專利名稱：一種IgG－IgM聚合物及其聚合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種IgG - IgM聚合物及其聚合方法，特別涉及一種增強體外免疫反應(yīng)體系的抗干擾能力的IgG - IgM聚合物及其聚合方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗原(antigen)是指能在機體中產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)，它進(jìn)入機體后，能刺激機體產(chǎn)生抗體(antibody)，激發(fā)細(xì)胞免疫。抗原的分子量一般大于5000，而小分子的半抗原(hapten)必須與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后才能引起機體產(chǎn)生特異性抗體?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇(antigenic determinant)，或表位(印itope)。根據(jù)抗原分子量大小和其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，一個抗原分子可帶有不同的決定簇?？贵w是指能與抗原特異結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，分為五類，即 IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，與免疫測定有關(guān)的是IgG和IgM。每個Y型狀的IgG單體有二個抗原結(jié)合部位或價，分子量為150000。而IgM是由五個單體組成的五聚體，具有10個抗原結(jié)合價，可是由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價，IgM的分子量為900000。針對同一個抗原不同決定簇的同一個機體產(chǎn)生的系列抗體稱為多克隆抗體。而針對同一個抗原、同一個決定簇的同一個機體產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體?？贵w的動物源性是指抗體產(chǎn)生的動物種類。利用抗體抗原結(jié)合反應(yīng)的原理從而檢測待測物的含量已被廣泛應(yīng)用于體外診斷技術(shù)數(shù)十年。而顯色化合物加入產(chǎn)生的酶聯(lián)免疫技術(shù)，使得靈敏度得到了很大提高。同位素示蹤物的加入而產(chǎn)生的放射免疫法，使靈敏度更上了一個臺階，可是由此產(chǎn)生的放射性廢物的處理以及放射線對人體造成的可能傷害，妨礙了這個技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。上個世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的化學(xué)發(fā)光免疫法，利用酶或其他標(biāo)記物在抗體抗原結(jié)合反應(yīng)而引發(fā)的鏈?zhǔn)交瘜W(xué)反應(yīng)，測定化學(xué)能轉(zhuǎn)換過程中釋放的光子，從而得到待測物的含量。由于這種鏈?zhǔn)交瘜W(xué)反應(yīng)能夠幾何數(shù)量級地放大光子信號，使得測量靈敏度獲得了極大提高，同時擴大了線性范圍從而改善了高低端的準(zhǔn)確性，這奠定了化學(xué)發(fā)光在免疫檢測中的理論基礎(chǔ)。但是， 由于各個檢測樣本的多樣性，其內(nèi)含物各有所不同，許多小分子或相似物會干擾正常的抗體抗原特異反應(yīng)，從而引起抗體的非特異結(jié)合反應(yīng)。由于化學(xué)發(fā)光的高敏感性，如果不能有效的抑制這種非特異反應(yīng)，那么不可避免的會產(chǎn)生假陽、假陰結(jié)果，特別是在線性低端的假陽不準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種IgG - IgM聚合物及其聚合方法，目的是降低免疫測定時小分子或相似物的干擾。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案是一種IgG - IgM聚合物，所述聚合物由IgG和IgM兩種免疫球蛋白組成；所述IgG和IgM兩種免疫球蛋白中的一者的多糖基團(tuán)中的羥基氧化后生成的醛基與另一者的氨基結(jié)合生成khiff堿化學(xué)鍵合。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第二種技術(shù)方案是一種IgG — IgM聚合物的聚合方法，主要由下列步驟組成
第一步、透析
