’非編碼序列都包括在這個(gè)構(gòu)建體中。此外，24bp序列位于每個(gè)漢坦病毒屬病毒M序列和它們各自CMV內(nèi)含子A序列之間。如上面所討論的那樣，我們發(fā)現(xiàn)，由于一些不明了的原因，這個(gè)24bp的序列 (或者它的一部分)對(duì)于Gl糖蛋白的表達(dá)是必需的。當(dāng)pWRG/HA-M被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，漢坦病毒和安地斯病毒M基因被表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物由漢坦病毒Gl和G2糖蛋白以及安地斯病毒Gl和G2糖蛋白組成。在本領(lǐng)域可以理解，基因構(gòu)建體中所用核苷酸序列上的某些變化對(duì)由該構(gòu)建體編碼的蛋白影響很小，或沒(méi)影響，原因例如是遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性。這種變化可能是由于沉默的點(diǎn)突變，也可能是點(diǎn)突變編碼的不同氨基酸并不能顯著改變編碼蛋白的行為。也可以理解，去掉一部分編碼區(qū)域，卻不影響構(gòu)建體體達(dá)到所需效果的能力，即誘導(dǎo)抗?jié)h坦病毒屬病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。在本領(lǐng)域可以進(jìn)一步理解，可以采用一些有利的步驟，如修飾氨基酸組成來(lái)增加編碼蛋白的抗原性。通過(guò)修飾編碼這種蛋白的遺傳序列，可以將這種變化導(dǎo)入氨基酸組成。值得思考的是漢坦病毒屬病毒M和S區(qū)段的所有這些修飾和變異在本發(fā)明的范圍之內(nèi)都是等同的。編碼所需抗原的DNA可以任何合適的形式導(dǎo)入細(xì)胞，這些形式包括線性質(zhì)粒，環(huán)形質(zhì)粒，能復(fù)制的質(zhì)粒，附加體，RNA等。把基因包含在質(zhì)粒中是優(yōu)選的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒是表達(dá)載體。能表達(dá)遺傳物質(zhì)的單個(gè)表達(dá)載體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)獲得。例如對(duì)于一般的克隆方法，請(qǐng)參看=Maniatis等人，1985，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)或 DNA 克隆，第 I 和第 II 卷(D. N. Glover，編輯，1985)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA分子，它包括載體以及上述的DNA 序列。載體可以質(zhì)粒的形式存在，如pCRIianvitrogen)，或pJW4303(Konishi，Ε.等人， 1992，Virology 188 :714)或任何諸如病毒載體這樣的表達(dá)載體，如腺病毒或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒或別的本領(lǐng)域已知的病毒。在靶細(xì)胞中優(yōu)選的是將可操作的啟動(dòng)子序列連接在 DNA序列上。對(duì)于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)，已知若干這種啟動(dòng)子，為了使編碼蛋白表達(dá)，啟動(dòng)子可以連接在編碼序列的5’端，或上游。合適的啟動(dòng)子是人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子。下游轉(zhuǎn)錄終止子，或多腺苷酸化序列，如牛生長(zhǎng)激素基因的PolyA附加序列也可以加在蛋白編碼序列的3’端。用在本發(fā)明方法中的合適構(gòu)建體是圖1中的pWRG7077 (4326bp) (Powder Ject Vaccines公司，Madison, WT)。pWRG7077包括人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期啟動(dòng)子(IE) 以及牛生長(zhǎng)激素polyA附加位點(diǎn)。啟動(dòng)子和polyA附加位點(diǎn)之間是內(nèi)含子A，它在天然情況下和hCMV IE啟動(dòng)子一起出現(xiàn)，當(dāng)hCMV IE啟動(dòng)子出現(xiàn)在表達(dá)質(zhì)粒中時(shí)，能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。內(nèi)含子A下游，介于內(nèi)含子A和polyA附加序列之間的是唯一的克隆位點(diǎn)，漢坦病毒屬病毒M 或S DNA可克隆到其中。PWRG7077也包括能使細(xì)菌宿主細(xì)胞對(duì)卡那霉素具有抗性的基因。 編碼漢坦病毒屬病毒Gl和/或G2或核殼蛋白的任何區(qū)段都可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法克隆到pWRG7077的一個(gè)克隆位點(diǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了上述重組DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如桿狀細(xì)菌或大腸桿菌，或真核細(xì)胞如糖酵母或畢赤酵母，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞。含有漢坦病毒屬病毒序列的載體在細(xì)菌中表達(dá)，而表達(dá)產(chǎn)物用于診斷或作為疫苗。例如對(duì)于通用的克隆方法，請(qǐng)參看=Maniatis等人，1985，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)或DNA克隆，第I和第II卷(D. N. Glover編輯，1985)。DNA序列可以出現(xiàn)在載體中，可操作地連接到高度純化的IgG分子，佐劑，載體，或有助于漢坦病毒屬病毒蛋白或肽純化的試劑上。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以作為上述DNA序列的來(lái)源。當(dāng)重組分子是表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以作為DNA編碼蛋白或肽的來(lái)源。DNA使用時(shí)可以是線形或環(huán)形的，或線性化的質(zhì)粒，只要漢坦病毒屬病毒序列可操作地連接在啟動(dòng)子上，而啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)。在本申請(qǐng)中，我們介紹了 DNA疫苗針對(duì)漢坦病毒屬病毒引發(fā)保護(hù)性免疫。DNA的轉(zhuǎn)移方式可以是通過(guò)注射進(jìn)入受體組織，口服或肺部給藥，或者通過(guò)粒子轟擊(即基因槍)接種。任何一種方法都可以轉(zhuǎn)移DNA，只要DNA能被表達(dá)而且細(xì)胞能制造所需的抗原。本申請(qǐng)例舉了兩種方法，這兩種方法都能在受接種者中成功地誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。為了通過(guò)粒子轟擊轉(zhuǎn)移DNA疫苗，我們選用了在1995年7月27日公開(kāi)的 W095/19799中介紹的PowdererJect-XR 基因槍裝置。別的儀器都可以得到，而且本領(lǐng)域的人所熟知。這些儀器利用高速粒子轟擊將包被了 DNA的金珠直接轉(zhuǎn)移到表皮細(xì)胞，和別的接種同樣DNA的非腸道途徑相比，它用更少量的DNA，能更有效地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(Eisenbraun, M 等人，1993，DNA Cell. Biol. , 12 :791 ；Fynan, Ε. F.等人，1993， 美國(guó)科學(xué)院院刊，90 11478 ；Haynes, J. R.等人，1994，AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 Supp 1. 2 :S43 ；Pertmer，T. M 等人，1995，Vaccine 13 :1427)。DNA 候選疫苗進(jìn)行表皮接種對(duì)于在免疫活性組織中的基因表達(dá)也有好處，免疫活性組織一般在15-30天脫落，而且它是蜱螫傷后病毒繁殖的重要天然聚集點(diǎn)(Bos, J. D. ,1997, Clin. Exp. Immuno. 107，Supp 1. 1 3 ；Labuda, M 等人，1996，Virology219 357 ；Rambukkana, A 等人，1995，Lab. Invest. 73 521 ；Stingl, G. ,1993, Recent Results Cancer Res. 128 :45)。