專利名稱：預防腸道病毒71型感染的基因重組疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域，涉及一種疫苗及其制備方法。特別涉及用于預防腸道 病毒71型(EV71病毒)感染所致手足口病、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性 疾病等多種與神經系統(tǒng)相關的疾病的基因重組疫苗及其制備方法。
背景技術：
手足口病是由小RNA病毒科，腸道病毒屬病毒引起的，現已成為危害嬰幼兒健康 和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。手足口病主要由腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒 A16(Cox.A16)引起。感染EV71和COX.A16所引起的臨床癥狀難于區(qū)別。感染EV71常常 并發(fā)嚴重神經炎癥，包括病毒性腦膜炎，腦炎，以及類似小兒麻痹的癱瘓，引起的肺水腫、肺 出血經常導致嬰幼兒快速死亡。手足口病從感染到出現癥狀通常為36天。病人常在口中 發(fā)現瘡，手掌、腳底出現皮膚紅疹。有些病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會出現嚴重的并發(fā) 癥，短期發(fā)燒后突然惡化，并快速死亡。目前尚無有效的疫苗或藥物可防止手足口病。自1974年首次報道EV71以來，EV71已在世界范圍內引起多次爆發(fā)流行。近10年 來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)猖獗，不僅發(fā)病人數多，而且死亡病例多。中國大陸地區(qū)于 1981年由上海首次報道手足口病，此后北京、山東、廣東等十幾個省份均有本病爆發(fā)流行的 報道。2007年山東臨沂等地區(qū)發(fā)生手足口病流行，發(fā)病39606例，死亡14例。根據最新的 疫情監(jiān)測結果顯示，截至5月16日，2010年全國累計報告病例553263例，發(fā)病率41. 66/10 萬，重癥7993例，死亡335例；報告病例數較去年同期(365630例)相比，增加51. 32%。自 2008年5月2日起，衛(wèi)生部將手足口病納入法定丙類傳染病管理。流行病學資料顯示，Cox. A16 一般和EV71相伴流行，在流行過程中，考慮到Cox. A16多導致無癥狀感染，可能在流行中所占實際比例更高。2008年安徽阜陽手足口病疫情 發(fā)生后，中國疾病預防控制中心在全國范圍內病例標本的實驗室檢測結果顯示，在582個 手足口病例陽性標本中，EV71占討.5%，Cox. A16占17. 4%。2010年全國31個省份共 報告實驗室診斷病例14650例，其中EV71陽性7867例(53. 70% ), CoxA 16陽性4579例 (31.26/% )，其它腸道病毒陽性2204例(15.04% )。在7993例重癥病例中，3249例為實 驗室診斷病例，其中86. 21%為EV71感染，3. 76%為CoxA16感染，10. 03%為其他腸道病毒 感染；335例死亡病例中，256例為實驗室診斷病例，其中EV71感染239例，CoxA 16感染2 例，其他腸道病毒感染15例。由EV71或Cox. A16引起的手足口病反復爆發(fā)可能是新的基因型在世界范圍內傳 播所致。對1970 2004年全球EV71分離株的分子流行病學分析顯示，EV71病毒分為3 個基因型，即A，B, C型，8個基因亞型，即B1-B4和C1-C4亞型。對1983年 2003年福島 地區(qū)(Fukushima，Japan) Cox. A16分離株進行遺傳重建顯示，Cox. A16分離株形成了 3個不 同的遺傳簇(A，B，C)。近幾年從中國大陸手足口病輕癥病例和重癥病例標本中分分離到的 EV71病毒主要為C4亞型，Cox. A16病毒主要為C型。