將IgM免疫球蛋白溶于pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液中得到濃度為2mg/ml的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后裝入透析袋中，在2 8°C條件下，pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析 8 15小時；
第二步、氧化
移出第一步中透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后向所述透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液中加入與其體積相等的濃度為43mg/ml的過碘酸鈉水溶液，使IgM免疫球蛋白中的多糖基團(tuán)中的羥基氧化反應(yīng)后生成醛基得到氧化IgM免疫球蛋白水溶液，所述氧化反應(yīng)的時間為25 35分鐘，所述氧化反應(yīng)的溫度條件為2 8°C ；
第三步、終止氧化
向第二步得到的氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入與所述過碘酸鈉水溶液體積相等的質(zhì)量濃度為3%的乙二醇水溶液，然后在2 8°C條件下保持25 35分鐘以終止所述氧化反應(yīng)得到終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液； 第四步、抗體交聯(lián)
向第三步得到的終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入IgG免疫球蛋白，然后裝入透析袋中，置于濃度為0. 05mol/l、pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液中透析8 15小時得到IgG — IgM免疫球蛋白聚合物原液，其中，所述IgM免疫球蛋白和IgG免疫球蛋白兩者之間的摩爾比為1:1 ；
第五步、還原
取出第四步中得到的IgG - IgM免疫球蛋白聚合物原液，向其加入濃度為10mg/ml的硼氫化鈉水溶液，于2 8°C條件下進(jìn)行還原反應(yīng)1. 5 2. 5小時得到IgG — IgM聚合物還原液，所述IgG - IgM聚合物原液與所述硼氫化鈉水溶液兩者之間的體積比為12. 5:1 ； 第六步提純
向第五步得到的IgG - IgM聚合物還原液中加入與其體積相等，且pH值為7. 6的25°C 硫酸銨飽和水溶液，置于2 8°C條件下反應(yīng)1. 5 2. 5小時產(chǎn)生沉淀，然后采用離心分離的方式取出該沉淀；
第七步、將第六步得到的沉淀溶于PH值為7. 4的0. 05mol/l的Tris-HCl緩沖液，稀釋至濃度為2mg/ml后裝入透析袋中，然后在2 8°C條件下，置于pH值為7. 4的0. 05mol/l 的Tris-HCl緩沖液中透析8 15小時即得IgG — IgM聚合物。上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下
上述方案中，將所述第七步中得到的IgG — IgM聚合物與其體積相等的甘油混合均勻， 然后與零下20°C條件下保存。本發(fā)明工作原理是
由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果 現(xiàn)有技術(shù)普遍采用的是在反應(yīng)體系中加入與檢測抗體相同動物源性的普通免疫球蛋白，通過競爭吸附非特異物質(zhì)的原理，最大程度抑制非特異反應(yīng)的發(fā)生，可是由于分子空間結(jié)構(gòu)的原因，許多時候其效果并不理想。本發(fā)明得到的IgM-IgG聚合體能有效地抑制非特異反應(yīng)，從而提高反應(yīng)系統(tǒng)的抗干擾能力。


附圖1為IgG-IgM聚合物即IgG單體對標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一種IgG - IgM聚合物及其聚合方法
一種IgG - IgM聚合物的聚合方法，主要由下列步驟組成 第一步、透析
將IgM免疫球蛋白溶于pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液中得到濃度為2mg/ml的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后裝入透析袋中，在2 8°C條件下，pH值7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析過夜(12小時)；
第二步、氧化
移出第一步中透析后的IgM免疫球蛋白水溶液，然后向所述透析后的IgM免疫球蛋白水溶液中加入與其體積相等的濃度為43mg/ml的過碘酸鈉水溶液，使IgM免疫球蛋白中的多糖基團(tuán)中的羥基氧化反應(yīng)后生成醛基得到氧化IgM免疫球蛋白水溶液，所述氧化反應(yīng)的時間為30分鐘，所述氧化反應(yīng)的溫度條件為4°C ；
第三步、終止氧化
