專利名稱：長翼蝠瘦素蛋白及其cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及瘦素蛋白，具體涉及一種來源于長翼蝠的瘦素蛋白及其cDNA序列。
背景技術(shù)：
瘦素蛋白(leptin)是1994年發(fā)現(xiàn)的一個由167個氨基酸組成的小蛋白，由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素，目前研究結(jié)果已經(jīng)證實其它組織也能產(chǎn)生，包括胎盤、大鼠的骨胳肌、大鼠的胃、人的乳腺上皮細胞、人和鼠的腺垂體等。 瘦素蛋白是肥胖相關(guān)的信號，脂肪組織的反饋信號作用到腦中心，控制飲食行為和活動(代謝和運動)，是ob(obese)基因的產(chǎn)物。脂肪組織產(chǎn)生的瘦素蛋白經(jīng)血液運輸?shù)侥X，與下丘腦的受體作用后通過控制飲食攝入和能量消耗來控制哺乳動物的體重，被認(rèn)為是最具有潛力的減肥藥物之一。 瘦素蛋白除了能夠降低食欲，控制體重，減少體內(nèi)脂肪含量外，還可傳遞動物體內(nèi)外能量貯存信號到大腦中樞，影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進動物生殖系統(tǒng)發(fā)育和獲得生育能力，調(diào)控動物初情期的啟動、性成熟和妊娠等生殖活動，調(diào)節(jié)胎兒胎盤，使動物提前發(fā)情，縮短發(fā)情周期，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，脂類代謝，調(diào)節(jié)血壓、大腦和骨骼發(fā)育，傷口愈合，細胞分化增殖，參與造血作用，機體免疫調(diào)節(jié)等功能。瘦素功能的多樣性尤其在能量調(diào)節(jié)方面的關(guān)鍵作用，也賦予瘦素更大的產(chǎn)品開發(fā)的價值。 瘦素蛋白的開發(fā)和利用已深入到許多領(lǐng)域包括減肥藥物的開發(fā)以及減肥產(chǎn)品的深加工，治療糖尿病藥物開發(fā)，治療高血壓藥物開發(fā)，治療脂肪肝藥物開發(fā)等等，隨著對其功能認(rèn)識的不斷深入，關(guān)于leptin產(chǎn)業(yè)化前景將更加廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于長翼蝠(Miniopteras fuliginosus)的瘦素蛋白，為今后開發(fā)瘦素基因工程產(chǎn)品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個目的在于提供含有上述瘦素蛋白完整編碼區(qū)的cDNA序列。
本發(fā)明的上述目的通過如下方案予以實現(xiàn) 本發(fā)明提供一種瘦素蛋白，該瘦素蛋白為如下 或(ii)所述任一項的蛋白質(zhì)
(i) —種具有SEQ ID NO : 3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所
組成，且與氨基酸序列 的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的瘦素蛋白優(yōu)選具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還提供編碼上述瘦素蛋白的cDNA序列，該cDNA序列為編碼如下 或
(ii)所述任一項蛋白質(zhì)的cDNA序列 (i) —種具有SEQ ID NO : 3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列 的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。 上述編碼瘦素蛋白的cDNA序列優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
本發(fā)明的瘦素蛋白來自于長翼蝠(Miniopteras fuliginosus)，提取長翼蝠脂肪組織總RNA反轉(zhuǎn)錄后作為模板，根據(jù)已知哺乳動物瘦素蛋白序列保守區(qū)設(shè)計簡并引物進行簡并PCR擴增，測序后得到本發(fā)明瘦素蛋白的全長cDNA序列，并對該全長cDNA序列進行氨基酸分析，得到本發(fā)明長翼蝠瘦素蛋白為SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列，總共167個氨基酸，其中前21個氨基酸為信號肽序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點 l.本發(fā)明從長翼蝠的脂肪組織中獲得了一種瘦素蛋白的全長cDNA，并進行了蛋白表達，通過利用GST重組表達技術(shù)和凝血酶酶切除去GST標(biāo)記物，成功獲得了長翼蝠瘦素蛋白，此外對該蛋白進行細胞活性分析，結(jié)果表明本發(fā)明的長翼蝠瘦素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用于制備減肥藥物、治療糖尿病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等； 2.本發(fā)明的瘦素蛋白是來源于長翼蝠的，而長翼蝠是一種冬眠動物，冬眠動物較之其他動物能更加好的增加體內(nèi)能量使用率，使其燃燒更多脂肪，從而使體內(nèi)脂肪控制在一定量，因此來源于冬眠動物長翼蝠的瘦素蛋白也具有更加好的脂肪降解能力。


