專利名稱：抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w及其試劑盒、產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系以及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種特異性的單克隆抗體 以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系，以及含有該單克隆抗體的試劑盒及它們?cè)?br> 沖企測(cè)PTX中的用途。
背景技術(shù)：
巖沙海葵毒素(Palytoxin, PTX)是從腔腸動(dòng)物皮沙?？粕橙汉？麑俣?沙群海葵Palythoatoxica中分離得來(lái)的一種非蛋白毒素，其是由129個(gè)碳原子組 成的聚醚化合物，分子量為2677，含有40個(gè)羥基和8個(gè)曱基。有極強(qiáng)的神經(jīng)系 統(tǒng)、心血管系統(tǒng)或細(xì)胞系統(tǒng)活性，皮摩爾級(jí)濃度的分子即可損傷細(xì)胞，而且 PTX的作用速度極快，動(dòng)物從中毒到死亡的時(shí)間僅3 5分鐘，是迄今為止在非 蛋白毒素中毒性最強(qiáng)的化合物之一。
巖沙?？且环N海洋腔腸動(dòng)物類，它生長(zhǎng)在海濱巖石上或半截身子埋在 海沙里或吸附在曱殼類生物的殼上，人類多由誤食或不慎接觸其觸手而中毒。 巖沙海葵毒素屬于聚醚類水溶性神經(jīng)毒素，作用于Na+-K+-ATP酶，阻斷鈉離 子通道；它是最強(qiáng)烈的血管收縮劑，對(duì)冠狀動(dòng)脈的收縮強(qiáng)度比血管緊張素強(qiáng) IOO倍。中毒癥狀主要表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸衰竭、驚厥、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、 嗜睡、四肢無(wú)力、虛脫、嘔吐、消化道廣泛出血、休克、死亡等。由于人類 愈來(lái)愈熱衷于海鮮產(chǎn)品，使得誤食這種毒素造成食物中毒的可能性越來(lái)越大， 但是目前對(duì)該類毒素中毒尚無(wú)特效治療藥物，因此，建立起一種靈敏性高、 特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法用于鑒別高致中毒性海葵種群以及測(cè)定供人類食用的海 產(chǎn)品里PTX的分布含量，以減輕或避免PTX中毒事件的發(fā)生實(shí)為必要。國(guó)內(nèi)外對(duì)PTX的研究主要都是圍繞PTX對(duì)Na-K泵或Ca泵的毒理影響方 面。由于PTX分子量小，不能直接免疫小鼠，甚至是不能直接與載體蛋白連接， 其研究難度較大，研究進(jìn)程比較緩慢。1988年Levine L等通過(guò)使用1125的放射 免疫測(cè)定法(RIA)來(lái)4全測(cè)PTX ( Levine L, Fujiki H， Gjika HB, Van Vunakis H. A radioimmunoassay for palytoxin. Toxicon. 1988; 26(12): 1115-21 ) ， 1992年 Bignami GS等制備出PTX的單克隆抗體，并發(fā)展到5種有關(guān)PTX免疫檢測(cè)方法 的報(bào)道，包括'間接竟?fàn)幰种品?CIEIA)、兩種直接竟?fàn)幰种品ㄒ约爸苯雍?間才矣夾心法(Bignami GS ， Raybould TJ等.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunoassays for the measurement of palytoxin in biological samples. Toxicon. 1992 Jul; 30(7): 687-700 )。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，ELISA的敏感度 是RIA的3倍，檢測(cè)范圍在6-250 ng/ml之間(Frolova GM, Kuznetsova TA, Mikhalov VV， Eliakov GB, Immunoenzyme method for detecting microbial producers of palytoxin. Bioorg Khim. 2000 Apr; 26(4): 315-20),但是該ELISA 實(shí)驗(yàn)是采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記，而且過(guò)程過(guò)于繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境要求 較高。在我國(guó)，最相關(guān)的報(bào)道只涉及焦紅、劉必勇等人制備出PTX多克隆抗體 (焦紅，劉必勇,郭素珍,席靜,林峰,王家驥.海洋生物巖沙?？舅匮迕庖呖?體的制備.檢驗(yàn)檢疫科學(xué).2005(2))以及對(duì)巖沙?？舅刂苯用嘎?lián)免疫吸附檢 測(cè)方法的研究(焦紅，劉必勇，王家驥，林峰.巖沙?？舅刂苯用嘎?lián)免疫吸 附檢測(cè)方法的研究)，未見其他更詳盡的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗巖沙?？舅?PTX)的單克隆抗體及其試劑盒、產(chǎn)生 該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系以及它們的用途。