候選疫苗包括含有M基因組區(qū)段的粒子，M基因組區(qū)段含有Gl和/或G2，來(lái)自一或多個(gè)不同的HFRS相關(guān)的病毒，如漢城病毒，漢坦病毒，普馬拉型病毒和多布拉伐病毒，也來(lái)自一或多個(gè)HPS相關(guān)的病毒，如辛諾柏病毒，黑渠港病毒，長(zhǎng)沼病毒，紐約病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒或這些病毒的組合。來(lái)自不同病毒的DNA片段可以在不同的粒子上，也可以在同一粒子上，無(wú)論哪種都會(huì)導(dǎo)致所需的免疫反應(yīng)。此外，本發(fā)明涉及的疫苗包括一或多個(gè)來(lái)自不同漢坦病毒屬病毒的DNA。這種疫苗被稱作多價(jià)疫苗。設(shè)計(jì)這種疫苗來(lái)防止由于暴露在一或多個(gè)漢坦病毒屬病毒中而引起的病變。疫苗也可以和試劑結(jié)合，這種試劑能提高疫苗的抗原性，或降低它的副作用。加速粒子基因轉(zhuǎn)移或粒子轟擊的技術(shù)的基礎(chǔ)是將要轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的DNA涂在很小的載體粒子上，該粒子比通過(guò)這個(gè)方法尋求轉(zhuǎn)化的細(xì)胞要小。含有所需基因的DNA序列能在一種小的惰性粒子上簡(jiǎn)單地干燥。粒子可以由任何惰性材料組成，如惰性金屬(金， 銀，鉬，鎢等)或惰性塑料(聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯纖維等)。優(yōu)選的粒子是由金，鉬或鎢組成。最優(yōu)選的粒子是由金組成。合適的粒子是球形的，直徑是0.5-5微米，優(yōu)選的是 1-3微米。含有所需基因的DNA序列可以制備成適合基因?qū)氲男问?，能?jiǎn)單地在裸露的金或鎢粒子上干燥。然而，這種形式的DNA分子具有相對(duì)短的穩(wěn)定期，而且由于和粒子本身的金屬或氧化底物的化學(xué)反應(yīng)，DNA分子往往降解得十分迅速。因此，如果載體粒子首先用封裝試劑包被，DNA鏈的穩(wěn)定性會(huì)顯著改善，而且即便是在幾周的時(shí)間內(nèi)，也不會(huì)顯著降解。合適的封裝試劑是聚賴氨酸(分子量200000)，它在DNA分子使用前用在載體粒子中。包括亞精胺在內(nèi)的其他封裝試劑，聚合的還是非聚合的，可以作為相似的封裝試劑使用。聚賴氨酸在粒子中的應(yīng)用方式是用含0. 02%聚賴氨酸的溶液沖洗金粒子，然后空氣干燥或加熱干燥，從而將粒子包被。一旦包被了聚賴氨酸的金屬離子被合適地干燥，就可以將DNA鏈負(fù)載到粒子中。DNA負(fù)載到粒子中的比率是每毫克金珠0. 5-30微克DNA。DNA和金珠的優(yōu)選比率是每毫克金珠0.5-5.0ygDNA。樣品開(kāi)始用、射線照射(優(yōu)選的是30kGy)乙烯-四氟乙烯共聚物小管。金粒子在微離心管中稱重，加入大約0. 5M亞精氨(游離堿)并混合，然后加入DNA。10%的CaCl2溶液和DNA —起培養(yǎng)大約10分鐘，提供細(xì)的鈣沉淀。沉淀物攜帶DNA 到金珠上。將微離心管離心，沉淀重懸并用100%乙醇沖洗，終產(chǎn)物重懸在含有0.0025mg/ ml PVP的100%乙醇中。然后把帶有DNA的金粒子放在小管中干燥。加速粒子基因轉(zhuǎn)染的通用方法在授權(quán)給Sanford的美國(guó)專利No4945050中已有介紹。根據(jù)這種方法改進(jìn)版本設(shè)計(jì)的儀器可以通過(guò)商業(yè)途徑從Wisconsin，Madison的 PowderJect Vaccines公司購(gòu)買(mǎi)到，這在W095/19799中介紹了。本申請(qǐng)上下文所引用的所有文件都以其全文被引作本發(fā)明的參考。簡(jiǎn)而言之，包被了 DNA的粒子沉積在塑料小管的內(nèi)表面，塑料小管被切成合適的長(zhǎng)度，形成樣品夾。將樣品夾放在壓縮氣體的通道上(例如氦氣，壓力足以將粒子從彈藥夾中驅(qū)逐出來(lái)，如350-400psi)。粒子被氣流帶走，然后朝著靶組織用足夠的力量轉(zhuǎn)移到組織的細(xì)胞中。進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明可以從已經(jīng)出版的儀器應(yīng)用指南上獲得。包被的載體粒子通過(guò)物理方法加速飛向?qū)⒁晦D(zhuǎn)化的細(xì)胞，致使載體粒子射入靶細(xì)胞的里面。這種技術(shù)可以在體外細(xì)胞中使用，也可以在體內(nèi)細(xì)胞中使用。以前已包被在載體粒子上的DNA以某種頻率在靶細(xì)胞中表達(dá)?；虮磉_(dá)技術(shù)已經(jīng)證明在原核和真核細(xì)胞， 從細(xì)菌和酵母到高等植物和動(dòng)物中都能發(fā)揮作用。因此，加速粒子的方法提供了一種方便的方法學(xué)，它可以將基因轉(zhuǎn)移到范圍更廣的不同類型的組織細(xì)胞中，并提供了一種原位或體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因到細(xì)胞中的能力，而不會(huì)對(duì)處理的個(gè)體有不利的影響或副作用。因此，加速粒子的方法也是優(yōu)選的，因?yàn)樗沟肈NA疫苗能夠針對(duì)特定的組織和某種組織的特定細(xì)胞層誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，只要分別改變轉(zhuǎn)移位點(diǎn)和粒子加速的力量。這種技術(shù)因此特別適合將抗原蛋白的基因轉(zhuǎn)移到表皮上。為了在個(gè)體中獲得所需的抗原反應(yīng)，利用一種非入侵的方式將DNA疫苗轉(zhuǎn)移到不同類型的易感組織中。最有利的是，基因疫苗可以導(dǎo)入表皮。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)移能產(chǎn)生一種全身性的體液免疫反應(yīng)。為了從這種技術(shù)中獲得額外的效果和保證在接種個(gè)體中產(chǎn)生粘膜，體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，將基因轉(zhuǎn)移到粘膜組織表面也是需要的。有許多不同的可用的適合轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，包括表皮，外周血細(xì)胞以及不同的口腔，上呼吸道，和生殖粘膜表面上任意數(shù)目的位點(diǎn)，外周血細(xì)胞即淋巴細(xì)胞，它們可以在體外處理，然后放回體內(nèi)。通過(guò)基因槍進(jìn)行DNA免疫能使DNA直接轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，誘發(fā)更高水平的保護(hù)性免疫反應(yīng)，而且比標(biāo)準(zhǔn)接種方法使用的DNA要少大約3個(gè)量級(jí)。此外，基因槍轉(zhuǎn)移使得在某個(gè)給定的表皮位點(diǎn)能精確地控制抗原產(chǎn)物的水平和形式，因?yàn)榘麅?nèi)DNA轉(zhuǎn)移能通過(guò)系統(tǒng)性地改變轉(zhuǎn)移的粒子數(shù)目和每個(gè)粒子中DNA的量來(lái)控制。 對(duì)抗原產(chǎn)物水平和形式的精確控制使得控制產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的屬性成為可能。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”指的是整合了轉(zhuǎn)移的外源DNA疫苗的細(xì)胞，而不管使用的轉(zhuǎn)移技術(shù)。本發(fā)明公開(kāi)的是在DNA疫苗接種后，在誘導(dǎo)細(xì)胞，體液，和保護(hù)性免疫反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選的靶細(xì)胞是表皮細(xì)胞，而不是更深層皮膚，如真皮的細(xì)胞。表皮細(xì)胞是優(yōu)選的DNA疫苗的受體，因?yàn)檫@些細(xì)胞是身體中最容易進(jìn)入的細(xì)胞，因此，可以非入侵的方式免疫。第二，除了能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，DNA免疫的表皮細(xì)胞也能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)，這種反應(yīng)比表皮下細(xì)胞中產(chǎn)生的反應(yīng)更強(qiáng)烈。向真皮轉(zhuǎn)移也具有侵入少以及轉(zhuǎn)移的細(xì)胞最終被身體脫落的優(yōu)點(diǎn)。盡管通過(guò)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶動(dòng)物中來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)是所需的，但僅僅證明免疫反應(yīng)并不足以給動(dòng)物提供保護(hù)性好處。重要的是獲得一種保護(hù)性的免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)顯然和臨床的形式有差異。換句話說(shuō)，一種方法只要在它能降低疾病癥狀的嚴(yán)重性時(shí)才是有效的。