圖1為長翼蝠瘦素蛋白全長cDNA序列的PCR擴增電泳圖； 其中，l為分子量標(biāo)記，2為PCR擴增產(chǎn)物； 圖2為實施例2中重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測電泳圖； 其中，1為重組表達菌未誘導(dǎo)對照樣品，2為重組表達菌IPTG誘導(dǎo)3h后樣品，
3為分子量標(biāo)記，箭頭所指處為新的表達條帶； 圖3為實施例3中蛋白表達的SDS-PAGE檢測電泳圖； 其中，1為過柱純化但未經(jīng)凝血酶切對照樣品，2為分子量標(biāo)記，3為過柱純化
且經(jīng)凝血酶切的樣品，4為GST， 5為瘦素蛋白； 圖4為長翼蝠瘦素蛋白MTT活性檢測結(jié)果柱狀圖； 其中，1為GST對照組，2為長翼蝠瘦素蛋白組，3為空白對照組，**:P
< 0.01 ; 圖5為長翼蝠瘦素蛋白LDH活性檢測結(jié)果柱狀圖； 其中，1為GST對照組，2為長翼蝠瘦素蛋白組，3為空白對照組，**:P
< 0.01。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。 實施例1長翼蝠瘦素蛋白全長cDNA序列的獲得
1、模板制備按照RNAiso試劑盒(TakaRa公司)說明書提取長翼蝠(Miniopteras fuliginosus)脂肪組織總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以該總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄試驗得到下述
PCR擴增用模板。 2、引物設(shè)計 根據(jù)已知的哺乳動物瘦素蛋白序列保守區(qū)設(shè)計簡并引物，如下所示
Primer 1，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示；
Primer 2，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 5所示。
3、 PCR擴增 PCR擴增反應(yīng)體系(50 ii 1) : PCR擴增模板2 ii 1，引物Primer 1/Primer 2(10pM)各 1 ii 1， 10 X Taq Polymerase mix(TaKaRa公司)5 ii 1， ddH20 41 ii 1 ;PCR擴增反應(yīng)條件94t:預(yù)變性5min， 94。C變性lmin， 54"退火90s， 72。C延 伸2min， 30個循環(huán)，最后72"C延伸5min。
4、 PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和測序 將上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)操作后克隆入pMD-19T載體 (市售)，陽性克隆經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定后，送測序公司進行測序，同時對測序結(jié)果 進行氨基酸序列分析。 測序結(jié)果及氨基酸序列分析結(jié)果表明，本實施擴增所得長翼蝠瘦素蛋白的全長 cDNA為504bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示，該cDNA序列編碼167個氨基酸 編碼，其氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示，其中前21個氨基酸為信號肽序列。
實施例2重組表達載體的構(gòu)建 根據(jù)實施例1所得長翼蝠瘦素蛋白基因序列設(shè)計引物(Pl和P2)，擴增不含信號 肽序列的全部編碼區(qū)，并引入BamH I/Sal I限制酶切位點用于重組表達載體的構(gòu)建。
Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 6所示；
P2，其核苷酸序列如SEQIDNO : 7所示。 上述PCR擴增反應(yīng)體系可參照PCR反應(yīng)試劑盒說明書，其具體反應(yīng)條件為 94。C預(yù)變性5min， 94。C變性lmin， 55。C退火90s， 72。C延伸2min， 30個循環(huán)，最后72°C 延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，可見到清晰的目的片段擴增條帶，如圖l所 示，擴增出的片段長度約440bp，與設(shè)計的擴增片段長度相符，且未出現(xiàn)非特異性擴增。
將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收后，用BamHI和SalI于37。C消化過夜，隨 后與PGEX-4T-2載體(Invitrogen)連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，挑選陽性克隆進行測序，測序 結(jié)果與原序列相同，表明擴增克隆后的基因未發(fā)生突變，而且開放閱讀框架(ORF)與載 體ORF—致，融合蛋白約375個氨基酸(含GST)，理論分子量為42kDa。
