專利名稱：一種富集血清中低豐度蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白純化技術領域，具體涉及一種富集血清中低豐度蛋白的方法。
背景技術：
人體血清中因疾病而引起的蛋白質的含量及種類變化是臨床上各種病癥 早期診斷及評價病情、判斷預后等常規(guī)檢驗的一個重要指標，應用現(xiàn)代生物技 術如蛋白質組學等尋找與疾病相關的特異蛋白質變化是當前研究的熱點。然 而，由于血清中的蛋白質種類超過一萬種之多，其中高豐度蛋白如白蛋白、球
蛋白、纖維蛋白原等就多達22種，占據(jù)了蛋白質總量的99%左右，從而掩蓋 了可能含有特異分子的低豐度蛋白質，造成其難于被檢測，因此，預先有效地 去除血清中高豐度蛋白質，富集低豐度蛋白，可以提高應用蛋白質組學技術尋 找疾病診斷的敏感性分子標志物的可能性。
目前在科研中雖然應用許多方法選擇性地去除1 2種高豐度蛋白，但這些 方法普遍純化率偏低，操作復雜?，F(xiàn)有的商業(yè)化產品使用成本高，而且易于去 除與高豐度蛋白有相互作用的低豐度蛋白，故應用性不大，如MARS純化柱 價格昂貴，需要應用成本較高的HPLC高效液相色譜技術，該純化過程只能去 除其中6種豐度最高的蛋白質，仍然留下不少高豐度的蛋白，且由于MARS 純化柱是在非變型條件下進行純化的，在天然構象狀態(tài)下能與白蛋白等蛋白結 合的蛋白也會被同時去除，導致蛋白損失過多，影響實驗的結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種重復性好、操作簡單、 純化成本低，能夠有效地去除血清中的高豐度蛋白并富集大量低豐度蛋白的方 法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
一種富集血清中低豐度蛋白的方法，該方法是利用肝素與血清中許多高豐 度蛋白質相互作用的特性，將肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，采用本領域技術 人員進行親和層析時的常規(guī)操作進行裝柱、平衡和上樣，由于不同的洗脫液會 收集得到不同的洗脫成分，洗脫液的選擇對洗脫效果影響很大，因此本發(fā)明人
對洗脫液進行了實驗研究，結果發(fā)現(xiàn)當采用濃度為1.5mol/L的NaCl做為洗脫 液時，洗脫得到的組分中含有大量富集的低豐度蛋白，而高豐度蛋白含量很低。
上述方法中，用1.5mol/L的NaCl做為洗脫液時，可采用Tris-HCl緩沖液 調節(jié)NaCl溶液的pH，如洗脫液的配方可以為10 mmol/L Tris-HC1禾口 1.5 mol/LNaCl， pH7.0。
上述方法中，采用1.5mol/L的NaCl做為洗脫液，得到的洗脫產物還可以 采用蛋白G瓊脂糖凝膠(Protein Gsepharose)進一步去除其中的IgG。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
l.本發(fā)明的方法選擇肝素瓊脂糖作為純化材料，材料本身價格便宜，利用 肝素與血清中許多高豐度蛋白質相互作用的特性，應用普通的親和層析的方法 便可獲得低豐度血清蛋白，而且層析過程簡單易行，大大降低純化成本，且與 MARS純化柱相比，肝素瓊脂糖純化的效果更好，能得到種類更多的血清蛋白， 而且肝素瓊脂糖可重復利用，也節(jié)約了成本；2. 本發(fā)明的方法能夠有效去除血清中高豐度蛋白，解決血清中高豐度蛋白 的干擾問題，進而高效富集大量的低豐度蛋白，獲得研究中所需的目的種類的 低豐度蛋白，為進一步深入研究確診疾病的高效、特異性的低豐度蛋白標識物
提供了研究條件；
3. 本發(fā)明的方法為應用蛋白質組學進行疾病研究，得到所需的高效、特異
性的低豐度蛋白標志物提供了研究基礎，利用該方法還可以制作成商品化的蛋
白純化柱，對于在應用功能蛋白質組學進行疾病診斷標志物的尋找和疾病發(fā)病
機制的研究以及藥物開發(fā)的機構推廣具有較大意義，產業(yè)化后也能帶來良好的
經濟效益，同時也具有良好的社會效益。


