專利名稱：制備高純度表柔紅霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物表阿霉素的前體表柔紅霉素的制備方法，具體而言，涉及采用微生物發(fā)酵法制備高純度表柔紅霉素的方法。
背景技術(shù)：
柔紅霉素以及以其為原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(印irubicin)是目前臨床上十分重要的抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素。表阿霉素的心臟毒性和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗腫瘤的效果相當(dāng)或更高。表柔紅霉素(4’ -epi-daunorubicin)是工業(yè)生產(chǎn)表阿霉素的重要前體，其與柔紅霉素的差別僅在于分子中脫氧糖C4位羥基構(gòu)型不同。由化學(xué)合成法從柔紅霉素到表柔紅霉素需要經(jīng)過(guò)多步條件要求苛刻的反應(yīng)過(guò)程，并會(huì)造成環(huán)境污染。 如果采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)表柔紅霉素將會(huì)大大節(jié)約成本，提高效率。目前現(xiàn)有技術(shù)可以采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)表柔紅霉素，但發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量較低。文獻(xiàn) Production of the antitumor drug epirubicin and its precursor by agenetically engineered strain of Streptomyces peucetius公開(kāi)了一種分離表柔紅霉素的方法，具體如下1)將表柔紅霉素的發(fā)酵液高速離心后取菌絲體，將其用甲醇浸泡 4h以上后抽提；2)將甲醇抽提液減壓濃縮，將pH調(diào)至4. 5后加入乙酸乙酯萃取除雜；3)萃取后將水相調(diào)至8. 2，再用二氯甲烷甲醇混合液(80 20)將表柔從水相中萃取出來(lái)；4) 用0. 02N鹽酸水溶液將表柔從混合液中萃取到水相，并用堿化劑碳酸鈉將pH調(diào)至5. 0使表柔析出，收集析出液，并用丙酮水OO 80)溶解；5)表柔的丙酮水溶液上反向硅膠柱 (Lichroprep RP-8)，上柱后用pH = 3的丙酮水05 75)將其洗脫下來(lái)，得到純度為97% 的表柔紅霉素。該方法步驟煩瑣，且必須使用硅膠為介質(zhì)的反向?qū)游鎏盍蟻?lái)完成分離純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種步驟簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)、具有很好的商業(yè)價(jià)值的提取微生物發(fā)酵產(chǎn)生的表柔紅霉素的方法。尤為重要的是，本發(fā)明方法所得的表柔紅霉素的最終純度將提高到97%以上。本發(fā)明所述的制備表柔紅霉素的方法包括以下步驟a)預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液上大孔弱酸樹(shù)脂，用添加鹽酸的丙酮或甲醇水溶液進(jìn)行洗脫；b)將表柔紅霉素洗脫液蒸干后溶于水中，然后用氯仿進(jìn)行萃取；c)表柔紅霉素萃取液上非極性吸附樹(shù)脂，再用丙酮水溶液進(jìn)行洗脫，制得表柔紅毒素。本發(fā)明中，表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程按照下列步驟進(jìn)行取表柔紅霉素發(fā)酵液，將其pH值調(diào)至3-5，離心，取菌絲體，用丙酮或甲醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸餾水溶解，抽濾，即得所述預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液。
根據(jù)本發(fā)明，將所述預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液的pH值調(diào)整為5-8，優(yōu)選調(diào)整為 7. 0。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程按照下列步驟進(jìn)行表柔紅霉素發(fā)酵液調(diào)PH為3.0，靜置一段時(shí)間后高速離心取菌絲體，用1.5倍體積的丙酮抽提菌絲體中表柔紅霉素，抽濾除去菌絲體，即得預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液。上述表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理步驟可以對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步純化，得到純度為 5 %左右的表柔紅霉素發(fā)酵液。但是，該預(yù)處理步驟不是必須的，也可以直接對(duì)表柔紅霉素發(fā)酵液進(jìn)行以下處理。表柔紅霉素發(fā)酵液中的雜質(zhì)非常多。發(fā)明人通過(guò)篩選各種樹(shù)脂，發(fā)現(xiàn)當(dāng)表柔紅霉素水溶液經(jīng)過(guò)大孔弱酸吸附樹(shù)脂時(shí)，很多極性雜質(zhì)吸附不上去，而表柔紅霉素能夠很好的被交換吸附上去。本發(fā)明所述大孔弱酸樹(shù)脂的型號(hào)可以包括CD40和D152。根據(jù)上述方法的步驟a)，所述第一種有機(jī)溶劑選自丙酮或甲醇，優(yōu)選第一種有機(jī)溶劑為丙酮。所述丙酮的濃度可以是20-80%，該濃度越高越好，但考慮到成本問(wèn)題，優(yōu)選 50%的丙酮，當(dāng)用50%的酸性丙酮水洗脫液洗脫時(shí)表柔紅霉素被完全洗下，而很多非極性的雜質(zhì)保留在樹(shù)脂上，從而提高了表柔紅霉素的純度。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，a)步驟中所添加HCl的濃度可以為0.01-0. 1N， 優(yōu)選0. 05N。通過(guò)步驟a)，可以得到純度為20%左右的表柔紅霉素洗脫液。根據(jù)上述方法的步驟b)，所用氯仿的體積優(yōu)選為和表柔紅霉素水溶液的體積相等，且氯仿的濃度優(yōu)選為100%。水相和氯仿相的比例沒(méi)有嚴(yán)格的限定，但每一相的比例不能少于兩相體積之和的30%。該步驟的主要作用是除去了大部分的水溶性雜質(zhì)，使得表柔紅霉素的純度有較大的提高。