專利名稱：腸道病毒71型病毒株、疫苗、動(dòng)物模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種腸道病毒71型病毒株及其用途、由該腸道病毒71型病毒株制備的疫苗和制備方法、和用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒感染引起的一種急性傳染病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，以手、足、口腔等部位皮膚粘膜的皮疹、皰疹、潰瘍?yōu)榈湫捅憩F(xiàn)，少數(shù)患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦脊髓膜炎、腦炎等并發(fā)癥。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，其中以柯薩奇病毒A16型(CA16)和腸道病毒71型(以下稱為EV71)最為常見，其中EV71不僅引起手足口病，而且可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等。研究發(fā)現(xiàn)，感染重癥病例中，EV71感染占90%以上。我國于1981年上海首次報(bào)道手足口病,此后,北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等十幾個(gè)省份均有本病報(bào)道。1983年天津發(fā)生Cox A16引起的手足口病爆發(fā)，1986年再次爆發(fā)。中國大陸首次發(fā)現(xiàn)EV71型感染是在1987年冬季湖北省的一次手足口病流行期間。2010年，全國共報(bào)告手足口病病例1593437例，死亡839余人。目前尚無針對(duì)預(yù)防該病的特異性疫苗、藥物等。其中，在預(yù)防該病的特異性疫苗的研制過程中，腸道病毒71型病毒疫苗屬于預(yù)防人類傳染病的新型疫苗，我國臺(tái)灣地區(qū)以及新加坡等國家曾先后開始進(jìn)行相關(guān)疫苗的研究，包括滅活疫苗、重組疫苗、多肽疫苗和減毒活疫苗等，但均停留在臨床前研究階段。目前，EV71疫苗的研究在世界范圍內(nèi)仍未取得突破，但血清流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，人群感染后產(chǎn)生的EV71中和抗體可有效預(yù)防EV71病毒的再次感染，為EV7 1疫苗的研發(fā)奠定了一定的免疫學(xué)基礎(chǔ)。由于不同基因型毒株間、相同基因型不同基因亞型毒株間、甚至相同基因亞型不同毒株間抗原性和免疫原性可能存在差異，從而導(dǎo)致不同毒株的交叉保護(hù)水平可能存在差異，對(duì)疫苗株的選擇提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)；雖然EV71感染已流行多年，但近年來EV71感染多次爆發(fā)、并且導(dǎo)致較多的重癥甚至死亡病例，其致病機(jī)制仍不清楚；這些均使EV71疫苗的研制存在一定的困難。此外，國內(nèi)外腸道病毒71型疫苗的研發(fā)還受困于穩(wěn)定的動(dòng)物模型，因此建立成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型病毒株及其用途。具體而言，本發(fā)明提供:(I) 一種腸道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株，所述病毒株的保藏編號(hào)為CGMCC N0.5539。
(2)根據(jù)(I)所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列為SEQ ID N0.:2所示的序列。(3)根據(jù)(I)所述的病毒株在制備用于預(yù)防和/或治療手足口病的藥物中的用途。(4)根據(jù)(3)所述的用途，其中，所述藥物為疫苗。(5) 一種用于預(yù)防和/或治療手足口病的疫苗，其中，所述疫苗含有:1)經(jīng)滅活的
(I)或⑵所述的病毒株；以及任選的2)佐劑。(6)根據(jù)(5)所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量計(jì)，所述病毒株的含量為I 4 μ g/ml ;并且/或者所述佐劑為氫氧化招,并且所述氫氧化招的含量為0.5 1.5 μ g/ml。(7) 一種根據(jù)(5)或(6)所述的疫苗的制備方法，其包括:將(I)或⑵所述的病毒株進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行滅活、純化，從而制備得到所述的疫苗。(8) 一種制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方法，其中，以根據(jù)(I)或⑵所述的病毒株或(5)或(6)所述的疫苗為免疫原進(jìn)行制備。(9)根據(jù)(8)的制備方法得到的制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。(10)根據(jù)(I)或(2)所述的病毒株在建立用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型中的用途。(11)根據(jù)(10)所述 的用途，所述病毒株用作攻擊毒株。(12) 一種用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法，其包括:I)將(I)所述的病毒株進(jìn)行培養(yǎng)，得到病毒培養(yǎng)液；以及2)將步驟I)所得的病毒培養(yǎng)液施予動(dòng)物，從而制備得到所述的動(dòng)物模型；其中，所述的動(dòng)物為小鼠。(13)根據(jù)(12)所述的制備方法，其中，所述的小鼠為1-14日齡的乳鼠。(14)根據(jù)(13)所述的制備方法，其中，所述的乳鼠是通過如下方法獲得的:將每只成年雌鼠與I只成年雄鼠交配，對(duì)所述雌鼠在所述交配前采用待評(píng)價(jià)的腸道病毒71型疫苗進(jìn)行初次免疫、在所述交配后2-3周采用該腸道病毒71型疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并在所述雌鼠懷孕后將其與所述雄鼠分窩，將所述雌鼠產(chǎn)下的乳鼠培養(yǎng)1-14天。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:1.本發(fā)明提供了兩種新的腸道病毒71型病毒株(EV71病毒株I和2)，以及使用該病毒株所生產(chǎn)的用于預(yù)防手足口病的疫苗I和2 (分別為EV71病毒株I和2所制備)，所生產(chǎn)的疫苗I和2均符合《中國藥典(三部)2010年版》的有關(guān)要求，并且具有有效的免疫活性和攻毒保護(hù)能力。本發(fā)明所述的病毒株(EV71病毒株I和2)細(xì)胞適應(yīng)性好、產(chǎn)量高、交叉免疫原性好；采用本發(fā)明所述的方法制備的EV71疫苗I或EV71疫苗2免疫動(dòng)物后，能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的特異性血清中和抗體，動(dòng)物免疫后，采用致病性較強(qiáng)的毒株進(jìn)行病毒攻擊，動(dòng)物各項(xiàng)指標(biāo)正常，且不出現(xiàn)臨床癥狀，表明該疫苗具有較好的保護(hù)作用。2.本發(fā)明所提供的所述疫苗I或2的制備方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):生產(chǎn)過程易于控制、重復(fù)性好、適合規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定。3.本發(fā)明所提供的EV71病毒株2還可用作攻毒用病毒株，其具有如下優(yōu)點(diǎn):毒力強(qiáng)，能使乳鼠出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓甚至死亡等典型的EV71感染癥狀，可用于EV71疫苗或藥物的評(píng)價(jià)。
