專利名稱：：一種71型腸道病毒及其應用的制作方法一種71型腸道病毒及其應用本發(fā)明涉及一株腸道病毒71型(以下簡稱EV71)及其應用。具體而言，本發(fā)明涉及一種通過蝕斑法分離的單克隆病毒株，其子代病毒表現為遺傳穩(wěn)定，可用于人用疫苗生產(尤其是嬰幼兒疫苗生產)。本發(fā)明的病毒株或由其生產的疫苗可用于預防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性強、免疫劑量小的特點。
背景技術：
：EV71屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。該病毒的顆粒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突出，直徑約2430nm，核酸為單股正鏈RNA。EV71病毒的基因組RNA中僅有一個開放閱讀框(0RF)，編碼含2194個氨基酸的多聚蛋白。如同其他腸道病毒屬成員一樣，EV71基因組編碼分子量分別為34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、VP2、VP3、VP4。這些多肽組成原聚體，然后再拼裝成具有五聚體樣結構的亞單位。60個亞單位通過各自的結構域相互連接，最終形成病毒的外殼。VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內側與病毒核心緊密連接，因而抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上。EV71病毒由于沒有類脂膜，所以它對乙醚、脫氧膽酸鹽、去污劑以及弱酸有抵抗性。此外，該病毒還能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常見的消毒劑，但是高溫(56°C，30min)處理和紫外線照射可以很快將病毒滅活，它對各種氧化劑如高錳酸鉀、雙氧水、漂白粉等也很敏感。EV71病毒的衣殼蛋白中，VP1是該病毒主要的中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性。由于VP1基因具有與病毒血清型完全對應的遺傳多樣性，VP1基因序列不僅可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據，并可作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考。因此VP1基因成了EV71基因分型和遺傳進化分析的最重要的對象。目前基于VP1核苷酸序列的差異，可將EV71分為A、B、C等三個基因型，其中A型僅包括原型株BrCr-CA-70;B型和C型又可進一步分為B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亞型。人是EV71病毒唯一的自然宿主，主要的傳染源為病人、健康攜帶者和隱性感染者。EV71的傳染性強，傳播途徑復雜，流行強度大，傳播快，在短時間內即可造成大流行。EV71引起的疾病的流行一年四季均可出現，常見于夏秋季，且有周期流行特點(間隔24年)。下面簡單介紹一下EV71引起的疾病的流行歷史。國際流行歷史1974年，Schmidt等首次從美國加利福尼亞一例腦炎患兒的糞便標本中分離到EV71，此后的幾十年，EV71已經在世界范圍內導致十幾次規(guī)模不等的流行，尤其是最近十年在亞太地區(qū)的流行呈現上升趨勢。1975年，保加利亞發(fā)生EV71大流行，共有705名患兒受到感染，其中545例為無菌性腦膜炎，149例發(fā)生了急性松弛性癱瘓，68例出現延髓受損，死亡44例。低齡兒童是本次流行的主要對象，93%的病例和83.8%的死亡病例發(fā)生在5歲以下人群。但本次疫情未發(fā)現HFMD(手足口病)病例。1978年，匈牙利發(fā)生EV71疫情，出現826例無菌性腦膜炎和724例腦炎病例，其中332例經病毒培養(yǎng)或血清學檢驗證實為EV71感染。所述病例中有嚴重神經系統(tǒng)損傷患者，包括13例脊髓灰質炎樣麻痹、145例腦炎、161例腦膜炎，死亡45例。本次疫情發(fā)現4例HFMD病例。19721973年和1978年，日本出現兩次EV71大流行，但病情表現相對溫和，除少數為腦炎、松弛性麻痹、無菌性腦膜炎外，主要為HFMD病例。