專利名稱：抗-纖維連接蛋白片段單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對人纖維連接蛋白片段具有特異性的抗_纖維連接蛋白片段單 克隆抗體及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
纖維連接蛋白(下文被稱作FN)是一個分子量約250，000的巨型糖蛋白，其存在 于動物的血液、培養(yǎng)細(xì)胞的表面或組織細(xì)胞外基質(zhì)中，并已知具有多種功能。FN的結(jié)構(gòu)域分 為七個，且在其氨基酸序列中包含三種類型相似序列，整個序列是分別由這些序列重復(fù)構(gòu) 成的。上述三種類型相似序列分別被稱為I型，II型和III型。其中，III型由71至96個 氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基的同一性為17至40%。在FN中包含14個III型序列， 其中第8、9、10個序列(下文分別被稱作III-8、III-9、III- 10)被包含在細(xì)胞結(jié)合域中，第 12、13、14個序列(下文分別被稱作111-12、111-13、111-14)被包含在肝素結(jié)合域中。并 且，VLA(晚期活化抗原)-5結(jié)合區(qū)被包含在III-10序列中，其核心序列為RGDS。另外，被 稱為IIICS的區(qū)域存在于肝素結(jié)合域的C末端。被稱為CS-I的區(qū)域具有與VLA-4結(jié)合的 活性，其由25個氨基酸構(gòu)成，存在于IIICS區(qū)域中。如上所述，F(xiàn)N具有多種生理活性，例如細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。與一般的生理活 性物質(zhì)相似，有利的是可使用一種特異性的抗體研究上述這些生理活性。在專利0文獻(xiàn) 1 (JP-B-6-44877)中公開了一種與FN反應(yīng)的單克隆抗體。另一方面，在非專利文獻(xiàn)1(J. Biochem.，1991，Vol. 110，No. 2, pp. 284-291)中公 開了一種由一個FN功能域或其一部分組成的FN片段。據(jù)悉，一個特定的FN片段提高了用 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因轉(zhuǎn)染到造血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，請參見非專利文獻(xiàn)2 (Human Gene Therapy, 1997, Vol. 8, No. 18，pp. 2193-2206)和非專利文獻(xiàn) 3 (Nature Medicine, 1996, Vol.2, pp. 876-882)。另外，專利文獻(xiàn)2 (WO 03/016511)公開了一種將FN片段加入到免疫 細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。因而，F(xiàn)N片段被用于添加細(xì)胞培養(yǎng)基中，被固定到細(xì)胞培養(yǎng)容
嬰坐μ 研寸丄ο[專利文獻(xiàn) 1] JP-B-6-44877[專利文獻(xiàn)2]國際公開No.WO 03/016511[非專利文獻(xiàn) 1] J. Biochem.，1991，Vol. 110，No. 2，pp. 284-291[非專利文獻(xiàn) 2]Human Gene Therapy, 1997，Vol. 8，No. 18，pp. 2193-2206[非專利文獻(xiàn) 3]Nature Medicine, 1996，Vol. 2，pp. 876—88
發(fā)明內(nèi)容
由于FN片段是FN的部分多肽，因而能與FN片段反應(yīng)的抗體也能與纖維連結(jié)蛋白 發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，由于FN大量存在于血液成分如血清等中，因而，不能在血清或包含血 清的樣本中特異性地檢測其中包含的FN片段，而將之與FN分辨開。然而，一直期望獲得一種方便操作且檢測精度、特異性及可再現(xiàn)性優(yōu)異的檢測FN 片段的方法。通過進(jìn)行深入的研究，本發(fā)明人首次成功地制備了一種抗_纖FN片段單克隆抗體， 其特異性地識別FN片段，但不識別FN，在此以前從未有人做到這一點(diǎn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過 應(yīng)用所述的單克隆抗體可解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，換而言之，所述的單克隆抗體可用于監(jiān) 測培養(yǎng)細(xì)胞液、細(xì)胞培養(yǎng)容器洗滌液及其他血液樣本中的FN片段，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及[1]抗-纖維連接蛋白(FN)片段單克隆抗體，其與人FN片段反應(yīng)，但不與人FN反 應(yīng)，[2]根據(jù)[1]所述的抗-FN片段單克隆抗體，其與包含序列表中SEQID NO :2所示 氨基酸序列的人FN片段反應(yīng)，[3]根據(jù)[1]所述的抗-FN片段單克隆抗體，其是由雜交瘤細(xì)胞RNIIC57Z 71-3A(FERM BP-11202)產(chǎn)生的單克隆抗體 RNIIC57Z71-3A，[4] 一種檢測樣本中FN片段的試劑，其包括根據(jù)[1]所述的抗-FN片段單克隆抗 體，[5]根據(jù)[4]所述的檢測FN片段的試劑，其還包括與人FN片段反應(yīng)的抗體，[6] 