EV71和Cox. A16病毒顆粒均為二十面體立體對稱的球形結結構，無包膜和突起。 病毒粒子的衣殼由60個亞單位構成，后者又是由4種衣殼蛋白(VP1-VP4)拼裝成的五聚體 樣結構?？乖瓫Q定簇基本上位于VP1-VP3上，而VP4包埋在病毒外殼的內側。EV71和Cox. A16病毒基因組均為7400 7420個核苷酸的單股正鏈RNA，基因組中僅有一個開放讀碼 框，編碼含約2190 2200個氨基酸的多聚蛋白，在其兩側為5’和3’ -非編碼區(qū)(UTRs)， 在其3’ -UTRs區(qū)的末端含有一個長度可變的poly-A。多聚蛋白可進一步水解成P1、P2、P3 前體蛋白。Pl前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3、VP4病毒外殼蛋白；P2和P3前體蛋白編碼7個 非結構蛋白(2A-2C和3A-3D) ·在脊髓灰質炎滅活疫苗和減毒活疫苗的啟發(fā)下，已經有針對手足口病的滅活疫苗 和減毒活疫苗的研究，并已取得了一些進展，但距離臨床應用尚不成熟。曾有EV71福爾馬 林滅活疫苗成功地控制EV71在保加利亞傳播的報道，但未見再次使用滅活疫苗的報道。中 國臺灣何美鄉(xiāng)篩選了一株適于制備EV71滅活疫苗的病毒株YN34a，病毒產量高、免疫原 性強、交叉保護譜廣、子代病毒穩(wěn)定性高。在弱毒活疫苗的研制方面，中國臺灣余俊強使用 EV71和Cox. A16弱毒柱免疫小鼠獲得了對EV71強毒株的免疫保護，表明具有交叉保護功 能。日本MInetaro Arita采用反向遺傳學技術拯救弱毒株EV71 (Sl_3，)，免疫短尾猴后， 神經毒力降低，而具有廣譜的交叉保護活性。減毒活疫苗方面，由于對EV71和Cox. A16毒 力決定基團至今不清，尚無進展。在傳統(tǒng)疫苗研究的同時，亞單位疫苗的實驗室研究取得了可喜的進展。采用畢赤 酵母、大腸埃希氏菌、昆蟲細胞、沙門氏菌、百日咳細菌等表達了 EV71和Cox. A16的結構蛋 白VP1，并利用病人陽性血清證實表達的VPl蛋白具有免疫原性。昆蟲細胞和沙門氏菌表達 的VPl結構蛋白以及使用VPl基因研制的DNA疫苗免疫小鼠后能誘導對EV71或Cox. A16 感染的保護。聯想到口服型脊髓灰質炎病毒疫苗的成功應用，以及近年來在黏膜免疫和口服疫 苗研究的進展，包括我國最新批準上市的幽門螺旋桿菌口服基因工程疫苗的成功案例，可 見EV71 口服型基因工程疫苗的研制已經并不遙遠。盡管進行了有關EV71和Cox. A16疫苗的開發(fā)工作，但是目前仍然未開發(fā)出有醫(yī)藥 商業(yè)應用價值的疫苗。

發(fā)明內容
針對目前手足口病的流行態(tài)勢，為了更好的預防手足口病的爆發(fā)，本發(fā)明人經過 不懈的努力，設計并構建了 EV71融合表達蛋白。在此基礎上，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于 預防EV71感染的口服疫苗。經實驗證明，本發(fā)明的疫苗或者藥劑具有有效的免疫活性和/ 或攻毒保護能力。所以，本發(fā)明一方面提供了用于針對EV71感染的疫苗，所述疫苗結構中包括EV71 的SP55和SP70兩個蛋白，以及LTB蛋白。進一步的，本發(fā)明提供了一種用于預防EV71感染的口服型疫苗。再一方面，本發(fā)明還提供了一種制備針對EV71感染口服型疫苗的方法。再另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的疫苗在制備預防EV71感染口服型疫苗中的用 途。
具體而言，本發(fā)明提供一種能有效預防EV71病毒感染引起的手足口病、無菌性腦 膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等多種與神經系統(tǒng)相關的疾病的基因重組口服疫 苗及其制備方法。 本發(fā)明預防EV71病毒感染的重組口服疫苗是一種由LTB-SP55-SP70融合而成的 基因重組口服疫苗，它以大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強佐劑、EV71病 毒外殼蛋白VPl中的兩段多肽SP55和SP70為抗原，根據大腸埃希氏菌的嗜好對密碼子進 行優(yōu)化，基因合成后采用基因工程技術構建rLTB-SP55-SP70的原核表達系統(tǒng)，得到的基因 重組疫苗。