其后，日本出現多起EV71的流行。1982年發(fā)生爆發(fā)流行，共計14萬余例病例。1997年，日本出現EV71的局部流行。2000年日本再次出現EV71的流行。從1982年至2000年，只報道了零星的死亡和重癥病例。1997年，馬來西亞出現EV71疫情，共報告病例5999例，主要臨床表現為HFMD，39例出現急性脊髓灰質炎樣麻痹或無菌性腦膜炎，死亡至少31例，死者平均年齡僅1.5歲，病程僅2天。澳大利亞在歷史上也多次出現EV71流行，1972-1973年、1986年和1999年澳大利亞均發(fā)生EV71流行。1999年，在澳大利亞西部的佩思，僅從3月到8月的大約6個月的時間里，超過6000例的HFMD病例，其中嚴重中樞神經系統(tǒng)癥狀病例為29例，包括腦干腦炎、急性松弛性癱瘓、肺水腫等。病原學檢驗顯示該起疫情由EV71和CA16引起，兩者引起病例的構成相近，但有神經系統(tǒng)損傷的都是EV71引起的，未發(fā)現致死性的神經性肺水腫病例。2000年9-11月，新加坡報告HFMD病例3790例，大多數為4歲以下的兒童；分離的病原體主要為EV71;有3例HFMD病例和2例非HFMD病例死亡；尸檢結果顯示為腦炎、間質性肺炎和心肌炎。2003年，越南爆發(fā)EV71疫情，導致26名小于3歲的幼兒死亡。2005年，越南胡志明市爆發(fā)HFMD疫情，導致764例兒童入院治療和3例死亡。從411例患兒中分離到了病源體，其中173例患兒EV71陽性，有51例伴有急性神經系統(tǒng)癥狀。我國流行歷史我國于1987年在湖北首次發(fā)現EV71感染，在這次HFMD流行期間，沒有發(fā)現急性或遲緩性麻痹和無菌性腦膜炎病例。我國香港地區(qū)1987年也發(fā)生過EV71流行。1995年武漢病毒研究所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛(wèi)生防疫站也從手足口病患者標本中分離出EV71。1998年我國臺灣地區(qū)EV71大爆發(fā)，分別在6月和10月出現兩個流行高峰，共發(fā)生129106例手足口病和皰疹性咽峽炎，其中405例為嚴重的中樞神經系統(tǒng)感染，78例死亡，死亡原因主要為由中樞神經系統(tǒng)感染而導致的肺水腫和出血，而且91%的死亡患兒小于5歲。2000年和2001年，臺灣又出現兩次EV71流行，規(guī)模較1998年小，分別有25人和26人死亡。自1999年以來，我國廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)報告局部流行EV71，并發(fā)現EV71是我國南方地區(qū)HFMD的主要病原之一。1999年59月，深圳南山區(qū)報道病例66例。從1999年至2004年，深圳市每年出現2229例的小規(guī)模局部爆發(fā)，少數病人出現神經系統(tǒng)癥狀，無死亡病例。2004年3_7月，深圳市發(fā)生HFMD聚集性病例10起，共報告病例106例，年齡在3-6歲間，從59份患兒的咽拭子、糞便標本中檢測出33份EV71型陽性標本，陽性率為56%。2000年58月山東省招遠市爆發(fā)EV71疫情，就診患兒1698例，年齡最小5個月，最大14歲，3例合并爆發(fā)心肌炎死亡。2000年蘇州某幼兒園因新加坡生病兒童返回引起爆發(fā)。2001年4月，北京昌平區(qū)某幼兒園發(fā)生一起手足口病爆發(fā)，患病率達6.65%。2006年全國共報告手足口病13637例，死亡6例。除西藏自治區(qū)外，全國31個省、自治區(qū)、直轄市均有病例報告。2007年全國共報告手足口病病例83344例，死亡17例。山東省報告病例39606例，北京、上海等也有手足口病病例報告。2008年3月上旬，安徽省阜陽市幾家醫(yī)院陸續(xù)收治了多例以發(fā)熱伴口腔、手足、臀部皮疹為主要臨床表現的患兒，少數伴有腦、心、肺嚴重損害，因搶救無效死亡，引起社會各界的廣泛關注。4月23日，經流行病學調查、臨床診斷和實驗室檢測，確定為腸道病毒EV71感染。5月2日，我國將手足口病納入丙類傳染病管理。截至5月6日，各地報告病例數超過1000例的有；安徽6545例，死亡22例；廣東3100例，死亡3例；北京1482例，無死亡;浙江1198例，死亡1例。