一種檢測樣本中的FN片段的方法，其包括使所述的樣本與根據(jù)[1]所述的 抗-FN片段單克隆抗體或根據(jù)[4]所述的用于檢測FN片段的試劑相接觸，[7]根據(jù)[6]所述的檢測FN片段的方法，其中所述的FN片段是人FN片段且所述 樣本中包含人FN，[8]根據(jù)[6]或[7]所述的檢測FN片段的方法，其中所述的樣本選自來源于活體 的樣本或來源于培養(yǎng)細(xì)胞的樣本組成的組，[9] 一種保藏編號為FERM BP-11202的雜交瘤細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生根據(jù)[1]所述的 抗-FN片段單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實(shí)施方案，可以穩(wěn)定地提供一種抗-FN片段單克隆抗 體，該抗體操作方便、具有較高的檢測精度、以及在特異性和可再現(xiàn)性方面優(yōu)異。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的試劑可用于檢測樣本中FN片段的數(shù)量。另外，由于本 發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體不識別全長的FN，因而即使在可能被FN污染的樣本如血清等 中，也可相當(dāng)有效地特異性地且精確地檢測FN片段。
具體實(shí)施例方式本申請所用的“纖維連接蛋白”(FN)是一個由2，000多個氨基酸殘基組成的巨大 的糖蛋白，其存在于血液、培養(yǎng)細(xì)胞的表面或組織細(xì)胞外基質(zhì)中。已知FN存在各種剪接變 異體。例如，當(dāng)FN來源于血漿時，存在于FN細(xì)胞結(jié)合域的上游的稱作ED-B的區(qū)域和存在 于細(xì)胞結(jié)合域和肝素結(jié)合域之間的稱作ED-A的區(qū)域可被剪切掉。只要它是存在于自然界的全長FN，這種來源于血漿的FN也就包括在本申請所用的FN內(nèi)。編碼FN的核酸序列及氨 基酸序列在GenBank中以登錄號NM-002026和NP-002017公開，它們的全部內(nèi)容以引用的 方式并入本文。根據(jù)本發(fā)明所述，“纖維連接蛋白片段”(FN片段)是指包含F(xiàn)N的一部分的多肽。 當(dāng)FN具有纖維連接蛋白的全長序列時，F(xiàn)N片段是具有FN的部分序列的多肽，例如，其可以 是一個具有特定的結(jié)構(gòu)域或其一部分的重組多肽，即重組FN片段。另外，本發(fā)明中的FN片 段還包括由多個相同或不同F(xiàn)N片段組成的重組多肽。在本申請中，所述的“單克隆抗體”是指由單一的克隆抗體產(chǎn)生性細(xì)胞分泌的抗 體。這種抗體識別特定抗原決定簇(表位)，并且其氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)均一。除了由 通過細(xì)胞融合的方法制備的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體外，通過使用抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的mRNA 等的基因工程技術(shù)來制備的抗體也包含在本申請的單克隆抗體內(nèi)。在本申請中，術(shù)語“與FN片段反應(yīng)但不與人FN反應(yīng)”意味著本發(fā)明的單克隆抗 體對人FN未顯示出強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。雖然對其沒有特別的限定，但是，(例如)當(dāng)采用本 發(fā)明的單克隆抗體檢測人FN時，其測量值與相同濃度或相同分子數(shù)的FN片段的測量值相 比非常低，或基本未顯示出有意義的測量值，即或以下，優(yōu)選為0. 或以下，更優(yōu)選為 0. 01%或以下。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)N的測量值為檢測極限或以下。(1)本發(fā)明的抗-FN片段單克隆抗體也就是說，本發(fā)明的示例性實(shí)施方案涉及一種與FN片段反應(yīng)但不與FN反應(yīng)的單 克隆抗體。由于本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體識別FN片段，而不與存在于例如血清等中的 天然FN反應(yīng)，也就是說，其不與全長FN反應(yīng)，正是基于這點(diǎn)該抗體具有顯著的有益效果。例如，本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體能夠在特異性地檢測FN片段，而不受血清中 存在的人FN，甚至是包含血清的樣本中的人FN的影響。因此，其可在采用包含來源于血液 成分(例如，人血、血清、血漿等)的人FN的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人類培養(yǎng)細(xì)胞的提取物或培養(yǎng)上 清液中，特異性且高靈敏度地檢測FN片段。例如，當(dāng)將FN片段基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng) 物中時，即使使用的是包含人血清的培養(yǎng)基，也可監(jiān)測FN片段的濃度。此外，在血液樣本等 活體樣本中，也可以高靈敏度地檢測或監(jiān)測FN片段。此外，當(dāng)將轉(zhuǎn)染了 FN片段的細(xì)胞或使 用FN片段來培養(yǎng)的細(xì)胞引入活體時，也可在包含該細(xì)胞的活體中監(jiān)測FN片段。此外，本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體可用于監(jiān)測在活體中針對FN片段的抗體的 產(chǎn)生。