通過基因工程技術制備的融合基因原核表達系統(tǒng)及其產物，使該疫苗具有表達 產物中同時含有重組佐劑rLTB及rSP55和rSP70重組病毒蛋白抗原，從而能對EV71病毒 感染引起的手足口病、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等相關疾病具有 免疫預防效果，并且還具有制備方法簡便可靠，生產成本較為低廉，使用方便、安全等特點。本發(fā)明的疫苗其結構由LTB-SP55-SP70表示，其氨基酸序列列在序列表序列8，和 本發(fā)明疫苗結構對應的核苷酸序列列在序列表序列7，本發(fā)明疫苗結構中的LTB-SP55-SP70其各自的氨基酸序列列在序列表序列2，4，6 中，其對應的核苷酸序列列在序列表序列1，3，5中。技術方案本發(fā)明提供了 EV71病毒感染的重組口服疫苗的制備方法及其效果鑒定步驟 1)大腸埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因的密碼子優(yōu)化、合成和測序；2) rLTB-SP55-SP70基因合成后，用Nde I和Xho I進行雙酶切，切下片段跟進行了同樣雙酶 切的pET30a載體連接，構建原核表達質粒；3)重組蛋白rLTB-SP55-SP70表達，SDS-PAGE 電泳和BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)確定表達情況和產量；4) DEAE陰離子交換層析和Ni-NTA 親和層析法純化rLTB-SP55-SP70 ；5)rLTB_SP55_SP70水溶液即可直接制成口服滴丸；6) rLTB-SP55-SP70還可經冷凍干燥與藥用賦性劑磷酸鈣混合后制備成口服膠囊。有益效果本發(fā)明通過重組蛋白rLTB-SP55_SP70的原核表達和純化，提供一種預防EV71病 毒感染引起的手足口病、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等相關疾病的 多價口服基因工程疫苗，并采用GM1-ELISA、免疫后小鼠血清抗體體外中和實驗等方法，證 實該疫苗中rLTB保持有佐劑活性，口服后產生的特異性抗體能夠有效中和病毒對細胞的 感染。本發(fā)明方法制備的重組蛋白rLTB-SP55_SP70是一種無害人體的細菌和病毒融合 蛋白，制備方法安全可靠、成本較低、易于推廣應用。本發(fā)明預防EV71病毒感染的基因重組口服疫苗是以口服滴丸或口服膠囊供人們 服用，故使用方便，可避免注射引起的疼痛和不適，也可避免使用針頭和針筒，減少了污染 的可能性；制造成本低，利于推廣應用。


圖1大腸埃希氏菌LTB基因密碼子優(yōu)化后核苷酸序列和氨基酸序列圖2 EV71病毒SP55和SP70基因密碼子優(yōu)化后核苷酸序列和氨基酸序列圖3大腸埃希氏菌LTB基因和EV71病毒SP55和SP70基因的LTB-SP55-SP70融合基因核苷酸和氨基酸序列。表達載體克隆設計。圖 4 rLTB-SP55-SP70 蛋白 SDS-PAGE 膠·
具體實施例方式實施例1本發(fā)明預防EV71病毒感染的重組口服疫苗是一種LTB-SP55-SP70融合基因的重 組口服疫苗，它以大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強佐劑、EV71病毒外 殼蛋白VPl中的兩段多肽SP55和SP70為抗原，根據大腸埃希氏菌的嗜好對密碼子進行優(yōu) 化，基因合成后采用基因工程技術構建rLTB-SP55-SP70的原核表達系統(tǒng)，獲得高純度重組 表達產物的EV71病毒基因工程疫苗。本發(fā)明研制基因工程疫苗對抗原及其基因的選擇所有EV71病毒均有編碼SP55 和SP70的基因，具有序列保守、表達量高、表面分布、大分子量和顆粒結構、抗原性強等特 點，故將這兩個蛋白作為EV71基因工程疫苗首選抗原；這兩段基因是中和抗原決定簇，其 中SP70更強些，可以誘發(fā)機體產生具有保護性中和抗體。