專利名稱：一種用于肝癌血清學(xué)診斷的單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于肝癌血清學(xué)診斷的單克隆抗體及其用途。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細胞肝癌(h印atocellular carcinoma, HCC)是我國最常見惡性腫瘤之一，占居民腫瘤死亡第二位。肝癌出現(xiàn)癥狀時多屬中晚期，切除后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高。因此，肝癌的早期診斷對延長患者的生存時間和降低肝癌死亡率具有重要意義。目前肝癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查、肝穿刺組織學(xué)檢查以及實驗室檢查。影像學(xué)診斷在肝癌診斷中起重要的作用，但是在診斷小肝癌及區(qū)分良惡性結(jié)節(jié)中均具有一定的局限性。肝硬化基礎(chǔ)上肝內(nèi)再生結(jié)節(jié)和發(fā)育不良的結(jié)節(jié)等良性病變較為常見，與肝癌的影像學(xué)特征有一定的重疊，放射學(xué)檢查對肝內(nèi)小的良惡性病變鑒別仍很困難。與肝臟病理對比，CT診斷肝癌的敏感度59% 80%。有創(chuàng)的組織病理學(xué)檢查是診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，即使是很好的細針穿刺仍因取材有限而有較高的假陰性率，并且有使腫瘤擴散和針道種植的危險。因此，臨床仍需要高度敏感的血清肝癌特異標(biāo)志物來鑒別肝臟良惡性病變，或在高危人群進行隨訪提高肝癌的早期診斷率。血清甲胎蛋白(α -fetoprotein, AFP)是目前唯一廣泛應(yīng)用的HCC標(biāo)志物。但是近年研究報道，以AFP診斷HCC的陽性率僅為50%，在直徑< 3cm的小肝癌中敏感性顯著降低，其陽性率不足40%，容易造成漏診；其次在一些良性肝病、生殖性畸胎瘤、肺癌等患者中也可有升高，容易造成誤診。如何運用已知的腫瘤標(biāo)志物來聯(lián)合診斷HCC或者探索新的腫瘤分子標(biāo)志物，以及建立相應(yīng)的易于推廣的檢測方法，仍是當(dāng)今肝癌研究領(lǐng)域的重要課題之一。此外，癌癥的血清學(xué)檢測技術(shù)一直是研究的重點。然而，目前現(xiàn)有的針對癌癥(如 HCC)標(biāo)志物的抗體的親和性和特異性差異很大，大多數(shù)難以滿足實際應(yīng)用的需要。例如，以 GPC3為例，國外有報道稱，GPC3外周血中含量較低，肝癌患者中GPC3濃度升高幅度較小，不易與正常對照尤其是肝硬化對照區(qū)分。由于目前仍然沒有檢測和或治療肝癌的有效方法，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高特異性抗人肝癌單克隆抗體，以及相應(yīng)的檢測肝癌的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性抗人肝癌單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測人肝癌的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性治療人肝癌的治療劑。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白Vh鏈，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID N0:6 所示的 CDR1，
SEQ ID N0:8 所示的 CDR2，SEQ ID NO :10 所示的 CDR3。較佳地，所述的免疫球蛋白Vh鏈具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫球蛋白\鏈，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO :12 所示的 CDR1，SEQ ID NO :14 所示的 CDR2，SEQ ID NO :16 所示的 CDR3。較佳地，所述的免疫球蛋白Vj連，它具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種免疫球蛋白，其乂11鏈和Vj連分別具有SEQID NO 2和SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。較佳地，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物具有Vh鏈，該Vh鏈的 ⑶R具有選自下組的⑶R的氨基酸序列SEQ ID N0:6 所示的 CDR1，SEQ ID NO 8 所示的 CDR2,SEQ ID NO 10 所示的 CDR3，或者，該免疫偶聯(lián)物具有\(zhòng)鏈，該\鏈的⑶R具有選自下組的⑶R的氨基酸序列SEQ ID NO :12 所示的 CDR1，SEQ ID NO 14 所示的 CDR2，SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。較佳地，所述的免疫偶聯(lián)物是免疫毒素。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是抗人肝癌雜交瘤 GPC3-7C8，CCTCC No. :C201009。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)上述的免疫球蛋白Vh鏈；上述的免疫球蛋白Vl鏈；上述的免疫球蛋白。較佳地，所述的DNA分子具有或含有選自下組的核酸序列SEQ ID NO :1、3、5、7、 9、11、13、15。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測是血清檢測。在另一優(yōu)選例中，所述的血清檢測是ELISA法、或雙抗夾心時間分辨免疫熒光法 (TRFIA 法)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括用于檢測血清甲胎蛋白(AFP)的試劑(如抗AFP的單體)。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。