例如，可采用固定有FN片段的平板來檢測在活體中所產(chǎn)生的抗-FN片段抗體，并使 源自活體的樣本(例如，人血清等)與本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體競爭。由于免疫系統(tǒng) 的異常等原因，活體有時產(chǎn)生FN的自發(fā)抗體。在這種情況下，使用與FN片段發(fā)生特異性反 應(yīng)的抗體的檢測體系，可有效地特異性檢測出FN片段的抗體的產(chǎn)生。與本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗體發(fā)生反應(yīng)的FN片段是一個包含F(xiàn)N細(xì)胞結(jié)合域的 多肽，該結(jié)合域是FN所具有的七個結(jié)構(gòu)域之一。也就是說，與本發(fā)明示例性實(shí)施方案的抗 體發(fā)生反應(yīng)的FN片段是一個至少包含由FN的III-8，9和10組成的細(xì)胞粘附域的一部分的 片段。該FN片段鏈長(例如)為50至1，500個氨基酸殘基，優(yōu)選為100至1，000個氨基 酸殘基，更優(yōu)選為200至800個氨基酸殘基，特別優(yōu)選為250至600個氨基酸。例如，可以 列舉上述非專利文獻(xiàn)1中公開的CH-296和C-274，專利文獻(xiàn)2中公開的CHV-89、CHV_92和 CHV-181。前述 CH-296 的市售商品名為 Retronectin (注冊商標(biāo))。CH-296、C-274、CHV_89、CHV-92及CHV-181的氨基酸序列分別如序列表中的SEQ IDNO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO 5 及 SEQ ID NO 6 所示。本發(fā)明的抗體至少與上述FN片段之一發(fā)生反應(yīng)，但不與FN發(fā)生反應(yīng)。而且，通過使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等之類的蛋白水解酶消化本發(fā)明的抗體，從 而除去所述抗體的Fc區(qū)域，由此獲得片段F(ab’)2、Fab\ Fab等，它們也包括在本發(fā)明使 用的抗體之內(nèi)。此外，本發(fā)明的抗體也可是重組抗體，可通過基因工程技術(shù)或嵌合抗體將本申請 所獲得的單克隆抗體的恒定區(qū)用基于所獲得的單克隆抗體而制備的其他抗體恒定區(qū)來替 代，從而制備該重組抗體。作為這種抗體，可以列舉雙特異性抗體(雙價抗體)、ScFV、Fab3、 雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微抗體，Bis-scFv, (ScFv)2-Fc及完整-IgG，其詳細(xì)內(nèi)容在 Holliger et al. , Nature Biotechnology, vol. 23, no. 9, pp. 1126-36(2005)中有描述，它 的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。通過采用由所謂細(xì)胞融合的方法來制備的雜交瘤細(xì)胞，可以制造本發(fā)明示例性實(shí) 施方案的單克隆抗體。使一組抗體產(chǎn)生性細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成融合雜交瘤細(xì)胞，克隆所 述的雜交瘤細(xì)胞，選擇能產(chǎn)生識別FN片段的抗體的克隆，并進(jìn)一步選擇適合本發(fā)明目的的 克隆，從而首次制備了上述本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)FN片段或其一部分免疫的動物的脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等均可被用 作抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。例如，作為免疫動物，可以列舉小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、馬、羊、兔等。通 過基因工程技術(shù)，使用編碼FN片段的基因，可以制備出重組蛋白，作為上述被用作免疫原 的FN片段。通過人工合成FN片段或其一部分的多肽，也可制備所述FN片段。由此獲得的 FN片段或其一部分可直接地且獨(dú)立地用于免疫動物。此外，也可通過將其與KLH(鑰匙孔 血藍(lán)蛋白)等載體蛋白組合或者與PVP(聚乙烯吡咯烷酮)混合后，與弗氏佐劑混合，然后 再用于免疫動物。此外，也可將FN片段或其一部分直接與弗氏佐劑混合后，用于免疫動物。 通過給每只動物皮下、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)注射20-200 μ g的抗原-佐劑混合物，從而進(jìn)行免疫 接種。例如，每間隔2-3周注射抗原-佐劑混合物3-7次，在最末次免疫的3-5天后免疫動 物的脾細(xì)胞會分化出抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。此外，一旦注射抗原-佐劑混合物后，2-3周內(nèi)免疫 動物的淋巴結(jié)也可分化出抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。作為所述的骨髓瘤細(xì)胞，可以采用源自小鼠、大鼠、人等的骨髓瘤細(xì)胞。所述的細(xì) 胞融合是通過G. Kehler, Nature, vol. 256，page 495 (1975)所公開的方法或類似的方法來 進(jìn)行的，它們的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。