2008年3月1日至5月31日，阜陽共報告患者7470例，發(fā)病率89.35/10萬；死亡23例，病死率0.31%?；颊吣挲g為28天30歲，高發(fā)年齡組為《5歲組，發(fā)病7184例，占92.70%;男女性別比為1.86:1;發(fā)病數以阜陽市三區(qū)(穎州、穎東、穎泉)最高，占阜陽市報告病例總數的53.57%，潁上縣最低；最早發(fā)病時間為3月10日，4月初病例數逐漸上升，發(fā)病高峰為4月28日，當日達到518例，5月6日后迅速下降，至5月17日后，每日發(fā)病數降至100例以下。對161例患者的咽試子等標本進行EV71核酸檢測，陽性97例(陽性率為60.25%)，在31例患者中分離到13株EV71病毒。針對全球范圍內的EV71的流行，而且因感染引起越來越重的中樞神經系統(tǒng)癥狀及較高的死亡率，已引起我國和全球許多國家和地區(qū)的關注。所以，急需研發(fā)一種疫苗來預防EV71的流行。發(fā)明才既述針對目前手足口病的流行態(tài)勢，為了更好的預防手足口病的暴發(fā)，本發(fā)明人經過長期不懈的努力，最終篩選出了具有良好功效的可用于預防、治療或抵抗手足口病的病毒株。在此基礎上，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于預防或治療手足口病的疫苗或藥劑。經實驗證明，本發(fā)明的疫苗或藥劑具有有效的免疫活性和/或攻毒保護能力，可以用于預防EV71病毒引起的兒童手足口病，且免疫劑量小，更適合于嬰幼兒疫苗生產。所以，本發(fā)明一方面提供了用于制備針對手足口病的疫苗或藥物的病毒株，其為EV71的C4基因型。對于上述病毒株，申請人于2009年12月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)對其進行了保藏，保藏號為CGMCCNo.3544。優(yōu)選地，本發(fā)明所涉及的保藏毒株是分離的和/或純化的。進一步的，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療手足口病的疫苗或藥劑，其包含上述所保藏的病毒株。再一方面，本發(fā)明還提供了一種制備針對手足口病疫苗或藥劑的方法，其包括使用上述保藏的病毒株。再另一方面，本發(fā)明還提供了上述保藏的病毒株在制備預防或治療手足口病的疫苗或藥劑(例如本發(fā)明所述的疫苗或藥劑)中的用途。再另一方面，本發(fā)明提供了一種制備針對手足口病的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體，或其功能性片段)或雜交瘤細胞或抗血清的方法，其中以本發(fā)明所述的毒株、疫苗或藥劑為免疫原。本發(fā)明還提供了根據該方法所制備的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體，或其功能性片段)或雜交瘤細胞或抗血清。再另一方面，本發(fā)明提供了制備預防或治療手足口病的疫苗或藥劑的方法，其包括使用上述保藏的病毒株。當然，本領域的技術人員明白，本發(fā)明的疫苗或藥劑可進一步包含其他病毒株，如腸道病毒72型和/或佐劑。優(yōu)選地，本發(fā)明各實施方式或技術方案中所包含的病毒株為經過滅活的和/或經過純化的(滅活也可以在純化以后進行)。進一步優(yōu)選地，所述滅活是通過P-丙內脂和/或者甲醛來實現的。對于本發(fā)明所述的純化，其可通過澄清過濾、超濾濃縮、離心、和/或層析等進行。具體而言，本發(fā)明中的單價或者還含有其它病毒株的聯合疫苗或藥劑可以不添加佐劑或可以添加佐劑。"佐劑"是用于增強本發(fā)明的病毒的免疫原性的物質，且給予佐劑可以加強免疫應答。另一方面，佐劑對本技術人員而言是公知的。具體地，用于增強病毒的有效性的合適的佐劑包括，但不限于1)鋁鹽，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁，等等；2)水包油乳液制劑，如MF59(PCT公布號W090/14837)，SAF，尺讓1"佐劑系統(tǒng)(RAS);3)皂苷佐劑，如ISCOMs，細菌脂多糖，合成的脂類A類似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或者其衍生物或類似物；4)細胞因子，如白介素，干擾素，粒細胞巨噬細胞集落剌激因子，巨噬細胞集落剌激因子，腫瘤壞死因子，等等；和5)作為免疫剌激劑以增強組合物的有效性的其他物質等。