圖1顯示了 GPC3-ELISA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2顯示了 ELISA測定血清GPC3含量。圖3顯示了 GPC3受試者ROC曲線(ELISA)。圖4顯示了 GPC3-TRFIA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5顯示了 CH組和HCC組的血清GPC3-R0C曲線。圖6顯示了 GPC3和AFP相關(guān)性分析。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，利用人肝癌相關(guān)膜分子GPC3(第350-364位) 偶聯(lián)多肽為免疫原，經(jīng)多年研究研制成功一種雜交瘤單克隆抗體，即抗人肝癌單抗7C8。此抗體經(jīng)多年研究證實穩(wěn)定性好，和肝癌抗原結(jié)合的特異性強。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的單克隆抗體及其檢測方法，對于肝癌高危人群普查、肝癌的早期診斷、肝癌療效隨訪、以及預(yù)后判斷等方面也有廣泛的應(yīng)用價值。本發(fā)明成果具有積極的社會效益。抗體及其編碼序列本發(fā)明的7C8單抗或其片段可用于肝癌的檢測(如放射性定位的診斷成像和血清學(xué)檢測)，還可用于免疫治療，例如通過直接或間接地將7C8單抗或其片段與化學(xué)治療劑、 或放療劑相連從而使其能直接導(dǎo)向腫瘤細胞。本發(fā)明還提供了編碼7C8單抗的可變區(qū)的輕鏈和重鏈的cDNA序列。本發(fā)明包括相應(yīng)的氨基酸序列和具有所述特征的可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少 95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與7C8單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的7C8單抗或其片段結(jié)合的細胞表面標(biāo)記物或抗原。如本文所用，“免疫毒素”指對靶細胞有特異性親和力和殺傷力的物質(zhì)，例如免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治療分子與7C8單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。具體的例子有例如mI-7C8，MTX-7C8偶聯(lián)物等。此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementarity determiningregion, CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶 ⑶R的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與此處鑒定的⑶R具有90%以上 (較佳地95%以上)的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab’ )2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體；或人源化抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。本發(fā)明的7C8單抗的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、C0S7、293細胞、或 Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O檢測方法利用本發(fā)明抗體的特異性強、效價高的GPC3的特點，本發(fā)明還提供了檢測肝癌的方法，尤其是血清學(xué)檢測方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，本發(fā)明提供一種檢測血清GPC3的時間分辨免疫熒光法(TRFIA)。此外，在本發(fā)明方法中，可將單克隆抗體7C8與其他腫瘤標(biāo)志物(如AFP)聯(lián)合應(yīng)用，這樣不僅可提高肝癌早期診斷的陽性率，而且可對臨床上為數(shù)眾多的AFP低度或中度
6增高患者的良惡性病變進行鑒別診斷。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。一種人肝癌診斷試劑盒，已完成臨床實驗207例，檢測陽性率高達41%， 與AFP聯(lián)合應(yīng)用檢測陽性率可進一步提高至75%。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括 (但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的藥物組合物可直接用于肝癌的治療。此外，還可同時使用其他治療劑，如 IFN-α、IFN-β、TNF-α 等。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯(lián)物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的7C8免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，其中包括(但并不限于)1.