在這種情況下，使用30-50%的聚乙二醇 (分子量為1，000到6，000)，將抗體產(chǎn)生性細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在30-40°C的溫度下反應(yīng)1_3 分鐘左右。對通過細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。例如，通過使用人FN片段作為 抗原，采用酶免疫分析法(EIA)等，從而篩選產(chǎn)生能夠與FN片段CH-296反應(yīng)的抗體的雜交 瘤細(xì)胞，所述的CH-296包含前已述及的序列表中SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。隨后篩 選產(chǎn)生不與全長FN反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞。將由此獲得的抗體產(chǎn)生性雜交瘤細(xì)胞通過 有限稀釋法來進(jìn)行克隆。隨后，為了篩選出一種能夠高靈敏度且高特異性地產(chǎn)生所述單克 隆抗體的目的克隆，將上述所獲得的克隆通過(例如)酶免疫分析法等方法來進(jìn)行篩選。由此選出的克隆被移植到預(yù)先注射了姥鮫烷(2，6，10，14_四甲基十五烷)或 FIA(弗氏不完全佐劑)的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，自此之后的10-14天收集包含高濃度單克隆抗體的腹水。可通過硫酸銨分級分離法，聚乙二醇分級分離法、離子交換層析法、凝膠層析 法、親和層析法等傳統(tǒng)已知的免疫球蛋白純化方法，從腹水中收集所述的單克隆抗體。例如，作為本發(fā)明的一個實(shí)施方案，可以列舉由雜交瘤細(xì)胞RNIIC57Z 71-3A產(chǎn)生 的單克隆抗體RNIIC57Z 71-3A，其是與人FN片段反應(yīng)但不與FN反應(yīng)的抗-FN片段單克隆 抗體。雜交瘤細(xì)胞RNIIC57Z71-3A已經(jīng)被保藏于國際專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary), B ^MUMMr^-ik^Jffi^ji (National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology) (Chuo 6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (郵編305-8566))，保藏號為FERM P-21747 (原始保藏日2008年12月10日)及 FERM BP-11202 (國際保藏日2009年12月9日)。上述單克隆抗體具有令人驚訝的功能，其可識別具有序列表中SEQ ID NO 2所示 的氨基酸序列的FN片段，但不識別包含相同的氨基酸序列的FN(天然FN)。包含該抗體的用 于檢測FN片段的試劑具有顯著的特性，其可以與CH-296，C-274，CHV-89，CHV-92及CHV-181 等各個FN片段反應(yīng)，但不與具有上述氨基酸序列的FN反應(yīng)，其中所述的FN片段是具有序 列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的人FN片段。因而，所述的試劑可廣泛地應(yīng)用于從FN 中的分離FN片段以及FN片段的檢測中。本發(fā)明包括上述產(chǎn)生本發(fā)明的RNIIC57Z 71-3A的單克隆抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì) 胞，即雜交瘤細(xì)胞RNIIC57Z 71-3A。(2)檢測本發(fā)明的FN片段的試劑本發(fā)明的檢測FN片段的試劑可用于檢測樣本中的FN片段，其包含上述(1)所述 的FN片段單克隆抗體。本發(fā)明的檢測試劑即使在被FN污染的樣本中，例如在包含血液成分的樣本(例 如，人體血液，血清，血漿或類似物或者尿液等)中，也不與全長FN反應(yīng)。因而其可以不受 FN污染的干擾，而高靈敏度且特異性地檢測FN片段。因此，可以在采用包含人FN的培養(yǎng)基 諸如人血、血清、血漿等來培養(yǎng)的人培養(yǎng)細(xì)胞的提取物或培養(yǎng)上清液中，高靈敏度且特異性 地檢測FN片段。通過本發(fā)明實(shí)施方案的檢測方法，即使在含有1 μ g/ml以上高濃度的FN 的樣本中，也可特異性地檢測FN片段。因此，例如，在將FN片段基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或細(xì)胞培 養(yǎng)物時，即使所采用的是包含人血清的培養(yǎng)基，也可監(jiān)測FN片段的濃度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測試劑可以檢測出包含如序列表 SEQ ID NO :2 所示氨基酸序列的人 FN 片段(例如，CH-296，C-274，CHV-89，CHV-92，CHV-181 等)，而將其從FN中分辨出來。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及一種檢測FN片段的試劑，其進(jìn)一步包含與人FN片段反應(yīng) 的抗體。與人FN片段反應(yīng)的所述抗體可以是多克隆抗體，也可是單克隆抗體，只要能與至 少一個上述的片段反應(yīng)即可。此外，與人FN片段反應(yīng)的所述抗體可以是選自抗-人FN多 克隆抗體或者已知的抗-人FN單克隆抗體中的適宜的抗體。例如，優(yōu)選使用由雜交瘤細(xì)胞 FN 30-8產(chǎn)生的單克隆抗體FN 30-8。