將上述經(jīng)測序驗證序列讀碼框正確的陽性克隆轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌BL21(市售) 內(nèi)，經(jīng)lmmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)3h，將重組表達菌誘導(dǎo)前、后菌體裂解 物一起經(jīng)SDS-PAGE檢領(lǐng)"電泳檢測結(jié)果如圖2所示，與重組表達菌誘導(dǎo)前的SDS-PAGE 電泳圖對比后，發(fā)現(xiàn)重組表達菌誘導(dǎo)后在42kDa處出現(xiàn)了一條新的表達條帶(圖中箭頭所 指條帶)，該條帶的分子量大小與理論推導(dǎo)值相符，說明誘導(dǎo)表達產(chǎn)物為GST-Leptin重組 蛋白。本實施例所涉及的膠回收、雙酶切消化、載體連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化以及IPTG誘
導(dǎo)表達等技術(shù)均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作。
實施例3蛋白表達與純化 將實施例2中制備得到的含有長翼蝠瘦素蛋白基因重組表達質(zhì)粒陽性克隆的大 腸桿菌BL21，按l : IOO(菌液LB+培養(yǎng)基，體積比)接種于含有氨芐青霉素的LB+培 養(yǎng)基(酵母提取物5g，蛋白胨10g，瓊脂15g， NaC15g， ddH20至1升，pH = 7.4，氨芐 抗生素1% )中，37°C， 190rpm，培養(yǎng)約3h。 當(dāng)OD60。 = 0.6 1時，加入IPTG至工作 濃度為0.6mM，于28t:， 190rpm，誘導(dǎo)3h。將上述誘導(dǎo)后的菌液于5000g， 4t:離心10min，菌體用PBS洗2遍，期間 5000g， 4t:離心10min;按照每2 5ml菌液加入28ml裂解液、50iU溶菌酶、30 40iU 苯甲基磺酰氟(PMSF)(終濃度100 ii M)對菌體裂解0.5 lh ;裂解好的菌體于4t:或冰浴 破碎(工作時間3s，隔時間5s， 300W)150次，約20 25min，然后于4。C離心(12000g， 10min)收集上清；上清用0.45 y m慮膜過濾后，作為下一步GST親和純化的上樣品。
本實施例的GST親和純化的填料采用High-Affinity GST Resin(市售)，其純化具 體操作可參考相關(guān)試劑說明書填料4ml，先用25 30ml PBS洗柱，然后加入前述已制 備好的上樣品過柱，流速控制2 4s/滴；再用20倍柱床體積的PBS清洗純化柱；還原 型谷胱甘肽洗脫新鮮配制0.154g谷胱甘肽+50mlTris-HCl(50mM， PH8.0)，每次3ml， 流速4 5s/滴；最后用PBS清洗純化柱3次。對上述過柱樣品進行超濾濃縮，可采用5000rpm， 4。C離心30min。
按照每lmg蛋白加入IOU凝血酶比例，采用凝血酶(市售)對上述濃縮樣品進行 常溫酶切3h，酶切后的產(chǎn)物再次進行親和純化以去除GST(具體操作同前述的GST親和純 化)，回收過柱樣品再次進行超濾濃縮(操作同前)，從而最終得到長翼蝠瘦素蛋白。將 該濃縮上清液、進行凝血酶酶切的樣品一起進行SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖3所示， 從圖3可以看出，過柱純化且經(jīng)過凝血酶酶切后的樣品得到兩條帶， 一條在26KD位置， 根據(jù)現(xiàn)有材料可知該條帶為GST(GST的分子量為26KD)，另外一條帶在16KD的位置， 這與理論值(本發(fā)明的瘦素蛋白不含信號肽的成熟肽序列為146個氨基酸，而146個氨基 酸編碼蛋白約為16KD)相符，說明長翼蝠瘦素蛋白與GST標(biāo)簽成功分離，同時蛋白濃度 檢測結(jié)果也表明分離、回收的長翼蝠瘦素蛋白濃度和純度達到細胞實驗要求。
實施例4細胞活性分析 本實施例首先采用傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)的操作培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，然后以培養(yǎng)好 的3T3-L1前脂肪細胞作為實驗樣品，對實施例3分離純化出的長翼蝠瘦素蛋白(16KD)進 行MTT檢測和LDH檢測。 本實施例的MTT檢測以及LDH檢測，均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，將 長翼蝠瘦素蛋白(10—6M)孵育3T3-L1前脂肪細胞24h，同時每個檢測均設(shè)兩個平行實驗對 照， 一個是不含3T3-L1前脂肪細胞的空白對照組， 一個是采用GST(10-6M)孵育3T3-L1 前脂肪細胞24h的對照組。
細胞活性分析結(jié)果 1.圖4給出長翼蝠瘦素蛋白MTT活性檢測結(jié)果，從圖中可以看出，空白對照組 的數(shù)據(jù)為0，用長翼蝠瘦素基因重組蛋白(10-SM)孵育3T3-Ll前脂肪細胞24h后，活細胞 比率(MTT)下降19.6%，與GST對照組(6.6% )相比差異極顯著(P < 0.01);
2.圖5給出長翼蝠瘦素蛋白LDH活性檢測結(jié)果，從圖中可以看出，空白對照組的數(shù)據(jù)為0，用長翼蝠瘦素基因重組蛋白(10-SM)孵育3T3-Ll前脂肪細胞24h后，脂肪細 胞的乳酸脫氫酶釋放比率(LDH)顯著升高(6.2% )，明顯高于GST對照(0.2% )(P < 0.01)。
