專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物、其修飾方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物、其修飾方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，各種活性蛋白及細(xì)胞因子相繼被開(kāi)發(fā)成藥物應(yīng)用于臨床。而將蛋白類(lèi)藥物制成合適的劑型，以保護(hù)其免受外部環(huán)境的破壞，延長(zhǎng)藥物半衰期，降低毒副作用成為一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。其中，將蛋白質(zhì)PEG化的研究成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。這是近三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)，它將活化的聚乙二醇分子鍵合到蛋白質(zhì)分子表面上，影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。研究證實(shí)，通過(guò)共價(jià)鍵用PEG來(lái)修飾蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基可以有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性，提高血漿半衰期，減少給藥次數(shù)。2000年中山大學(xué)生命科學(xué)院從我國(guó)南海側(cè)花?？|手毒腺cDNA文庫(kù)中篩選的一種具有顯著增強(qiáng)心肌收縮作用的活性肽?？念?lèi)毒素rhk2a，后通過(guò)基因工程技術(shù)成功表達(dá)了這種活性肽，并在專(zhuān)利號(hào)為ZL02134651.8、發(fā)明名稱(chēng)為一種?？?xì)胞毒素基因、其編碼的蛋白及應(yīng)用的中國(guó)專(zhuān)利中詳細(xì)論述了所述蛋白質(zhì)。4有關(guān)?？窠?jīng)毒素rhk2a的藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，?？念?lèi)毒素rhk2a對(duì)心臟有非常專(zhuān)一的作用靶點(diǎn)，能和細(xì)胞膜上電壓依賴(lài)性鈉通道結(jié)合，延遲鈉通道的失活，通過(guò)間接的鈉鈣交換，增加胞內(nèi)鈣離子濃度，從而對(duì)心肌組織產(chǎn)生非常強(qiáng)的正性肌力作用，且對(duì)心率和血壓沒(méi)有明顯影響。經(jīng)豚鼠、兔、犬等多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明，rhk2a能夠明顯增加心肌收縮力，作用強(qiáng)度約為洋地黃類(lèi)強(qiáng)心藥西地蘭的3.5倍。所以，海葵肽類(lèi)毒素rhk2a在治療充血性心力衰竭方面有極好的應(yīng)用前景。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射rhk2a后1小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)四肢痙攣，最后呼吸停止、死亡。另海葵肽類(lèi)毒素rhk2a穩(wěn)定性差，增強(qiáng)心肌收縮的作用時(shí)間小于1個(gè)小時(shí)，導(dǎo)致至今仍無(wú)法應(yīng)用于臨床，詳見(jiàn)歐陽(yáng)平等在第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，(1)中有關(guān)重組?？念?lèi)毒素rhk2a對(duì)急性心功能不全犬左心功能的影響論述；劉彥波等在第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，(3).中有關(guān)重組?？念?lèi)毒素rhk2a對(duì)慢性充血性心力衰竭新西蘭兔左心功能的影響的論述；以及2004年中山大學(xué)的王磊關(guān)于重組?？窠?jīng)毒素在大腸桿菌中高表達(dá)、純化、活性、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理的研究中都作了相關(guān)論述。另一方面，rhk2a對(duì)小鼠的LD50值為1.4mg/kg，以往研究顯示，?？舅谹p-A、Ap-B對(duì)小鼠的LD50分別為66iig/kg和8ug/kg(Notron，1991)，相比較而言，rhk2a的毒性相對(duì)較低，說(shuō)明其具有重要的臨床價(jià)值。修飾是一種解決毒性的途徑。隨著被修飾蛋白質(zhì)多肽種類(lèi)的增加，發(fā)現(xiàn)最初的隨機(jī)修飾方法對(duì)某些蛋白質(zhì)多肽藥物的改善并不能達(dá)到預(yù)期的效果，如成分復(fù)雜、分離困難、活性大大下降、有效成分少。進(jìn)而研究人員發(fā)現(xiàn)通過(guò)定點(diǎn)修飾方式、PEG修飾劑和反應(yīng)pH等的優(yōu)化選擇可以避免隨機(jī)修飾的盲目性，這樣既不影響蛋白質(zhì)多肽活性中心結(jié)構(gòu)，又能選擇性干擾某些抗原位點(diǎn)，從而達(dá)到特定的修飾目的。PEG定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)多肽的方式據(jù)所修飾基團(tuán)的不同，主要可分為4類(lèi)(l)N端氨基定點(diǎn)修飾；(2)巰基定點(diǎn)修飾；(3)氨基定點(diǎn)修飾；(4)糖類(lèi)殘基和N端氧化后定點(diǎn)修飾?，F(xiàn)階段主要以巰基和N端氨基定點(diǎn)修飾為主，如2006年申請(qǐng)美國(guó)專(zhuān)利的PEG化粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)和PEG化白細(xì)胞介素一IO(PEG-IL-IO)便是N端氨基定點(diǎn)修飾產(chǎn)物，干擾素e(IFN-e)的巰基定點(diǎn)修飾在2003年申請(qǐng)了美國(guó)專(zhuān)利。