4.本發(fā)明還提供了用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法，該方法能夠提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型，為腸道病毒71型疫苗研制和抗病毒藥物的篩選提供了基礎(chǔ)。
保藏信息:關(guān)于保藏編號(hào)為CGMCC N0.5540的腸道病毒71型病毒株:該病毒的分類命名為人腸道病毒 71 型(Human Enterovirus 71),拉丁文學(xué)名為 Enterovirus 71,是于 2011 年 12月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行的保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5540。關(guān)于保藏編號(hào)為CGMCC N0.5539的腸道病毒71型病毒株:該病毒的分類命名為人腸道病毒 71 型(Human Enterovirus 71),拉丁文學(xué)名為 Enterovirus 71,是于 2011 年 12月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行的保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5539。


圖1為本發(fā)明EV71病毒株I在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代滴定結(jié)果圖；圖2為由本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案建立的乳鼠模型經(jīng)本發(fā)明疫苗I免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲線圖(A)、乳鼠腦腔攻毒生存率曲線圖(B)；圖3為采用本發(fā)明EV71病毒株2顱內(nèi)攻擊后乳鼠生存率曲線圖；圖4為采用本發(fā)明EV71病毒株2腹腔攻擊后乳鼠生存率曲線圖；圖5為米用本發(fā)明EV71病毒株2攻擊后乳鼠發(fā)病表現(xiàn)圖,其中A圖為正常對(duì)照組正常乳鼠，B圖為病毒組后肢麻痹、癱瘓乳鼠；圖6為由本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案建立的乳鼠模型經(jīng)本發(fā)明疫苗I免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲線圖(A)、顱內(nèi)攻毒生存率曲線圖⑶；圖7為經(jīng)本發(fā)明疫苗I免疫后中和抗體水平圖；圖8為本發(fā)明疫苗I接種組與未接種疫苗對(duì)照組組織中EV71RNA水平比較圖，其中橫坐標(biāo)中Cl ClO代表未接種疫苗組中的10個(gè)個(gè)體，即10只未接種疫苗的乳鼠；P1 Pio代表疫苗接種組中的10個(gè)個(gè)體，即10只接種疫苗的乳鼠；圖9為由本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案建立的乳鼠模型經(jīng)本發(fā)明疫苗2免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲線圖(A)、顱內(nèi)攻毒生存率曲線圖(B)。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式
的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本文中，所述的“攻毒用毒株”是指能引起動(dòng)物發(fā)病的攻擊毒株。在本發(fā)明中EV71病毒株2既可用作攻毒株，也可經(jīng)滅活后用于制備疫苗。本發(fā)明人篩選出了可用于預(yù)防手足口病的腸道病毒71型病毒株I和2，并在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了用于預(yù)防手足口病的疫苗。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明疫苗I和2具有有效的免疫活性和攻毒保護(hù)能力。本發(fā)明人通過選育與純化腸道病毒71型疫苗株I和2，建立并檢定毒種三級(jí)種子批庫。并用(例如)生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐)、細(xì)胞工廠或WAVE生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞，在細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層或細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，接種病毒，36±1°C培養(yǎng)4-7天后收獲病毒懸液，經(jīng)過濃縮、純化滅活等步驟后，制備出疫苗原液。可經(jīng)過換算稀釋加入諸如Al (OH)3之類的佐劑吸附配制成含佐劑半成品，也可不加入佐劑配制成不含佐劑半成品。分裝0.5ml/支即可為腸道病毒71型滅活疫苗I和2。具體而言，本發(fā)明的又一方面提供一種腸道病毒71型病毒株(EV71病毒株I)。該病毒的分類命名為人腸道病毒71型(Human Enterovirus 71),拉丁文學(xué)名為Enterovirus71，是于2011年12月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行的保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5540。所述病毒株的全基因序列(cDNA序列)可如SEQ ID N0.:1所示。本發(fā)明還提供一種腸道病毒71型病毒株(EV71病毒株2)。該病毒的分類命名為人腸道病毒 71 型(Human Enterovirus 71),拉丁文學(xué)名為 Enterovirus 71,是于 2011 年 12月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行的保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5539。所述病毒株的全基因序列(cDNA序列)可如SEQ ID N0.:2所示。EV71病毒株I和2均可用于制備預(yù)防和/或治療手足口病的藥物。優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種用于預(yù)防和/或治療手足口病的疫苗，其含有經(jīng)滅活的EV71病毒株1 (對(duì)應(yīng)本發(fā)明疫苗I)或含有經(jīng)滅活的EV71病毒株2 (對(duì)應(yīng)本發(fā)明疫苗
·2)。本發(fā)明疫苗1或2可含有佐劑，也可以不含有佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要確定EV71病毒株I或EV71病毒株2在本發(fā)明的疫苗I或2中的含量。優(yōu)選地，以蛋白含量計(jì)，EV71病毒株I或EV71病毒株2的含量為I 4 μ g/ml ο蛋白含量可采用(例如)BCA方法(可參見以下文獻(xiàn)中公開的方法:李海玲，彭書明，李凜，張雪梅，4種常用蛋白濃度測(cè)定方法的比較.中國生化藥物雜志2008，29 (4):277-282.)進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗中含有佐劑。佐劑可以為本領(lǐng)域公知的常用的佐劑，例如:氫氧化鋁佐劑、CpG佐劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要確定佐劑在本發(fā)明的疫苗中的含量。優(yōu)選地，佐劑為氫氧化鋁。并且優(yōu)選地，所述氫氧化鋁的含量為0.5 1.5μ g/ml。優(yōu)選地，每劑疫苗為0.1 2ml ;更優(yōu)選地，每劑疫苗為0.5ml。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供疫苗的制備方法，其包括:將EV71病毒株I或EV71病毒株2進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行滅活、純化，從而制備得到所述的疫苗。