專(zhuān)利名稱(chēng)：重組纖維蛋白原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組纖維蛋白原，涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以高水平產(chǎn)生重組纖維蛋白 原的方法，還涉及它的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原是可溶性血漿糖蛋白，主要是通過(guò)肝臟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在人體內(nèi)合成。 它是由兩對(duì)標(biāo)記為A α、Ββ和γ的三條多肽鏈組成的二聚體分子，所述三條多肽鏈由二硫 橋鍵連接。三條多肽鏈由三個(gè)獨(dú)立的基因編碼。野生型A α鏈合成為含625個(gè)氨基酸的前 體，并作為含610個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)存在于血漿中，Ββ含461個(gè)氨基酸，γ鏈含411個(gè)氨 基酸。三種多肽分別由3種mRNA合成。三條組成鏈(Αα、Ββ和Y)組裝成最終形式的六 鏈二聚體(Αα、Ββ、Y )2發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔內(nèi)。纖維蛋白原以高濃度(l_2g/L)循環(huán)于血液中，并顯示出高度的異質(zhì)性。通過(guò)基 因多態(tài)性、糖基化和磷酸化的差異、A α鏈的端羧基部分的(部分)蛋白水解以及選擇性剪 接產(chǎn)生變體(請(qǐng)參閱 De Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hemato 1. 12，377 ；Laurens 等(2006)J. Thromb Haemost. 4，932 ；Henschen-Edman(2001)Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 936， 580)。據(jù)估計(jì)，在每個(gè)個(gè)體中，約有一百萬(wàn)個(gè)不同的纖維蛋白原分子循環(huán)。大部分的這些 變體在功能和結(jié)構(gòu)上都不同，所述的這些變體只占纖維蛋白原總數(shù)的一小部分(在大多數(shù) 情況下不超過(guò)幾個(gè)百分比)。Aa鏈的端羧基部分的蛋白水解導(dǎo)致具有明顯不同分子量 的纖維蛋白原的三種主要循環(huán)形式。纖維蛋白原以高分子量的形式合成(HMW ；分子量為 340kDa;循環(huán)中的Aa鏈的主要形式含610個(gè)氨基酸)。A α鏈之一的降解產(chǎn)生低分子量形 式(LMW ;MW = 305kDa) ；LMW形式Q70kDa)是其中兩個(gè)A α鏈都在端羧基部分地降解的變 體。在正常血液中，50-70%的纖維蛋白原是HMW，20-50%是具有一個(gè)或兩個(gè)降解Aa鏈的 纖維蛋白原(de Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。HMW 和 LMW 變體 在凝血時(shí)間和纖維蛋白聚合體結(jié)構(gòu)方面顯示出明顯的差異(Hasegawa N5Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57,183。由選擇性剪接產(chǎn)生的眾所周知的變體是所謂的Y，變體和Fib420變體。γ丨變體占γ鏈總數(shù)的約8%。對(duì)于豐度最高的Y鏈來(lái)說(shuō)，它由427個(gè)而不是 411個(gè)氨基酸組成；四個(gè)末端C氨基酸(AGDV)被含2個(gè)硫酸化酪氨酸的20個(gè)氨基酸取代。 纖維蛋白原 ’鏈不能與對(duì)調(diào)節(jié)血小板凝聚至關(guān)重要的血小板纖維蛋白原受體nb0 3結(jié)合。分子量為420kDa的Fib420變體占循環(huán)纖維蛋白原總數(shù)的1_3 % (de Maat和 Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。通過(guò)選擇性剪接，使額外的開(kāi)放讀碼框包 括于Aa鏈的C-末端，從而用237個(gè)氨基酸將其擴(kuò)展。附加的氨基酸形成結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。血源性纖維蛋白原是市售纖維蛋白封閉劑的一個(gè)重要組分，所述纖維蛋白封閉劑 臨床應(yīng)用于外科手術(shù)中，用以止血和減少血液及體液的流失。此外，其用于通過(guò)利用纖維蛋 白的凝集性能促進(jìn)組織粘連和用于改善傷口的愈合。纖維蛋白原臨床上也用于補(bǔ)充遺傳性纖維蛋白原缺乏癥患者和后天性纖維蛋白原缺乏癥患者的纖維蛋白原缺乏。已證實(shí)高劑量 纖維蛋白原(3-10克)的靜脈注射能在不同的臨床情況下使血液凝固正?；⒆柚够蝾A(yù)防 嚴(yán)重的出血。人纖維蛋白原的重組生產(chǎn)，無(wú)論是野生型(HMW)形式或作為變體(如Fib420)，比 使用血源性材料有很多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括其優(yōu)選的安全特性、以純粹的方式產(chǎn)生變體的 可能性和無(wú)限制供應(yīng)。然而，為了以經(jīng)濟(jì)上可行的方式進(jìn)行生產(chǎn)，需要完整、功能性纖維蛋 白原的高表達(dá)水平。