本發(fā)明的目的之一是"t是供一種抗巖沙?？舅?PTX)單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞系，其保藏在武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保
4藏號(hào)為CCTCC No. C200922,保藏日為2009-5-19,命名為抗巖沙海葵 毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w的雜交瘤細(xì) 胞系分泌的單克隆抗體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種能準(zhǔn)確方便的檢測(cè)巖沙?？舅氐脑噭?盒，所述試劑盒含有所述抗巖沙海葵毒素的單克隆抗體。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述單克隆抗體、含有該單克隆抗體的試劑 盒、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系在檢測(cè)PTX中的應(yīng)用。
本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè) 的方法，用于鑒別高致中毒性海葵種群以及測(cè)定供人類使用的海產(chǎn)品里PTX 的含量分布，可以有效地減輕或避免PTX中毒事件的發(fā)生。
下面將詳細(xì)介紹本發(fā)明的抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w的雜交瘤細(xì)胞系、 單克隆抗體及其試劑盒和用途。


本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏在武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCCNo.C200922，保藏日為2009-5-19， 命名為抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞抹，本發(fā)明的抗巖沙?？?素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞抹，為半懸浮細(xì)胞，在安靜情況下生長(zhǎng)時(shí)能輕輕貼 壁于培養(yǎng)瓶上，經(jīng)吹打能脫落下來(lái)，形成細(xì)胞懸液。該細(xì)胞呈圓形，在光學(xué)
顯微鏡下發(fā)亮而透明。
圖l為本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞林在光學(xué)顯微鏡下的圖片。如圖所示，在光學(xué) 顯微鏡下觀察可以雜交瘤細(xì)胞成群生長(zhǎng)，與圖中箭頭所指的死細(xì)月包所呈現(xiàn)出 的棕色或黑色及其不透明性，有明顯的不同。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明先將PTX與異型雙功能試劑SPDP反應(yīng)，然后再偶聯(lián)載體蛋白KLH 制備完全抗原，免疫Balb/c小鼠，并制備PTX-PDP-BSA偶聯(lián)物作為檢測(cè)抗原。 取小鼠脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合，間接ELISA篩選分泌PTX單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞株并制備腹水型單克隆抗體。利用該單克隆抗體初步建立并比較檢測(cè)PTX 的直接和間接竟?fàn)幟该庖邔W(xué)^f企測(cè)方法。
實(shí)施例一、雜交瘤細(xì)胞系的制備
1. PTX與栽體蛋白的偶聯(lián)
在PH7.5， 0.1M PBS:DMSO19:l的混合液中加入20pg PTX和12iig的 SPDP, 4。C冰箱過(guò)夜?；旌衔锛尤氲攘緾H2CL2萃取3次，取水層部分過(guò)5ml SephadexG-25預(yù)裝柱，用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脫，收集最大吸 收波長(zhǎng)在263nm下的洗脫液。
在0.025M, pH9.0硼酸鹽緩沖液中加入45 pg KLH蛋白和50倍摩爾濃度 (2隱iminothiolate: KLH)的2-亞氨基硫醇鹽(2-iminothiolate) ， 4。C冰箱過(guò)夜。 混合物過(guò)截留分子量為30K的超濾管，取上層管液體，在分光光度計(jì)下檢測(cè) KLH-SH最大吸收波長(zhǎng)278nm下的洗脫液，并凍干。BSA-SH的制備跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脫液，并凍千。