優(yōu)選地，所述純化在所述滅活之前進(jìn)行并且/或者在所述滅活之后進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明的制備方法包括:1)提供Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞；2)在步驟I)得到的Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞中，對(duì)EV71病毒株I或EV71病毒株2進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到病毒懸液；3)將步驟2)得到的病毒懸液進(jìn)行純化并滅活，從而得到疫苗原液；以及4)將步驟3)得到的疫苗原液進(jìn)行稀釋，從而得到所述的疫苗。在本文中，Vero細(xì)胞是指非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，可得自ATCC公司；人二倍體細(xì)胞來源于正常人胎兒組織，可得自ATCC公司。在進(jìn)行病毒接種前，可將Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞在細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)?？稍诩?xì)胞長(zhǎng)成合適密度的致密單層或細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，接種病毒。其中，所述微載體是細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的一類無毒性、非剛性、密度均一、通常是透明的小顆粒，能使依賴貼壁的細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時(shí)貼附在顆粒表面單層生長(zhǎng)，從而增加細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的面積，有利于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和收集。在本文中，細(xì)胞工廠是指一種細(xì)胞培養(yǎng)的耗材，它和細(xì)胞培養(yǎng)皿、瓶類似，均用于細(xì)胞培養(yǎng)，只是細(xì)胞工廠用于較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，可得自(例如)NUNC公司；生物反應(yīng)器是指動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，為細(xì)胞提供的一個(gè)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境的容器，使之快速增殖并達(dá)到較高密度，常用于大規(guī)模、高密度細(xì)胞培養(yǎng)，其可得自(例如)SART0RIS公司。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述的培養(yǎng)在生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐或WAVE生物反應(yīng)器)或細(xì)胞工廠中進(jìn)行。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為溫度36±1°C、pH值7.0±0.5、溶解氧濃度20 80%、轉(zhuǎn)速20 80rpm。培養(yǎng)可進(jìn)行4_7天。在步驟3)中，可以先進(jìn)行純化、再進(jìn)行滅活，也可以先進(jìn)行滅活、再進(jìn)行純化。純化方式可為本領(lǐng)域常用的方法，如超濾濃縮及層析，層析可包括:凝膠過濾層析(例如采用Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、或Sephacryl S400介質(zhì)的層析)和/或離子交換層析(如陰離子交換層析(如采用DEAE-Sepharose FF介質(zhì)的層析))。滅活方式可為本領(lǐng)域常用的方法，如采用甲醛作為滅活劑，按1: 1500-1: 4000比例于34-38°C滅活2-7天。也可用β-丙內(nèi)酯滅活，按I: 2000-1: 4000比例于2_8°C滅活2-3天,然后37°C水解2-4小時(shí)。優(yōu)選地，在步驟4)中，用氫氧化鋁溶液對(duì)步驟3)得到的疫苗原液進(jìn)行稀釋，使得在所得疫苗中，以病毒蛋白含量計(jì)，所述病毒株的含量為I 4μ g/ml，并且所述氫氧化鋁的含量為0.5 1.5 μ g /ml。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供以EV71病毒株1、2或本發(fā)明的疫苗I或2為免疫原制備的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體或其功能性片段)或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。可以根據(jù)本領(lǐng)域常用的方法，來制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。例如，家兔背部多點(diǎn)皮下注射法制備抗血清及細(xì)胞融合法制備雜交瘤細(xì)胞，辛酸沉淀法及親和層析法純化多克隆或單克隆抗體。可以采用本領(lǐng)域已知的用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型建立方法(例如中國專利申請(qǐng)公開N0.CN 101982181A或CN101978970A中所披露的方法)來建立動(dòng)物模型，并評(píng)價(jià)本發(fā)明的疫苗I或2的效果。本發(fā)明的疫苗I或2的效果還可以采用由本發(fā)明所述的方法建立的動(dòng)物模型來進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明人提供了一種用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的穩(wěn)定的動(dòng)物模型建立方法，為腸道病毒71型疫苗研制和抗病毒藥物的篩選提供了基礎(chǔ)。為此，本發(fā)明提供了 EV71病毒株2作為攻毒用毒株，所述攻毒用毒株具有如下特點(diǎn):毒力強(qiáng)，能使乳鼠出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓甚至死亡等典型的EV71感染癥狀，可用于EV71疫苗或藥物的評(píng)價(jià)。EV71病毒株2可用于建立用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型。其中，EV71病毒株2可用作攻擊毒株。本發(fā)明的又一方面提供一種用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法，其包括:
I)將EV71病毒株2進(jìn)行培養(yǎng)，得到病毒培養(yǎng)液；以及2)將步驟I)所得的病毒培養(yǎng)液施予動(dòng)物(例如注射到動(dòng)物體內(nèi))，從而制備得到所述的動(dòng)物模型。優(yōu)選地，所述病毒培養(yǎng)液的中病毒含量為IO4 107CCID5(l/ml。所述的動(dòng)物可以采用本領(lǐng)域常用的動(dòng)物，例如:小鼠、大鼠、豚鼠、兔子。優(yōu)選地所述的動(dòng)物為小鼠。更優(yōu)選地，所述的小鼠為1-14日齡的乳鼠。更優(yōu)選地，所述的小鼠的品系為ICR、BALB/c、NIH或昆明品系。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述注射為顱內(nèi)注射。優(yōu)選地，所述病毒培養(yǎng)液的注射量為每只小鼠 1000-10000CCID5。。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述注射為腹腔注射。優(yōu)選地，所述病毒培養(yǎng)液的注射量為每只小鼠 1000-10000CCID5。。所述的乳鼠可采用本領(lǐng)域常用的方法獲得。優(yōu)選地，所述的乳鼠是通過如下方法獲得的:將每只成年雌鼠與I只成年雄鼠交配，對(duì)所述雌鼠在所述交配前采用本發(fā)明所述的疫苗I或2進(jìn)行初 次免疫(0.5 4 μ g/ml，優(yōu)選2 μ g/ml)、在所述交配后2_3周采用該疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫(0.5 4μ g/ml，優(yōu)選2 μ g/ml)，并在所述雌鼠懷孕后將其與所述雄鼠分窩，將所述雌鼠產(chǎn)下的乳鼠培養(yǎng)1-14天，優(yōu)選培養(yǎng)1-7天。本發(fā)明的動(dòng)物模型可以用于評(píng)價(jià)本領(lǐng)域已知的腸道病毒71型疫苗(例如中國專利申請(qǐng)公開N0.CN101575593A或CN101897963A中所披露的疫苗)的效果，也可以用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的疫苗的效果。以下通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步解釋或說明本發(fā)明內(nèi)容，但這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。以下實(shí)施例中的DMEN培養(yǎng)基可購自GIBCO公司；Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞可購自ATCC公司；牛血清可購自GIBCO公司；抗EV71免疫血清可購自ATCC公司；199細(xì)胞生長(zhǎng)液可購自SIGMA公司；胰酶可購自GIBCO公司；細(xì)胞工廠可購自NUNC公司；超濾膜可購自MILLIP0RE 公司；Sepharose 4FF、DEAE_Sepharose FF介質(zhì)可購自 GE 公司；β-丙內(nèi)酷可購自SIGMA公司；RD細(xì)胞可購自ATCC公司；ICR、BALB/c、NIH、昆明小鼠可購自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。實(shí)施例1:EV71病毒株I的分離與鑒定方法(1)EV71病毒株I的分離方法候選毒株要具有完整的記錄、歷史、來源。測(cè)定候選毒株的生物學(xué)特性，候選病毒株制備的滅活疫苗應(yīng)當(dāng)具備病毒產(chǎn)量高、誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力強(qiáng)、交叉保護(hù)譜廣、生物學(xué)特性穩(wěn)定，并依據(jù)流行病學(xué)和分子流行病學(xué)選擇的，在當(dāng)前和今后具有廣泛流行潛力的病毒株。候選病毒免疫動(dòng)物，分離血清，測(cè)定血清中和抗體效價(jià)，篩選保護(hù)譜廣，誘導(dǎo)免疫保護(hù)能力強(qiáng)的病毒作為滅活疫苗病毒株。收集手足口病患者(來自安徽阜陽一名4歲手足口病患兒黃XX)咽拭子標(biāo)本，在4°C條件下,2000 4000rpm離心30min,取上清用0.2 μ m濾器過濾除菌,將過濾后的上清接種Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。接種標(biāo)本前，倒掉生長(zhǎng)液，每瓶細(xì)胞接種0.2 Iml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36土 1°C ;吸附I 2小時(shí)后，換上含2%牛血清的DMEN培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞病變，若7天無細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)，盲傳I代繼續(xù)觀察7天，直到75% 90 %的細(xì)胞發(fā)生變化，然后儲(chǔ)藏在_20°C以備二次傳代。第二代培養(yǎng)見可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后_70°C凍存，陰性則廢棄。從而得到EV71病毒株1，送中國微生物菌毒種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)為:CGMCC N0.5540。(2)病毒的鑒定方法形態(tài)學(xué)觀察:在光學(xué)顯微鏡下觀察EV71病毒在細(xì)胞上的病變，細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加。EV71病毒超濾濃縮后，經(jīng)2%磷鎢酸溶液負(fù)染后，置電鏡下可觀察到球形病
毒顆粒。鑒別試驗(yàn):將病毒培養(yǎng)液與等量的抗EV71免疫血清于36土 1°C中和I 2小時(shí)后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)7天，觀察病變細(xì)胞孔數(shù)，同時(shí)設(shè)血清和細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照的滴度應(yīng)不低于500CCID 5(l/ml，實(shí)驗(yàn)有效。結(jié)果顯示病毒對(duì)照組孔全部出現(xiàn)細(xì)胞病變，血清對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞均未出現(xiàn)病變；候選毒株均可被抗EV71免疫血清中和，證明它們確為EV71。分子生物學(xué)鑒定:取病毒液0.2-0.5ml，提取病毒RNA，采用EV71特異性引物進(jìn)行全基因擴(kuò)增、序列測(cè)定和基因分型，上述步驟可由北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行。結(jié)果顯示，其基因組全長(zhǎng)7406bp，屬于C4基因亞型。全基因序列如SEQ ID N0.:1所示。實(shí)施例2:EV71病毒株I的純化和傳代穩(wěn)定性分析(I)噬斑純化將實(shí)施例1得到的EV71病毒懸液系列稀釋，顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄掉六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原有的培養(yǎng)液，加入病毒懸液0.1-0.5ml/孔,36土1°C吸附1_2小時(shí),吸附結(jié)束后，倒掉板中液體，用無菌PBS洗一次，加覆蓋物，置于二氧化碳孵育箱36 ± I °〇培養(yǎng)。接種病毒后3-7天，鏡下觀察噬斑形成，挑取噬斑，做進(jìn)一步噬斑純化，如此方法再純化2次。(2)病毒的傳代穩(wěn)定性分析以Vero細(xì)胞為例，將EV71選用病毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代，病變?yōu)?5% 90 %時(shí)收獲，采用微量細(xì)胞病變法測(cè)定滴度，觀察其在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代的滴度穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，該株在Vero細(xì)胞上連續(xù)十五代以上傳代的滴度均維持在7.0Lg CCID50/ml以上，具有很好的傳代穩(wěn)定性。結(jié)果圖1所示。實(shí)施例3:EV71病毒株I的種子批的建立和檢定按照《中國藥典》關(guān)于種子庫建立方法的要求，疫苗生產(chǎn)用毒種應(yīng)以病毒種子批系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行三級(jí)管理，即原始種子批、主種子批和工作種子批，種子批細(xì)胞均需于_60°C以下冷凍保存。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、歷史來源和生物特性。主種子批，應(yīng)進(jìn)行全面檢定，檢定內(nèi)容包括鑒別試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、支原體檢查、病毒滴定、病毒外源因子檢查、免疫原性檢查等項(xiàng)目。