本發(fā)明基因工程疫苗采用口服疫苗的理由是注射免疫通常是誘生血清抗體；而 EV71因為是腸道感染病毒，所以通過口服疫苗在誘生血清抗體的同時，還可以誘生機體產 生針對EV71的黏膜免疫。因此，采用EV71病毒口服疫苗能更有效的產生免疫保護作用?；蚬こ桃呙珉m具有抗原成分明確、副作用小等優(yōu)點，但單一蛋白抗原構成的疫 苗免疫效果往往較差。近年有不少研究資料證明，大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素(LT)有很強 的黏膜免疫佐劑活性。LT分別由亞單位A(LTA)和B(LTB)組成，其中LTA是LT的毒性部 位，LTB功能則是黏附細胞，并無毒性。已有不少文獻報道，LTB有很強的誘導黏膜免疫的活 性，是良好的粘膜免疫佐劑。若采用基因工程技術，將大腸埃希氏菌LTB、EV71病毒外殼蛋白VPl中的兩 段多肽SP55和SP70分別重組表達，必然使得生產工藝復雜，增加生產成本。因此，本 實施例將LTB、SP55和SP70三個基因串聯成為LTB-SP55-SP70這樣一個融合基因，然 后構建LTB-SP55-SP70原核表達系統(tǒng)。LTB-SP55-SP70原核表達系統(tǒng)重組表達產物為 rLTB-SP55-SP70,其分子中同時含有粘膜免疫佐劑LTB以及SP55和SP70抗原，不僅可因 LTB這一分子內佐劑的存在而提高蛋白的免疫原性，并可有效地降低生產成本而有利于產 業(yè)化。此外，還對r LTB-SP55-SP70免疫原性、表達產量和提純方法、佐劑活性、口服免疫小 鼠后預防EV71感染的效果等進行了驗證，表達后r LTB-SP55-SP70產量可達細菌總蛋白的 24.3%，其中1~1^8仍保持有佐劑活性，口服免疫后可使小鼠產生特異性抗體，在體外細胞 中和實驗中可有效中和病毒對細胞的感染。其結果表明，rLTB-SP55-SP70可用于預防EV71 病毒感染的基因重組口服疫苗。 本實施例預防EV71病毒感染的基因重組口服疫苗的制備方法包含以下的步驟 1)大腸埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因的密碼子優(yōu)化、合成和測序；2) ! LTB-SP55-SP70基因合成后，分別用限制性內切酶Nde I和Xho I進行消化，收集目的 片段與同樣用限制性內切酶處理的pET30a載體進行連接，構建重組表達質粒；3)重組蛋 白rLTB-SP55-SP70表達，SDS-PAGE電泳和BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)確定表達情況和產 量；4)DEAE陰離子交換層析和Ni-NTA親和層析法純化rLTB_SP55_SP70蛋白。此外還采用GMI-ELISA法對rLTB-SP55-SP70分子中的rLTB佐劑活性進行鑒定；將高純度基因重 組蛋白免疫BALB/c小鼠，檢測其特異性抗體，并采用體外病毒中和實驗評價該重組抗原對 BALB/c小鼠初步的免疫保護力。本實施例中大腸埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因均通過基因合成 獲得；本實施例中所用的一切實驗用材料和試劑及相關設備均可從各自國內外相關產業(yè)公 司或國外公司國內銷售代理公司購得。在微生物學、分子生物學等技術領域的專業(yè)人員，均 可重復本實施例中的制備方法并進行試用。上述人工合成的融合基因LTB-SP55-SP70的制備方法是由寶生物工程(大連)有 限公司直接基因合成。上述原核表達載體pET30a購自Novagen公司，E. coli BL21 (DE3)購自北京博邁 德科技發(fā)展有限公司。將上述合成基因的目的基因LTB-SP55-SP70與pET30a載體均用Nde I和Xho I限制性內切酶進行消化處理，用T4 DNA連接酶16°C連接，獲得目的重組表達質 粒；一、連接反應1、將pET30a載體和人工合成的LTB-SP55-SP70基因片段用Nde I和Xho I兩種 限制性內切酶進行消化處理，收集目的片段。