在漢坦病毒屬病毒攻擊免疫種群后，抑制死亡的有效性至少能達(dá)到20%的免疫方法是優(yōu)選的。對(duì)免疫種群死亡的抑制能達(dá)到50%或更大的有效性的免疫接種方法是更優(yōu)選的，而最優(yōu)選70-100%的有效性。本發(fā)明顯示的免疫接種方法對(duì)漢坦病毒屬病毒感染的倉(cāng)鼠模型具有100%的有效性。倉(cāng)鼠被廣泛地用作實(shí)驗(yàn)室模型，選用來(lái)評(píng)估針對(duì)漢坦病毒屬病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。相反，由于漢坦病毒屬病毒的攻擊，沒(méi)有免疫的動(dòng)物一律被感染。 我們的結(jié)果表明用SEOV M基因組區(qū)段接種能防止?jié)h城病毒，漢坦病毒(HTNV)和多布拉伐病毒(DBOV)感染。用HTNV M基因組區(qū)段接種能防止?jié)h坦病毒，漢城病毒和多布拉伐病毒感染。用ANDV M基因組區(qū)段接種能防止ANDV，辛諾柏病毒和黑渠港病毒感染。用ANDV-M/ HTNV-M區(qū)段接種能防止SEOV，HTNV, DBOV, ANDV，辛諾柏病毒以及黑渠港病毒等其他漢坦病毒屬病毒的感染?？傊?，施用的DNA疫苗數(shù)量是每劑大約1-8 μ gDNA，而且取決于將要處理的供試者，供試者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生所需免疫反應(yīng)的能力，以及所需保護(hù)的程度。將要施用疫苗的精確數(shù)量取決于從業(yè)者的判斷，而對(duì)每個(gè)供試者和抗原是特殊的。誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的疫苗能防止一或多種病毒，可以單劑量施用，或優(yōu)選地以多劑量施用，在多劑量規(guī)程中，疫苗接種開(kāi)始進(jìn)程是1-8次單獨(dú)劑量，在隨后的時(shí)間間隔中使用的是其他劑量，時(shí)間間隔是保持或增強(qiáng)免疫反應(yīng)所必需的，例如，在1-4個(gè)月是第2劑，而如果需要的話，若干月后，再施用隨后的劑量。合適免疫規(guī)程的實(shí)施例包括(i)0，l和6個(gè)月； (ii) 0，7天和1個(gè)月；(iii) 0和1個(gè)月；(iv) 0和6個(gè)月，或別的足以誘導(dǎo)所需免疫反應(yīng)，按預(yù)期那樣提供保護(hù)性免疫反應(yīng)，或減少疾病癥狀，或降低疾病嚴(yán)重性的免疫規(guī)程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑。這種試劑包括含有來(lái)自一或多個(gè)漢坦病毒屬病毒的M或S或兩個(gè)基因片段的DNA片段，以及小的惰性的密集的粒子。DNA片段和密集的粒子在上面已經(jīng)介紹了。DNA優(yōu)選的是冷凍的或凍干的，而小的惰性的密集的粒子是干粉形式。如果使用了包被溶液，包被溶液的干燥成分可以預(yù)混合和提前測(cè)量，而且可以放在諸如小瓶或密封的包膜這樣的容器中。本發(fā)明也提供用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的試劑盒。本試劑盒含有第一個(gè)容器，該容器中含有上述冷凍或凍干的DNA。該試劑盒也包括第二個(gè)容器，該容器中含有包被溶液或包被溶液中預(yù)混合和提前檢測(cè)的干燥成分。該試劑盒也包括第三個(gè)容器，該容器中包括小的，惰性的，密集的粒子，這些粒子是干粉形式或懸浮在100%的乙醇中。這些容器可以由玻璃，塑料或金屬薄片構(gòu)成，可以是小瓶，瓶子，袋子，管子，包等。該試劑盒也包括書(shū)寫(xiě)的信息，如實(shí)施本發(fā)明的程序，或分析信息，如第一個(gè)容器中包含的試劑數(shù)量(例如DNA的摩爾數(shù)或質(zhì)量數(shù))。手寫(xiě)的信息可以在第一，第二和/或第三個(gè)容器中的任一個(gè)中，和/或與第一，第二， 和第三個(gè)容器一起，單獨(dú)放在第四個(gè)容器中。例如，第四個(gè)容器可以是盒子或包，而且包括第一，第二和第三個(gè)容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及多克隆抗體，它來(lái)自接受了上述DNA疫苗的受接種者。術(shù)語(yǔ)“抗體”是本領(lǐng)域公知的術(shù)語(yǔ)，意思包括能結(jié)合已知抗原的分子或分子的活性片段。這些活性片段是通過(guò)許多技術(shù)從本發(fā)明的抗體中衍生而來(lái)的。為了進(jìn)一步介紹分離抗體活性片段的通用技術(shù)，請(qǐng)參看Khaw，B. A等人，J. Nucl. Med. 23 1011-1019 (1982)。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括雙特異和嵌合抗體。下面實(shí)施例介紹的多克隆抗體的特征是用諸如ELISA，免疫沉淀，或免疫熒光試驗(yàn)時(shí)，能和合適免疫原，即Gl和G2結(jié)合的抗體。此外，用噬菌斑降低中和試驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)抗體必須能中和漢坦病毒屬病毒。任何保留了這些特征的抗體都和本發(fā)明有關(guān)。多克隆抗體可以濃縮，照射以及測(cè)驗(yàn)中和安地斯病毒和漢坦病毒等其他目的漢坦病毒屬病毒的能力。 具有足夠高中和抗體效價(jià)的血清，即高到轉(zhuǎn)移后足以在受體中檢測(cè)到反應(yīng)，可以被匯集。然后將產(chǎn)物凍干用于貯存和復(fù)溶。
如實(shí)施例中所更詳細(xì)介紹的那樣，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用含有諸如漢坦病毒或安地斯病毒這類漢坦病毒屬病毒M區(qū)段的DNA疫苗免疫的受接種者的血清含有能中和漢坦病毒屬病毒的抗體，并能在體外和體內(nèi)展示中和漢坦病毒屬病毒的性質(zhì)。有意義的是，抗體的反應(yīng)性適用于范圍更廣的不同的漢坦病毒屬病毒，無(wú)論是HFRS漢坦病毒屬病毒還是HPS漢坦病
毒屬病毒。鑒于這些結(jié)果，本發(fā)明的多克隆抗體適合作為治療用和預(yù)防用試劑，這些試劑用來(lái)治療或預(yù)防易受漢坦病毒屬病毒接觸影響的供試者中漢坦病毒屬病毒感染或疾病。供試者包括諸如小鼠或豚鼠這樣的嚙齒類動(dòng)物，鳥(niǎo)或禽類，以及包括人在類的哺乳類動(dòng)物?？傊@種方法包括給可能在漢坦病毒屬病毒中暴露的供試者或表示出漢坦病毒屬病毒癥狀的供試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明多克隆抗體?？贵w的任何活性形式都可以施用。本發(fā)明的抗體可以在任何系統(tǒng)中產(chǎn)生，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，小雞， 兔，山羊，母牛，或植物，如番茄，馬鈴薯，香蕉或草莓。在這些系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)選的是，使用的抗體和受體物種是相容的，致使針對(duì)抗體的免疫反應(yīng)不會(huì)在病毒得到控制之前將抗體清除掉，而且供試者中針對(duì)抗體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不會(huì)在供試者中誘導(dǎo)“血清病”?；加袧h坦病毒屬病毒感染的個(gè)體的治療可包括施用治療有效量的本發(fā)明抗?jié)h坦病毒屬病毒的抗體?？贵w可以在下面介紹的試劑盒中提供。在給患者提供能結(jié)合漢坦病毒屬病毒的抗體，或抗體區(qū)段，或能防止患者受體感染漢坦病毒屬病毒的抗體時(shí)，施用試劑的劑量根據(jù)患者的因素如年齡，體重，高度，性別，總的醫(yī)療情況，以前病史等來(lái)變化?？傊?，給受體提供一劑抗體是所需的，盡管可以施用更低或更高的劑量，但抗體劑量的范圍是 lpg/kg-100pg/kg，100pg/kg-500pg/kg，500pg/kg_lng/kg，lng/kg-100ng/ kg,100ng/kg-500ng/kg,500ng/kg_lμ g/kg,1 μ g/kg-100μ g/kg,100 μ g/kg-500μ g/kg, 500 μ g/kg-lmg/kg,lmg/kg_50mg/kg，50mg/kg_100mg/kg，100mg/kg_500mg/kg，500mg/ kg-lg/kg, lg/kg-5g/kg，5g/kg-10g/kg (受體的體重)。把防止?jié)h坦病毒屬病毒感染的抗體提供給受體供試者，數(shù)量足以減輕漢坦病毒屬病毒感染癥狀。如果試劑的劑量，給藥途徑等足以影響這種反應(yīng)，數(shù)量被說(shuō)成足以“影響”感染癥狀的減輕。對(duì)施用抗體的反應(yīng)可以通過(guò)分析供試者的生命征象來(lái)檢測(cè)。如果組合物的施用能被受體患者耐受，則說(shuō)它是“可藥用的”。如果這種試劑施用的數(shù)量具有生理意義，則說(shuō)它是以“治療有效量”施用的。如果一種試劑的存在能在受體患者中檢測(cè)到生理變化，則說(shuō)它具有生理意義。