所述的單克隆抗體FN 30_8是一個具有能夠與C-274 及FN結(jié)合的能力的單克隆抗體的例子，其可通過Experimental Cell Research，1989， Vol. 185，pp229-236中所述的方法由雜交瘤細(xì)胞FN 30-8來制備。日本寶生物工程株式會 社出售所述單克隆抗體FN 30-8 (產(chǎn)品編碼M010)。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的檢測試劑可檢測出濃度約為3ng/ml的低濃度的FN片段。對可被本發(fā)明的檢測試劑檢測的樣本沒有特別的限定，可以列舉如血漿、血清、尿 液等體液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。雖然對上述樣本沒有特別的限定，但是所述 樣本應(yīng)該是通過本發(fā)明的檢測試劑可檢測的樣本，例如可以提到的是來源于人的樣本。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案的檢測試劑是用于檢測FN片段的試劑，其中所述FN 片段可用于包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的酶免疫分析法的檢測方法中。作為其實(shí)施方 案，可以列舉通過雙抗夾心法來檢測FN片段的檢測試劑，其中所述雙抗夾心法使用了識別 FN片段的兩種抗體。作為這種試劑的例子，可以提及采用上述⑴所述的抗-FN片段單克 隆抗體及單克隆抗體FN 30-8作為兩種抗體組分的檢測試劑。在這些抗體中，其中一個抗 體可被用作固相抗體(一次抗體)，而另一個抗體可被用作標(biāo)記抗體(二次抗體)。在這種 情況下，固相抗體是指固定在適宜的不溶性載體上的抗體，而標(biāo)記抗體是指用合適的標(biāo)記 物來標(biāo)記的抗體。固相抗體通過與FN片段發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，用于捕捉樣本中作為底物 被檢測的FN片段。標(biāo)記抗體用于檢測上述已被捕捉的待測底物。特別是，可適宜地使用將 (1)所述的抗-FN片段的單克隆抗體用作固相抗體并且將單克隆抗體FN 30-8用作標(biāo)記抗 體的檢測試劑。即使樣本中包含全長的FN，本實(shí)施方案的檢測試劑也可特異性的捕捉具有 如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的人FN片段，并可特異性地檢測出上述FN片段，而不引起 全長FN對固相抗體的屏蔽，也不會受到標(biāo)記抗體的交叉反應(yīng)性物質(zhì)(cross-species)的影 響。與FN片段反應(yīng)但不與FN反應(yīng)的本發(fā) 明的檢測試劑可應(yīng)用于上述雙抗夾心法中， 其采用兩種抗體作為檢測試劑。由于這些抗體識別FN片段與FN之間存在的微小差異，它 們的特異性非常接近，因而其幾乎不能組成可在雙抗夾心方法中使用的檢測試劑。即使進(jìn) 行連續(xù)交叉反應(yīng)和添加回收試驗(yàn)(addition recovery test)，此前也幾乎不能找到固相抗 體與標(biāo)記抗體的組合。雖然對本發(fā)明中所使用的單克隆抗體沒有特別的限定，但是，可通過使用放射性 同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物、蛋白質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記，來制備標(biāo)記抗體。雖然對放射性同位素 沒有特別的限定，但是(例如)優(yōu)選[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。雖然對酶沒有特別的限 定，但是(例如)優(yōu)選β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸 脫氫酶等穩(wěn)定且有較高比活性的酶。雖然對熒光材料沒有特別的限定，但是可以列舉(例 如)熒光胺、異硫氰酸熒光素等。雖然對發(fā)光物沒有特別的限定，但是可以列舉(例如)魯 米諾、魯米諾衍生物、熒光素、光澤精等。另外，也可使用生物素等化合物。在本發(fā)明的檢測 試劑中，可采用溶液、凍干品等多種形式的標(biāo)記抗體。通過采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將本發(fā)明的能識別FN片段的檢測試劑固 定于微珠、微孔板、試管、硝酸纖維素膜、尼龍膜等載體表面，從而制備固相載體。此外，在進(jìn) 行固定化前應(yīng)制備抗體、用于制備固相抗體的載體及固定所必需的試劑。為上述該目標(biāo)所 使用的抗體也包含在本發(fā)明的固相抗體中。本發(fā)明的檢測試劑可進(jìn)一步包含諸如酪蛋白、BSA(牛血清白蛋白)等之類的保護(hù) 劑。此外，本發(fā)明的檢測試劑還可進(jìn)一步包含諸如疊氮化鈉、Proclin等之類的防腐劑。本 發(fā)明實(shí)施方案的檢測試劑可以任選地包含各種試劑、材料、工具等。其還可包含一種吸附平 板，用于吸附組成本發(fā)明檢測試劑的本發(fā)明的抗-FN片段單克隆抗體或與人FN片段反應(yīng)的抗體。此外，其還可包含檢測標(biāo)記抗體的試劑(例如，諸如TMBZ等之類的底物)和用作對 照的試劑(例如，作為濃度標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)FN片段)。(3)檢測本發(fā)明的FN片段的方法在檢測本發(fā)明的FN片段的方法中，使用了上述(1)所述的抗-FN片段單克隆抗體 或上述(2)所述的檢測FN片段的試劑。