專利名稱：表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1, 3-甘油二酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結構特異性化合物的制備方法，尤其涉及一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法。
背景技術：
1，3-甘油二酯是天然食用油脂(甘油三酯)的結構類似物，其口感、外觀均與前者一致，但在人體內的代謝吸收方式不同甘油三酯經消化酶消化后生成單甘酯和游離脂肪酸，二者吸收進入血液后，很大部分重新合成甘油三酯而增加血脂或造成脂肪積累。而1， 3-甘油二酯經消化酶作用后生成甘油和游離脂肪酸，甘油經丙酮酸進入TCA循環(huán)，游離脂肪酸被運往肝臟進行氧化。因此，食用含有1，3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪積累、 防止體重增加的效果。天然存在的1，3-甘油二酯很少，因而其人工合成尤顯重要。鑒于1，3-甘油二酯主要用作健康食用油脂，其合成過程中必須盡量避免酸、堿、有機溶劑等有害成分的參與以及高溫、高壓等苛刻條件對產品口感、外觀的不良影響，因而適宜利用脂肪酶的區(qū)域選擇性在無溶劑條件下由甘油和高級脂肪酸直接酯化是來合成高純度的1，3-甘油二酯。已有利用游離脂肪酶催化合成1，3-甘油二酯的報道[孟祥河，鄒冬芽，段作營等.無錫輕工大學學報，2005, 23(2) 31-35 ]。但是無溶劑合成1，3-甘油二酯的反應為高黏度非均相體系，這造成了脂肪酶在應用中分散性差、選擇性下降、穩(wěn)定性差、回收重復利用困難的問題。納米材料能大幅提高分散性；另外，本實驗室曾采用表面活化的疏水硅藻土為載體采用多種方法對Arthrobacter sp.脂肪酶進行固定化，發(fā)現通過交聯處理脂肪酶的選擇性和穩(wěn)定性有Il著提高[Yang G, Wu J-P, Xu G, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008，2009，57(1-4): 96-103 ]。此外，磁性材料為酶在高黏度體系中的回收重復利用提供了方便，劉薇等以磁性基質固定化的脂肪酶，具有出很好的分離效果[劉薇，白姝，孫彥.過程工程學報，2004，4(4) 362-366.]。為了同時解決脂肪酶在高粘度非均相體系中的若干問題，我們嘗試將納米材料、 表面活化交聯處理及磁性基質結合起來，對脂肪酶進行固定化。目前，尚無將疏水性表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶應用于無溶劑體系中1，3-甘油二酯合成的嘗試的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，提供一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法。表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法的步驟如下 1)向200 mL無氧水中加入0. 20 0. 30 mol三價鐵鹽和0. 10 0. 15 mol 二價鐵鹽，
以鹽酸調整至PH = 1.5 1.7，超聲處理20 30 min ；升溫至65 90 °C，在1 300 1 500rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL質量百分數25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，使溶液pH = 9 10，15 30 min后，磁分離，無氧水洗滌5 10次，再以 0. 010 0. 015 mol/L乙醇水溶液洗滌2 3次；
2)加入80 100mL體積百分數為50%的乙醇水溶液，4 8 mL硅烷交聯劑，50 60 °C、 180^220 rpm攪拌5 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3 5次；
3)加入16 20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 20 mL質量百分數5%的戊二醛水溶液， 180^220 rpm攪拌纊3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌;Γ5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體；
4)將含有10 50mg脂肪酶、pH = 5 10的水溶液與10 50 mg表面活化的磁性納米粒子微球載體混合，0 4 °C、18(T220 rpm攪拌12 24 h，加入5 25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 24 h，磁分離，凍干8 12 h，得到磁性納米固定化脂肪酶；
5)將40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸與10 35 mg 4 A分子篩、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm攪拌下反應7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二價鐵鹽為!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三價鐵鹽為FeCl3 · 6H20 或i^e2(S04)3*7H20。所述的硅烷交聯劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述白勺月旨肪BS為 Mucor javanicus^ Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 月旨肪Si。 所述的脂肪酸為油酸或油酸與月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸中一種或幾種的混合物。本發(fā)明將磁性固定化脂肪酶應用于在無溶劑體系中合成1，3-甘油二酯的反應中，選擇性、活力及操作穩(wěn)定性均有顯著提高，并且大大方便酶的回收和重復利用，產品純度高、不含有毒溶劑，具有極大的應用價值。


圖1固定化脂肪酶與游離酶重復利用情況比較；
圖2表面活化的磁性納米粒子微球載體固定化酶掃描電子顯微鏡照片； 圖3表面活化的磁性納米粒子微球載體固定化酶透射電子顯微鏡照片； 圖4表面活化的磁性納米粒子微球載體固定化酶X射線晶體衍射圖譜。
具體實施例方式表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法的步驟如下
1)向200mL無氧水中加入0. 20 0. 30 mol三價鐵鹽和0. 10 0. 15 mol 二價鐵鹽， 以鹽酸調整至pH = 1.5 1.7，超聲處理20 30 min ；升溫至65 90 °C，在1 300 1 500 rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL質量百分數25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，使溶液pH = 9 10，15 30 min后，磁分離，無氧水洗滌5 10次，再以 0. 010 0. 015 mol/L乙醇水溶液洗滌2 3次；
2)加入80 100mL體積百分數為50%的乙醇水溶液，4 8 mL硅烷交聯劑，50 60 °C、 180^220 rpm攪拌5 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3 5次；
3)加入16 20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 20 mL質量百分數5%的戊二醛水溶液， 180^220 rpm攪拌纊3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌;Γ5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體；4)將含有10 50mg脂肪酶、pH = 5 10的水溶液與10 50 mg表面活化的磁性納米粒子微球載體混合，0 4 °C、18(T220 rpm攪拌12 24 h，加入5 25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 24 h，磁分離，凍干8 12 h，得到磁性納米固定化脂肪酶；
5)將40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸與10 35 mg 4 A分子篩、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm攪拌下反應7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二價鐵鹽為!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三價鐵鹽為FeCl3 · 6H20 或i^e2(S04)3*7H20。所述的硅烷交聯劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述白勺月旨肪BS為 Mucor javanicus^ Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 月旨肪Si。 所述的脂肪酸為油酸或油酸與月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸中一種或幾種的混合物。實施例1