根據(jù)已知的方法，可以將本發(fā)明的化合物配制成藥用組合物，將這些材料，或它們的功能衍生物，和可藥用的載體介質(zhì)結(jié)合成混合物。合適的介質(zhì)，以及它們的制劑，包括其他人蛋白，如人血清白蛋白，都在諸如Remington的《藥物科學(xué)》(16版)(Osol，A編輯，Mack EastonPa. (1980))這樣的出版物中被介紹了。為了形成藥用可接受的組合物，適合有效地施用，這種組合物將包含有效量的上述化合物，以及合適數(shù)量的載體介質(zhì)?？梢詰?yīng)用別的藥用方法去控制作用的持久。通過(guò)使用多聚體來(lái)復(fù)合或吸收化合物來(lái)獲得控釋制劑。為了控制釋放，通過(guò)選擇合適的大分子(例如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯，吡咯酮，乙烯-醋酸乙烯共聚物，甲基纖維素，羧甲基纖維素或硫酸魚(yú)精蛋白)和大分子濃度以及摻入的方法可實(shí)施受控的轉(zhuǎn)移。另一種由控釋制劑控制作用持續(xù)時(shí)間的可能方法是將本發(fā)明的化合物整合到諸如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，聚乳酸或乙烯_醋酸乙烯共聚物這樣的多聚體材料粒子中。此外，也可以不把這些試劑整合到多聚體粒子中，而把這些試劑包埋在通過(guò)諸如界面聚合法制備的微膠囊，如羥甲基纖維素或明膠微膠囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊中，或者膠體藥物釋放系統(tǒng)如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳劑，納米微粒，以及納米囊或巨大乳劑中也是可能的。這些技術(shù)在Remington' s Pharmaceutical Sciences—書(shū)中(1980)中公開(kāi)了?？梢圆捎萌魏魏线m的方法包括腸道外注射(如腹膜內(nèi)的，皮下的或肌肉注射)，蛋內(nèi)(in ovo)注射鳥(niǎo)，口服或局部給藥將抗體(典型的是包含在藥用制劑中)施用在導(dǎo)氣管表面這樣的方法施用本發(fā)明公開(kāi)的抗體。將抗體局部施用到導(dǎo)氣管表面的實(shí)施方法是鼻內(nèi)給藥(例如利用點(diǎn)滴器，藥簽或吸入器，這些儀器都能在鼻內(nèi)放置藥用制劑)。將抗體局部施用到導(dǎo)氣管表面的實(shí)施方法也可是吸入給藥，如通過(guò)制造一種藥用制劑的可呼吸粒子 (包括固體和液體粒子)，該藥用制劑含有以氣溶膠懸浮液形式存在的抗體，然后使得供試者吸入可吸入粒子。藥用制劑呼吸粒子給藥的方法和儀器是眾所周知的，而且任何常規(guī)的技術(shù)都可以使用?？谇唤o藥的方式可以是可消化的液體或固體形式。治療可以是單劑量規(guī)程，或者優(yōu)選的是多劑量規(guī)程，在多劑量規(guī)程中，初始療程是單獨(dú)的1-10劑，在隨后的時(shí)間間隔中使用的是其他劑量，時(shí)間間隔是保持或增強(qiáng)免疫反應(yīng)所必需的，例如，在1-4個(gè)月是第2劑，而如果需要的話，若干月后，可以施用隨后的劑量。合適的治療方案實(shí)施例包括(i)0，l和6個(gè)月；(ii)0，7天和1個(gè)月；(iii)0和1個(gè)月；(iv)0 和6個(gè)月，或別的足以誘導(dǎo)所需免疫反應(yīng)，按預(yù)期那樣減少疾病癥狀，或降低疾病嚴(yán)重性的方案。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種在疑似漢坦病毒屬病毒感染樣品中檢測(cè)漢坦病毒屬病毒的方法。方法包括，用本發(fā)明能結(jié)合漢坦病毒屬病毒抗原的多克隆抗體接觸樣品，讓抗體結(jié)合到漢坦病毒屬病毒抗原上形成免疫復(fù)合物，檢測(cè)形成的免疫復(fù)合物，并且使免疫復(fù)合物存在與否與樣品中漢坦病毒屬病毒存在與否相聯(lián)系。樣品可以是生物樣品，環(huán)境樣品或食物樣品?！皺z測(cè)形成的免疫復(fù)合物”這句話的意思包括發(fā)現(xiàn)樣品中漢坦病毒屬病毒抗原存在與否。利用免疫試驗(yàn)可以檢測(cè)漢坦病毒屬病毒抗原存在與否。許多用來(lái)檢測(cè)和/或定量抗原的免疫試驗(yàn)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。參看Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約1988,555-612)。這些免疫試驗(yàn)包括抗體捕捉試驗(yàn)，抗原捕捉試驗(yàn)和雙抗體夾心試驗(yàn)。這些試驗(yàn)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通用的方法。在抗體捕捉試驗(yàn)中， 將抗原吸附到固體支持物上，允許標(biāo)記的抗體結(jié)合。沖洗后，通過(guò)檢測(cè)固體支持物上保留的抗體數(shù)量來(lái)定量該實(shí)驗(yàn)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)變化是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，在ELISA實(shí)驗(yàn)中，抗原結(jié)合在固體支持物上，而兩種含有能結(jié)合抗原的抗體溶液，例如漢坦病毒屬病毒受接種者的血清以及本發(fā)明的多克隆抗體，都被允許和抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合。然后檢測(cè)結(jié)合的多克隆抗體的量，然后可以確定血清中是否含有抗?jié)h坦病毒屬病毒抗原的抗體。這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用來(lái)表示接種后，受接種者中已知的保護(hù)性表位的免疫性。在抗原捕捉實(shí)驗(yàn)中，將抗體吸附到固體支持物上，允許標(biāo)記的抗原結(jié)合。通過(guò)沖洗去掉未結(jié)合的蛋白，通過(guò)檢測(cè)結(jié)合抗原的數(shù)量來(lái)定量該實(shí)驗(yàn)。在雙抗體夾心試驗(yàn)中，一種抗體吸附到固體支持物上，允許抗原結(jié)合該第一種抗體。通過(guò)檢測(cè)可結(jié)合抗原的標(biāo)記第二個(gè)抗體的數(shù)量來(lái)定量該實(shí)驗(yàn)。這些免疫試驗(yàn)典型的依賴于檢測(cè)用的標(biāo)記的抗原，抗體或第二種試劑。這些蛋白可以用放射活性化合物，酶，生物素或熒光染料標(biāo)記。其中，放射活性標(biāo)記幾乎可以用在所有類型的實(shí)驗(yàn)中，而且有最多的變化。當(dāng)放射活性必須避免或需要快速的結(jié)果時(shí)，酶聯(lián)標(biāo)記是特別有用的。生物素偶聯(lián)的試劑通常用標(biāo)記的鏈霉親和素來(lái)檢測(cè)。鏈霉親和素能緊密和迅速地結(jié)合生物素，并且標(biāo)記上放射性同位素或酶。熒光染料，盡管在使用時(shí)要求昂貴的設(shè)備，但它提供了非常靈敏的檢測(cè)方法。用在這些實(shí)驗(yàn)中的抗體包括單克隆抗體，多克隆抗體，以及親和純化的多克隆抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都知道別的合適的標(biāo)記，它們可根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用。利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同知道的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將這些標(biāo)記和抗體或抗體區(qū)段結(jié)合在一起。典型的技術(shù)在Kennedy，J. H.等人1976年的Clin. Chim. Acta 70 1-31)和 Schurs，Α. H. W. Μ.等人 1977 年的 Clin. Chim Acta 81 :1-40 中介紹了。在后文中提到的偶聯(lián)技術(shù)是戊二醛方法，高碘酸鹽方法，二馬來(lái)酰亞胺方法以及其他，所有這些方法都被引作本申請(qǐng)的參考。“生物樣品”這句話的意思包括生物材料，如細(xì)胞，組織，或生物流體?！碍h(huán)境樣品” 意思是指諸如土和水這樣的樣品。食物樣品包括罐裝品，肉等。本發(fā)明另一方面是檢測(cè)生物樣品中漢坦病毒屬病毒的試劑盒。試劑盒包括含有一或多個(gè)本發(fā)明多克隆抗體的容器，本發(fā)明多克隆抗體能結(jié)合漢坦病毒屬病毒抗原，還包括抗體使用說(shuō)明書(shū)，目的是將抗體結(jié)合到漢坦病毒屬病毒抗原上形成免疫復(fù)合物，并且檢測(cè)免疫復(fù)合物的形成，以致將免疫復(fù)合物的存在與否和樣品中漢坦病毒屬病毒的存在與否聯(lián)系起來(lái)。容器的實(shí)施例包括多孔培養(yǎng)板，它使得能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中的漢坦病毒屬病毒。