同時(shí)，它也除去了一些極性低的雜質(zhì)。優(yōu)選所述b)步驟采用調(diào)節(jié)pH的方法進(jìn)行萃取和反萃取。具體而言，先將所述PH 調(diào)至8-9，將表柔紅霉素萃取到氯仿有機(jī)溶劑相中，再將pH調(diào)至3-5，將表柔紅霉素反萃取到水相。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)b)步驟將表柔紅霉素洗脫液蒸干溶于水后，用氯仿-水體系進(jìn)行萃取，當(dāng)調(diào)節(jié)PH為8-9時(shí)，表柔紅霉素主要在氯仿相，而當(dāng)調(diào)節(jié)pH 在3-5時(shí)，表柔紅霉素主要在在水相，因此采用調(diào)節(jié)pH的方法先將表柔紅霉素萃取到氯仿相中，再反萃取到水相，從而除去雜質(zhì)。通過(guò)步驟b)，可以得到純度為71%左右的表柔紅霉素萃取液。根據(jù)上述方法的步驟C)，所述非極性吸附樹(shù)脂為反相吸附樹(shù)脂，優(yōu)選的型號(hào)是微球1號(hào)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，將步驟b)得到的表柔紅霉素萃取液上反相層析柱，用1 1的丙酮水溶液進(jìn)行洗脫，分步接收，收集純度較高的部分。該步驟的主要作用是通過(guò)反向?qū)游龅玫郊兌容^高的表柔紅霉素，采用1 1的丙酮水溶液洗脫時(shí)表柔紅霉素與雜質(zhì)有很好的分離度。通過(guò)步驟c)，可以得到純度為97%左右的表柔紅霉素。因此，本發(fā)明制備表柔紅霉素的方法的總收率在20%以上，最高可達(dá)45%以上；
4最終表柔紅霉素的純度為94%以上，最高可達(dá)97%以上。與前述文獻(xiàn)的工藝相比，本方法步驟及設(shè)備簡(jiǎn)單，卻同樣能達(dá)到文獻(xiàn)工藝的純度， 因而更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明表柔紅霉素發(fā)酵條件如下本發(fā)明實(shí)施例1-10采用以下菌種Str印tomyces peucetius，保藏號(hào)為ATCC 四050，購(gòu)自美國(guó)微生物保藏中心。實(shí)施例11-14采用其他類似菌種。培養(yǎng)配方斜面高氏培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)淀粉20，酵母浸膏20，葡萄糖20，麩皮20，MgS04. 7H201 ；種子培養(yǎng)條件:28°C,220rpm, 36h接種量10%發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)黃豆餅粉60，葡萄糖 10，麩皮 20，K2HPO4. 3H200. 5，(NH4) 2S042， 豆粕 10-15，MgS04. 7H20 0. 5，淀粉酶 1。發(fā)酵培養(yǎng)條件觀°C，220rpm, 6天表柔紅霉素的HPLC檢測(cè)條件色譜柱agilent C184. 6拉50讓；檢測(cè)波長(zhǎng)2Mnm ；流動(dòng)相0.2% H3PO4 MeOH = 45 55 ；流速0. 800ml/min柱溫40°C實(shí)施例1-2考察不同來(lái)源的發(fā)酵液對(duì)分離工藝的影響實(shí)施例1表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.6%，單位為Mug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜
置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 2 % ο表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的大孔弱酸離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 01MHC1) 洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為23. 2%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為8. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為69.8%。裝一根高約20cm，直徑約為km的微球一號(hào)層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97.3%。以上幾步的總收率約為48%。實(shí)施例2表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為2.2%，單位為21ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為5. 0后靜
置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 5%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以^iil/ min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0.05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為沈.4%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)PH為5. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為72. 1%。裝一根高約20cm，直徑約為km的微球一號(hào)層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為96.9%。以上幾步的總收率約為53%。實(shí)施例3-5考察不同的抽提溶劑對(duì)分離工藝的影響實(shí)施例3表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.8%，單位為19ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用3倍的甲醇浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將甲醇蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 5%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 1MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為8%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為68.7%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反向吸附層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為95.9%。以上幾步的總收率約為49%。實(shí)施例4表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.3%，單位為22ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜
置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為2.9%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 01MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為19.5%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為4. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為67.5%。裝一根高約20cm，直徑約為km的微球一號(hào)層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97.2%。以上幾步的總收率約為50%。實(shí)施例5表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為2. 1%，單位為^ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1.5倍的甲醇浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將乙醇蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為
3.7 % ο表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用3 1的丙酮水(0. 01MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為沈.4%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為69.8%。裝一根高約20cm，直徑約為km的微球一號(hào)層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為96.8%。以上幾步的總收率約為49%。實(shí)施例6-7考察不同大孔弱酸吸附樹(shù)脂對(duì)分離的影響實(shí)施例6表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為2.0%，單位為17ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為4. 0后靜
置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 5%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的⑶40離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 01MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為觀.6%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)PH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為70.2%。裝一根高約20cm，直徑約為km的微球一號(hào)層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97.3%。以上幾步的總收率約為51%。實(shí)施例7表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為2.5%，單位為20ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 9%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152大孔弱酸離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以anl/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素全部被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水 (0. 01MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為21.5%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為67.5%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反向吸附層析柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為96.4%。以上幾步的總收率約為45%。實(shí)施例8、9考察不同的吸附樹(shù)脂對(duì)分離的影響實(shí)施例8表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.8%，單位為16ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜
置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 5%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的⑶40弱酸離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 01MHC1) 洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為25.4%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為72. 1%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂1400，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為94.8%。以上幾步的總收率約為52%。實(shí)施例9