本發(fā)明的疫苗或藥劑可以用于保護或者治療對EV71感染敏感的受試者(優(yōu)選是哺乳動物，更優(yōu)選是人)，這可通過全身或者粘膜途徑施用疫苗或藥劑來完成。這些施用可以包括通過肌內、腹膜內、皮內或者皮下途徑注射，或者通過粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。施用劑量依個體體重而定，例如可為0.02-0.03微克/Kg體重或可為0.12微克/Kg，施用次數可為單次或間隔1-6個月加強一次。當然，本領域技術人員應當明白，根據本發(fā)明所保藏的毒株為免疫原(例如本發(fā)明所述的疫苗)所制備的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體，或其功能性片段)或雜交瘤細胞也是屬于本發(fā)明的保護范圍的，因為這對本領域技術人員而言是顯而易見或在無需花費創(chuàng)造性勞動的情況下就可以實施的。對于本發(fā)明的疫苗或藥劑，可通過以下方法制備，所述方法包括如下步驟將保藏的毒株接種至培養(yǎng)的細胞(例如RD細胞、Vero細胞或人胚肺二倍體細胞)后，繼續(xù)培養(yǎng)接種后的細胞從而經過滅活和純化(或先純化后滅活)后獲得疫苗原液。可以向該疫苗原液加入佐劑或不加入佐劑，從而獲得針對手足口病的單價疫苗或藥劑。具體的，對于本發(fā)明的疫苗或藥劑可通過以下方法制備，所述方法包括對于從工作細胞庫中取出細胞(例如RD細胞、vero細胞和人胚肺二倍體細胞)進行復蘇；對復蘇后的細胞進行擴大培養(yǎng)(例如，可以采用轉瓶、細胞工廠、發(fā)酵罐等方式)；在細胞擴大培養(yǎng)至一定的細胞量后(本領域技術人員可以根據實際需要來進行確定合適的細胞量，例如培養(yǎng)至完全匯合)，按照一定的比例(例如0.00001-10M0I的病毒濃度)接種病毒，然后繼續(xù)培養(yǎng)(例如在30-4(TC下培養(yǎng)2-10日)；在無菌的條件下、收獲培養(yǎng)后的單價病毒液；對收獲的單價病毒液進行滅活(例如通過加入適量e-丙內脂或者甲醛)和純化。其中，滅活也可以在純化以后進行。對于本發(fā)明所述的純化，其可通過澄清過濾、超濾濃縮、離心、和/或層析等進行。圖1:病毒中和抗體測定的操作步驟中的版式設計。圖2:EV71滴度隨代次變化趨勢。圖3:EV71抗原含量隨代次變化趨勢。圖4:不同劑量免疫大鼠的動態(tài)免疫原性分析結果。為更清楚地說明本發(fā)明，現結合如下實施例進行詳細說明，但這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。實施例實施例1:Vero細胞(ATCCCCL81)的培養(yǎng)細胞復蘇方法將細胞種子從液氮中取出，2000rpm離心5min，用復蘇液(含20%小牛血清MEM培養(yǎng)基)重懸細胞。將重懸的細胞以約1.OX105細胞/CM2的量接種于空的細胞培養(yǎng)瓶中，并在37t:下培養(yǎng)過夜(約16hr)。然后，更換生長液(含有5%小牛血清的MEM培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至單層然后傳代。細胞傳代方法如下將單層細胞用消化液(0.25%胰蛋白酶(含0.03%EDTA))消化，按照l:5的分種率接種(細胞數約為1.5-2.0X105)，37t:培養(yǎng)2天后用于病毒傳代，37t:培養(yǎng)4天后用于細胞傳代培養(yǎng)。細胞生長過程中將pH控制在7.2-7.4。實施例2:病毒培養(yǎng)在2008年的手足口病疫區(qū)(安徽阜陽)，采集經臨床確診的典型手足口患者的咽拭子標本，立即置-20°C凍存，運至實驗室，用于分離EV71病毒。將咽拭子在標本保存液中充分攪動(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞，然后在fC條件下，10000rpm離心20min，用0.22um濾器過濾除菌后將其接種到上述實施例1中培養(yǎng)2天的Vero細胞接種病毒，細胞密度達到約80%。