所有在整個(gè)本申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容(包括文獻(xiàn)參考，發(fā)表的專利，出版的專利申請(qǐng)和在審申請(qǐng))專門(mén)在此引作本申請(qǐng)的參考。本發(fā)明的其他特征將在下面示范性實(shí)施方案的介紹過(guò)程中變得更清晰，給出的這些實(shí)施方案是為了證明本發(fā)明，而不是有意限制本發(fā)明。下列材料和方法都在下面實(shí)施例中使用了。材料和方法病毒，細(xì)胞和培養(yǎng)基HTNV 病毒株 76-118 (Lee 等人，1978，J. Infect. Dis. 137,298-308)，ANDV 病毒株 Chile-9717869 (Hooper 等人，2001, Virology 289,6-14)，BCCV (RolIin 等人，1995，J. Med. Virol. 46,35-39)，和 SNV病毒株CC107(Schmaljohn 等人，1995, Virology 206,963-972)都在 Vero E6 細(xì)胞中繁殖(Vero C1008，ATCC CRL 1586)。在 COS 細(xì)胞(C0S-7 ；ATTCCRL1651) 中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。兩種類型細(xì)胞都在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基是含有Earle 氏鹽的fegle氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM)，其中含有10%的胎牛血清，IOmM,pH7. 4的HEPES，以及抗生素(青霉素[100U/ml]，鏈霉素[100μ g/ml]和硫酸慶大霉素[50μ g/ml]) (cEMEM)。HTNV G2 特異的單克隆抗體(MAbs) :MAb-23G10，MAb-llE10，MAb-3D7，MAb_16E6 和 MAb-HC02 ；HTNV Gl 特異的 MAbs :MAb_2D5，MAb_6D4，MAb-8B6, MAb_3D5，以及 MAb-IOFll 都在以前介紹了(Arikawa 等人，1989，J. Gen. Virol. 70，615-24，24)。MAb_HC02 和 MAbE606 由J.McCormick博士提供(亞特蘭大，疾病控制中心，Georgia, Ruo等人，1991，Arch. Virol. 119，1-11)。
SEOV M和S裸露DNA質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)RT-PCR克隆SEOV病毒株SR-11的M和S 基因組區(qū)段這種方法已經(jīng)在前面介紹了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。將代表每個(gè)基因組區(qū)段的cDNA亞克隆到以前介紹的裸露DNA載體pWRG7077的NotI或BamHI 位點(diǎn)(Schmaljohn 等人，1997，J. Virol. 64，3162-3170)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用 Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒(目錄號(hào)12163，Qiagen)純化質(zhì)粒DNA。我們用于接種針肌內(nèi)接種和表皮基因槍接種的DNA并不是通過(guò)無(wú)內(nèi)毒素(endo-free) qiagen DNA試劑盒制備的，因此，該DNA并不是無(wú)內(nèi)毒素的(Qiagen質(zhì)粒試劑盒，每μ gDNA產(chǎn)生 9. 3內(nèi)毒素單位 [QIAGEN質(zhì)粒純化手冊(cè)01. 971])。為了控制內(nèi)毒素可能的免疫刺激效果，我們用制備候選疫苗相同的方法精確地制備了陰性對(duì)照質(zhì)粒DNA。含漢坦病毒屬病毒M基因的DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建。用如下方式構(gòu)建pWRG/SEO-M的修飾版本。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從pWRG/SEO-M擴(kuò)增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物0，5，-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC(SEQ IDNO :10)]和反向引物[反向，5' -G CGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG(SEQ ID NO: 11)]。用 NotI 和 BamHI 切割 PCR 產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/SE0-M (0)。通過(guò)PCR從pWRG/SEO-M(0)中擴(kuò)增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物1-24, 5’ GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO: 12)]，或[引物 24-1，5，-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAA ACAGCA (SEQ ID NO 13)]，或[引物 1-12，5，_GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCA AGAAACAGCA (SEQ ID NO 14)]，或[引物 13-24，5，-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGMGTAGTAGACT CCGCAAGAMCAGCA (SEQ ID NO :15)]，或[引物 1-24*，5，GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGC ACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAMCAGCA (SEQ ID NO 16)]，或[引物 1-8，5，GGCCGCGGCCGCGGATC TGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO 17)]以及反向引物BACK。用 NotI 和BamHI 切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，分別得到pWRG/SE0-M(1-24)， pWRG/SEO-M(24-1)，pWRG/SEO-M(1-12), pWRG/SEO-M(13-24)，pWRG/SEO-M(1-24*),以及 pWRG/SEO-M(1-8)。為了構(gòu)建 pWRG/SEO-M (χ)，通過(guò) PCR 從 pWRG/SEO-M 中擴(kuò)增編碼 SEOV G1/G2 蛋白的 DNA,使用引物 1-24 和反向引物[SE0MX，5 ‘ -GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG (SEQ ID NO :18)]。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。 通過(guò)去掉pWRG7077 BamHI和BglII位點(diǎn)之間不需要的克隆人造DNA(猿免疫缺陷病毒nef 基因大約100個(gè)核苷酸)，構(gòu)建該克隆。去掉該序列對(duì)克隆基因的表達(dá)沒(méi)影響(數(shù)據(jù)沒(méi)有表示出來(lái))。HTNV M DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/HTN_M的構(gòu)建基本按如下方法進(jìn)行。首先，用BglII 將編碼HTNV G1/G2的DNA從pTZ19RHTNMm中剪切下來(lái)(Schmaljohn等人，1989，同上)，并連接到用BamHI剪切的pWRG7077載體中。該質(zhì)粒表達(dá)G2，但不表達(dá)Gl (數(shù)據(jù)沒(méi)有表示出來(lái))。第二步，該質(zhì)粒含有M基因5’末端的NotI-PshAI區(qū)段被剪切下來(lái)，并用PCR擴(kuò)增的 DNA(來(lái)自質(zhì)粒pUC18，pUC18中含有全長(zhǎng)HTNV M基因，該基因是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶PCR從病毒 RNA中克隆來(lái)的)取代，PCR使用的引物是1_24(參考上文)和反向引物[M5B，5’_TCAGGAC TCCTGTCATGCAATAAGATCTC(SEQ ID NO: 19)]。反向引物包括HTNV M基因中沉默的核苷酸變化，這種變化創(chuàng)造了一個(gè)用于診斷的BglII位點(diǎn)。用NotI和I^shAI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用 NotI-PshAI 切割的 pWRG7077 中，得到 pWRG/HTN_M。