向第二步得到的氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入與所述過碘酸鈉水溶液體積相等的質(zhì)量濃度為3%的乙二醇水溶液，然后在4°C條件下保持30分鐘以終止所述氧化反應(yīng)得到終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液； 第四步、抗體交聯(lián)
向第三步得到的終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入小鼠IgG免疫球蛋白，然后裝入透析袋中，置于濃度為0. 05mol/l、pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液中透析過夜(12小時)得到IgG - IgM免疫球蛋白聚合物原液，其中，所述IgM免疫球蛋白和IgG免疫球蛋白兩者之間的摩爾比為1:1 ； 第五步、還原
取出第四步中得到的IgG - IgM免疫球蛋白聚合物原液，向其加入濃度為10mg/ml的硼氫化鈉水溶液，于4°C條件下進(jìn)行還原反應(yīng)2小時得到IgG - IgM聚合物還原液，所述 IgG - IgM聚合物原液與所述硼氫化鈉水溶液兩者之間的體積比為12. 5:1 ； 第六步提純
向第五步得到的IgG - IgM聚合物還原液中加入與其體積相等，且pH值為7. 6的硫酸銨飽和水溶液，置于4°C條件下反應(yīng)2小時產(chǎn)生沉淀，然后采用離心分離的方式取出該沉淀；
第七步、將第六步得到的沉淀溶于PH值為7. 4的0. 05mol/l的Tris-HCl緩沖液，稀釋至濃度為2mg/ml后裝入透析袋中，然后在4°C條件下，置于pH值為7. 4的0. 05mol/l的 Tris-HCl緩沖液中透析過夜(12小時)即得IgG — IgM聚合物。第八步、將所述第七步中得到的IgG - IgM聚合物與其體積相等的甘油混合均勻，然后與零下20°C條件下保存。所述IgG - IgM聚合物的結(jié)構(gòu)為所述聚合物由IgG和IgM兩種免疫球蛋白組成； 所述IgG和IgM兩種免疫球蛋白中的一者的多糖基團(tuán)中的羥基氧化后生成的醛基與另一者的氨基結(jié)合生成khiff堿化學(xué)鍵合。pH值為7.4的0.05mol/l的三羥甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖液配制方法50ml 0. lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與42.0 ml 0. lmol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至 IOOml0飽和(NH4) 2S04為預(yù)配制，飽和(NH4) 2S04需用氨水調(diào)PH至7. 6。注意事項
一、稱取粉末狀化學(xué)藥品時，應(yīng)注意手勢盡量放慢速度必要時關(guān)閉排風(fēng)系統(tǒng)以確保稱
量準(zhǔn)確。二、檢查所需稱取的化學(xué)藥品是否都在使用期限內(nèi)。三、檢查某些特殊化學(xué)藥品是否受潮或結(jié)塊。四、待所有化學(xué)藥品稱量完畢后，整理稱量室以保持清潔。五、NaI04、乙二醇、NaBH4均需新鮮配制。六、滴加NaIO4時，NaIO4需一邊振蕩一邊均勻的滴加。七、操作前檢查
電子稱量器表面托盤是否干凈。稱量勺是否潔凈。所需試劑是否都在使用期限內(nèi)。驗證方法
A)吸光度法交聯(lián)產(chǎn)物，IgG-IgM聚合物、單體IgG及IgM，具有不同的吸收峰。由此可進(jìn)行初步驗證交聯(lián)結(jié)果。B)純化凝膠柱及親和層析柱法進(jìn)行純化，再由電泳技術(shù)驗證可能聚合物的純度。C)功能性實驗將聚合物加入抗體抗原反應(yīng)體系(化學(xué)發(fā)光法)以驗證它在體系中的抗干擾能力。以加普通同源免疫球蛋白，及不加任何免疫球蛋白為對照。結(jié)果
本反應(yīng)體系采用雙抗體夾心法作為檢測手段。其中的二個抗體分別為小鼠及豚鼠源性。雙抗體夾心法抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留標(biāo)記物的催化活性。受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。加入標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入標(biāo)記物的底物后，底物被催化而產(chǎn)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)射出光子，光子產(chǎn)生的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)測定相對光子單位進(jìn)行定性或定量分析。標(biāo)記物的催化效率很高，極大地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。競爭法原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺，或在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中產(chǎn)生的光子愈少。結(jié)果如下列五個表格以及附圖1所示