此外，針對(duì)具體的應(yīng)用(如使用纖維蛋白原作為靜脈注射(IV)止血 劑)，需要正確的翻譯后修飾(如糖基化)。由于翻譯后修飾的原因，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的表達(dá)是優(yōu)選的。因此，生物活性重組 纖維蛋白原已經(jīng)在各種細(xì)胞中被表達(dá)，如幼倉(cāng)鼠腎(BHK)(如Roy等，(1991)Biochemistry 30,9414)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(如 Lord, (US6037457)，Binnie 等，(1993) Biochemistry 32，107)或非洲綠猴源性 COS 細(xì)胞(如 Roy 等，(1991) J. Biol. Chem. 266, 4758)。然而，表達(dá)水平只有大約l_15yg/ml，被認(rèn)為不足以取代臨床實(shí)踐中所需的大量血 漿纖維蛋白原。此外，人纖維蛋白原在酵母P. pastor is中的表達(dá)水平為8 μ g/ml，這對(duì)于商 業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)也是不夠的CTojo等，(2008) Prot. Expr.和Purif. 59，289)。在EP 1 661 989中，據(jù)報(bào)道，對(duì)于商業(yè)上可行的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，需要的產(chǎn)量為至少 100mg/L。在這種應(yīng)用中，報(bào)告稱(chēng)在轉(zhuǎn)瓶中，CHO細(xì)胞的表達(dá)水平可高達(dá)631. 5mg/L。然而， 為了達(dá)到這種水平，細(xì)胞必須共同表達(dá)桿狀病毒P35抗凋亡蛋白質(zhì)，且必須使用甲氨蝶呤 (抗代謝物)擴(kuò)增載體。與工業(yè)上的標(biāo)準(zhǔn)相比(例如mirm(Nature Biotechnol. (2004)22， 1393)報(bào)告了 3-4天的傳代培養(yǎng)中的常規(guī)細(xì)胞密度為2 X 106細(xì)胞/ml)，細(xì)胞密度相對(duì)較低 (在轉(zhuǎn)瓶中，15天內(nèi)最高為9. 4X105細(xì)胞/ml)。重組纖維蛋白原的成功生產(chǎn)的最重要問(wèn)題是如何制備高純度的足夠完整、正確組 裝的生物活性產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對(duì) 在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列可實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中以完整的形式高效表達(dá)重組纖維蛋白原。由優(yōu)化核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列與 由相應(yīng)的非優(yōu)化核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列相同。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)‘纖維蛋白原’可以 指任何形式的纖維蛋白原，包括通過(guò)基因多態(tài)性、糖基化和磷酸化的差異、Aa鏈的端羧基 部分的(部分)蛋白水解和選擇性剪接產(chǎn)生的變體。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)‘α鏈’和‘Αα鏈’ 可互換使用。它們可以指α鏈的野生型和變體兩者，包括含信號(hào)序列(SEQ ID No. 8)的 644個(gè)氨基酸的纖維蛋白原α鏈、無(wú)信號(hào)序列(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至644)的625個(gè) 氨基酸的前體纖維蛋白原α鏈、見(jiàn)于循環(huán)中的610個(gè)氨基酸(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至 629)的截短纖維蛋白原α鏈和含信號(hào)序列(SEQ ID Ν0. 11)或無(wú)信號(hào)序列(SEQ ID NO. 11 的氨基酸20-866)的866個(gè)氨基酸的Fib420變體α鏈。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)‘β鏈，和‘Ββ 鏈’可互換使用。它們可以指β鏈的野生型和變體兩者，包括含信號(hào)序列(SEQ ID No. 9) 的491個(gè)氨基酸的纖維蛋白原β鏈和無(wú)信號(hào)序列(SEQ ID Ν0. 9的氨基酸31至491)的 461個(gè)氨基酸的纖維蛋白原β鏈。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)‘伽瑪鏈’和‘ Y鏈’可互換使用。它們可以指Y鏈的野生型和 變體兩者，包括含信號(hào)序列(SEQ ID No. 10)的437個(gè)氨基酸的纖維蛋白原、鏈、無(wú)信號(hào)序 列(SEQ ID NO. 10的氨基酸27至437)的411個(gè)氨基酸的纖維蛋白原Y鏈、453個(gè)氨基酸 的纖維蛋白原、鏈(帶有信號(hào)序列(SEQ ID NO. 13)的Y ’鏈)和427個(gè)氨基酸的纖維蛋 白原Y鏈(無(wú)信號(hào)序列(SEQ ID NO. 13的氨基酸27至453)的Y ’鏈)。