當細胞病變(CPE)達到+++時(l+，<25%;2+，25%-50%;3+，50%-75%;4+，75%-100%)，收獲培養(yǎng)物，_201:冷凍，然后室溫融化處理，從而破壞細胞使病毒顆粒從細胞中釋放出來。之后，收獲病毒顆粒，并以凍融物為毒種進行傳代。第1、2、3、4代按照1:30體積比接種；其他代次按照i:ioo體積比接種。在病毒培養(yǎng)過程中，維持液為不含抗生素但含有2%小牛血清的MEM培養(yǎng)基，其適用于所有代次病毒的傳代。實施例3:蝕斑純化將實施例2中所獲得的病毒種子稀釋至10CCID5。。然后將該稀釋后的病毒種子接種至長滿Vero細胞的6孔板上，以進行蝕斑純化。具體而言，使用PBS沖洗細胞板2次，每孔接種病毒1.Oml，35t:吸附120min，每隔30min輕搖6孔板一次，再用PBS洗板2次；將A液和B液等體積混合配制營養(yǎng)瓊脂，溫度控制在45t:左右，然后在6孔板中加入營養(yǎng)瓊脂，每孔添加3.0ml。接著，將6孔板置于35°C、5%0)2孵箱中培養(yǎng)96hr。然后，將A液和C液等體積混合，溫度控制在45t:左右，在每孔中加入3.Oml染色，再將6孔板置于35°C、5%C02孵箱中培養(yǎng)96hr。將6孔板倒置可觀察到培養(yǎng)板底面上出現白色斑點，將單個的呈圓形的斑點用記號筆圈出，做好標記，打開細胞板用吸管將標記的斑點上方的營養(yǎng)瓊脂吸出，接種于另一塊6孔板(板中事先加入含2%牛血清的MEM培養(yǎng)基)。當CPE至++++時，收獲培養(yǎng)物懸液，凍融一次，然后如實施例2所示，在Vero細胞上進行3次傳代擴增，以建立病毒庫。將病毒傳至病毒滴度穩(wěn)定、抗原含量穩(wěn)定、免疫原性穩(wěn)定后，建立病毒種子庫，并送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏號為CGMCCNo.3544。所建立的病毒種子庫保存于_701:冰箱中備用。A液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>C液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4:病毒滴度的測定以不含血清的MEM維持液作為病毒稀釋液，將實施例3中獲得的病毒種子進行10倍連續(xù)稀釋，將稀釋的毒種接種于長滿單層細胞的96孔板中(細胞數為約106細胞/孔)，加入含有2%血清的MEM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察細胞CPE，以使96孔板中50%以上呈現典型CPE現象時的最低病毒稀釋度作為其病毒滴度(CCID5。)。本發(fā)明通過如下公式對病毒滴度進行計算LogCCID5。=L-d(s-O.5)，其中，L=病毒滴定時的最低稀釋度；d=稀釋度的間距；以及s=被感染細胞比例之和。結果種子庫(第7代)病毒滴度病變孔數(>+++):10—、8孔)，10—2(8孔)，10—3(8孔)，10—4(8孔)，10—5(5孔)，lO—6(3孔)，lO—7(0孔)，10—8(0孔)，lO—9(0孔)，10—1Q(0孔)；logCCID50=-1-1(8/8+8/8+8/8+8/8+5/8+3/8-0.5)=-5.5病毒滴度為1055CCID5。/0.lml將連續(xù)傳代的各個代次的病毒種子按照上述方法測定其病毒滴度，繪制病毒滴度變化曲線，結果見圖2。實施例5:抗原含量測定采用EV71抗原的雙抗體夾心酶聯免疫法(ELISA)，檢測實施例3中獲得的病毒種子的EV71抗原含量。a)兔抗EV71多抗包被物的制備、鑒定與純化免疫原EV71山東株是2007年在山東分離的病毒，其屬于C4基因型，該株EV71病毒與本發(fā)明的病毒同屬一個亞型，但流行時間和區(qū)域不同，且經測定其VPl基因序列與本發(fā)明的序列不同。選擇另一個毒株作為免疫原符合一般的試驗原則。免疫原制備將病毒接種Vero細胞，培養(yǎng)后收獲病毒，滅活后進行超濾濃縮、病毒沉淀、密度梯度離心、脫糖、除菌過濾制備EV71疫苗原液，BCA法檢測其蛋白濃度，結果179ug/ml。