利用引物1-24 和反向引物[HTNMX，5，-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC (SEQ ID NO 20)]從 pffRG/HTN-M 中擴(kuò)增 HTNV M 基因，構(gòu)建 pffRG/HTN-M(χ)。用 NotI 和 BamHI 切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的載體pWRG7077中。這個(gè)克隆和pWRG/HTN_M 完全一樣。然而，該基因3’非翻譯區(qū)的一部分，以及NotI和BglII之間的載體序列被去掉了。利用引物O和反向引物HTNMX，從pWRG/HTN_M(χ)中PCR擴(kuò)增HTNV M基因，構(gòu)建 pffRG/HTN-M(0)。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。利用引物1-24和反向引物HTNMX，從pWRG/HTN-M(0)中PCR擴(kuò)增HTNV M基因，構(gòu)建pWRG/HTN-M(1-24)。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的 PWRG7077 中。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。為了構(gòu)建含有ANDV M基因的DNA疫苗質(zhì)粒pWRG/AND_M，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，利用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)從 ANDV 感染的 Vero E6 細(xì)胞中分離病毒 RNA。利用Superscript〗〗反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)在50°C將該RNA反轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后在70°C培養(yǎng)15分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活。用RNaseH在37°C消化20分鐘，去掉RNA。分別根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的SNV和PUUV序列設(shè)計(jì)的正向和反向引物包括在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中正向引物[SN-Fj，5’ -GG CCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC(SEQ ID NO :21)]和反向引物[PUUM-R，5，-GCGCGGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC (SEQ IDNO 22)] 正向引物包括一個(gè)NotI限制性位點(diǎn)(下劃線)和M基因非編碼區(qū)上游的M個(gè)核苷酸，這M個(gè)核苷酸就是我們以前發(fā)現(xiàn)的在pWRG/HTN-M (χ)中表達(dá)Gl時(shí)很重要的序列。反向引物包括一個(gè)BamHI限制性位點(diǎn)(下劃線)。用PCR純化試劑盒^jiagen)純化cDNA，并在PCR反應(yīng)中作為模板。PCR反應(yīng)包括SN-Fj和PUUM-R引物，以及Platinum Taq高保真DNA聚合酶 (Invitrogen) -MV，3分鐘，一個(gè)循環(huán)，緊接著是30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循化是94°C 30秒，68°C 8 分鐘。用NotI和BamHI切割PCR產(chǎn)物，然后連接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(l. 1)，迄今稱作pWRG/AND_M(SEQID NO 8)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用Qiagen maxiprep DNA純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。在構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒的時(shí)候，ANDV M基因的序列是未知的，因此我們利用引物步移技術(shù)和ABI 3100基因分析儀對(duì)M基因和載體/插入位點(diǎn)連接處進(jìn)行了測(cè)序。間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)(IFAT)IFAT 是以前介紹的方法的修改(Kamrud 等人，1995，Exp. Parasitol. 81， 394-403)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，利用Fugene6 (Boehringer Mannheim)，將1 μ g質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的15mm玻璃蓋玻片上的COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)，用PBS(pH7. 4) 沖洗蓋玻片一次，用丙酮在室溫下固定10分鐘，然后和抗SEOV的多克隆抗血清(兔)或接種動(dòng)物的血清反應(yīng)。在含有3%胎牛血清(FBQ的PBS中稀釋抗體，然后和轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37°C 培養(yǎng)30分鐘。用PBS沖洗蓋玻片三次，并和生物素?；暮锟雇每贵w在37°C培養(yǎng)30分鐘， 緊接著和稀釋在含3% FBS的PBS中的鏈霉親和素交聯(lián)的熒光素(Amersham)，或熒光素標(biāo)記的山羊抗倉(cāng)鼠抗體反應(yīng)(Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室)。伊文氏藍(lán)(Fisher)包含在二級(jí)抗體溶液中，作為復(fù)染劑。用PBS沖洗蓋玻片三次，并且用去離子水沖洗一遍，然后放在玻片上熒光裝片基質(zhì)(DAKO)液滴中。Axioplan熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。對(duì)于HTNV，倉(cāng)鼠血清用含有3% FBS的PBS按1 200稀釋，然后和轉(zhuǎn)染細(xì)胞在 37°C培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS沖洗蓋玻片三次，并和熒光素標(biāo)記的山羊抗倉(cāng)鼠IgG抗體在37°C 培養(yǎng)30分鐘(Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室)。赫斯特染色劑(1 μ g/ml)包含在二級(jí)抗體溶液中，作為復(fù)染劑。用PBS沖洗蓋玻片三次，并且用去離子水沖洗一遍，然后放在玻片上熒光裝片基質(zhì)(DAKO)液滴中。用Nikon E600熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。免疫沉淀培養(yǎng)在T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的COS細(xì)胞經(jīng)Fugene6 (Boehringer Mannhein)介導(dǎo)， 用5-8 μ g質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，表達(dá)產(chǎn)物用ft~0mix([35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸，Amersham)進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后根據(jù)前面介紹的方法進(jìn)行免疫沉淀(Schmaljohn 等人，1997，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。還原的樣品在 200V 常壓下，4-12% Bis-Tris SDSPAGE梯度膠上電泳，3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)做電泳緩沖液(Nu Page) 0用基因槍接種根據(jù)前面介紹的方法制備基因槍的彈夾(Eisenbraun等人，1993，DNA Cell Biol. 12,791-797 ；Schmal john 等人，1997，同上)。簡(jiǎn)而言之，將 1. 5 μ gDNA 沉淀到 0. 5mg 的約2μπι直徑的金珠上(Degussa)。DNA包被的金珠被用來(lái)包被Tefzel小管的內(nèi)表面 (McMaster-Carr)。彈夾的制作方法是將DNA-金-包被的Tefzel小管切成約0. 5英寸的小塊，每一塊含有 0. 