2、將50ng雙酶切后的pET30a載體與5 8倍摩爾量的目的基因片段加入到0. 5ml 無菌Eppendorf管中。3、加雙蒸水補充體積到8μ 1，然后加入 10XT4 DNA Ligase buffer 1μ 1，T4 DNA Ligase 1 μ 1，混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底，于16°C保溫1小時。同時做二組對照反應，其中對照組一僅有雙酶切后的pET30a載體片段而無外源 DNA ；對照組二僅有雙酶切后的外源DNA片段而沒有載體片段。二.感受態(tài)細胞的制備1.挑取E. coli BL21(DE3)單菌落接種于Iml無菌LB培養(yǎng)液中，37°C 210轉搖床 2-3小時。2.取0. 05 0. Iml培養(yǎng)的新鮮菌液轉種到50ml無菌LB培養(yǎng)液中，37°C劇烈震 蕩，直到A600達到0.5。3.在無菌條件下將培養(yǎng)物轉移到50ml無菌離心管中，4°C 4，OOOrpm離心lOmin。4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干，此操作為無菌條件下。5.取15ml 0. IM預冷的無菌氯化鈣溶液重懸沉淀，冰水浴中放置10 15min，4°C 4，OOOrpm 離心 IOmin06.棄上清，沉淀重懸于5ml (含0. IM預冷的無菌氯化鈣溶液，15%的無菌甘油)溶 液中輕柔混勻，冰水浴中放置lOmin。7.將菌液分裝于無菌EP管中，-80°C或液氮凍存。8.取兩管感受態(tài)細胞分別加入1 μ 1無菌ddH20(陰性對照)和1 μ 1純質粒(陽 性對照)進行轉化(見后)，以檢測感受態(tài)的質量。陰性對照平板上應該無菌落生長，陽性 對照平板上菌落數目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。LB的配制 蛋白胨 IOg
酵母提取物5gNaCl 0. 58gNaOH 1 100 調 pH 值溶解并加水定容至1L，121 °C X20min高壓蒸汽滅菌0. IM氯化鈣溶液的配制0. IM CaCl2ddH20 to IOOml注上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理三.轉化1.取100 μ 1感受態(tài)細胞于冰水浴上融化。2.加入10 μ 1連接產物，輕輕吹散混勻，冰水浴放置30min。3.將感受態(tài)細胞放入42°C水浴中熱激90秒，后立即放入冰水浴中放置2min。4.加入0. 9ml無菌LB溶液，于37°C恒溫搖床上150rpmX45min復性。5.將感受態(tài)細胞4000rpm離心lmin，留200 μ 1上清將沉淀輕柔吹散，均勻涂布于 含氨卞青霉素的瓊脂平板表面，平板于37°C倒置培養(yǎng)過夜。四.重組質粒的測序鑒定1.上述轉化過程可通過提取核酸，用限制性內切酶篩選，獲得含有重組外源DNA 片段質粒的菌斑，進行小量表達。2.經蛋白電泳將有預期表達條帶大小正確的樣品，送去測序，以確定是否有外源 基因LTB-SP55-SP70的插入，以及插入序列是否正確。上述目的重組表達產物rLTB-SP55_SP70的表達和提純方法是一、重組蛋白質的誘導表達1.挑取轉化有質粒的單菌落，接種于1.5ml含氨卞青霉素(50 μ g/ml)的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)2-3小時。2.取0. 5ml菌液保存4°C冰箱中，剩余菌液中加入lmol/L IPTG，使IPTG終濃度為 lmmol，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)2小時。取Iml樣本作為誘導后標本，收集菌體沉淀。4.將誘導后菌體沉淀用20 40 μ 1 PBS (pH = 8. 