在本發(fā)明中，當(dāng)氨基酸序列含由核苷酸序列編碼的所有氨基酸，任選不含在正常 細(xì)胞(分泌)處理過(guò)程中被移除的氨基酸時(shí)，纖維蛋白原或纖維蛋白原鏈?zhǔn)恰暾问降摹?因此，具有644、625或610個(gè)氨基酸的α鏈?zhǔn)峭暾问降摩伶湹睦?。根?jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量為至少55 %，優(yōu)選為至少58 %，更優(yōu)選為 至少60或65 %。在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量在約55 %至 70 %范圍內(nèi)。在另一實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量在約60 %至65 % 范圍內(nèi)。編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本分明的優(yōu)化核苷酸序列是針對(duì)在真核細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。優(yōu)選地，它們是針對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的，如 針對(duì)在COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、CHO細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或昆 蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)。更優(yōu)選地，核苷酸序列是針對(duì)在人體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu) 化的，如針對(duì)PER. C6細(xì)胞或HEK293細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化的密碼子適應(yīng)指數(shù)為至少0. 90，優(yōu)選為至少0. 95，更優(yōu)選為至 少0. 97。在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列通過(guò)適應(yīng)CHO細(xì)胞的密碼子使用被優(yōu) 化，其中密碼子適應(yīng)指數(shù)為至少0. 95。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可以是編碼任何類(lèi)型的纖維蛋白原鏈的。優(yōu)選地，它們 編碼哺乳動(dòng)物纖維蛋白原鏈，更優(yōu)選地，它們編碼靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物纖維蛋白原鏈，最優(yōu)選地，它 們編碼人纖維蛋白原鏈。鏈的組合也是可能的，例如一個(gè)或兩個(gè)哺乳動(dòng)物纖維蛋白原鏈與 兩個(gè)或一個(gè)嚙齒類(lèi)動(dòng)物纖維蛋白原鏈組合。優(yōu)化核苷酸序列可以是DNA或RNA。優(yōu)選是 cDNA。編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列顯示出與其相應(yīng)的非 優(yōu)化對(duì)應(yīng)物至少70%的一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼纖維蛋白原α、β和Y鏈的本發(fā)明 的優(yōu)化核苷酸序列顯示出與其相應(yīng)的非優(yōu)化序列70-80%的一致性。優(yōu)選地，編碼纖維蛋白 原α、β或Υ鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列不包含順式作用位點(diǎn)，如剪接位點(diǎn)和poly(A)信號(hào)。編碼纖維蛋白原α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列不包含通常存在于編碼人纖維 蛋白原的α鏈的基因中的39個(gè)堿基對(duì)直接重復(fù)序列。在編碼α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷 酸序列中，不用改變編碼的蛋白質(zhì)序列即可改變重復(fù)序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含根據(jù)SEQ ID No. 4或7的序列。編碼纖維蛋白原α鏈且包含部分的這些序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā) 明中。在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 4的核苷酸60-1932。 在另一實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 4的核苷酸60-1887。在 又一實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 7的核苷酸60-2598。