但目前仍沒(méi)有見(jiàn)到有關(guān)對(duì)重組?？念?lèi)毒素rhk2a進(jìn)行修飾以降低其毒性的技術(shù)報(bào)道，因此，如何獲得可行的技術(shù)方案，通過(guò)rhk2a進(jìn)行修飾獲得低毒穩(wěn)定的重組?？窠?jīng)毒素，改善該蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)以提高體內(nèi)外穩(wěn)定性及給藥便利程度，使rhk2a發(fā)揮重要的臨床應(yīng)用，一直是研究的重點(diǎn)和迫切點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，以滿(mǎn)足重組?？窠?jīng)毒素rhk2a在臨床應(yīng)用方面的需求。本發(fā)明另一個(gè)目的是具體提供所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a修飾產(chǎn)物的修飾方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a修飾產(chǎn)物在制備高效低毒的治療充血性心力衰竭藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)提供一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，是在重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a的氨基N末端單一位點(diǎn)特異性連接一條聚乙二醇鏈制備得到。所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a是由中山大學(xué)生命科學(xué)院提供的重組?？窠?jīng)毒素rhk2a，相關(guān)內(nèi)容在發(fā)明名稱(chēng)為"一種?？?xì)胞毒素基因、其編碼的蛋白及應(yīng)用"，專(zhuān)利號(hào)為ZL02134651.8的專(zhuān)利中有詳細(xì)描述。所述的聚乙二醇鏈的分子量為500020000。所述聚乙二醇鏈來(lái)自于活化聚乙二醇或其衍生物，其衍生物優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。本發(fā)明同時(shí)提供了所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a修飾產(chǎn)物的修飾方法，包括以下步驟(1)將重組?？窠?jīng)毒素rhk2a溶解于醋酸鹽緩沖液中；(2)加入活化聚乙二醇或其衍生物，攪拌反應(yīng)l小時(shí)；(3)加入還原劑反應(yīng)615小時(shí)；(4)采用離子交換色譜柱進(jìn)行色譜分離，即得聚乙二醇定點(diǎn)修飾重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a。步驟(1)所述醋酸鹽緩沖液的濃度為0.02M，pH值為3.56.0，優(yōu)選pH值為4.0。步驟(2)所述活化聚乙二醇或其衍生物的加入量按照其與重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a的摩爾比為130確定。步驟(3)所述還原劑為氰基硼氫化鈉，氰基硼氫化鈉加入后的終濃度為0.020.16mol/ml;優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為812小時(shí)。步驟(4)所述色譜分離采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱，修飾反應(yīng)混合物在含0.30.6MNaCl醋酸鹽緩沖液中洗脫。修飾反應(yīng)按下式進(jìn)行其中H2N-R為重組?？窠?jīng)毒素rhk2a。mPEG為CH30-(CH2CH20)n-CH2CH20H;其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫(xiě)，n=442200;R代表去除一個(gè)氨基(NH2)的重組?？窠?jīng)毒素rhk2a分子。本發(fā)明所述的重組?？窠?jīng)毒素rhk2a修飾產(chǎn)物可應(yīng)用于制備高效低毒的治療充血性心力衰竭藥物方面。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明提供了一種重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a修飾產(chǎn)物，修飾產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單、活性回收率高，聚乙二醇定點(diǎn)修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a在治療充血性心力衰竭方面有極好的應(yīng)用前爭(zhēng)(2)本發(fā)明提供的重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a修飾方法簡(jiǎn)單易行，最終獲得的聚乙二醇定點(diǎn)修飾重組?？窠?jīng)毒素rhk2a純度大于90%。圖1修飾產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果圖2修飾產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果圖3修飾產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為修飾產(chǎn)物的離子交換柱層析分離圖圖5聚乙二醇修飾?？委熜乃ツＰ托膬?nèi)壓示意圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例l修飾方法的條件確定1、反應(yīng)pH值的選擇分別用pH值為3.5、4.0、5.0、6.0、的0.