0)重懸，加入等體積的2 X SDS 上樣緩沖液，煮沸加熱5min，SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，考馬斯亮藍染色1 小時后，脫色觀察結果。5.選取誘導成功的細菌克隆，擴大誘導規(guī)模，收集菌體沉淀，于-20°C保存，準備 做下一步分析及純化。二.重組蛋白質為非可溶性蛋白的分離純化1.在含氨卞青霉素(50μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基IL中，接種含 pET30a-LTB-SP55-SP70的菌液，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜，后加入IPTG至終濃度lmmol/L，按 上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時； 2. 4000g 離心 IOmin 收集細菌沉淀，用裂解液(0.05% Triton-XlOO, IOmmol/L Tris · Cl，pH8. 0)吹起混勻，在冰水浴中進行超聲破碎(200瓦，作用20秒，間隔20秒，作 用20次)；3. 9000g離心lOmin，沉淀用裂解液吹起混勻，再次超聲破碎；
4. 9000g 離心 lOmin，沉淀用基夜(8mol/L 尿素、10mmol/L Tris · HCl，ρΗ8· 0)重 懸；5. IlOOOg離心lOmin，上清過HiS柱，用300mM咪唑洗脫目的蛋白；6.將洗脫的目的蛋白再用10mmol/L Tris · HCl, pH8. 04°C透析2小時；7.透析的蛋白上DEAE陰離子層析柱，分別用100mM、200mM濃度NaCl洗脫，收集目 的重組表達蛋白；8.將200mM NaCl洗脫的目的蛋白于_20°C保存，準備做下一步分析及純化。三、重組蛋白質的復性、凍干和定量純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0. 01XPBS透析，透析后 的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準，采用BIORAD公司蛋白質定量 試劑(protein assay)比色測定蛋白質的含量。上述實驗結果如下1)含pET30a-LTB-SP55-SP70 的 E. coli BL21 (DE3)工程菌可 有效表達rLTB-SP55-SP70，產量可達細菌總蛋白的24. 3%，見圖4 ;2)經過DEAE陰離子層 析及Ni-NTA親和層析純化，rLTB-SP55-SP70純度可達到90% -95 %。為證實目的重組表達產物rLTB-SP55_SP70的免疫原性及LTB的生物學活 性，分別以rLTB-SP55-SP70為抗原免疫BALB/c小鼠，觀察特異性抗體產生情況、以及 rLTB-SP55-SP70與神經節(jié)苷酯GMl的結合能力。1)免疫原性檢測注射組，在小鼠皮下多點注射rLTB-SP55_SP70，每次劑量5ug/ 只，每隔14天注射一次，共3次，同時分別采集小鼠尾部靜脈血0. 5 1ml，第三次注射 后14天采集小鼠眼眶靜脈血1ml，分離血清，以試劑盒檢測血清中特異性抗體；口服組，以 rLTB-SP55-SP70通過喂飼方式，每次劑量2ug/只，每隔14天喂飼一次，共3次，同時分別采 集小鼠尾部靜脈血0. 5 1ml，第三次喂飼后14天采集小鼠眼眶靜脈血1ml，分離血清，以 試劑盒檢測血清中特異性抗體。2) LTB生物學活性檢測根據LTB能與GMl的特異性結合的特性，可用GM1-ELISA 方法來檢測重組表達LT蛋白是否具有生物學活性。(I)GMl粉劑Img溶于2ml PBS (pH7. 4)溶液中，終濃度為0. 5mg/ml，分裝到EP管 中；(2)吸取 12 μ 1 GMl 溶液(0. 5mg/ml)到 3. Oml 碳酸緩沖液(1. 59g Na2C03、 2.93gNaHC03溶于IL去離子水)中，混勻后加到聚苯乙烯包被板條中，100 μ 1/孔，4°C過 夜；(3)將包被液倒掉，每孔加入170 μ 1封閉液(含1. 0% BSA的PBS溶液)，37°C作 用1小時；(4)將封閉液倒掉，用洗液(含0. 