表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.7%，單位為18ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用2. 5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 9%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 01MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為27. 3%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為72.5%。裝一根高約20cm，直徑約為4cm的反相吸附Y(jié)PRII，將表柔紅霉素的水溶液以^iil/ min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為95.0%。以上幾步的總收率約為47%。實(shí)施例10表柔紅霉素發(fā)酵液的預(yù)處理過(guò)程取發(fā)酵液1000ml，其純度為1.9%，單位為23ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為 3. 5%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為25. 4%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為68.8%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂微球一號(hào)，將表柔紅霉素的水溶液以aiil/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97. 9%。以上幾步的總收率約為48%。實(shí)施例11-14比較不同菌種來(lái)源的發(fā)酵液的分離效果實(shí)施例11采用天藍(lán)淡紅鏈霉菌ATC(^9050進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液IOOOml，其純度為 2. 1%,單位為21ug/ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用 1. 5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為3.7%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為27. 3%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為71.2%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂微球一號(hào)，將表柔紅霉素的水溶液以aiil/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為96. 9%。以上幾步的總收率約為47%。實(shí)施例12采用天藍(lán)淡紅鏈霉菌mYGlllS進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。該菌株由上海醫(yī)工院保藏，是以表柔紅霉素產(chǎn)生菌mHJ-02-30-1為原始菌株，構(gòu)建含有兩個(gè)aveBVI表達(dá)單元的整合型質(zhì)粒， 并將其轉(zhuǎn)入mHJ-02-30-1中，使菌株內(nèi)aveBVI的表達(dá)單元數(shù)由1個(gè)增加到3個(gè)，由于增加 aveBIV基因表達(dá)單元數(shù)可以提高表柔紅霉素的產(chǎn)量，其發(fā)酵單位比mHJ-02-30-1提高了 1倍。取天藍(lán)淡紅鏈霉菌mYGl 118的發(fā)酵液1000ml，其純度為3. 3%，單位為64ug/ml，將發(fā)酵液PH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1. 5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為4.3%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為31.2%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為74. 1%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂微球一號(hào)，將表柔紅霉素的水溶液以aiil/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97. 6%。以上幾步的總收率約為48%。實(shí)施例13采用天藍(lán)淡紅鏈霉菌mHJ-02-30-1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。該菌株由上海醫(yī)工院保藏，是以柔紅霉素產(chǎn)生菌SIPI-1482(醫(yī)工院保藏，可購(gòu)買得到)為原始菌株構(gòu)建的基因工程菌， 具體操作為將紅霉素啟動(dòng)子和aveBIV基因插入柔紅糖胺的生物合成基因dnmV內(nèi)部，置換 dnmV基因中間199bp的堿基，保持剩下的dnmV基因的兩端的堿基和編碼氨基酸不變，從而最大限度的減少中斷dnmV和插入aveBIV基因?qū)ι舷掠位虻挠绊?，其發(fā)酵單位穩(wěn)定在 35mg/L。取天藍(lán)淡紅鏈霉菌mHJ-02-30-1的發(fā)酵液IOOOml，其純度為2.9%，單位為
ml，將發(fā)酵液pH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1. 5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為4. 1%。