工作種子批進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、支原體檢查、病毒滴定等項(xiàng)目檢定，合格后方可使用。以Veix)細(xì)胞為例，簡(jiǎn)述三級(jí)種子批的建立方法(但本發(fā)明不限于此):將來自原始種子批的病毒接種至長(zhǎng)成單層的VeiO細(xì)胞(M.0.1 = 0.001 I)，使用倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞病變，直至出現(xiàn)75% 90%的細(xì)胞病變時(shí)，將培養(yǎng)物置于_20°C冷凍，室溫融化二次后，按照上述方法接種至新的VeiO細(xì)胞單層細(xì)胞，直至出現(xiàn)75% 90%的細(xì)胞病變，如此反復(fù)進(jìn)行病毒傳代。每一批收獲物記為一代。實(shí)施例4:EV71病毒株I的培養(yǎng)和收獲(1)細(xì)胞:生產(chǎn)用細(xì)胞為Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。(2)病毒:制備的EV71工作種子批。(3)細(xì)胞及病毒培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存細(xì)胞，移植細(xì)胞懸液1ml (濃度:8X106/ml)于199細(xì)胞生長(zhǎng)液IOml中，置于36±1°C培養(yǎng),4小時(shí)后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)置于36± I°C培養(yǎng),待生長(zhǎng)成致密單層后進(jìn)行傳代。棄去瓶中原有生長(zhǎng)液，加入0.25%胰酶20ml消化，待細(xì)胞脫壁后，補(bǔ)充199細(xì)胞生長(zhǎng)液1OOml吹打至細(xì)胞呈分散懸液狀，取細(xì)胞懸液20ml接種至轉(zhuǎn)瓶中，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，同樣方法進(jìn)行胰酶消化后，取細(xì)胞懸液200ml接種至生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠中，培養(yǎng)4 7天后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，確定病毒接種時(shí)間，按病毒接種量為M.0.1 = 0.001 I的比例加入維持液20000ml，混勻，接種至長(zhǎng)成單層的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察病變、根據(jù)病變程度收獲病毒液。反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)條件:微載體含量2 15克/升、溫度36土 1°C、pH值7.0±0.5、溶解氧濃度20 80%、轉(zhuǎn)速20 80rpm ;病毒培養(yǎng)條件:溫度36±l°C、pH值
7.0±0.5、DO 濃度 20 80%、轉(zhuǎn)速 20 80rpm。(4)病毒收獲:待接種病毒后48-120h、細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲病毒培養(yǎng)液。實(shí)施例5 :EV71病毒株I的濃縮、純化及滅活超濾濃縮病毒:將按照上述方法制備獲得的病毒收獲液，經(jīng)截留分子量為100-1000KD的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)約為20-200倍。病毒的純化凝膠過濾層析:將病毒濃縮液加入至用pH6.0-8.0PBS平衡好的S印harose 4FF介質(zhì)進(jìn)行凝膠過濾層析，收集病毒峰。離子交換層析:將凝膠過濾層析后收集液加入至用pH6.0-8.0PBS平衡好的DEAE-Sepharose FF介質(zhì)中進(jìn)行離子交換層析，洗脫液為含0.1M 0.5M NaCl的pH6.0-8.0PBS,收集病毒峰。病毒滅活:采用甲醛作為滅活劑，按1: 2000比例于35°C滅活7天。也可用β-丙內(nèi)酯滅活，按1: 2000比例于2-8°C滅活2天，然后37°C水解2小時(shí)。去除滅活劑后，即為疫苗原液5 40 μ g/ml ο實(shí)施例6:EV71疫苗I的配制EV71滅活疫苗半成品與成品(氫氧化鋁佐劑吸附)的配制將實(shí)施例5獲得的EV71滅活疫苗原液與氫氧化鋁溶液(鋁含量為10-20mg/ml)混合，使氫氧化鋁含量為0.5 1.5mg/ml、蛋白含量為I 4μ g/ml，即可獲得EV71滅活疫苗I半成品。將制成的半成品分裝至無菌西林瓶(或預(yù)充式注射器)中，即可得到EV71滅活疫苗I成品。EV71滅活疫苗半成品與成品(無佐劑吸附)的配制將獲得的EV71滅活疫苗原液稀釋，稀釋液為50mM PBS緩沖液(pH為7.0)，使蛋白含量為I 4μ g/ml，即可獲得EV71滅活疫苗I半成品。將制成的半成品分裝至無菌西林瓶(或預(yù)充式注射器)，即可得到EV71滅活疫苗I成品。實(shí)施例7:EV71疫苗I的質(zhì)量分析
根據(jù)《中國藥典(三部)2010年版》的有關(guān)要求，對(duì)EV71滅活疫苗I成品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，疫苗的外觀為乳白色渾懸液體、疫苗的裝量不低于0.5ml/瓶、疫苗的PH值在6.0 8.0、鑒別試驗(yàn)符合規(guī)定、氫氧化鋁含量< 2mg/ml、無菌檢查陰性、細(xì)菌內(nèi)毒素< IOEU/劑、異常毒性試驗(yàn)符合規(guī)定、牛血清白蛋白殘留量< 50ng/劑、游離甲醛含量(10 μ g/劑、Vero細(xì)胞DNA殘留量< IOOpg/劑等，均不低于國家標(biāo)準(zhǔn)，符合有關(guān)規(guī)定。實(shí)施例8:EV71疫苗I免疫原性分析測(cè)定血清中和抗體效價(jià)方法:待測(cè)血清在96孔微量滴定板上進(jìn)行2倍系列稀釋，將中和用病毒(實(shí)施例4得到的病毒)分別稀釋至100CCID5(i/50 μ 1，滴加至微量滴定板上(血清、細(xì)胞對(duì)照除外)，50 μ I/孔。至36°C培養(yǎng)箱，中和2小時(shí)。中和結(jié)束后，將RD細(xì)胞用胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，1.5父105/1111，加入96孔板中，10(^1/孔，361:、5%0)2繼續(xù)培養(yǎng)7天后，觀察細(xì)胞病變，判定結(jié)果，中和結(jié)束后進(jìn)行病毒回滴，設(shè)立病毒對(duì)照、血清對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果判定:當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有I孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)I孔細(xì)胞病變，另I孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的EV71中和抗體效價(jià)。小鼠免疫:將EV71滅活疫 苗分為不同劑量組:5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.07 μ g/ml，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠按疫苗接種劑量進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只。