這樣 的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ iD N0. 4或7有至少85%、至少87 %或至少90 %、更優(yōu)選至少92 %、至少94 %、96 %、最優(yōu)選至少98 %或至少99 %的一 致性的序列，并且編碼纖維蛋白原α鏈，例如帶有根據(jù)SEQ ID NO. 8或11的序列或部分的 這些序列的纖維蛋白原α鏈，如上文所例示。在優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼β鏈的本發(fā)明的優(yōu) 化核苷酸序列包含根據(jù)SEQ ID No. 5的序列。編碼纖維蛋白原β鏈且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中。在一 個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 5的核苷酸93-1473。這樣的 核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ ID No. 5有至少85%、至少87% 或至少90%、更優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu)選至少98%或至少99%的一致性的 序列，并且編碼纖維蛋白原β鏈，例如帶有根據(jù)SEQ ID NO. 9的序列或部分此序列(例如 SEQ ID NO. 9的氨基酸31至491)的纖維蛋白原β鏈。在優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼纖維蛋白 原、鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO. 6的序列。編碼纖維蛋白原、鏈 且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼纖維蛋白原Y 鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 6的核苷酸81-1311。這樣的核苷酸序列也 涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ ID No. 6有至少85%、至少87%或至少90%、更 優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu)選至少98%或至少99%的一致性的序列，并且編碼纖 維蛋白原Y鏈，例如帶有根據(jù)SEQ ID NO. 10的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO. 10的 氨基酸27至437)的纖維蛋白原、鏈。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼纖維蛋白原Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含 根據(jù)SEQ ID N0. 12的序列。編碼纖維蛋白原Y鏈且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋 在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼纖維蛋白原Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 12的核苷酸81-1359。這樣的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與 SEQ ID No. 12有至少85%、至少87%或至少90%、更優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu) 選至少98%或至少99%的一致性的序列，并且編碼纖維蛋白原γ鏈，例如帶有根據(jù)SEQ ID N0. 13的序列或部分此序列(例如SEQ ID N0. 13的氨基酸27至453)的纖維蛋白原Y鏈。在另一方面，本發(fā)明涉及核苷酸構(gòu)建體，所述核苷酸構(gòu)建體包含編碼纖維蛋白原 α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列。核苷酸構(gòu)建體可包含影響纖維蛋白原鏈的表 達(dá)的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸構(gòu)建體是載體，例如 克隆載體或表達(dá)載體。核苷酸構(gòu)建體可包含選擇標(biāo)記。在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核 苷酸序列的細(xì)胞。在所述細(xì)胞中，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸可以本身或者在構(gòu)建體中的形式存 在，如在表達(dá)載體或克隆載體中。所述細(xì)胞通常是用于產(chǎn)生纖維蛋白原的宿主細(xì)胞。包含 根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合適例子包括昆蟲(chóng) 細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、CHO細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞和HEK293細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生大量的完整生物活性纖維蛋白原。