根據(jù)圖4和圖5的對比結(jié)果，說明本發(fā)明的長翼蝠瘦素蛋白具有明顯的脂肪降解 活性。 <110>廣東省昆蟲研究所 <120>長翼蝠瘦素蛋白及其cDNA序列 <130> <160>7 <170>PatentIn version 3.5 <210>1 <211>504 <212>DNA <213>長翼蝠(Miniopteras fuliginosus) <400>1 atgcgttgcg gactcctgtg ccaattcctg tggctttggc cctatctgtt ctgtacagaa 60 gctgcgccca tccaaaaagt ccaggatgac accaaaaccc tcatcaagac gattgtcacc 120 agaatcaatg acatttcaca cacgcggtca gtctcctcca aacagagggt caccggtttg 180 gacttcattc ctgggctcta ccctgtcctg agtttgtcca agatggacca gacattggcg 240 atttaccaac agatcctcac cagcctgcct tctggaaatg tgctccaaat atctaatgac 300 ctggagaacc tccgggacct tctccacctg ctggcctcct ccaacagctg ccccttcccc 360 cggaccaggg gtctgaagac cttggagggc ctgggtgatg tcctggaagc ttcactctat 420 tccacagagg tggtggtcct gagcaggctg cagggatctc tgcaggacat gctacagcag 480 ttggacttca gccctggatg ctga 504 <210>2 <211>504 <212>DNA <213>長翼蝠(Miniopteras fuliginosus) <220> <221>CDS <222>(1)..(501) <400>2 atg cgt tgc gga etc ctg tgc caa ttc ctg tgg ctt tgg ccc tat ctg 48 Met Arg Cys Gly Leu Leu Cys Gin Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 15 ttc tgt aca gaa get gcg ccc ate caa aaa gtc cag gat gac acc aaa 96 Phe Cys Thr Glu Ala Ala Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
長翼蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列.txt SEQUENCE LISTING
acc ctc atc aag acg att gtc acc aga atc aat gac att tca cac acg144[Ol 02]Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
354045[Ol 043 cgg tca gtc tcc tcc aaa cag agg gtc acc ggt ttg gac ttc att cct192[Ol 05-1 Arg Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
505560[Ol 07] ggg ctc tac cct gtc ctg agt ttg tcc aag atg gac cag aca ttg gcg240
Gly Leu Tyr Pro Val Leu Ser Leu Ser Lys MetAsp Gln Thr LeuAla
65707580
att tac caa cag atc ctc acc agc ctg cct tct gga aat gtg ctc caa288
Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gly Asn Val Leu Gln
859095
ata tct aat gac ctg gag aac ctc cgg gac ctt ctc cac ctg ctg gcc336
Ile SerAsnAsp Leu GluAsn LeuArgAsp Leu Leu His Leu LeuAla
100105110
tcc tcc aac agc tgc CCC ttc CCC cgg acc agg ggt ctg aag acc ttg384
Ser SerAsn Ser Cys Pro Phe Pro Arg ThrArg Gly Leu Lys Thr Leu
115120125
gag ggc ctg ggt gat gtc ctg gaa gct tca ctc tat tcc aca gag gtg 432
Glu Gly Leu GlyAsp Val Leu GluAla Ser Leu Tyr Ser Thr GluVal
130135140[Ol 22] gtg gtc ctg agc agg ctg cag gga tct ctg cag gac atg cta cag cag 480[Ol 23] Val Val Leu SerArg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Gln Gln