將 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 無氧水中超聲處理 30 min 使溶液混合均勻，升溫至85 °C，在1 300 rpm攪拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 濃氨水，保持溫度、攪拌及N2反應30 min，結束后磁分離所得沉淀并以無氧水洗滌至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗滌3次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 200 rpm攪拌 5 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，200 rpm 攪拌2 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子。4 °C下，將10 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入10 mg載體，在冰浴中200 rpm攪拌M h，加入25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌M h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h 即為固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率達到89%，目標產物
含量80% (質量分數)。采用氣象色譜內標法計算產物生成量及底物消耗量，三月桂酸甘油酯為底物，位置異構體過量值re = (1，3-甘油二酯)％ (1，2-甘油二酯)％，以每分鐘催化消耗1 Umol油酸所需的酶量(或固定化酶量)為一個酯化活力單位(Ue，ymol - min 0，每克蛋白所具有的酯化活力即為酯化比活。游離酶，位置異構體過量值re = 70%，比活為0.133 U· (g蛋白)S在40 ！以上迅速失活，固定化酶位置異構體過量值re = 85%，酯化比活為游離酶的11倍，固定化酶經磁性分離回收可重復使用5次以上，在80 °C仍不失活。實施例2
1)向200mL無氧水中加入0. 20 mol三價鐵鹽和0. 10 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至65 °C，在1 500 rpm攪拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，30 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加100mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 60 220 rpm攪
5拌6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3飛次；
3)加入20 mL pH = 7的磷酸緩沖液及20 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，220 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將50 mg Mucor Javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 10磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體，在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率大于80%，目標產物含量大于70% (質量分數)。實施例3
1)向200mL無氧水中加入0. 30 mol三價鐵鹽和0. 15 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至90 °C，在1 500 rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，15 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交聯劑，60 °C ,180 rpm攪拌 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，180 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將50 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 10磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體，在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率大于80%，目標產物含量大于70% (質量分數)。實施例4
將 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 無氧水中超聲處理 30 min 使溶液混合均勻，升溫至85 °C，在1 300 rpm攪拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 濃氨水，保持溫度、攪拌及N2反應30 min，結束后磁分離所得沉淀并以無氧水洗滌至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗滌3次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 200 rpm攪拌 5 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，200 rpm 攪拌2 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子。4 °C下，將10 mg Rhizopus chinentis脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入10 mg載體，在冰浴中200 rpm攪拌M h，加入25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌M h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率達到90%，目標產物
含量高于80% (質量分數)； 實施例5
1)向200mL無氧水中加入0. 20 mol三價鐵鹽和0. 10 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至65 °C，在1 500 rpm攪拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，30 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加100mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 60 220 rpm攪拌6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3飛次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸緩沖液及20 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，220 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體， 在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率85%，目標產物含量75% (質量分數)。實施例6
1)向200mL無氧水中加入0. 30 mol三價鐵鹽和0. 15 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至90 °C，在1 500 rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，15 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交聯劑，60 °C ,180 rpm攪拌 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，180 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體，在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率大于80%，目標產物含量大于67% (質量分數)。實施例7