所述細(xì)胞通常是細(xì)胞 系的一部分。在本發(fā)明中，短語(yǔ)‘產(chǎn)生大量完整纖維蛋白原的細(xì)胞或細(xì)胞系’是指產(chǎn)生超過(guò) 85 %、優(yōu)選超過(guò)90 %、95 %或99 %的完整產(chǎn)物的細(xì)胞或細(xì)胞系。優(yōu)選地，這是在群體倍增為 10,20或30的時(shí)期、更優(yōu)選為40或50的時(shí)期測(cè)量的。在本發(fā)明中，‘生物活性’纖維蛋白 原是指在凝血酶的存在下聚合成纖維蛋白的纖維蛋白原。這種細(xì)胞或細(xì)胞系也涵蓋在本發(fā) 明中。在優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系產(chǎn)生完整重組纖維蛋白原的水平為每天每個(gè)細(xì)胞至少3微微克，更優(yōu)選為每天每個(gè)細(xì)胞至少4或5微微克，甚至更優(yōu)選為每天每個(gè)細(xì) 胞至少7或10微微克。在細(xì)胞密度為30 X 106個(gè)細(xì)胞/ml的反應(yīng)器中，每天每個(gè)細(xì)胞3微 微克相當(dāng)于每天每升反應(yīng)器體積產(chǎn)生90mg纖維蛋白原，每天每個(gè)細(xì)胞5微微克相當(dāng)于每天 每升產(chǎn)生150mg纖維蛋白原，每天每個(gè)細(xì)胞7微微克相當(dāng)于每天每升產(chǎn)生210mg纖維蛋白 原。優(yōu)選地，細(xì)胞群的至少50%、更優(yōu)選細(xì)胞群的至少60%、70%或80%、最優(yōu)選細(xì)胞群的 至少90^^95%或99%每天每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生至少3微微克，更優(yōu)選每天每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生至少5 微微克，甚至更優(yōu)選每天每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生至少7微微克。產(chǎn)生大量完整纖維蛋白原的細(xì)胞或細(xì)胞系的選擇優(yōu)選在沒(méi)有蛋白酶抑制劑的表 達(dá)的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，使用抗體進(jìn)行選擇，優(yōu)選的是與α鏈的完整N-末端 和α鏈的完整C-末端結(jié)合的單克隆抗體。市售的這種抗體的合適例子包括由Koppert 等((1985)Blood 66,503)所描述的 Y18 抗體和由 Hoegee-de Nobel 等((1988)Thromb. Haemost. 60(3)415)所描述的G8抗體。優(yōu)選在無(wú)血清的環(huán)境中進(jìn)行這種選擇。選擇產(chǎn)生完 整纖維蛋白原的細(xì)胞系的方法也是本發(fā)明的一部分。另一方面，本發(fā)明涉及在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生纖維蛋白原的方法。所述方法 包括根據(jù)本發(fā)明在產(chǎn)生纖維蛋白原的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或細(xì)胞系。可任選回收產(chǎn)生的纖 維蛋白原?？梢越M合優(yōu)化和非優(yōu)化的鏈?？梢酝ㄟ^(guò)基因工程或者通過(guò)合成方法獲得非優(yōu)化 鏈，并且它們的來(lái)源可以與優(yōu)化鏈不同。在一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)纖維蛋白原分子中只有一個(gè) 鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)根據(jù)本發(fā)明的密碼子優(yōu)化核苷酸序列編碼的，而兩個(gè)其它鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)兩個(gè)沒(méi)有優(yōu)化 的核苷酸序列編碼的。在另一實(shí)施例中，每個(gè)纖維蛋白原分子的三個(gè)纖維蛋白原鏈中的兩 個(gè)是通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的密碼子優(yōu)化核苷酸序列編碼的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所有三個(gè)纖維 蛋白原鏈都是通過(guò)優(yōu)化的核苷酸序列編碼的。與血源性纖維蛋白原相比，因?yàn)楫a(chǎn)生了特定 的纖維蛋白原鏈，所以由此方法產(chǎn)生的纖維蛋白原制劑相當(dāng)均勻。所述方法能夠產(chǎn)生纖維 蛋白原制劑，其 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上、優(yōu)選95%、98% 或99 %以上是僅少量存在于血漿中的變體。另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列在制備若干醫(yī)療應(yīng)用的纖維蛋白 原中的用途。