例如，通過使用本發(fā)明的單克隆抗體，采用競爭性免 疫測定法，可以檢測FN片段。同樣，在雙酶夾心法中使用了本發(fā)明實(shí)施方案的檢測試劑，其 包含兩種單克隆抗體，使用其中一種單克隆抗體作為固相抗體并且使用另一種作為標(biāo)記抗 體，通過使待測底物與固相抗體相接觸，進(jìn)一步與標(biāo)記抗體相接觸，并檢測這些單克隆抗體 和待測底物的復(fù)合物，從而可檢測出FN片段。此外，其還可包括下述步驟在使固相抗體與 待測底物相接觸后洗滌固相抗體；和/或通過洗滌除去未與待測底物結(jié)合的標(biāo)記抗體。此 外，通過在上述(2)中所述的操作進(jìn)行固定并標(biāo)記，從而制備固相抗體及標(biāo)記抗體。作為本 發(fā)明的一個實(shí)施方案，其優(yōu)選使用單克隆抗體RNIIC57Z 71-3A及單克隆抗體FN 30_8。此 外，特別優(yōu)選采用將作為固相抗體的單克隆抗體RNIIC57Z 71-3A和作為標(biāo)記抗體的單克 隆抗體FN 30-8組合的檢測體系。本發(fā)明的方法包括定性檢測和定量檢測。作為一個實(shí)施 方案，所述的樣本可以列舉出血漿、血清等體液、以及細(xì)胞培養(yǎng)物等。根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實(shí)施方案的方法，可檢測濃度約為3ng/ml的低濃度的 FN片段CH-296。本發(fā)明一個示例性實(shí)施方案的方法，可通過使用識別FN片段不同區(qū)域的 兩種單克隆抗體，實(shí)現(xiàn)具有很高的特異性的辨別能力。雖然采用下述示意性實(shí)施例對本發(fā)明的示例性實(shí)施方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是 本發(fā)明并不局限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1抗體的制備和選擇[1](1)抗原免疫和細(xì)胞融合按非專利文獻(xiàn)1中所描述的方法，制備FN片段CH 296 (序列表中的SEQ ID NO 1)，并以lmg/ml的抗原溶液來使用。初次免疫時，用完全弗氏佐劑使抗原溶液形成乳狀液 后，將其以100 μ g/次/只的劑量腹腔內(nèi)注射給2只C57BL6小鼠，并在第二次及以后的免 疫中，每隔兩周，加強(qiáng)注射抗原溶液與市售的水溶性佐劑(RIBI佐劑)的混合物，共進(jìn)行4 次。此后，在確認(rèn)眶靜脈血清中FN片段的抗體滴度提高后，給每只小鼠最后加強(qiáng)注射一次。 在最后加強(qiáng)注射的三天后，摘取兩只小鼠的脾臟，通過無血清培養(yǎng)基分散和洗滌后收集脾 細(xì)胞，隨后按照5 1(脾細(xì)胞骨髓瘤)的比例與用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞(P3U1)相 混合并離心，除去上清液，以獲取細(xì)胞沉淀。向該細(xì)胞混合物中，勻速加入在合適的溫度下 溫?zé)岬腎ml的50% PEG(聚乙二醇)溶液，以至總體積為3ml，然后輕輕振搖混勻。隨后，向 其中勻速加入7ml的無血清培養(yǎng)基，通過此操作進(jìn)行細(xì)胞融合。從上面的操作中獲得各種融合細(xì)胞。從這些眾多的細(xì)胞群中篩選出針對該抗原的 特異性抗體。(2) HAT 選擇為了篩選融合細(xì)胞，將HAT(H:黃嘌呤，A 氨蝶呤，T 胸苷)加入到克隆培養(yǎng)基(三 光純藥株式會社制造)中而制備HAT培養(yǎng)基，并在發(fā)生融合的第二天使用該HAT培養(yǎng)基更 換培養(yǎng)基3次。由于上述培養(yǎng)基的更換而生長的細(xì)胞是一種具有源于脾臟的從頭合成體系 但該細(xì)胞的增殖被永生化了融合細(xì)胞。
(3)篩選制備在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的濃度為10yg/ml的作為免疫原的FN片段 CH-296，將其以50μ 1/孔加入到酶標(biāo)板(Nalge NuncInternational公司制造)中，并使 其在4°C下過夜，以進(jìn)行物理吸附。通過明膠柱吸附部分的凝膠過濾，從正常人血漿中純 化FN后，將其篩選評價中用作空白抗原，并采用與上述相同的方法，使其在PBS中的濃度 為20 μ g/ml,以50 μ 1/孔進(jìn)行包被。第二天，棄去所述的抗原溶液后，以200 μ 1/孔加入 25%的封閉劑酪蛋白(Pierce公司制造)，由此進(jìn)行封閉操作，并使其在室溫下靜置過夜 (20-30°C )。此后，棄去封閉液，對通過上述(2)所獲得的融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清液(使用原 液)進(jìn)行編號，隨后加入到酶標(biāo)板中，在室溫下(20-30°C )進(jìn)行初次免疫反應(yīng)1小時。在反 應(yīng)完成后，將每孔用包含0. 吐溫(Tween)的PBS洗滌3次，用紙巾充分吸干液體。檢測 時，使用了抗-小鼠IgG大鼠單克隆抗體-過氧化物酶-標(biāo)記抗體。將上述抗體溶液的濃度 調(diào)整為1 μ g/ml，并將其以50 μ 1/孔加入到酶標(biāo)板中后，在室溫下(20-30°C )反應(yīng)1小時。 隨后，棄去標(biāo)記抗體液，用PBS清洗每孔4次。用紙巾充分吸干洗滌液，向其中以50 μ 1/孔 加入ΤΜΒΖ(3，3' ,5,5' _四甲基聯(lián)苯胺)溶液(BioFX Laboratories公司制造)作為過 氧化物酶底物，在室溫下15-30分鐘內(nèi)發(fā)生顏色反應(yīng)。