兔抗EV71多抗血清制備將上述EV71疫苗原液與等體積的弗氏完全佐劑混合并充分乳化，免疫新西蘭大白兔2只，6ml/只，頸部與背部皮下多點與大腿內側肌肉免疫；兩周后用弗氏不完全佐劑與等體積EV71疫苗原液充分乳化，背部皮下多點免疫兔子，4m1/只；以后每周同第二此免疫一次，再加強免疫3次。最后一次免疫后一周采血，4t:離心，收集全部血清，分別約為60ml，35ml。封裝后于_20°C下凍存。b)單克隆抗體本文此處所用的單克隆來源于專利發(fā)明名稱為"EV71病毒廣譜性單克隆抗體及其應用"、申請?zhí)枮?00910131558.2中所述的單克隆抗體。c)采用經典過碘酸鈉法對純化單抗進行HRP標記，標記后加等體積甘油分裝2ml/只，5支，-20。C放置。d)方法建立抗原含量在80-5U/ml時，0D值>陰性對照X2.1(陰性對照<0.050時，按0.05計算，為0.105)。因此該方法的檢測靈敏度為5U/ml?？乖吭?0-5U/ml時，連續(xù)5點線性^0.99。因此，該方法的檢測靈敏度為5U/ml，檢測線性范圍為80-5U/ml。e)EV71抗原檢測檢測傳代的病毒樣品，繪制曲線。結果將實施例3中的病毒種子在Vero細胞上傳至15代，各代次毒種抗原含量變化趨勢見圖3。由圖中結果看見，本發(fā)明的病毒株在蝕斑克隆后連續(xù)傳15代，抗原含量穩(wěn)定，說明病毒在Vero細胞上傳代是穩(wěn)定的。實施例6:中和抗體檢測a)中和實驗方法病毒感染敏感細胞后，引起細胞形態(tài)學變化，出現致細胞病變效應(CPE)，特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現。液體配制A液血清處理液::(100ml中含下列液體)MEM95ml3%L-谷氨酰胺1ml7.5%碳酸氫鈉2ml牛血清2mlB液細胞營養(yǎng)液::(按生長液配方配制，100ml中含下列液體)MEM86ml3%L-谷氨酰胺1ml7.5%碳酸氫鈉2mlHEPES1ml牛血清10mlC液病毒(血清)稀釋液(按維持液配方配制，100ml中含下列液體)MEM94ml3%L-谷氨酰胺1ml7.5%碳酸氫鈉2mlHEPES1ml牛血清2mlb)攻擊病毒CCID5l。滴定和滴度梯度制備(1)在實施例3中獲得的病毒種子增殖后，將增殖的病毒懸液凍融3次，然后在4t:、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，每管1.5ml;(2)加MEM液IO倍系列稀釋為10—'至10—8病毒液，各加入細胞板內，每孔50ii1，每稀釋度4孔細胞；(3)每孔加vero細胞懸液50iU，同時設細胞對照(50y1稀釋液+50y1細胞懸液)，36t:培養(yǎng)7d，觀察細胞病變；(4)按Behrens-KSrber公式計算出分離病毒株的CCID5。logCCID50=L—d(S—0.5)(其中L=實驗中使用的最低稀釋度的log值；d=稀釋梯度的log值；S=終判時陽性部分的總和(即出現CPE的細胞孔所占的比例之和))；(5)按照上述方法滴定病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID5。的病毒載量；(6)按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量(即100CCID50/0.05ml);(7)取3支小試管，每只加病毒稀釋液(液體配制中的C液)0.9ml;(8)用帶濾芯的吸尖(ART吸尖)吸O.1ml已經稀釋好的攻擊病毒液到第一支小試管中(即10CCID5。/0.05ml)，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至lCCID5。/0.05ml和0.lCCID5。/0.05ml。c)稀釋待檢血清(1)待檢血清-20。C凍存?zhèn)錂z。(2)取無菌小試管若干支(每份血清使用一支)置試管架上，每管加血清處理液(上面液體配制中的A液)0.3ml，加待測血清0.lml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4t:冰箱過夜，即為1:4稀釋血清。次日56。C、30min滅活。