145150155160
ttg gac ttc agc cct gga tgc tga504[Ol 26]LeuAsp Phe Ser Pro Gly Cys
165
<210>3
<2l 1>167
<212>PRT[Ol 31]<2 1 3>長翼蝠fMiniopterus fuliginosus)
<400>3
MetArg Cys Gly Leu Leu Cys Gln Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu
l51015[Ol 35]Phe Cys Thr Glu Ala Ala Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
202530[Ol 37]Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
354045[Ol 39] Arg Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60Gly Leu Tyr Pro Val Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala6570 75 80lie Tyr Gin Gin lie Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gly Asn Val Leu Gin85 90 95lie Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Ser Ser Asn Ser Cys Pro Phe Pro Arg Thr Arg Gly Leu Lys Thr Leu115 120 125Glu Gly Leu Gly Asp Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Val Leu Sei. Arg Leu Gin Gly Sei. Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin145 150 155 160Leu Asp Phe Ser Pro Gly Cys165<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>4aagaagmmsa tccyrggrag ga犯atg<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5wgrccttyra rrcytcagca yycag<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6ccggatccgc gcccatccaa aa敏c<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7ccgtcgactc agcatccagg gctg
權(quán)利要求
一種瘦素蛋白，該瘦素蛋白為如下(i)或(ii)所述任一項的蛋白質(zhì)(i)一種具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述瘦素蛋白，其特征在于該瘦素蛋白具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述瘦素蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)氨基酸序列中的前21個氨基 酸為信號肽序列。
4. 一種編碼瘦素蛋白的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列編碼如下 或(ii)所 述任一項蛋白質(zhì) —種具有SEQ ID NO : 3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組 成，且與氨基酸序列 的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列具有SEQ ID NO : 1 所示核苷酸序列。
6. —種含有權(quán)利要求4所述cDNA序列的質(zhì)粒。
7. —種含有權(quán)利要求6所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種長翼蝠的瘦素蛋白及其cDNA序列，該瘦素蛋白為一種具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用GST重組表達技術(shù)和凝血酶酶切除去GST標(biāo)記物，從冬眠動物——長翼蝠中提取得到瘦素蛋白，細胞活性分析結(jié)果表明該長翼蝠瘦素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用于制備減肥藥物、治療糖尿病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等。
文檔編號C07K14/435GK101691402SQ200910039439
公開日2010年4月7日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者何靈江, 原麗紅, 左學(xué)國, 張樹義, 林本夫, 陳金平 申請人:廣東省昆蟲研究所