通過加入同樣體積的IN硫酸終止反 應(yīng)，隨后可通過肉眼或使用讀板器分辨陽性細(xì)胞系，接著嘗試挑選不與FN發(fā)生反應(yīng)而特異 性的與所述的FN片段發(fā)生反應(yīng)的目的細(xì)胞系。(4)選擇和克隆陽性細(xì)胞系以及細(xì)胞系的建立作為如(3)所0述嚴(yán)格篩選后的結(jié)果，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的960孔內(nèi)的10，000個以上克 隆中，不與FN抗原發(fā)生反應(yīng)而特異性地與所述的FNO片段發(fā)生反應(yīng)的目的細(xì)胞系僅有8個 克隆。使用這8個細(xì)胞系，通過有限稀釋法立即進(jìn)行克隆。在這8種克隆的抗-FN片段抗 體產(chǎn)生性雜交瘤中，每種選出2個克隆(主細(xì)胞系和亞細(xì)胞系)。(5)收集小鼠腹水將具有高度特異性的上述雜交瘤克隆的主細(xì)胞系和亞細(xì)胞系的兩種母細(xì)胞 (Master cells)以凍存細(xì)胞的形態(tài)保存，并且同時，在scid(Τ細(xì)胞和B細(xì)胞的缺失型)小 鼠的腹腔中大量培養(yǎng)每種主細(xì)胞系，以獲得腹水粗制抗體。每只小鼠的腹水約為3-5ml。(6)抗體純化由此獲得的腹水用50%的飽和硫酸銨沉淀并透析，并將得到的組分加入到蛋白A 純化柱內(nèi)。作為平衡緩沖液，制備了高鹽濃度的溶液3M NaCl、l. 5M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖 液(pH 8. 9)，并采用了所有的IgG亞類均可結(jié)合的條件。用平衡液稀釋經(jīng)過硫酸銨沉淀后 的腹水級分兩次，并加入到體積與腹水幾乎相同的蛋白A樹脂柱內(nèi)，用平衡液洗滌該柱，直 到在280nm波長的吸光度幾乎為零。隨后，用檸檬酸緩沖液(pH 4.0)和檸檬酸緩沖液(pH 3.0)進(jìn)行兩步洗脫。洗脫出的級分立即用IM Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)進(jìn)行中和，并進(jìn) 行了硫酸銨沉淀或離心超濾濃縮。最終的抗體用PBS透析，并用0.22 μ m過濾器過濾。用 10% SDS-PAGE (還原加熱條件)分析抗體純度，以確保該抗體足夠純，并且除了 H鏈和L鏈 之外，不含其他雜質(zhì)。(7)通過不同技術(shù)純化抗體為了進(jìn)一步擴(kuò)大選擇，除了實(shí)施例1所制備的八種抗體外，根據(jù)JP-B-44877 (專利 文獻(xiàn)1)中所述的制備抗-FN單克隆抗體的方法，還制備了可結(jié)合到非專利文獻(xiàn)1所述的FN片段C-274或H-296的3種單克隆抗體。(8)為構(gòu)建檢測體系選擇抗體用高碘酸鉀法進(jìn)行過氧化物酶標(biāo)記共計(jì)11種抗體，包括通過上述(1)_(6)的操作 而獲得的8種抗體，以及通過上述(7)的操作而獲得的3種抗體。所述的高碘酸鉀法是，將 過氧化物酶的糖鏈二醇通過脫氫氧化形成希佛堿(Schiff base)并使之結(jié)合到抗體的氨基 酸上的方法。為了使所有的抗體保持其與相應(yīng)抗原的結(jié)合活性，可以制備酶-標(biāo)抗體。通 過將上述標(biāo)記的抗體與11種相應(yīng)的固相抗體相組合，最終使用共計(jì)121種組合作為篩選可 以檢測FN片段的體系。然而，當(dāng)FN濃度小于l，000ng/ml時，上述各種組合不與FN反應(yīng)， 當(dāng)FN濃度為1，000ng/ml以上時，即1 μ g/ml以上時，所有的組合均與FN反應(yīng)。因而，與通 常的情形相比，很難獲得能從FN片段中辨別出FN的抗體，這是因?yàn)?，兩者具有非常相似?抗原特異性。由于FN與FN片段的結(jié)構(gòu)差異相當(dāng)小，一種可能是所獲得的FN片段特異性抗 體能夠與相似的抗原表位反應(yīng)。實(shí)施例2抗體的制備與選擇[2](1)新抗體的制備
除實(shí)施例1(1)所述的FN片段CH-296之外，根據(jù)非專利文獻(xiàn)1的描述，還制備了 FN片段C-274(序列表的SEQ ID NO :2)及FN片段H-296。采用與實(shí)施例1 (1)_(6)相同 的方法，嘗試制備與這些FN片段特異性反應(yīng)的抗體。將PBS中的濃度為2 μ g/ml的FN片 段CH-296、C-274和H-296加入并固定到酶標(biāo)板上，并用于篩選抗體。作為篩選結(jié)果，在 10，000個以上的所測融合細(xì)胞系中，不與FN抗原反應(yīng)而特異性地與FN片段CH-296、C-274 或H-296中的任何一者反應(yīng)的細(xì)胞系僅為6個。采用與實(shí)施例1相同的方法，在6個細(xì)胞 系中每種選出2個克隆(主細(xì)胞系和亞細(xì)胞系)，隨后通過scid小鼠形成腹水，以制備純化 的抗體。此外，采用與實(shí)施例1(8)相同的方法，制備過氧化物酶-標(biāo)記抗體。(2)篩選用于構(gòu)建檢測體系的抗體使用總共289種組合，篩選能檢測FN片段的體系，其中11種抗體被用于初次篩 選且6種抗體被用于二次篩選(共計(jì)17種抗體)，它們分別均作為標(biāo)記抗體和固相抗體。 通過這一篩選，能夠獲得至少一種檢測體系，其可在濃度高達(dá)1 μ g/ml的FN的存在下，高 靈敏度地檢測FN片段而不與FN發(fā)生交叉反應(yīng)。所述的組合為以抗-RNIIC57Z71-3A(FERM P-21747，F(xiàn)ERM BP-11202)為固相抗體且以抗-FN 30_8 (寶生物工程株式會社制造)為標(biāo) 記抗體。(3) FN片段檢測體系一種采用所述已建立的檢測體系的檢測方法如下所述。(A)用PBS稀釋單克隆抗體RNIIC57Z 71-3A溶液為10yg/ml，將其以100 μ 1/孔 分配到酶標(biāo)板設(shè)備(Nalge Nunc International公司制造)中，并使其在4°C下靜置過夜。(B)第二天，棄去抗體溶液，并以200μ 1/孔加入25%的封閉劑酪蛋白/PBS溶液 (封閉液)，使其在4°C下靜置過夜，以封閉上述抗體未結(jié)合的蛋白部分(moiety)。第三天，棄去封閉液并將所述平板應(yīng)用于下述檢測中。(C)使用微量吸管，將100μ 1確定濃度的分析物分別加入到兩排孔內(nèi)，并使其在 室溫(20-30°C )下反應(yīng)1小時(第一反應(yīng))。(D)棄去反應(yīng)液后，用包含0. Tween 20的PBS洗滌3次，將100 μ 1的單克隆抗體FN 30-8的酶標(biāo)抗體溶液分別加入各孔中，并使其在室溫下(20-30°C )反應(yīng)1小時(第