05% Tween-20的PBS溶液)洗6次，扣干；(5)用PBS溶液將免疫小鼠血清蛋白稀釋成100μ g/ml、10l·! g/ml及1 μ g/ml，將 LTB 蛋白稀釋成 100 μ g/ml, 10 μ g/ml, 1 μ g/ml, 100ng/ml 及 10ng/ml ；(6)每孔加入系列稀釋的樣品ΙΟΟμ 1，每個樣品加復孔，用PBS溶液作為陰性對照，另取2孔不加樣，作為空白對照；(7)倒掉樣品液，用洗液洗6次，扣干；(8)每孔加入1 6，000稀釋的兔抗CT全毒素血清100μ 1，37°C作用1小時；
(9)重復步驟(7)；(10)每孔加入1 2，000稀釋的山羊抗兔IgG-HRP 100μ 1，37°C作用1小時；(11)重復步驟(7)；(12)每孔加入TMB顯色A液、B液各50 μ 1，37°C顯色15分鐘;(13)每孔加入終止液50μ 1，混勻，以空白對照調零測定各孔A45ciIim值；(14)臨界值(cutoff)=陰性對照A45ciIim均值+0. 16，樣品A45ciIim值彡臨界值，判為 陽性；樣品~5。歷值<臨界值，判為陰性。上述實驗結果如下l)rLTB-SP55-SP70免疫小鼠后可產生特異性抗體，用EV71抗體檢測試劑盒檢測 呈陽性。結果見附表1.2) GM1-ELISA檢測rLTB-SP55_SP70抗血清能與牛神經節(jié)苷酯GMl結合，其0D490 均值高于陰性對照20倍以上，故判為有較強的神經節(jié)苷酯GMl結合能力。結果見附表2為證實目的重組產物rLTB-SP55_SP70的特異性抗體對病毒的中和作用，進行了 體外病毒中和實驗。用含有rLTB-SP55-SP70的溶液，采用皮下多點注射(5ug/0. Iml/次， 共免疫3次)和灌胃(2ug/lml/次，共3次)兩種方式免疫小鼠。在三次免疫后取小鼠眼 眶靜脈血，分離血清，進行體外病毒中和實驗。結果顯示第三次免疫小鼠后，注射組和口服 組小鼠特異性血清對病毒有明顯的中和作用，有效的血清中和效價在1 32稀釋度以上。 結果見附表3EV71血清中和試驗試劑準備DMEM培養(yǎng)基(已加入1% G,3% PS)、FBS(胎牛血清)；0. 結晶紫溶 液、已知滴度病毒懸液、待測血清樣本耗材準備24孔培養(yǎng)板、1000 μ L/200 μ L/20 μ L的槍及槍頭，10mL/2mL吸管實驗步驟細胞的傳代和培養(yǎng)中和實驗前一天將RD細胞傳24孔板(一個5cm2小方瓶傳2 個24孔板)備用。待24孔板中RD細胞密度長至80%時即可接種。病毒的稀釋稀釋病毒懸液至1/2X10_5滴度。待測血清樣本的稀釋在新的24孔板中用稀釋好的病毒液將待測血清按1 64、 1 128或1 256倍進行稀釋，稀釋后于5%C02、37°C的培養(yǎng)箱中溫育lh，期間每隔15min 搖晃混勻一次；病毒-血清混合液的接種將24孔板中細胞培養(yǎng)上清吸去，每孔加入200 μ L稀釋 孵育過的病毒-血清混合液(步驟3所示)，于5%C02、37°C的培養(yǎng)箱中溫育lh，期間每 隔15min搖晃混勻一次；Ih后每孔補加ImL DMEM培養(yǎng)基(含2% FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)。每板分 別做一孔空白細胞對照和一孔只加病毒懸液的細胞對照。結果觀察待靜置培養(yǎng)約72h(如培養(yǎng)期間細胞液體太酸，可補加適當培養(yǎng)基)， 吸去細胞培養(yǎng)上清，每孔加入適量0. 1 %結晶紫溶液(以覆蓋住孔表面為宜)，室溫靜置 IOmin,吸棄上清，用蒸餾水洗一遍，吸干，觀察結果。綜上所述，rLTB-SP55-SP70能形成一種口服EV71基因工程疫苗產品而用于預防 EV71感染的相關疾病。附表1 免疫小鼠血清EV71抗體檢測結果
權利要求
1.一種預防手足口病的基因重組疫苗，其特征在于，其氨基酸序列為％9 ID NO. 8所示 的序列，結構為LTB-SP55-SP70。