圖1為SDS-PAGE考染和銀染電泳其中，l為考染電泳圖，2為銀染電泳圖，3為Marker, 4為洗脫組分，5 為進一步去除IgG后組分，6為IgG， 7為IgG重鏈，8為IgG輕鏈； 圖2為MARS column處理所得的蛋白組分的2D-PAGE電泳圖； 圖3為肝素親和富集的低豐度蛋白組分的2D-PAGE電泳圖； 圖4為洗脫條件優(yōu)化SDS-PAGE電泳其中，1為Marker, 2為未處理過的血清，3為清洗組分(即肝素不結合 的組分)，4為洗脫液配方(1) ， 5為洗脫液配方(2) ， 6為洗脫液配方(3)， 7為洗脫液配方(4) ， 8為洗脫液配方僅含有1.5mol/LNaCl。 具體事實方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地解釋，但具體實施例并不對本發(fā) 明做任何限定。實施例l肝素親和層析
本實施例以肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，對樣品進行肝素親和層析，其 具體步驟如下
1. 樣品預處理
收集10mL正常人血液于不抗凝試管中，室溫靜置30min，然后1500g離 心30min，取上清液再次5000g， 4。C離心20min，去除沉淀收集上清液，取該 上清液IO(VL，用60jiL純凈水和40pL的乙腈稀釋，40。C溫浴15min， 14 OOOg 離心10min去除沉淀，收集上清液即為本實施例的血清上樣品。
2. 親和層析
本實施例的親和層析釆用本領域技術人員的常規(guī)操作，所用到的儀器和試 劑均為市售。
裝柱將lmL肝素瓊脂糖裝入5mL的BIO-RAD層析柱； 平衡用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)平衡柱子；
上樣將180pL上述血清上樣品用lmL平衡液(含有10mmol/L Tris-HCl 和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)稀釋后，上柱；
平衡上柱后再次用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH7.0)平衡；
洗脫用2.5mL洗脫液(含有IO mmol/L Tris-HCl和1.5 mol/LNaCl， pH 7.0) 洗脫柱子，收集洗脫產物。
層析結束后依次用Cleaning Buffer 1 (含有0.1mol/L硼酸鹽和l mol/LNaCl， pH9.8) 、 Cleaning Buffer 2 (含有0.1mol/L硼酸鹽，pH9.8) 、 Cleaning Buffer3 (超純水，MilliQ Water)和Cleaning Buffer 4 (含有2.0 mol/L NaCl)這四
種清洗液各5mL清洗柱子后，則可重復利用柱子。 3.IgG的去除
用PBS清洗兩遍Protein G sepharose (市售)，并將其儲存于等體積的PBS
中；
將上述洗脫產物濃縮于500pLPBS中，加入200^L Protein G sepharose，于 恒溫震蕩器上4i:震蕩3h后，14000g離心10min去除ProteinG，吸取上清作為后 續(xù)試驗的樣品。
4.SDS-PAGE
采用本領域技術人員的常規(guī)操作，進行SDS-PAGE電泳，電泳結果用考染 及銀染染色，如圖1所示，
4為肝素親和層析所得的洗脫組分，即肝素結合蛋白組分，其中仍存在較 濃的IgG條帶，5為進一步去除IgG后的洗脫組分，IgG條帶大幅變淡，6為被去 除的IgG組分，7和8分別為IgG的重鏈和輕鏈條帶。
5.2D-PAGE
對上述步驟3中去除IgG后的上清樣品進行二維聚丙烯酰胺凝膠電泳 (2D-PAGE)，其具體操作采用本領域技術人員的常規(guī)操作，電泳結果用銀 染顯示。
6.圖像分析處理
將上述SDS-PAGE和2D-PAGE的銀染染色膠都進行Image Scanner (Amersham Biosciences)掃描，過程中使用軟件Lab Scan 3.00進行操作，掃 描后圖像用Image Master 2D Elite Software 4.01 (Amersham Biosciences)軟件分析。
掃描結果運用MARS column處理所得的蛋白組分的2D-PAGE電泳圖 如圖2所示；運用該實施例肝素親和所富集的低豐度蛋白組分的2D-PAGE電泳 圖如圖3所示；從圖2和圖3可以看出用MARS處理后，2D-PAGE顯示561個點， 而用肝素瓊脂糖和ProteinGsepharose處理后，顯示622個點，說明本方法能夠 比MARS純化柱分離到更多的蛋白。