免疫抗原將PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解于PH7.5, 0.1MPBS 中，體積分別為lml、 0.5ml、 0.5ml。然后BSA-SH和KLH-SH都分別加入到等 體積的PTX-PDP溶液中，4。C過(guò)夜。然后再過(guò)5mlSephadexG-25預(yù)裝柱，用含 O.lMNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脫，收集分光光度計(jì)4全測(cè)下收集最大吸收波 長(zhǎng)為267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波長(zhǎng)為273歸的PTX-PDP-BSA。
2. 動(dòng)物免疫以及免疫后血清的檢測(cè)
將100ng、 150ng、 200ng、 300ng PTX-PDP-KLH分別溶于0.2ml生理鹽水， 并用等體積的弗氏完全佐劑充分混合；選用雌性6 8周齡BALB/C小鼠作為免 疫動(dòng)物多點(diǎn)免疫；2周后取同樣體積抗原與弗氏不完全佐劑混合，免疫方法同上；免疫3周后開始檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)以PTX-PDP-BSA為包被抗原， 采用間接ELISA法檢測(cè)；免疫6次后直接取PTX-PDP-KLH 0.2ml腹腔注射加強(qiáng)免疫。
3.細(xì)胞融合以及融合后篩選 3.1飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)
處死2 3只8 12周齡的健康BALB/C小鼠，消毒；無(wú)菌條件下在小鼠腹腔 注入3ml4。C的基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗腹腔，收集各小鼠腹腔沖洗液，連續(xù)操作3次； 1000rpm離心10min,棄上清；用HAT培養(yǎng)液稀釋離心沉淀細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì) 數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05個(gè)/ml，經(jīng)細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，每孑U).lml， 放置到37。C、 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 3.2免疫脾細(xì)胞懸液的制備
① 取已經(jīng)免疫的、效價(jià)高的BALB/C小鼠，摘除眼^求放血，并分離血清 供抗體檢測(cè)用，同時(shí)將小鼠處死，浸泡于75 。/。酒精中5min,隨即方欠入超凈臺(tái) 內(nèi)。無(wú)菌手術(shù)打開腹部，取出脾臟，放入己盛有8ml不完全培養(yǎng)基的平皿中 輕輕洗一次，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。
② 將脾臟移入另一盛有5ml不完全培養(yǎng)基的平亞內(nèi)，置于鋼絲網(wǎng)上。用 注射器內(nèi)芯擠壓研磨脾臟，并用平皿內(nèi)的不完全培養(yǎng)基輕輕沖洗鋼絲網(wǎng)，使 脾細(xì)胞全部通過(guò)鋼絲網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
③ 將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)基至30ml，混勻。
1000 rpm離心5 min,棄去上清。
⑤ 沉淀細(xì)胞再用不完全培養(yǎng)基同法離心洗滌一次，然后將細(xì)胞重懸至 10ml,混勻。
⑥ 取脾細(xì)胞懸液，加臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。 3,3 NS-1骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備① 在融合前2 3天將NS-l骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)于75ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 每瓶加12 15ml培養(yǎng)液，置37。C， 5 %C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
② 融合時(shí)，收集細(xì)胞于50ml離心管中。
③ 1000rpm離心5min ,棄上清。
④ 沉淀細(xì)胞中加入30ml不完全培養(yǎng)基，同上離心洗滌一次。然后將細(xì) 胞重懸至10ml ，混勻。
⑤ 取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用 3.4脾細(xì)月包與NS-1細(xì)月包融合
① 將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，按8:1的比例加入到一支50ml離心 管中，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至20ml ，充分混勻；
② 100rpm離心7min ,棄上清；輕叩管底使細(xì)胞松散；加入相對(duì)分子量 為4000的50。/。的PEG0.7ml ,邊搖邊加，lmin內(nèi)加完；