在一個(gè)應(yīng)用中，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列用于制備用在纖維蛋白封閉劑中的 纖維蛋白原，所述纖維蛋白封閉劑臨床應(yīng)用于外科手術(shù)中，用以止血和減少血液及體液的 流失。在另一應(yīng)用中，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備纖維蛋白原，從而通過(guò)利用纖維 蛋白的凝集性能促進(jìn)組織粘連和改善傷口的愈合。在又一應(yīng)用中，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序 列可用于制備纖維蛋白原，所述纖維蛋白原臨床上用于通過(guò)靜脈注射纖維蛋白原治療先天 性或后天性(如通過(guò)在創(chuàng)傷后或在手術(shù)過(guò)程中出血)纖維蛋白原缺乏癥患者的急性出血發(fā) 作。市場(chǎng)上銷(xiāo)售的血源性纖維蛋白原制劑有Riastap (CSL Behring LLC ；在美國(guó)市場(chǎng)銷(xiāo)售) 和Haemocomplettan (CSL Behring AG;在歐洲市場(chǎng)銷(xiāo)售)。與血源性制劑相比，重組纖維蛋 白原制劑有若干優(yōu)點(diǎn)，包括優(yōu)選的安全特性、無(wú)限制供應(yīng)和以純粹的方式針對(duì)此特定適應(yīng) 證生產(chǎn)具有優(yōu)選活性特性的纖維蛋白原變體的可能性。


圖1在CHO細(xì)胞用野生型和編碼A α、Ββ和γ鏈的密碼子優(yōu)化構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后的第 1、2、3和6天時(shí)重組人纖維蛋白原的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行兩次，(opt)優(yōu)化序列；(wt)野生型序列。圖2在CHO細(xì)胞用編碼A α、B β和γ鏈的密碼子優(yōu)化構(gòu)建體和帶有A α -擴(kuò)展 的、B β和γ鏈(標(biāo)記為A α-ext. (opt)+B β (opt)+ γ (opt))的密碼子優(yōu)化構(gòu)建體(標(biāo)記 為Aa (opt)+B β (opt)+ y (opt))轉(zhuǎn)染后的第1、2、3和6天時(shí)重組人纖維蛋白原的表達(dá)水
平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行兩次。圖3來(lái)自表達(dá)重組人纖維蛋白原的克隆體M21、M25和M57的批處理運(yùn)行的培養(yǎng) 上清液的蛋白質(zhì)印跡分析。對(duì)照泳道(contr)含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。箭頭指示A α鏈的分解產(chǎn)物。圖4來(lái)自表達(dá)具有擴(kuò)展A α鏈的變體人纖維蛋白原(Fib420)的克隆體P40的批 處理運(yùn)行的培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1是含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3， Enzyme Research Laboratories)的對(duì)照泳道。泳道2和3含克隆體P40A α擴(kuò)展的培養(yǎng)上 清液，分別取自比處理運(yùn)行的第4天和第7天。圖5用含Y’的人纖維蛋白原瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的PER. C6細(xì)胞的培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì) 印跡分析(詳見(jiàn)實(shí)例9中所述)。泳道1含表達(dá)重組Y’纖維蛋白原的PER. C6細(xì)胞的 培養(yǎng)上清液。泳道2是對(duì)照泳道，含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。圖6通過(guò)PNGase F處理的N-糖基化的纖維蛋白原分析，接下來(lái)的SDS-PAGE分析。泳道加載如下MW 分子量標(biāo)準(zhǔn)(基準(zhǔn)，hvitrogen)ERL FIB3 血源性纖維蛋白原(ERL)，用PNGase F處理(+)或不用PNGase F處理 ㈠。PER. C6 fdg :PER. C6源性纖維蛋白原，用PNGase F處理(+)或不用PNGase F處理㈠。每條泳道加載2 μ g纖維蛋白原；使用考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)完成染色。使用還原的10% BisTris 凝膠(Nul^age，Invitrogen)進(jìn)行分析。圖7R0TEM分析凝血時(shí)間。通過(guò)ROTEM分析確定凝血時(shí)間。200 μ 1合并的正常(檸檬酸鹽)血漿或100 μ 1 合并的正常(檸檬酸鹽)血漿以1 1的比例與Haemocomplettan (CSL Behring GmbH, Marburg, Germany)或PER. C6纖維蛋白原(均為在TBS中ang/ml)混合。添加CaC12至最終 濃度為17mM。為了開(kāi)始凝血，加入α-凝血酶至最終濃度為lU/ml?？偡磻?yīng)體積是240μ 1。 圖中顯示與纖維蛋白原以1 1混合的血漿的凝血時(shí)間(秒)1.血源性纖維蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纖維蛋白原所有的測(cè)量均重復(fù)兩次。圖8R0TEM分析血凝塊硬度。通過(guò)ROTEM分析確定血凝塊硬度。圖中表示的是 AlO值(mm)，該值是在血漿與纖維蛋白原以1 1混合10分鐘時(shí)血凝塊的硬度。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié) 與圖7的圖例中所述相同。1.血源性纖維蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纖維蛋白原