表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為四.4%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為69.8%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂微球一號(hào)，將表柔紅霉素的水溶液以aiil/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為97. 1%。以上幾步的總收率約為46%。實(shí)施例14采用天藍(lán)淡紅鏈霉菌mYG1116E進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。該菌株由上海醫(yī)工院保藏，是以表柔紅霉素產(chǎn)生菌mHJ-02-30-1為原始菌株，通過(guò)同源重組雙交換的方法對(duì)其旁路代謝的 dnrU基因進(jìn)行敲除得到的工程菌，其發(fā)酵單位比mHJ-02-30-1提高了約40%。取天藍(lán)淡紅鏈霉菌mYG1116E的發(fā)酵液1000ml，其純度為3. 4%，單位為52ug/ml， 將發(fā)酵液PH調(diào)為3. 0后靜置一段時(shí)間，高速離心后棄去上清液，用1. 5倍的丙酮浸取其中的表柔紅霉素，過(guò)濾除去菌絲體，再將丙酮蒸干后用水溶解表柔紅霉素，同樣過(guò)濾除去其中的不溶物，檢測(cè)其純度為3.9%。表柔紅霉素的制備方法裝一根高約20cm，直徑約為km的D152離子交換柱，將表柔紅霉素的水溶液以 2ml/min的流速過(guò)柱，表柔紅霉素完全被吸附在柱上，再用1 1的丙酮水(0. 05MHC1)洗脫柱子，收集全部洗脫液，其純度為27. 9%。將表柔紅霉素洗脫液中丙酮蒸去，調(diào)節(jié)水溶液pH為9. 0，加入等體積氯仿充分混勻，靜置30分鐘，棄去水相。再在氯仿相中加入等體積蒸餾水，調(diào)pH為3. 0，充分混勻，靜置 30分鐘，棄去氯仿相。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為65. 1%。裝一根高約20cm，直徑約為km的反相吸附樹(shù)脂微球一號(hào)，將表柔紅霉素的水溶液以aiil/min的流速過(guò)柱，再用1 1的丙酮水洗脫柱子，分步收集洗脫液中純度較高的部分，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純度為94. 1%。以上幾步的總收率約為49%。
權(quán)利要求
1.制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液上大孔弱酸樹(shù)脂，用添加鹽酸的丙酮或甲醇水溶液進(jìn)行洗脫；b)將表柔紅霉素洗脫液蒸干后溶于水中，然后用氯仿進(jìn)行萃??；c)表柔紅霉素萃取液上非極性吸附樹(shù)脂，再用丙酮水溶液進(jìn)行洗脫，制得表柔紅霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，所述預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液按照下列步驟得到取表柔紅霉素發(fā)酵液，將其PH值調(diào)至3-5，離心，取菌絲體，用丙酮或甲醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸餾水溶解，抽濾，即得所述預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，將預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液的PH值調(diào)整為5-8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，將預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液的PH值調(diào)整為7. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，a)步驟中所述鹽酸的濃度為0. 01-0. IN0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，a)步驟中所述鹽酸的濃度為0. 05。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，a)步驟中所述丙酮或甲醇水溶液的濃度為20-80%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，a)步驟中所述丙酮或甲醇水溶液的濃度為50%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，c)步驟中所述丙酮水溶液的濃度為30-70%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，C)步驟中所述丙酮水溶液的濃度為50%。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，所述丙酮或甲醇水溶液所用的體積為菌絲體的1-3倍。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，所述第一種溶劑所用的體積為菌絲體的2倍。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，a)步驟所述大孔弱酸樹(shù)脂的型號(hào)選自D152或CD40。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，c)步驟所述非極性吸附樹(shù)脂為反相吸附樹(shù)脂。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，所述反相吸附樹(shù)脂的型號(hào)為微球1號(hào)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，b)步驟采用調(diào)節(jié)PH的方法進(jìn)行萃取和反萃取。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制備表柔紅霉素的方法，其特征在于，先將所述pH調(diào)至8-9， 將表柔紅霉素萃取到氯仿有機(jī)溶劑相中，再將PH調(diào)至3-5，將表柔紅霉素反萃取到水相。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備表柔紅霉素的方法，所述方法包括以下步驟a)預(yù)處理后的表柔紅霉素發(fā)酵液上大孔弱酸樹(shù)脂，用添加鹽酸的丙酮或甲醇水溶液進(jìn)行洗脫；b)將表柔紅霉素洗脫液蒸干后溶于水中，然后用氯仿進(jìn)行萃取；c)表柔紅霉素萃取液上非極性吸附樹(shù)脂，再用丙酮水溶液進(jìn)行洗脫，制得表柔紅霉素。本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)、具有很好的商業(yè)價(jià)值，并且本發(fā)明方法所得的表柔紅霉素的最終純度將提高到97％以上。
文檔編號(hào)C07H15/252GK102190691SQ20101012645
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者盧亮, 張志杰, 李繼安 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院