③ 再用吸管吸取細(xì)胞，靜置30sec ,然后30sec內(nèi)將細(xì)胞吹入離心管中； 在5min內(nèi)加入20ml完全培養(yǎng)基稀釋PEG;⑤800rpm離心7min ，棄上清； 加入10mlHAT培養(yǎng)基，輕輕混勻細(xì)胞；
⑥ 將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml。共加有 兩塊96孔培養(yǎng)板，將此兩塊板放入37。C ， 5。/。C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
4.融合后篩選
融合后18天用間接ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)用BSA、 KLH包被抗原 對(duì)照以排除與載體蛋白之間的交叉反應(yīng)，檢測(cè)方法同小鼠免疫血清的檢測(cè)。 三天后重復(fù)檢測(cè)一次。
將檢測(cè)到的陽(yáng)性孔細(xì)胞A6、 B8用有限稀釋法克隆化，同時(shí)將細(xì)胞從96孔 板轉(zhuǎn)移到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到要求數(shù)量并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集 細(xì)胞凍存。以后每次克隆化的細(xì)胞用同樣的方法檢測(cè)，并及時(shí)將陽(yáng)性雜交瘤 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存一批。實(shí)施例二、腹水型單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
1. 腹水型單克隆抗體的制備
(1) 小鼠預(yù)處理每只BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml弗氏不完全佐劑；
(2) 接種雜交瘤細(xì)胞24h后將雜交瘤細(xì)胞收集，1000rpm離心7min，棄 上清，用不完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞細(xì)胞懸起并計(jì)數(shù)，每只小鼠注射0.5ml細(xì)胞懸 液(約7xl05個(gè)/ml)。同時(shí)以相同數(shù)量的NS-1細(xì)胞注射小鼠，制備腹水作為 陰性對(duì)照。
(3) 接種雜交瘤細(xì)胞后18天后，用注射器抽取腹水。將抽取的腹水經(jīng) 3000rpm離心15min,棄去沉淀，收集上清，分裝并置于-20。C水箱保存。
2. 腹水型單克隆抗體的純化
2.1硫酸銨鹽析法初提單克隆抗體
(1) 飽和碌u酸銨的配制于100ml蒸餾水中加90g硫酸銨，80。C溶解過(guò)濾， 降至室溫后即有結(jié)晶析出，任其留在瓶中，用時(shí)取所需要量，用氨水調(diào)PH至 7.2;
(2) 在冰浴中將處理好的腹水用0.02M PH7.4的PBS稀釋4倍。然后在4。C 攪拌下，逐滴加入8倍腹水量的飽和硫酸銨，然后在水箱放置2h以上，使其形 成沉淀物；
(3) 10000rpm， 4。C離心15min，棄上清，將沉淀物溶解于0.02M PH7.4的 PBS中，透析過(guò)夜，凍存。
2.2 rProteinA FF純化分離抗體 2.2.1 rProteinAFF純化分離腹水器材與試劑 rProteinA FF預(yù)裝柱 GE公司
0.1MPH8.0PBS: Na2HP04'12H20 33g， KH2P04 0.76g, NaCl 8g,加蒸 餾水至1000ml。0.1MPH6.0檸檬酸緩沖液0.1M檸檬酸9.5ml 0.1M檸檬酸鈉40.5ml。 0.1MPH5.0檸檬酸緩沖液0.1M檸檬酸20.5ml 0.1M檸檬酸鈉29.5ml。 0.1MPH4.2檸檬酸緩沖液0.1M檸檬酸31.5ml 0.1M檸檬酸鈉18.5ml。 0.1MPH3.0杼檬酸緩沖液0.1M檸檬酸46,5ml 0.1M檸檬酸鈉3.5ml。 lMPH9.0Tris-HCl緩沖液12.1gTris， 5mllMHCl ,加蒸餾水至100ml。 0.2MPH2.2Gly陽(yáng)HCl緩沖液50ml 0.2MGly, 44.0ml 0.2M HC1,加蒸餾 水至100ml。
2.2.2 rProteinA FF純化分離腹水方法
(1) 用2 ~3倍體積的O . 2M PH2.2 Gly-HCl緩沖液洗rProteinA FF預(yù)裝 柱，然后用0.1MPH8.0PBS平衡。
(2) 樣品處理1體積預(yù)處理過(guò)的腹水加3體積量0.1MPH8.0PBS，20000g 4°C離心30min，取上清用1M PH9.0 Tris-HC1緩沖液調(diào)至PH8.0。
(3) 上樣1柱床體積加樣0.2體積樣品，靜置15min。
(4) 洗脫依次用0.1MPH6.0檸檬酸緩沖液、0.1MPH5.0檸檬酸緩沖液、
0. 1MPH4.2檸檬酸緩沖液、0.1MPH3.0檸檬酸緩沖液、0.2M PH2.2 Gly-HCl 緩沖液洗脫，收集樣品。
3.純化結(jié)果
收集的樣品在280nm下檢測(cè)吸光值，發(fā)現(xiàn)在PH4.2處出現(xiàn)一個(gè)主峰，說(shuō)明 此腹水較純，成分為IgG3。純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在50KD 和25KD處各出現(xiàn)一條較強(qiáng)和較弱的條帶，分別與抗體重、輕鏈實(shí)際大小相符， 說(shuō)明純化得到的蛋白是抗體蛋白。