實施例2肝素親和洗脫條件優(yōu)化
本實施例對本發(fā)明的樣品洗脫條件進行優(yōu)化，對實施例1中的洗脫液進行 一系列不同的配方，對比洗脫效果，從而選出最優(yōu)洗脫條件。 洗脫液配方
(1) 10mmol/LTris-HCl和0.5mol/LNaCl， pH7.0;
(2) 10mmol/LTris-HCl和1.0mol/LNaCl， pH7.0;
(3) 10 mmol/L Tris匿HCl和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0;
(4) 10mmol/LTris-HCl和2.0mol/LNaCl， pH7.0。
同時本實施例還設置了對比組未處理的血清，肝素不結合組分，洗脫液
配方僅有1.5 mol/LNaCl。
將上述不同處理后的結果進行SDS-PAGE電泳，如圖4所示，
1為Marker, 2為未處理的血清，3為肝素不結合組分，4 7分別為使用
洗脫液配方1 4進行梯度洗脫的結果，8為僅使用10 mmol/L Tris-HCl和1.5
mol/LNaCl， pH 7.0配方進行洗脫的結果，可見使用該洗脫液配方基本可將肝
素結合組分全部洗脫下來。
因此，本實施例選擇配方(3) : 10mmol/LTris陽HCl和1.5mol/LNaClpH7.0，作為優(yōu)選的洗脫液配方,
權利要求
1、一種富集血清中低豐度蛋白的方法，其特征在于該方法是采用肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，NaCl做為洗脫液，對血清進行低豐度蛋白的富集。
2、 根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于所述洗脫液的配方為10mmol/L Tris — HC1和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0。
3、 根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于所述肝素瓊脂糖經Cleaning Buffer 1 、 Cleaning Buffer2、 Cleaning Buffer 3和Cleaning Buffer 4這四種清洗 液清洗后，可多次使用；所述Cleaning Buffer 1含有0.1 mol/L硼酸鹽和1 mol/L NaCl， pH9.8;所述Cleaning Buffer2含有0.1 mol/L硼酸鹽，pH 9.8;所述 Cleaning Buffer 3為超純水；所述Cleaning Buffer 4含有2.0 mol/L NaCl。
4、 根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于所述純化柱的平衡液為10 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0。
5、 根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于該方法采用洗脫液洗脫后，洗 脫產物再采用蛋白G瓊脂糖凝膠進一步處理。
全文摘要
本發(fā)明公開一種富集血清中低豐度蛋白的方法，該方法采用肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，1.5mol/L的NaCl做為洗脫液，洗脫得到的組分中含有大量富集的低豐度蛋白，而高豐度蛋白含量很低，解決了血清中高豐度蛋白的干擾問題，獲得研究中所需的目的種類的低豐度蛋白，為進一步深入研究診斷疾病的高效、特異性的低豐度蛋白標識物提供了研究條件。本發(fā)明選擇肝素瓊脂糖作為純化材料，材料本身價格便宜，層析過程簡單易行，純化效果好，能得到種類更多的血清蛋白，且肝素瓊脂糖可重復利用。利用本發(fā)明方法還可制作商品化的蛋白純化柱，對于在應用功能蛋白質組學進行疾病診斷標志物的尋找和疾病發(fā)病機制的研究以及藥物開發(fā)推廣具有較大意義。
文檔編號C07K14/435GK101575370SQ200910040389
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權日2009年6月19日
發(fā)明者何慶瑜, 霆 雷 申請人:暨南大學