6表1 標(biāo)準(zhǔn)對照(無免疫球蛋白)(RLU*)
權(quán)利要求
1.一種IgG - IgM聚合物，其特征在于所述IgG - IgM聚合物由IgG和IgM兩種免疫球蛋白組成；所述IgG和IgM兩種免疫球蛋白中的一者的多糖基團(tuán)中的羥基氧化后生成的醛基與另一者的氨基結(jié)合生成khiff堿化學(xué)鍵合。
2.—種IgG - IgM聚合物的聚合方法，其特征在于主要由下列步驟組成第一步、透析將IgM免疫球蛋白溶于pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液中得到濃度為2mg/ml的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后裝入透析袋中，在2 8°C條件下，pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析 8 15小時；第二步、氧化移出第一步中透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后向所述透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液中加入與其體積相等的濃度為43mg/ml的過碘酸鈉水溶液，使IgM免疫球蛋白中的多糖基團(tuán)中的羥基氧化反應(yīng)后生成醛基得到氧化IgM免疫球蛋白水溶液，所述氧化反應(yīng)的時間為25 35分鐘，所述氧化反應(yīng)的溫度條件為2 8°C ；第三步、終止氧化向第二步得到的氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入與所述過碘酸鈉水溶液體積相等的質(zhì)量濃度為3%的乙二醇水溶液，然后在2 8°C條件下保持25 35分鐘以終止所述氧化反應(yīng)得到終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液；第四步、抗體交聯(lián)向第三步得到的終止氧化IgM免疫球蛋白水溶液中加入IgG免疫球蛋白，然后裝入透析袋中，置于濃度為0. 05mol/l、pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液中透析8 15小時得到IgG — IgM免疫球蛋白聚合物原液，其中，所述IgM免疫球蛋白和IgG免疫球蛋白兩者之間的摩爾比為1:1 ；第五步、還原取出第四步中得到的IgG - IgM免疫球蛋白聚合物原液，向其加入濃度為10mg/ml的硼氫化鈉水溶液，于2 8°C條件下進(jìn)行還原反應(yīng)1. 5 2. 5小時得到IgG — IgM聚合物還原液，所述IgG - IgM聚合物原液與所述硼氫化鈉水溶液兩者之間的體積比為12. 5:1 ；第六步提純向第五步得到的IgG - IgM聚合物還原液中加入與其體積相等，且pH值為7. 6的25°C 硫酸銨飽和水溶液，置于2 8°C條件下反應(yīng)1. 5 2. 5小時產(chǎn)生沉淀，然后采用離心分離的方式取出該沉淀；第七步、將第六步得到的沉淀溶于PH值為7. 4的0. 05mol/l的Tris-HCl緩沖液，稀釋至濃度為2mg/ml后裝入透析袋中，然后在2 8°C條件下，置于pH值為7. 4的0. 05mol/l 的Tris-HCl緩沖液中透析8 15小時即得IgG — IgM聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的IgG- IgM聚合物的聚合方法，其特征在于將所述第七步中得到的IgG - IgM聚合物與其體積相等的甘油混合均勻，然后與零下20°C條件下保存。
全文摘要
一種IgG－IgM聚合物及其聚合方法、所述IgG－IgM聚合物由IgG和IgM兩種免疫球蛋白組成；所述IgG和IgM兩種免疫球蛋白中的一者的多糖基團(tuán)中的羥基氧化后生成的醛基與另一者的氨基結(jié)合生成Schiff堿化學(xué)鍵合。所述IgG－IgM聚合物經(jīng)由透析、氧化、終止氧化、抗體交聯(lián)、還原、提純等步驟制備而得。本發(fā)明得到的IgM-IgG聚合體能有效地抑制非特異反應(yīng)，從而提高反應(yīng)系統(tǒng)的抗干擾能力。
文檔編號C07K16/46GK102206280SQ201110103790
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者徐德鳴, 王智聯(lián), 范寶臣 申請人:江蘇昶迅生物科技有限公司