將 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 無氧水中超聲處理 30 min 使溶液混合均勻，升溫至85 °C，在1 300 rpm攪拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 濃氨水，保持溫度、攪拌及N2反應30 min，結束后磁分離所得沉淀并以無氧水洗滌至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗滌3次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 200 rpm攪拌 5 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，200 rpm 攪拌2 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子。4 °C下，將10 mg Candida antarctica脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入10 mg載體，在冰浴中200 rpm攪拌M h，加入25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌M h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率達到90%，目標產物含量70% (質量分數)；
實施例8
1)向200mL無氧水中加入0. 20 mol三價鐵鹽和0. 10 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至65 °C，在1 500 rpm攪拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，30 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加100mL體積分數為50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交聯劑，50 60 220 rpm攪拌6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3飛次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸緩沖液及20 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，220 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將 50 mg Candida antarctica 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體， 在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。
500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率大于80%，目標產物含量大于70% (質量分數)。實施例9
1)向200mL無氧水中加入0. 30 mol三價鐵鹽和0. 15 mol 二價鐵鹽，以鹽酸調整至 pH = 1.7，超聲處理20 min;升溫至90 °C，在1 500 rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL質量分數28%的氨水，15 min后，磁分離，無氧水洗滌10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗滌2次；
2)加入80mL體積分數為50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交聯劑，60 °C ,180 rpm攪拌 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 mL質量分數5%的戊二醛水溶液，180 rpm 攪拌3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體。4 °C下，將 50 mg Candida antarctica 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸緩沖液，漩渦振蕩混合90 s,4 0C >12 000 rpm離心5 min，棄去沉淀，加入50 mg載體， 在冰浴中220 rpm攪拌12 h，加入5 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 h。結束后在冰浴中進行磁分離并以磷酸緩沖液洗滌數次以除去殘余蛋白，所得固體冷凍干燥12 h即為固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶與10 mg 4 A分子篩加入2 mL離心管中漩渦震蕩充分混合，在37 200 rpm攪拌下反應12 h，轉化率大于80%，目標產物含量大于67% (質量分數)。
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權利要求
1.一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于它的步驟如下1)向200mL無氧水中加入0. 20 0. 30 mol三價鐵鹽和0. 10 0. 15 mol 二價鐵鹽， 以鹽酸調整至PH = 1.5 1.7，超聲處理20 30 min ；升溫至65 90 °C，在1 300 1 500 rpm攪拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL質量百分數25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，使溶液pH = 9 10，15 30 min后，磁分離，無氧水洗滌5 10次，再以 0. 010 0. 015 mol/L乙醇水溶液洗滌2 3次；2)加入80 100mL體積百分數為50%的乙醇水溶液，4 8 mL硅烷交聯劑，50 60 °C、 180^220 rpm攪拌5 6 h，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌3 5次；3)加入16 20mL pH = 7的磷酸緩沖液及16 20 mL質量百分數5%的戊二醛水溶液， 180^220 rpm攪拌纊3 h，磁分離，用pH = 7的磷酸緩沖液洗滌;Γ5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體；4)將含有10 50mg脂肪酶、pH = 5 10的水溶液與10 50 mg表面活化的磁性納米粒子微球載體混合，0 4 °C、18(T220 rpm攪拌12 24 h，加入5 25 μ L質量分數為25%的戊二醛水溶液，攪拌12 24 h，磁分離，凍干8 12 h，得到磁性納米固定化脂肪酶；5)將40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸與10 35 mg 4 A分子篩、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm攪拌下反應7 24 h，得到1，3-甘油二酯。
2.根據權利要求1所述的一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的二價鐵鹽為FeSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。
3.根據權利要求1所述的一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的三價鐵鹽為FeCl3 · 6H20或!^e2 (SO4)3 · 7H20。
4.根據權利要求1所述的一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的硅烷交聯劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅焼。
5.根據權利要求1所述的一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酶為Mucor javanicus, Rhizopus chinentis或 Candia antarctica 月旨肪Si。
6.根據權利要求1所述的一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸為油酸或油酸與月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸中一種或幾種的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表面活化的磁性納米粒子固定化脂肪酶制備1,3-甘油二酯的方法，包括如下步驟1)以二價和三價鐵鹽的混合物共沉淀制備超順磁性Fe3O4納米粒子，以硅烷偶聯劑進行修飾，并在修飾后的微粒外表以戊二醛活化，從而得到表面活化的磁性納米粒子；2)加入脂肪酶酶溶液，攪拌、洗滌、干燥得到固定化酶；3)采用該固定化酶催化甘油與脂肪酸的酯化反應，得到1,3-甘油二酯。本發(fā)明所涉及的固定化脂肪酶在1,3-甘油二酯的合成反應中，活力、操作穩(wěn)定、區(qū)域選擇性均顯著提高，酶的回收利用操作極大簡化，產品純度高且不含有害溶劑。
文檔編號C12N11/14GK102517348SQ20111041767
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權日2011年12月14日
發(fā)明者吳堅平, 孟梟, 徐剛, 楊立榮 申請人:浙江大學