取EV71滅活疫苗，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，0.5ml/只，免疫2次，間隔2 4周，于加強(qiáng)免疫后3 4周采血，分離血清，按上述方法檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，血清中和抗體水平與疫苗劑量存在明顯的量效關(guān)系，5、2.5、1.25、0.625,0.31,0.15,0.07 μ g/ml組，血清中和抗體陽轉(zhuǎn)率除0.07 μ g/ml組為90%夕卜，其他均達(dá)到100%，對(duì)照組未產(chǎn)生中和抗體，血清中和抗體陽轉(zhuǎn)率為0%。各組血清中和抗體GMT達(dá)1: (32 1024)，對(duì)照組GMT低于1: 8。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):中和效價(jià)大于1: 8。實(shí)施例9:EV71疫苗I保護(hù)效果的分析以實(shí)施例6得到的含氫氧化鋁佐劑的疫苗為例，采用本發(fā)明所述的EV71感染小鼠模型對(duì)疫苗的保護(hù)效果進(jìn)行分析。將EV71滅活疫苗I分為高、中、低三個(gè)劑量組(2、1、0.5 μ g/ml)。將成年ICR(每只配I只雄鼠，雌鼠懷孕后將雄鼠分窩)8只，于交配前O周初次免疫、交配后2-3周加強(qiáng)免疫，肌肉注射，0.1-1.0ml/只。母鼠產(chǎn)下乳鼠后1_7天，通過腦腔注射10 μ I由下述實(shí)施例10中的方法制備的EV71病毒株2培養(yǎng)液/只或者腹腔注射100 μ I由下述實(shí)施例10中的方法制備的病毒株2培養(yǎng)液/只，逐日觀察發(fā)病情況，計(jì)算生存率。病毒攻擊后第I天、2天和3天疫苗組和佐劑對(duì)照組均無異常，病毒攻擊后第4 5天對(duì)照組乳鼠后肢出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓癥狀，疫苗組無異常。病毒攻擊后第5 6天佐劑對(duì)照組乳鼠全部死亡，而疫苗組無任何異常，生存率曲線如圖2所示，結(jié)果顯示，EV71疫苗I具有明顯的保護(hù)作用，采用高、中、低劑量組的EV71疫苗I免疫后，均可保護(hù)小鼠免受EV71感染。疫苗接種組與正常對(duì)照組小鼠無明顯差別，體重正常、未出現(xiàn)肢體麻痹等行動(dòng)異?，F(xiàn)象，存活率率達(dá)100%，而佐劑對(duì)照組乳鼠于病毒攻擊后4 5天相繼發(fā)病直至死亡。實(shí)施例10:EV71病毒株2的分離及鑒定
1.EV71病毒株2的分離方法如下:收集手足口病患者(分離自浙江寧波一名3歲重癥手足口病患兒龔XX)咽拭子標(biāo)本，在4°C條件下，2000 4000rpm離心30min，取上清用0.2 μ m濾器過濾除菌，將過濾后的上清接種Vero細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。接種標(biāo)本前，倒掉生長(zhǎng)液，每瓶細(xì)胞(8XlO6個(gè)/瓶)接種0.2 Iml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36±1°C;吸附I 2小時(shí)后，換上含2 %牛血清的DMEM培養(yǎng)基IOml繼續(xù)培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞病變，若7天無細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)，盲傳I代繼續(xù)觀察7天，直到75% 90%的細(xì)胞發(fā)生變化，然后儲(chǔ)藏在-20°C以備二次傳代。第二代培養(yǎng)見可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后_70°C凍存，陰性則廢棄。從而得到EV71病毒株2，送至中國微生物菌毒種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)為=CGMCC N0.5539。2.EV71病毒株2的培養(yǎng)方法如下:從液氮罐中取出凍存細(xì)胞，移植細(xì)胞懸液Iml (濃度:8X IO6個(gè)/ml)于IOml 199細(xì)胞生長(zhǎng)液中，置于36± I°C的溫度下培養(yǎng),4小時(shí)后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)置于36±1°C的溫度下培養(yǎng)，待生長(zhǎng)成致密單層后進(jìn)行傳代。棄去瓶中原有199細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入IOml0.25%胰酶消化，待細(xì)胞脫壁后，補(bǔ)充6ml 199細(xì)胞生長(zhǎng)液，吹打至細(xì)胞呈分散懸液狀，取Iml細(xì)胞懸液接種至方瓶中，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，培養(yǎng)4 7天后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，確定病毒接種時(shí)間，按病毒接種量為M.0.1 = 0.001 I的比例加入IOml含2%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻，接種至長(zhǎng)成單層的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察病變，待接種病毒后48-120小時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲病毒培養(yǎng)液。3.EV71病毒株2的鑒定方法如下:(I)形態(tài)學(xué)觀察:在光學(xué)顯微鏡下觀察EV71病毒株2在細(xì)胞上的病變，細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加。超濾濃縮后，經(jīng)2%磷鎢酸溶液負(fù)染后，置電鏡下可觀察到球形病毒顆粒。(2)免疫學(xué)試驗(yàn)鑒定:將EV71病毒株2的病毒培養(yǎng)液與等量的抗EV71免疫血清于36±1°C中和I 2小時(shí)后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)7天，觀察病變細(xì)胞孔數(shù)，同時(shí)設(shè)血清和細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照的滴度應(yīng)不低于500CCID5(l/ml。結(jié)果顯示病毒對(duì)照組孔全部出現(xiàn)細(xì)胞病變，血清對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞均未出現(xiàn)病變；候選毒株均可被抗EV71免疫血清中和，證明它們確為EV71病毒株2。(3)分子生物學(xué)鑒定:取病毒液0.2-0.5ml，提取病毒RNA，采用EV71特異性引物進(jìn)行全基因擴(kuò)增、序列測(cè)定和基因分型，以上步驟可由北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行。結(jié)果顯示，其基因組全長(zhǎng)7404bp，屬于C4基因亞型。全基因序列如SEQ ID N0.:2所示。實(shí)施例11:由EV71病毒株2制備EV71疫苗2EV71病毒株2可作為動(dòng)物模型的攻毒株使用，同樣地也可用于制備EV71滅活疫苗。制備方法與EV71病毒株I類似，具體步驟可參見實(shí)施例2-6，唯一不同的是，將各步驟中所用的EV71病毒株I替換為EV71病毒株2。例如，以Vero細(xì)胞制備EV71滅活疫苗2為例，建立并檢定毒種三級(jí)種子批庫，并用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠培養(yǎng)Vero細(xì)胞，在細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層或細(xì)胞 在微載體上生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，接種病毒，36±1°C培養(yǎng)4-7天后收獲病毒懸液，經(jīng)過濃縮、純化滅活等步驟后，制備出疫苗原液?？