(3)打開獨立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液(上面液體配制中的C液)0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取處理過的血清O.lml加入第一孔(即為l:16)，吹吸8-10次，吸0.lml加入第二孔(即為1:64)，依次至1:1024，血清稀釋的過程中不必換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1:4、i:16、i:64、i:256、i:1024。(4)每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。d)病毒中和抗體測定的操作步驟(1)取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份(4對)待測血清，版面設計如圖1所示。Al-A2孑L(B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2)中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必換吸尖，在A3-A4孔(B3-B4、C3_C4、D3_D4、E3_E4、F3_F4、G3-G4、H3-H4)中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔(B5_B6、C5_C6、D5-D6、E5-E6、F5F6、G5-G6、H5-H6)中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7_A8孔(B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8)中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，A9-A10孑L(B9_B10、C9_C10、D9_D10、E9_E10、F9_F10、G9_G10、H9—H10)中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔(B11_B12、C11_C12、D11_D12、E11_E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12)為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml;(2)上述孔中分別加入病毒0.05ml(病毒滴度事先已經稀釋為100CCID50/0.05ml);(3)蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36°CC02孵箱中孵育2h;(4)另取一塊96孔板縱向使用，做100CCID5。/0.05ml病毒滴度的核實(每次實驗都必須做)。每孔先加病毒稀釋液(試劑配制中的C液)0.05ml，然后從0.lCCID5。/0.05ml加起，每孔O.05ml，每個稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100CCID5。/0.05ml;同時留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.lml病毒稀釋液，然后放入4t:冰箱中暫存；(5)在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2X105個/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml;(6)孵育結束后每個待測血清孔、血清對照孔(待檢標本板)和病毒回滴孔和細胞對照孔(病毒回滴板)分別加入0.lml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36°CC02孵箱中孵育培養(yǎng)；(7)使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結果，以不產生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數為終點效價。當100CCID5。/0.05ml的病毒對照孔出現完全病變時，判定最終結果(約5-7d);(8)注意如果病毒對照結果(病毒回滴)不在32-320CCID5。/0.05ml的范圍內，實驗無效，就要重復實驗。