9
所有的測(cè)量均重復(fù)兩次。圖9R0TEM分析血凝塊形成時(shí)間。用或不用林格氏(Ringer's)乳酸鹽(Baxter， Utrecht, The Netherlands)稀釋來(lái)自健康個(gè)體的檸檬酸鹽血。隨后給林格氏乳酸鹽稀釋 的血液補(bǔ)充或不補(bǔ)充(對(duì)照)血源性或重組的纖維蛋白原。圖中顯示如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸鹽(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL,50 μ 1 重組 hFbg 6. 5mg/ml (最終濃度:1. lmg/ml)在任何情況下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 試劑(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)開(kāi)始凝血。正常范圍(35-160秒)是見(jiàn)于健康個(gè)體的值。160-220秒的CFT值見(jiàn)于止血功能正常未受損但儲(chǔ)血減少的患者。圖10 ROTEM分析血凝塊硬度。用或不用林格氏乳酸鹽(Baxter，Utrecht, The Netherlands)稀釋來(lái)自健康個(gè)體 的檸檬酸鹽血。隨后給林格氏乳酸鹽稀釋的血液補(bǔ)充或不補(bǔ)充(對(duì)照)血源性或重組的纖 維蛋白原。測(cè)量條件如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸鹽(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 重組 hFbg 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ml)在任何情況下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 試劑(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)開(kāi)始凝血。正常范圍(53-72mm)是見(jiàn)于無(wú)凝血功能障礙的健康患者的值。45_40mm的MCF值 見(jiàn)于有出血危險(xiǎn)指征的患者。實(shí)例實(shí)例1優(yōu)化的cDNA構(gòu)建體的制備在野生型(此例中指非優(yōu)化形式)和由GeneArt (RegensburgjGermany)密碼子優(yōu) 化的形式兩者中合成編碼人纖維蛋白原多肽鏈Αα、Ββ、γ、Αα-擴(kuò)展(Fib420)和Y’的 cDNA (i)移除順式作用位點(diǎn)(剪接位點(diǎn)，poly(A)信號(hào))；(ii)修飾Aa鏈的重復(fù)序列；±曾 加GC含量以延長(zhǎng)mRNA的半衰期；(iv)使密碼子使用適應(yīng)CHO (密碼子適應(yīng)指數(shù)-CAI- > 0.95)。使用的野生型參照物，對(duì)于α鏈?zhǔn)铅琠021871，對(duì)于β鏈?zhǔn)铅琠005141，對(duì)于γ鏈 是 ΝΜ_000509。將編碼野生型形式中的Aa (SEQ ID NO. 1)、Ββ (SEQ ID NO. 2)和 y (SEQ ID NO. 3)鏈的00嫩與編碼優(yōu)化的八0 (SEQ ID Ν0·4)、Ββ (SEQ ID NO. 5)禾口 y (SEQ ID NO. 6) 的cDNA進(jìn)行比較，結(jié)果示于表1。優(yōu)化的Aa-擴(kuò)展(Fib420) (SEQ ID NO. 7)和γ，序列(SEQ ID NO. 12)也示于表 1。野生型α (SEQ ID No. 1)、β (SEQ ID NO. 2)禾口 γ (SEQ ID NO. 3)鏈 cDNA 及優(yōu)化 的 α (SEQ ID No. 4)、β (SEQ ID NO. 5)禾口 γ (SEQ ID NO. 6)鏈 cDNA 在 pcDNA3. 1 衍生物 (deriviate)中被亞克隆。野生型和優(yōu)化的_A α -鏈及A α擴(kuò)展(Fib420)均在pcDNA3. 1(+) neo 中，Ββ 鏈均在 pcDNA3. 1 (+)hygro 中，γ 鏈均在 pcDNA3. 1(-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。優(yōu)化的Y'鏈在pcDNA3. 1 (+) hygro中被亞克隆。表 權(quán)利要求