山?jīng)過換算稀釋加入諸如Al (0!1)3之類的佐劑吸附配制成含佐劑半成品，也可不加入佐劑配制成不含佐劑半成品。分裝0.5ml/支即可為腸道病毒71型疫苗2。實(shí)施例12:EV71疫苗2的質(zhì)量分析根據(jù)《中國藥典(三部)2010年版》的有關(guān)要求，對(duì)EV71滅活疫苗I成品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，疫苗的外觀為乳白色渾懸液體、疫苗的裝量不低于0.5ml/瓶、疫苗的PH值在6.0 8.0、鑒別試驗(yàn)符合規(guī)定、氫氧化鋁含量< 2mg/ml、無菌檢查陰性、細(xì)菌內(nèi)毒素< IOEU/劑、異常毒性試驗(yàn)符合規(guī)定、牛血清白蛋白殘留量< 50ng/劑、游離甲醛含量(10 μ g/劑、Vero細(xì)胞DNA殘留量< IOOpg/劑等，均不低于國家標(biāo)準(zhǔn)，符合有關(guān)規(guī)定。實(shí)施例13:EV71疫苗2免疫原性分析測(cè)定血清中和抗體效價(jià)方法:待測(cè)血清在96孔微量滴定板上進(jìn)行2倍系列稀釋，將中和用病毒(實(shí)施例11得到的病毒)分別稀釋至100CCID5(l/50y 1，滴加至微量滴定板上(血清、細(xì)胞對(duì)照除外)，50 μ I/孔。至36°C培養(yǎng)箱，中和2小時(shí)。中和結(jié)束后，將RD細(xì)胞用胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，1.5父105/1111，加入96孔板中，10(^1/孔，361:、5%0)2繼續(xù)培養(yǎng)7天后，觀察細(xì)胞病變，判定結(jié)果，中和結(jié)束后進(jìn)行病毒回滴，設(shè)立病毒對(duì)照、血清對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果判定:當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有I孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)I孔細(xì)胞病變，另I孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的EV71中和抗體效價(jià)。小鼠免疫:將EV71疫苗分為不同劑量組:5,2.5、1.25,0.625,0.31,0.15、
0.07 μ g/ml，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠按疫苗接種劑量進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只。取EV71滅活疫苗，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，0.5ml/只，免疫2次，間隔2 4周，于加強(qiáng)免疫后3 4周采血，分離血 清，按上述方法檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，血清中和抗體水平與疫苗劑量存在明顯的量效關(guān)系，5、2.5、1.25、
0.625,0.31,0.15,0.07 μ g/ml組，血清中和抗體陽轉(zhuǎn)率除0.07 μ g/ml組為85%外，其他均達(dá)到100%，對(duì)照組未產(chǎn)生中和抗體，血清中和抗體陽轉(zhuǎn)率為0%。各組血清中和抗體GMT達(dá)1: (24 1024)，對(duì)照組GMT低于1: 8。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):中和效價(jià)大于1: 8。實(shí)施例14:EV71疫苗2保護(hù)效果的分析以實(shí)施例11得到的含氫氧化鋁佐劑的疫苗為例，采用本發(fā)明所述的EV71感染小鼠模型對(duì)疫苗的保護(hù)效果進(jìn)行分析。將EV71疫苗2分為高、中、低三個(gè)劑量組(2、1、0.5μ g/ml)。將成年ICR(每只配I只雄鼠，雌鼠懷孕后將雄鼠分窩)8只，于交配前O周初次免疫、交配后2-3周加強(qiáng)免疫，肌肉注射，0.1-1.0ml/只。母鼠產(chǎn)下乳鼠后1_7天，通過腦腔注射10 μ I由實(shí)施例10中的方法制備的EV71病毒株2培養(yǎng)液/只或者腹腔注射100 μ I由實(shí)施例10中的方法制備的病毒株2培養(yǎng)液/只，逐日觀察發(fā)病情況，計(jì)算生存率。病毒攻擊后第I天、2天和3天疫苗組和佐劑對(duì)照組均無異常，病毒攻擊后第4 5天對(duì)照組乳鼠后肢出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓癥狀，疫苗組無異常。病毒攻擊后第5 6天佐劑對(duì)照組乳鼠全部死亡，而疫苗組無任何異常，生存率曲線如圖9所示，結(jié)果顯示，EV71疫苗2具有明顯的保護(hù)作用，采用高、中、低劑量組的EV71疫苗2免疫后，均可保護(hù)小鼠免受EV71感染。疫苗接種組與正常對(duì)照組小鼠無明顯差別，體重正常、未出現(xiàn)肢體麻痹等行動(dòng)異?，F(xiàn)象，存活率率達(dá)100%，而佐劑對(duì)照組乳鼠于病毒攻擊后3 4天相繼發(fā)病直至死亡。
實(shí)施例15:顱內(nèi)注射EV71感染動(dòng)物模型的建立方法包括以下步驟:取1-14日齡ICR乳鼠，顱內(nèi)注射攻毒用毒株的病毒培養(yǎng)液(具體制備方法可參見實(shí)施例10，下同)，濃度為105CCID5(l/ml，10-30l.! I/只，即獲得EV71感染動(dòng)物模型。具體操作步驟如下:(I)動(dòng)物分組取1-14日齡乳鼠兩組(每組10只)，分別設(shè)為病毒組和正常對(duì)照組，病毒組顱內(nèi)注射攻毒用毒株培養(yǎng)液，正常對(duì)照組注射DMEM培養(yǎng)液。(2)顱內(nèi)注射用無菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培養(yǎng)液，顱內(nèi)注射乳鼠，10-30 μ I/只，正常對(duì)照組注射病毒培養(yǎng)液，10-30 μ I/只，逐日觀察乳鼠發(fā)病情況。(3)乳鼠發(fā)病情況觀察顱內(nèi)注射后第I天、2天和3天病毒組和正常對(duì)照組均無異常，病毒攻擊后第4 5天病毒組乳鼠后肢出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓癥狀，正常對(duì)照組無異常。病毒攻擊后第5 6天病毒組乳鼠全部死亡，而正常對(duì)照組無異常，生存率曲線如圖3所示，證明動(dòng)物模型建立成功。實(shí)施例16:腹腔注射EV71感染動(dòng)物模型的建立方法包括以下步驟:取1-14日齡ICR乳鼠，腹腔注射攻毒用毒株的病毒培養(yǎng)液(具體制備方法可參見實(shí)施 例10，下同)，濃度為105CCID5(l/ml，100l.! I/只，即獲得腸道病毒71型病毒的腹腔感染動(dòng)物模型。具體操作如下:(I)動(dòng)物分組取1-14日齡乳鼠兩組(每組10只)，分別設(shè)為病毒組和正常對(duì)照組，病毒組顱內(nèi)注射攻毒用毒株病毒培養(yǎng)液，正常對(duì)照組注射DMEM培養(yǎng)液。(2)腹腔注射用無菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培養(yǎng)液，腹腔注射病毒組乳鼠，100μ I/只；正常對(duì)照組注射DMEM培養(yǎng)液，100 μ I/只。逐日觀察乳鼠發(fā)病情況。(3)乳鼠發(fā)病情況觀察腹腔注射后第I天、2天和3天病毒組和正常對(duì)照組均無異常，病毒攻擊后第4 5天病毒組乳鼠后肢出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓癥狀，正常對(duì)照組無異常。病毒攻擊后第5 6天實(shí)驗(yàn)組乳鼠全部死亡，而正常對(duì)照組無異常，如圖5所示。生存率曲線如圖4所示，證明動(dòng)物模型建立成功。實(shí)施例17:EV71感染動(dòng)物模型的應(yīng)用(I)腸道病毒71型滅活疫苗的制備使用的是實(shí)施例6制備的EV71滅活疫苗(氫氧化鋁佐劑吸附)成品。(2)EV71感染動(dòng)物模型在EV71滅活疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)中的應(yīng)用I)疫苗準(zhǔn)備將制備成的EV71滅活疫苗，稀釋為高、中、低三個(gè)劑量(2、1、0.5μ g/ml)，對(duì)照為氫氧化招佐劑，濃度為lmg/ml。