實(shí)施例三、酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立(試劑盒組成及操作方法)
1. 4金測(cè)方法的原理基于竟?fàn)幮悦嘎?lián)反應(yīng)原理，相關(guān)的巖沙?？舅豍TX包被于微孔板上，吸 附在孔內(nèi)的抗原與被測(cè)試的樣品中的抗原竟?fàn)幮耘cPTX單克隆抗體相結(jié)合。當(dāng) 樣品抗原相結(jié)合的抗體被洗涂去除后，只剩下與《鼓孔內(nèi)抗原相結(jié)合的抗體， 與經(jīng)酶標(biāo)記的二抗相結(jié)合，酶底物在酶作用下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，加酸鄉(xiāng)冬止反應(yīng)， 在450nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值。OD值的大小與樣品中PTX的含量成反比。
2. ;險(xiǎn)測(cè)方法的材料
2.1儀器酶標(biāo)儀、水浴箱、酶標(biāo)《敬孔板。
2.2主要試劑巖沙?？舅貥?biāo)準(zhǔn)品、抗PTX-KLH的單克隆抗體、包被液 (PH7.4 0.01MPBS )、封閉液(5%BSA/0.01MPBS )、洗滌液(0.01MPBS/0.05% Tween20,PBS-T)、抗體稀釋液(1%BSA/PBS-T) 、 TMB顯色液、2MH2S04、 HRP-羊抗鼠IgG
3. 操作程序
(1) 包被用PH7.4 PBS緩沖液按需稀釋PTX，以100jul/孔的PTX加入到96 孔酶標(biāo)板中，置4。C冰箱過(guò)夜；
(2) 甩干板孔中液體，然后向孔中加入PBS-T洗滌緩沖液,每孔300nl，放 置搖床上輕輕晃動(dòng)3min,棄去洗液，拍干，重復(fù)洗板4次；
(3) 用封閉液300pl/孔，37。C水浴封閉2h;
(4) 洗板4次，操作同(2),加樣品提取液(或標(biāo)準(zhǔn)液)50nl/孔和已稀 釋的單抗50iil/孔，37。C水浴放置lh;
(5) 洗板3次，操作同(2);
(6) 加入已稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，每孔100ial， 37。C水浴;^文置lh, 洗板3次；
(7) 加入TMB顯色液，每孔100pl， 37。C顯色30min; (8 ) 2M H2SO4終止液終止顯色反應(yīng),每孔50^il;
(9)酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。
ii4.結(jié)果計(jì)算
巖沙?？舅氐臐舛劝聪旅娴墓接?jì)算
巖沙海葵毒素PTX濃度(ng/g) = " m
式中
c一PTX含量，單位為納克(ng)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線按數(shù)值插入法求； Vl—樣品提取液的體積，單位為毫升(mL); V2—滴加樣液的體積，單位為毫升(mL); D一稀釋倍數(shù)；
m—試樣質(zhì)量，單位為克(g) 實(shí)施例四、單克隆、多克隆抗體ELISA間接法測(cè)定巖沙?？舅氐谋容^ 1.材料與方法
1.1 PTX免疫抗原與檢測(cè)抗原的制備
在PH7.5, 0.1M PBS: DMS0=19: 1的混合液中加入20pg PTX和12pg 的SPDP, 4。C水箱過(guò)夜?；旌衔锛尤氲攘緾H2CL2萃取3次，取水層部分過(guò) 5mlSephadexG-25預(yù)裝柱，用含0.1MNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脫，收集 最大吸收波長(zhǎng)在263nm下的洗脫液。
在0.025M, PH9.0硼酸鹽緩沖液中加入45叫KLH蛋白和50倍摩爾濃度 (2畫iminothiolate: KLH)的2-亞氨基硫醇鹽(2-iminothiolate )， 4。C冰箱過(guò)夜。 混合物過(guò)截留分子量為30K的超濾管，取上層管液體，在分光光度計(jì)下檢測(cè) KLH-SH最大吸收波長(zhǎng)278nm下的洗脫液，并凍干。BSA-SH的制備跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脫液，并凍干。
免疫抗原將PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解于PH7.5,0.1MPBS 中，體積分別為lml、 0.5ml、 0.5ml。然后BSA-SH和KLH-SH都分別加入到 等體積的PTX-PDP溶液中，4。過(guò)夜。然后再過(guò)5ml Sephadex G-25預(yù)裝柱， 用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脫，收集分光光度計(jì)檢測(cè)下收集最大吸收波長(zhǎng)為267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波長(zhǎng)為273nm的
PTX-PDP-BSA。
1.2抗PTX多克隆抗體的制備
將PTX-PDP-KLH按常規(guī)方法免疫雌性6 8周齡BALB/C小鼠。經(jīng)親和層 析處理得到與KLH和BSA無(wú)交叉反應(yīng)性的抗血清。 1.3抗PTX單克隆抗體的制備按常規(guī)方法制備。 1.4多克隆、單克隆抗體EUSA間接測(cè)定方法