d)結果判定當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現細胞病變，另一孔不出現細胞病變，該稀釋度的倒數計即為該血清標本的中和抗體效價；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清均出現1孔細胞病變，另1孔不出現細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價。將含鋁佐劑的疫苗免疫大鼠，劑量分別為6.25U/ml、25U/ml、100U/ml和400U/ml，免疫后累計觀察6周，每周測定其中和抗體，結果見圖4。由圖4可見，隨著劑量提高中和抗體效價相應提高，存在明確的量效關系。實施例7:疫苗制備將實施例3中獲得的病毒種子接種Vero細胞工廠，采用無血清的MEM培養(yǎng)基，33t:培養(yǎng)5-7天進行收獲病毒。用終濃度l:2000甲醛溶液進行滅活，在36.5t:滅活4天。經純化超濾濃縮，離心純化后配制疫苗原液，抗原含量200U/0.5ml，蛋白含量為l-5ug/ml。實施例8:疫苗免疫原性分析將按照上述實施例7的方法制備的疫苗抗原免疫Wistar大鼠，做不同免疫劑量的動態(tài)免疫原性分析，疫苗抗原含量為800U/ml，與等體積的鋁佐劑混合配制劑量為400、100、25、6.255U/ml的疫苗原液。免疫程序:1針肌注，O.5ml/只，1-6周分別采血，分離血清，檢測中和抗體。在實驗過程中，大鼠共分5組，每組5只，對照為鋁佐劑。中和抗體測定方案如下血清按照i:io，i:20，i:40，i:so，i:160，i:320稀釋；陽性對照兔多抗血清；陰性對照兔陰性血清。結果表明疫苗的量效關系顯著，隨著劑量提高，中和效價隨之提高，A1-400U和A1-100U組的中和抗體效價大于1:40，達到了保護性抗體水平。在說明書、權利要求和/或附圖中描述的本發(fā)明的特性可以單獨地或組合地成為用于以其各種形式實現本發(fā)明的目的。權利要求一種病毒株，其保藏號為CGMCCNo.3544。2.用于預防或治療手足口病的疫苗或藥劑，其包含權利要求1的病毒株。3.權利要求3中所述的疫苗或藥劑，其中所述的病毒株是經過滅活(例如通過|3-丙內脂和/或者甲醛來滅活)和純化的(例如可通過澄清過濾、超濾濃縮、離心、和/或層析來純化)。4.權利要求2或3的疫苗或藥劑，其中所述的疫苗或藥劑還含有佐劑。5.權利要求4的疫苗或藥劑，其中所述的佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。6.權利要求1的病毒株在制備預防或治療手足口病的疫苗或藥劑(例如權利要求2-5中任一項所述的疫苗或藥劑)中的用途。7.—種制備抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體，或其功能性片段)或雜交瘤細胞或抗血清的方法，其中以權利要求1中所述的毒株為免疫原(例如權利要求2-5中任一項所述的疫苗或藥劑)。8.通過權利要求l中所述的毒株為免疫原(例如權利要求2-5中任一項所述的疫苗或藥劑)所制備的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體，或其功能性片段)或雜交瘤細胞或抗血清。9.制備預防或治療手足口病的疫苗或藥劑的方法，其包括使用權利要求l中所述的病毒株或權利要求2-5中任一項所述的疫苗或藥劑。10.權利要求9中所述的方法，其中所述的權利要求1的病毒株是經過滅活和純化的。全文摘要本發(fā)明涉及一株71型腸道病毒(簡稱EV71)及其應用。具體而言，本發(fā)明涉及一種通過蝕斑法分離的單克隆病毒株，其子代病毒表現為遺傳穩(wěn)定，可用于人用疫苗生產(尤其是嬰幼兒疫苗生產)。本發(fā)明的病毒株或由其生產的疫苗可用于預防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性強、免疫劑量小的特點。文檔編號C07K16/10GK101717754SQ20091024957公開日2010年6月2日申請日期2009年12月30日優(yōu)先權日2009年12月30日發(fā)明者公雪杰,劉玉芬,尹衛(wèi)東,張卉,張小梅,張建三,惠增弟,高強,高正倫申請人:北京科興生物制品有限公司