5mg的金，包被著 0. 75 μ g的DNA (根據(jù)洗脫和熒光分析確定的結(jié)合在金珠上的沉淀DNA的 50% )。為了接種動(dòng)物，用大剪刀去掉腹部的毛，根據(jù)以前介紹的方法(Pertmer 等人，1995，Vaccine 13，1427-1430)，利用基因槍(Powderject-XRR 移裝置，Powderject Vaccine公司)將DNA包被的金珠施用到腹部表皮的不相重疊的部位。BALB/c小鼠(National Cancer Institute (國(guó)家癌癥研究所))和遠(yuǎn)交的敘利亞倉(cāng)鼠(Charles River)分別用2或4個(gè)彈夾在400p. s. i的氦氣壓下接種。這些研究根據(jù) Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals (實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理及使用指南)上介紹的方法進(jìn)行(國(guó)家衛(wèi)生研究院，1996)。這些設(shè)施已經(jīng)被American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (美國(guó)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理授權(quán)協(xié)會(huì))充分授權(quán)了。對(duì)于HTNV，制備基因槍彈夾( 0. 5 μ g質(zhì)粒DNA包被0. 5mg金珠)，并且如上所述用基因槍接種遠(yuǎn)交的金黃色敘利亞倉(cāng)鼠。倉(cāng)鼠每隔3周接種3次。獼猴用接種倉(cāng)鼠同樣的彈夾和基因槍條件接種，然而，猴子每接種一次得給藥8次，而不是4次。根據(jù)第II期臨床試驗(yàn)接種人的方法(McClain等人，2000，同上)，獼猴用重組的痘苗病毒rVV/HTN-M+S接種。用26G3/8英寸的針將疫苗(0. 5ml PBS中有3. 4 X IO7PFU)皮下注射到右側(cè)上臂。42天后，猴子左臂接受了完全一樣的加強(qiáng)接種。對(duì)于ANDV，質(zhì)粒DNA沉淀在金珠上(每毫克金珠是3 μ g DNA)，然后將DNA包被的金珠包被在小管上。制備由包被在0. 5mg金珠上的 0. 75 μ g質(zhì)粒DNA的基因槍彈夾，并將其貯存在4°C，使變干，直到使用時(shí)。在400p. s. i氦氣壓的情況下在刮剃的腹部表皮的非重疊部位敘利亞倉(cāng)鼠用Powderject XRl粒子介導(dǎo)的表皮轉(zhuǎn)移裝置(基因槍)(Powerject
2Vaccines公司，Madison，Wis.)接種，每次接種要給藥四次。獼猴用接種倉(cāng)鼠同樣的彈夾和基因槍條件接種，然而，猴子每接種一次得給藥8次G次在腹部，而4次在腹股溝淋巴結(jié))。 在不痛苦的基因槍接種過(guò)程中，倉(cāng)鼠和猴子都得麻醉。唯一可見(jiàn)到的效果是在接種部位有輕微的紅斑。接種針肌內(nèi)接種用28. 5號(hào)針頭將懸浮在50 μ 1 PBS (ρΗ7. 4)中的質(zhì)粒DNA (25 μ g)注射到麻醉了的小鼠腓腸肌中。ELISA。為了檢測(cè)SEOV Gl和G2，將SEOV感染的Vero E6細(xì)胞裂解液(Xo照射 (3000000拉德)失活的病毒)用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋，4°C過(guò)夜，然后涂在酶標(biāo)板 (Costar)上。用PBS，3%脫脂奶，0. 05% Tween-20 (封閉溶液)在37°C封閉酶標(biāo)板1小時(shí)， 然后用PBS，0. 05% Tween-20 (沖洗溶液)沖洗一遍。小鼠或倉(cāng)鼠血清在封閉溶液中稀釋， 加到孔中，然后用前面的方法培養(yǎng)酶標(biāo)板。用沖洗溶液沖洗酶標(biāo)板4次，然后和在封閉溶液中稀釋了 1000倍的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)交聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(目錄號(hào)A-4416，Sigma) 或稀釋了 2000倍的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗倉(cāng)鼠抗體(目錄號(hào)14-22-06，Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室)培養(yǎng)1小時(shí)。同前面一樣沖洗酶標(biāo)板，然后和四甲基聯(lián)苯胺底物(TMB，目錄號(hào)50-76-04，Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室)在室溫共培養(yǎng)10分鐘。加入終止溶液(目錄號(hào)50-85-04，Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室)終止呈色反應(yīng)，并且確定450nm處的光密度 (OD)。檢測(cè)SEOV N特異抗體的方法是從以前介紹的技術(shù)中改編而來(lái)的(Elgh等人，1997， J. Clin. Microbiol. 35，1122-1130)。利用 pRSET質(zhì)粒(Invitrogen)將 SEOV (病毒株 SR-11) 核殼蛋白的1-117位氨基酸在大腸桿菌BL21(DE!3) (Novagen公司)中表達(dá)成組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，并在Ni-NTA柱Oiiagen)上通過(guò)親和層析進(jìn)行純化。用碳酸鹽緩沖液(pH9. 6) 稀釋抗原，并將其加入96孔的微升板上(Maxisorp ；NUNC)(每個(gè)孔中100 μ 1緩沖液，含有 0. 2 μ g抗原)，然后在4°C培養(yǎng)過(guò)夜。用去離子水沖洗酶標(biāo)板，并在室溫下和封閉溶液培養(yǎng) 30分鐘。用去離子水沖洗酶標(biāo)板后，將100 μ 1血清(在封閉緩沖液中稀釋，封閉緩沖液含有大腸桿菌抗原提取物
)加入完全相同的孔。酶標(biāo)板在37°C培養(yǎng)1小時(shí)，然后又用以前的方法沖洗。加入HRP 二級(jí)抗體，用上面介紹的方法，對(duì)SEOV G1-G2 ELISA進(jìn)行呈色檢測(cè)。終點(diǎn)效價(jià)被確定為最高的稀釋度，這時(shí)的OD比陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7077)接種的動(dòng)物血清的平均OD加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差要大。用SEOV N抗原檢測(cè)HTNV N特異的抗體，而用 PUUV N來(lái)檢測(cè)ANDV N特異的抗體。噬菌斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)。中和試驗(yàn)基本上是按以前介紹的方法進(jìn)行(Chu等人，1995，J. Virol. 69，6417-6423)。血清樣品在cEMEM中稀釋，然后和等量的含有 75PFU SEOV的cEMEM(lll μ 1)結(jié)合。這種血清病毒混合物在4°C培養(yǎng)過(guò)夜，然后以200 μ 1/孔的量加入6孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)板中含有3-7天大的Vero Ε6單層細(xì)胞。在37°C吸收1小時(shí)后， 在每個(gè)孔中加入3ml含10% FBS的覆蓋培養(yǎng)基(Earl氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBME)，IOmM HEPEs, 0. 6%瓊脂糖[Sea Kem ME瓊脂糖]，8mML_谷氨酰胺，抗生素)和IX非必需氨基酸(GIBC0 BRL)。酶標(biāo)板在37°C培養(yǎng)7天，然后通過(guò)添加aiil/孔的含5 % FBS和5 %中性紅溶液(GIBC0 BRL)的覆蓋培養(yǎng)基進(jìn)行染色。酶標(biāo)板在37°C培養(yǎng)2天后計(jì)數(shù)噬菌斑。實(shí)驗(yàn)前將血清樣品加熱滅活(56°C，30分鐘)。在使用補(bǔ)體的實(shí)驗(yàn)中，血清和病毒在存在5%豚鼠補(bǔ)體(目錄號(hào) ACL-4051,Accurate Chemical and Scientific Corporation)的情況下培養(yǎng)過(guò)夜。HTNV，SEOV, ANDV,以及BCCV PRNT在1周后用中性紅染色，而PUUV，DOBV,以及SNV PRNT在9天后染色。染色后2-3天(37°C )計(jì)數(shù)噬菌斑。用SEOV攻擊。將稀釋在0. 2ml滅菌PBS (pH7. 4)中的IO3PFU的SEOV用25號(hào)針通過(guò)肌內(nèi)(近尾股)注射到倉(cāng)鼠。