2)動(dòng)物免疫和攻毒將成年ICR雌鼠(每只配I只雄鼠，雌鼠懷孕后將雄鼠分窩)，于交配前(O周)用本發(fā)明所制備的EV71疫苗進(jìn)行初次免疫、交配后2-3周加強(qiáng)免疫，肌肉注射，0.1-1.0ml/只。母鼠產(chǎn)下乳鼠后1-7天，通過顱內(nèi)注射10 μ I病毒液/只或者腹腔注射100 μ I病毒液/只，逐日觀察發(fā)病情況，計(jì)算生存率。3)攻毒后的觀察病毒攻擊后第I天、2天和3天疫苗組和佐劑對(duì)照組均無異常，病毒攻擊后第4 5天對(duì)照組乳鼠后肢出現(xiàn)明顯的麻痹、癱瘓癥狀，疫苗組無異常。病毒攻擊后第5 6天佐劑對(duì)照組乳鼠全部死亡，而疫苗組無任何異常，生存率曲線如圖6所示，結(jié)果顯示，EV71滅活疫苗具有明顯的保護(hù)作用，采用高、中、低劑量組的EV71滅活疫苗免疫后，均可保護(hù)小鼠免受EV71感染。疫苗接種組與正常對(duì)照組小鼠無明顯差別，體重正常、未出現(xiàn)肢體麻痹等行動(dòng)異?，F(xiàn)象，存活率率達(dá)100%，而佐劑對(duì)照組乳鼠于病毒攻擊后4 5天相繼發(fā)病直至死亡。4)測(cè)定中和抗體效價(jià)分別采集對(duì)照組、疫苗接種組母鼠、I日齡乳鼠、14日齡乳鼠血清進(jìn)行中和抗體檢測(cè)(檢測(cè)方法可參見以下文獻(xiàn):毛群穎，何鵬，于祥，李楠，郝春生等.人腸道病毒71型中和抗體檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià).中國生物制品學(xué)雜志.2010,23(8):885-888)。結(jié)果如圖7所示，EV71滅活疫苗免疫后，母鼠、I日齡、14日齡乳鼠血清中和抗體明顯高于對(duì)照組。5)各組織器官病毒載量檢測(cè)采用熒光定量PCR方法(檢測(cè)方法可參見以下文獻(xiàn):朵建英，王衛(wèi)，叢喆，劉強(qiáng)，魏強(qiáng)等.SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定腸道病毒71型(EV71)RNA拷貝數(shù)方法的建立.中國比較醫(yī)學(xué)雜志.2010，20 (7):27-31.)，檢測(cè)疫苗接種組和氫氧化鋁佐劑對(duì)照組小鼠各器官(腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脊髓、腸)中的EV71 RNA的相對(duì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗接種組乳鼠組織器官中病毒載 量明顯低于對(duì)照組。以脾為例，如圖8所示。對(duì)照組乳鼠上述各臟器中EV71RNA含量明顯高于氫氧化鋁佐劑對(duì)照組，這表明EV71疫苗接種后，可明顯降低各器官組織中的EV71病毒載量，從而達(dá)到保護(hù)乳鼠免受EV71感染的作用。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株，所述病毒株的保藏編號(hào)為CGMCCN0.5539。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列為SEQID N0.:2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒株在制備用于預(yù)防和/或治療手足口病的藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中，所述藥物為疫苗。
5.一種用于預(yù)防和/或治療手足口病的疫苗，其中，所述疫苗含有:1)經(jīng)滅活的權(quán)利要求I或2所述的病毒株；以及任選的2)佐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量計(jì)，所述病毒株的含量為1 4 μ g/ml ;并且/或者所述佐劑為氫氧化招,并且所述氫氧化招的含量為0.5 1.5 μ g/ml。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的疫苗的制備方法，其包括:將權(quán)利要求1或2所述的病毒株進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行滅活、純化，從而制備得到所述的疫苗。
8.一種制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方法，其中，以根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒株或權(quán)利要求5或6所述的疫苗為免疫原進(jìn)行制備。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備方法得到的制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒株在建立用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，所述病毒株用作攻擊毒株。
12.—種用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法，其包括: 1)將權(quán)利要求1所述的病毒株進(jìn)行培養(yǎng)，得到病毒培養(yǎng)液；以及 2)將步驟1)所得的病毒培養(yǎng)液施予動(dòng)物，從而制備得到所述的動(dòng)物模型； 其中，所述的動(dòng)物為小鼠。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其中，所述的小鼠為1-14日齡的乳鼠。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，所述的乳鼠是通過如下方法獲得的:將每只成年雌鼠與I只成年雄鼠交配，對(duì)所述雌鼠在所述交配前采用待評(píng)價(jià)的腸道病毒71型疫苗進(jìn)行初次免疫、在所述交配后2-3周采用該腸道病毒71型疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并在所述雌鼠懷孕后將其與所述雄鼠分窩，將所述雌鼠產(chǎn)下的乳鼠培養(yǎng)1-14天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腸道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株、疫苗、動(dòng)物模型建立方法。本發(fā)明病毒株的保藏編號(hào)為CGMCC No.5539。本發(fā)明所提供的EV71型病毒株具有如下優(yōu)點(diǎn)毒力強(qiáng)，可用于EV71疫苗或藥物的評(píng)價(jià)。本發(fā)明所提供的用于評(píng)價(jià)腸道病毒71型疫苗效果的動(dòng)物模型的建立方法能夠提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型，為腸道病毒71型疫苗研制和抗病毒藥物的篩選提供了基礎(chǔ)。由本發(fā)明的EV71型病毒株制備的疫苗符合《中國藥典(三部)2010年版》的有關(guān)要求，并且具有有效的免疫活性和攻毒保護(hù)能力。該疫苗的制備方法的生產(chǎn)過程易于控制、重復(fù)性好、適合規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N7/00GK103160474SQ201110418318
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者李秀玲, 郝春生, 王瀟瀟, 張中洋, 郭會(huì)杰, 陳蕾, 吳蘊(yùn)怡, 李懿, 張晨, 劉宇 申請(qǐng)人:北京微谷生物醫(yī)藥有限公司