(1) 用濃度梯度的PTX檢測(cè)抗原加入到96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)濃度做2個(gè) 孔，置4'C冰箱過(guò)夜；
(2) 甩干板孔中液體，然后向孔中加入PBS-T洗滌緩沖液,每孔 放置搖床上輕輕晃動(dòng)3min,棄去洗液，拍干，重復(fù)洗板4次；
(3 )用封閉液300ixl/孔,37 °C水浴封閉2h;
(4) 洗板4次，操作同(2)，在同樣濃度的孔中分別加入單克隆抗體和 多克隆抗體，在37t水浴放置lh;
(5) 洗板3次,操作同(2);
(6) 加入已稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，每孔100nl， 37。C水浴放 置lh,洗板3次；
(7 )加入TMB顯色液，每孔100|li1， 37。C顯色30min;
(8) 2MH2SCM冬止液終止顯色反應(yīng)，每孔50ixl;
(9) 酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。 2結(jié)果與討論
結(jié)果顯示PTX濃度0.5mg/L時(shí)單抗法結(jié)果高于多抗法。出現(xiàn)這樣的原 因主要是因?yàn)閱慰寺】贵w是由生長(zhǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的同一 B淋巴細(xì)月包的群體 合成并分泌的，因此所有的抗體識(shí)別的是同一個(gè)抗原決定簇。
此外，由于單克隆抗體是針對(duì)抗原某一抗原決定簇分泌的，不同于多克隆抗體，是多個(gè)不同克隆的B細(xì)胞產(chǎn)生的，是多種抗體的混合物，因此能夠
避免了因動(dòng)物之間的同源性而導(dǎo)致的交叉反應(yīng)，從而確保了結(jié)果的真實(shí)可靠。 另外，分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞能夠在體外"永久"地存活并傳代， 只要不發(fā)生細(xì)胞林的基因突變，就可以不斷的生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗 體，而不同于多克隆抗體，每次必須要對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后才能得到。巖沙海 葵毒素樣品價(jià)格昂貴，供貨來(lái)源少，其免疫抗原的制備工序復(fù)雜，可重復(fù)性
不高。使得多克隆抗體的方法不適合用于巖沙海葵毒素的實(shí)際;險(xiǎn)測(cè)中，而更
凸現(xiàn)單克隆抗體技術(shù)在PTX檢驗(yàn)中的重要性。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本 發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)生抗巖沙海葵毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CCTCC No.C200922。
2、 一種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體，所述單克 隆抗體特異性地抗巖沙?？舅亍?br> 3、 一種巖沙海葵毒素檢測(cè)試劑盒，其包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
4、 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系在檢測(cè)巖沙?？舅刂械膽?yīng)用。
5、 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測(cè)巖沙海葵毒素中的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求3所述的試劑盒在檢測(cè)巖沙?？舅刂械膽?yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種特異性的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系，及含有該單克隆抗體的試劑盒和在檢測(cè)PTX毒素檢測(cè)中的用途。本發(fā)明涉及的雜交瘤細(xì)胞系，保藏在CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC No.C200922。本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)的方法，用于鑒別高致中毒性?？N群以及測(cè)定供人類使用的海產(chǎn)品里PTX的含量分布，可以有效地減輕或避免PTX中毒事件的發(fā)生。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101597596SQ20091003986
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者戴悅嬋, 紅 焦, 王家驥, 陳思強(qiáng) 申請(qǐng)人:焦 紅;王家驥;陳思強(qiáng);戴悅嬋