IO3PFU劑量是根據(jù)以前發(fā)表的文章來(lái)定的，該文章報(bào)道用這樣的劑量和途徑攻擊后，倉(cāng)鼠會(huì)100%感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Chu等人，1995， 同上)。攻擊后觀天，將倉(cāng)鼠麻醉，通過(guò)心臟穿刺進(jìn)行抽血。通過(guò)IFAT，ELISA和PRNT評(píng)估攻擊后血清中抗SEOV抗體的存在與否。攻擊后病毒蛋白，而不是免疫原的抗體效價(jià)顯著上升說(shuō)明倉(cāng)鼠被SEOV感染了。對(duì)于HTNV和ANDV，通過(guò)ELISA評(píng)估攻擊前和攻擊后血清中N特異抗體的存在，并且通過(guò)PRNT評(píng)估中和抗體的存在。檢測(cè)攻擊后N特異抗體表明倉(cāng)鼠被攻擊的病毒感染。HTNV的攻擊劑量是2000PFU，這時(shí)大約IOOOLD5tl (未發(fā)表的數(shù)據(jù))。ANDV的攻擊劑量是2000PFU，這時(shí)大約250LD5(1。在生物安全4級(jí)(BSL-4)實(shí)驗(yàn)室做了一些涉及感染了 ANDV的倉(cāng)鼠的實(shí)驗(yàn)。在生物安全3級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室做了涉及感染了 HTNV的倉(cāng)鼠的實(shí)驗(yàn)， 這時(shí)要戴著3M-RACAL兜帽，穿著TYVEK衣服。利用一種邏輯回歸模型評(píng)估疫苗對(duì)殘存結(jié)果的作用。利用 SAS8. 2 版本(SAS Insitute Inc. SASOnlineDoc, Version 8，Cary, NC2000) 進(jìn)行分析。所有的動(dòng)物研究都是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用指南中介紹的方法進(jìn)行的(國(guó)家衛(wèi)生研究所，Bethesda，MD，1996)。這種設(shè)施是由美國(guó)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理授權(quán)委員會(huì)充分授權(quán)的。交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)。用pWRG/SEO-M或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7707)接種倉(cāng)鼠，每組倉(cāng)鼠 4-5只。在3周的間隔中，用基因槍給藥(每次給藥約1.5yg DNA)接種了 4次。最后一次接種后3周，獲得攻擊前的血清樣品，然后用1000PFU的漢坦病毒，1000PFU的多布拉伐病毒或1000-2000PFU的普馬拉病毒攻擊倉(cāng)鼠。攻擊后觀天，獲得攻擊后血清樣品。對(duì)攻擊前和攻擊后的血清樣品進(jìn)行評(píng)估，方法是通過(guò)抗N ELISA檢測(cè)核殼的抗體，通過(guò)漢坦病毒，多布拉伐病毒或普馬拉病毒噬菌斑降低中和測(cè)驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)攻擊病毒依賴的切除的中和抗體。抗體注射。把人類HPS患者的恢復(fù)期的血漿凍干，重懸在水中，在使用前加入CaCl2 至0. 1M，在37°C培養(yǎng)4小時(shí)，然后在4°C過(guò)夜，最后在_20°C放置1小時(shí)進(jìn)行重新鈣化。將處理過(guò)的血漿解凍，在10000XG下離心20分鐘，收集上清夜。將接種了 DNA疫苗的猴血清和人血清(PEL-FREEZ，Biologies, Rogers, Ariz)加熱滅活(56°C，30 分鐘)。用帶 25 號(hào)， 5/8英寸針頭的Iml注射器將Iml血清或血漿以腹膜內(nèi)(i. p.)給藥的方式注射到倉(cāng)鼠中。實(shí)施例1漢坦病毒屬病毒基因的瞬時(shí)表達(dá)表示SEOV病毒株SR-IIM(SEQID N0:1)或S(SEQ ID NO :2)基因區(qū)段的cDNA被亞克隆到裸露的DNA表達(dá)載體pWRG7077巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子的下游，分別得到pWRG/ SEO-M(SEQ ID NO 3)和 pffRG/SE0-S (SEQ ID NO :4)(圖 1)。為了檢測(cè) M 禾口 S 構(gòu)建體的表達(dá)，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫染色或免疫沉淀。在和抗SEOV 的多克隆血清一起培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染單層細(xì)胞中，出現(xiàn)了染色的細(xì)胞，表明pWRG/SEO-M和pWRG/ SEO-S都表達(dá)了 SEOV反應(yīng)蛋白(圖2A)。放射性標(biāo)記的表達(dá)產(chǎn)物用抗SEOV的多克隆抗血清進(jìn)行免疫沉淀，并用SDS-PAGE分析(圖2B)。免疫沉淀的蛋白具有G1，G2和N所預(yù)計(jì)的表觀分子量(80kDa, 56kDa,以及 48kDa) (Elliot 等人，1984，J. Gen. Virol. 65，1285-1293 ； khmaljohn 等人，1986，Virology 155,633-643)。其他表觀分子量是約 37kDa 和約 ^kDa 的蛋白條帶和N蛋白共沉淀。這些多肽被N蛋白氨基端特異的單克隆抗體免疫沉淀，并且用Western印跡能檢測(cè)出來(lái)，表明它們是截短形式的N蛋白(數(shù)據(jù)未表示)。實(shí)施例2用pWRG/SEO-M或pWRG/SEO-S免疫接種小鼠。為了確定是M構(gòu)建體還是S構(gòu)建體在小鼠中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，用pWRG/SEO-M，pffRG/SEO-S或陰性對(duì)照質(zhì)粒(pWRG7077)對(duì)10組 6-8周大小的BALB/c小鼠免疫接種，采用了兩種不同的接種方式用基因槍接種表皮或用針注射腓腸肌。對(duì)小鼠進(jìn)行初次接種，然后在4周的間隔中加強(qiáng)2次。每次接種前收集血樣品，并且在最后一次加強(qiáng)后3周，用ELISA篩選SEOV特異的抗體反應(yīng)。M構(gòu)建體和S構(gòu)建體用兩種DNA給藥途徑都能誘導(dǎo)SEOV特異的抗體反應(yīng)(圖幻。用基因槍接種了 SEOV S 基因的大多數(shù)小鼠僅在一次接種后表示出特異的抗體，而在隨后的免疫接種后抗體反應(yīng)增加(圖3B)。為了比較相對(duì)抗體反應(yīng)，對(duì)終了血樣品確定終點(diǎn)ELISA效價(jià)(表1)。與肌內(nèi)接種任一構(gòu)建體比較，基因槍接種導(dǎo)致較高的血清轉(zhuǎn)化頻率和幾何平均效價(jià)(GMT)。表1 在接種有SEOV裸露的DNA疫苗的小鼠中的ELISA效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種組合物，包括惰性粒子，以及包被在惰性粒子上形成核酸包被的粒子的核酸，所述核酸由能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中操作的啟動(dòng)子、SEQ ID NO 6和編碼來(lái)自ANDV的Gl和G2蛋白的多核苷酸M區(qū)段組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是如SEQIDN0:8中所示的pWRG/ AND-M(x)。
3.一種重組DNA構(gòu)建體，其組成為 i)載體， )編碼來(lái)自ANDV的Gl和G2蛋白的多核苷酸M區(qū)段，以及 iii)SEQ ID NO :6所示的核酸片段。
4.一種組合物，含有一群受接種者的多克隆抗體，受接種者接種了 DNA疫苗，該疫苗含有 pWRG/AND-M。
5.權(quán)利要求1或2的組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗ANDV感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗?jié)h坦病毒屬病毒感染的DNA疫苗。本發(fā)明介紹的是抗HFRS-和HPS-相關(guān)漢坦病毒的保護(hù)性DNA疫苗。疫苗的構(gòu)建是將表示中間(M)序列(編碼G1和G2糖蛋白)的cDNA亞克隆到DNA表達(dá)載體pWRG7077中。接種有M構(gòu)建體的動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)。被動(dòng)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)顯示，攻擊后4或5天注射接種動(dòng)物的血清可以保護(hù)動(dòng)物免受致命疾病的傷害。
文檔編號(hào)C07K14/175GK102441174SQ20111030457
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者康尼·S·施馬爾約翰, 杰伊·W·胡珀, 馬克斯·卡斯特 申請(qǐng)人:美國(guó)傳染性疾病軍醫(yī)研究所