與影像學(xué)檢查和AFP檢測等結(jié)合應(yīng)用于肝癌的診斷。2.應(yīng)用于甲胎蛋白增高肝病的良惡性鑒別診斷。3.應(yīng)用于治療前GPC3陽性肝癌的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。4.應(yīng)用于肝癌高危人群的篩查。5.應(yīng)用于肝癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括(a)本發(fā)明單抗7C8僅以針對GPC3蛋白中段的15肽350-364位多肽所制備，其特異性識別GPC3蛋白的能力較強。(b)本發(fā)明單抗7C8具有高親和力，并且抗體的氨基酸序列組成(尤其是CDR區(qū)) 不同于現(xiàn)有技術(shù)。(c)本發(fā)明首次將ELISA和TRFIA同時應(yīng)用于GPC3的檢測。TRFIA與ELISA方法相比，最低檢測濃度并未見提高，但前者陰性標(biāo)本的本底較易控制，因而出現(xiàn)假陽性的機會較少，且重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均能夠控制在13%以內(nèi)。全自動測定儀的使用，也極大地提高了檢驗效率，同時降低了人為誤差，使結(jié)果更為可靠。兩種方法的聯(lián)合使用，使得GPC3檢測敏感性和特異性更為提高。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例17C8單抗的制備和純化(1).多肽合成對全長GPC3蛋白抗原性進行分析，基于蛋白的抗原性和可及性，最終選擇多肽抗原GPC3350-364位氨基酸作為免疫原，該短肽被命名為GPC3_Ag2。采用人工合成方法制備短肽 GPC3-Ag2，其序列為 AHSQQRQYRSAYYPE(SEQ ID NO :17)。表 權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白Vh鏈，其特征在于，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO 6 所示的 CDRl， SEQ ID NO 8 所示的 CDR2， SEQ ID NO 10 所示的 CDR3。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白Vh鏈，其特征在于，它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一種免疫球蛋白\鏈，其特征在于，它的互補決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO 12 所示的 CDRl， SEQ ID NO 14 所示的 CDR2, SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。
4.如權(quán)利要求2所述的免疫球蛋白\鏈，其特征在于，它具有SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
5.一種免疫球蛋白，其特征在于，其Vh鏈和Vl鏈分別具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
7.一種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物具有Vh鏈，該Vh鏈的CDR具有選自下組的⑶R的氨基酸序列SEQ ID NO 6 所示的 CDRl， SEQ ID NO 8 所示的 CDR2， SEQ ID NO :10 所示的 CDR3，或者，該免疫偶聯(lián)物具有\(zhòng)鏈，該\鏈的CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列 SEQ ID NO 12 所示的 CDRl， SEQ ID NO 14 所示的 CDR2, SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。
8.—種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，它是抗人肝癌雜交瘤GPC3-7C8， CCTCC No. :C201009。
9.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質(zhì) 權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白Vh鏈；權(quán)利要求3所述的免疫球蛋白\鏈；或權(quán)利要求5所述的免疫球蛋白。
10.一種檢測肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的免疫球蛋白或權(quán)利要求7所述的免疫偶聯(lián)物；更佳地，所述的試劑盒還包括用于檢測血清甲胎蛋白(AFP)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于肝癌血清學(xué)診斷的單克隆抗體及其用途。具體地，本發(fā)明提供了一種抗人肝癌的特異性單克隆抗體7C8。該單克隆抗體具有穩(wěn)定性好和與肝癌抗原結(jié)合的特異性強的特點。本發(fā)明還提供了7C8免疫球蛋白、及其片段和免疫偶聯(lián)物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種檢測肝癌的檢測試劑盒。
文檔編號C07K16/18GK102276721SQ20101020088
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者屠紅, 張菁, 陳敏 申請人:上海市腫瘤研究所