1.一種編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對(duì)在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對(duì)在COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、 NSO細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Sp2/0或人細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對(duì)在PER.C6細(xì)胞或 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列通過(guò)適應(yīng)CHO細(xì)胞的密碼子 使用被優(yōu)化，優(yōu)選密碼子適應(yīng)指數(shù)為至少0. 95。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列的GC含量為至少55%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列顯示出與其相應(yīng)的非優(yōu)化對(duì) 應(yīng)物至少70%的一致性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的核苷酸序列，其中所述密碼子優(yōu)化的纖維蛋白原鏈不包含 順式作用位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據(jù)SEQID No. 4或7 的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 4或7有至少85%的一致性且編碼 纖維蛋白原α鏈的序列的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據(jù)SEQID No. 5的核 苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 5有至少85%的一致性且編碼纖維蛋白 原β鏈的序列的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據(jù)SEQID No. 6或 12的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 6或12有至少85%的一致性且 編碼纖維蛋白原Y鏈的序列的核苷酸序列。。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的核苷酸序列的核苷酸構(gòu)建體。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的核苷酸序列或權(quán)利要求11所述的核苷酸構(gòu)建體的 細(xì)胞。
13.一種細(xì)胞或細(xì)胞系，所述細(xì)胞或細(xì)胞系以每天每個(gè)細(xì)胞至少3微微克的水平產(chǎn)生 完整的重組纖維蛋白原。
14.一種在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生纖維蛋白原的方法，所述方法包括在產(chǎn)生纖維蛋 白原的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞系，可 任選回收所產(chǎn)生的纖維蛋白原。
15.通過(guò)權(quán)利要求14所述的方法制備的纖維蛋白原制劑。
16.一種纖維蛋白原制劑，其中超過(guò)10%的α、β或Y鏈?zhǔn)亲凅w型。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的纖維蛋白原制劑，其中所述變體型是Y’鏈或α擴(kuò)展鏈。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17所述的纖維蛋白原制劑，用作藥劑、組織封閉劑或用于促進(jìn)組 織粘連。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18所述的纖維蛋白原制劑在制備用于治療或預(yù)防纖維蛋白原缺 乏癥的藥劑方面的用途。
20.一種通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的纖維蛋白原制劑，其中超過(guò)85%的纖維蛋白原是完整形 式的。
21. 一種選擇產(chǎn)生完整重組纖維蛋白原的細(xì)胞或細(xì)胞系的方法，所述方法包括使用兩 種抗體，其中一種抗體選擇性地與α鏈的完整N-末端結(jié)合，另一種抗體選擇性地與α鏈 的完整C-末端結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼纖維蛋白原α、β或γ鏈的核苷酸序列。所述序列是針對(duì)在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)優(yōu)化的。這種優(yōu)化的核苷酸序列可實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以完整的形式高效表達(dá)重組纖維蛋白原及其變體。
文檔編號(hào)C07K14/75GK102089322SQ200980126952
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日
發(fā)明者A·伯特, J·庫(kù)普曼, J·格林伯格 申請(qǐng)人:普羅菲布瑞克斯公司