2.如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，是一種細胞內佐劑基因重組口服疫苗，它以 大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB為免疫增強佐劑、EV71病毒外殼蛋白VPl中的兩 段線性中和表位SP55和SP70為抗原，用基因工程技術構建LTB-SP55-SP70融合基因的原 核表達質粒，在大腸埃希菌中進行表達，并對重組表達產物進行純化，制成EV71病毒基因 工程疫苗。
3.如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所說的LTB-SP55-SP70制備成口服滴丸。
4.如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所說的LTB-SP55-SP70制備成口服膠囊。
5.如權利要求1所述疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包含以下步驟1)大腸埃 希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因密碼子優(yōu)化、合成和測序；幻rLTB_SP55_SP70 原核表達系統(tǒng)構建；3)rLTB-SP55-SP70重組蛋白的表達，SDS-PAGE電泳和BioRad凝膠 圖像分析系統(tǒng)確定表達情況和產量；4)DEAE陰離子交換層析和Ni-NTA親和層析法純化 rLTB-SP55-SP70 ；5)采用GM1-ELISA對rLTB_SP55_SP70分子中的rLTB佐劑活性進行鑒定； 6)用rLTB-SP55-SP70重組蛋白免疫BALB/c小鼠，對免疫血清的抗體產生情況進行檢測， 利用體外中和實驗測定口服免疫的EV71病毒基因工程疫苗rLTB-SP55-SP70的免疫保護作 用。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，其中步驟1)所說的大腸埃希氏菌LTB 具有序列表中SeQ ID NO. 2所示的序列。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟1)中所說的EV71病毒SP55和 SP70，是根據大腸埃希氏菌偏好密碼子優(yōu)化而基因合成的EV71病毒基因序列所表達，具有 序列表中ID NO. 4和6所示的序列。
8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟2)所構建的表達載體中，LTB是作 為一種細胞內分子免疫增強佐劑。
9.一種表達權利要求1疫苗的核苷酸序列，其特征在于，為％0 ID NO. 7所示的序列。
10.表達LTB-SP55-SP70三個亞單位的核苷酸序列，其特征在于，為kQID NO. 1,3,5 所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預防腸道病毒71型感染的基因重組疫苗及其制備方法，所述感染包括手足口病、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等多種與神經系統(tǒng)相關的疾病，我們以大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為免疫增強佐劑、EV71病毒外殼蛋白VP1中的兩段線性中和表位SP55和SP70為抗原，用基因工程技術構建LTB-SP55-SP70融合基因的原核表達質粒，在大腸埃希菌中進行表達，并對重組表達產物進行純化，制成EV71病毒基因工程疫苗。
文檔編號A61P31/14GK102058881SQ20101062274
公開日2011年5月18日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權日2011年2月25日
發(fā)明者伊瑤, 李慶, 畢勝利, 賈志遠, 陳斯勇 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 北京銳金立華生物技術有限公司