二反應(yīng))。(E)棄去反應(yīng)液后，用包含0. Tween 20的PBS洗滌4次，在各孔中加入100 μ 1 的TMBZ溶液，并使其在室溫下(20-30°C )反應(yīng)20分鐘(顯色反應(yīng))。(F)按照向孔中加入TMBZ溶液的次序，分別向各孔加入100 μ 1的IN硫酸，接著徹 底混合，以終止反應(yīng)。使用蒸餾水作為對照，進(jìn)行空白校對酶標(biāo)儀后，在450nm波長下測量吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，通過分析物的吸光度讀取相應(yīng)的FN片段的濃度。表1顯示了通過上述的使用FN片段CH-296作為標(biāo)準(zhǔn)FN片段的檢測體系的檢測 結(jié)果。試樣的需要量為100 μ 1/ml，并且，即使FN片段的濃度為3. 125ng/ml，也可以檢測。[表 1]
濃度(ng/ml)03.1256.2512.52550100200在450 nm下的吸光度0.0410.0830.1250.2050.3810.7731.5293.080標(biāo)準(zhǔn)差(SD)0.0020.0010.0030.0030.0040.0010.0100.021變異系數(shù)(CV [%])5.21.72.31.41.10.20.60.7(N = 2)(4)血清中干擾FN的檢測通過實(shí)施例2(2)所述的檢測體系，在不同的溶劑中檢測FN片段CH-296。作為 溶劑，測試了 25%的封閉劑酪蛋白/PBS溶液、包含10%胎牛血清(Lonza公司制造)的 RPMI-1640培養(yǎng)液(Sigma公司制造)及人血清。在450nm波長的吸光度實(shí)測結(jié)果如表2所 示。表2的結(jié)果表明，上述檢測體系不被人血清或血清培養(yǎng)基抑制，并且其可以檢測FN片 段而不與血清中存在的FN反應(yīng)。[表 2]
權(quán)利要求
一種抗 纖維連接蛋白片段單克隆抗體，其與人纖維連接蛋白片段反應(yīng)，但不與人纖維連接蛋白反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗-纖維連接蛋白片段單克隆抗體，其與包含SEQID NO 2 所示氨基酸序列的人纖維連接蛋白片段反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗-纖維連接蛋白片段單克隆抗體，其是由雜交瘤細(xì)胞 RNIIC57Z 71-3A(FERM BP-11202)產(chǎn)生的單克隆抗體 RNIIC57Z 71-3A。
4.一種檢測樣本中纖維連接蛋白片段的試劑，其包括權(quán)利要求1所述的抗_纖維連接 蛋白片段單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測纖維連接蛋白片段的試劑，其還包括與人纖維連接蛋白 片段反應(yīng)的抗體。
6.一種檢測樣本中的纖維連接蛋白片段的方法，其包括使所述的樣本與根據(jù)權(quán)利要求 1所述的抗_纖維連接蛋白片段單克隆抗體或根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測纖維連接蛋 白片段的試劑相接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測纖維連接蛋白片段的方法，其中所述的纖維連接蛋白片 段是人纖維連接蛋白片段且所述樣本中包含人纖維連接蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的檢測纖維連接蛋白片段的方法，其中所述的樣本選自由 來源于活體的樣本或來源于培養(yǎng)細(xì)胞的樣本組成的組。
9.一種保藏編號為FERM BP-11202的雜交瘤細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的 抗_纖維連接蛋白片段單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種易于操作的、并具有優(yōu)異的檢測精度、特異性及可再現(xiàn)性的檢測纖維連接蛋白片段的方法。本發(fā)明還提供一種與人纖維連接蛋白片段反應(yīng)而不與人纖維連接蛋白反應(yīng)的抗-纖維連接蛋白片段的單克隆抗體、一種包括所述單克隆抗體的檢測試劑、一種使用所述單克隆抗體用于檢測纖維連接蛋白片段的方法以及一種產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
文檔編號C07K16/18GK101974087SQ20101014152
公開日2011年2月16日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者上萩京子, 佐野結(jié)花, 加藤千加, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社