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液lml，分別加入摩爾比為1:5的單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)，室溫下攪拌1小時(shí)混合后，分別加入1M氰基硼氫化鈉0.02ml攪拌反應(yīng)，在反應(yīng)8h后反應(yīng)物進(jìn)行修飾率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表l所示，在pH值分別為3.5、4.0、5.0、6.0的緩沖液中反應(yīng)都能得到聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a，其中緩沖液pH值為4.0的修飾率最高。表l緩沖液pH值3.54569修飾率(％)53.857.7727.9427.652、反應(yīng)時(shí)間的選擇pH值4.0的0.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液lml，加入摩爾比為1:5的單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)，室溫下攪拌l小時(shí)混合后，加入1M氰基硼氫化鈉0.02ml攪拌反應(yīng)，分別在反應(yīng)時(shí)間為6h、9h、12h、15h后對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行修飾率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2所示，反應(yīng)時(shí)間為6h、9h、12h、15h條件下反應(yīng)都能得到聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a，其中12h后修飾率沒(méi)有明顯提高。表2反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))691215修飾率(％)53.3360.8467.0267.553、活化聚乙二醇或其衍生物的加入量與重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的摩爾比選擇選擇單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用pH值4.O的O.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液lml，分別加入摩爾比為l:l、1:5、1:15、1:30的mPEG-ALD-5000，室溫下攪拌l小時(shí)混合，加入lM氰基硼氫化鈉0.02ml攪拌反應(yīng)，在反應(yīng)8h后反應(yīng)物進(jìn)行修飾率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3所示，表明在上述不同摩爾比下反應(yīng)都能得到聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a，其中隨著單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)同重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的摩爾比的提高，修飾率也得到提高。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4、單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)與還原劑氰基硼氫化鈉的摩爾比的選擇在pH值4.O的O.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液lml，加入摩爾比為l:5的mPEG-ALD-5000，室溫下攪拌l小時(shí)混合后，分別加入還原劑IM氰基硼氫化鈉O.02ml、0.040ml、0.08ml、0.16ml攪拌反應(yīng)，在反應(yīng)8h后反應(yīng)物進(jìn)行修飾率測(cè)定，比較表4結(jié)果表明在上述不同量還原劑條件下反應(yīng)都能得到聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a，其中當(dāng)還原劑氰基硼氫化鈉的添加量為O.08ml時(shí)，修飾率己達(dá)到較高值，進(jìn)一步增加氰基硼氫化鈉的量修飾率也沒(méi)有明顯地增加。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例2修飾產(chǎn)物的分離和鑒定采用pH值4.O的O.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液2ml，加入摩爾比為l:5的10mg單甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)室溫下攪拌1小時(shí)混合，加入IM氰基硼氫化鈉O.08ml攪拌反應(yīng)12h，得反應(yīng)液l;采用pH值4.O的O.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液2ml，加入摩爾比為1:10的10mg單甲氧基聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-lOOOO)室溫下攪拌l小時(shí)混合，加入1M氰基硼氫化鈉O.08ml攪拌反應(yīng)12h，得反應(yīng)液2;采用pH值4.O的O.02M醋酸緩沖溶液配制lmg/ml的rhk2a溶液2ml，加入摩爾比為l:30的15mg活化聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)室溫下攪拌l小時(shí)混合，加入IM氰基硼氫化鈉O.08ml攪拌反應(yīng)12h，得反應(yīng)液3;取上述反應(yīng)液l、2和3，分別按照下述方法進(jìn)行修飾產(chǎn)物的分離和鑒定分別用截流分子量為1000的超濾膜超濾除鹽后，上柱分離。強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析法條件如下1)層析柱SP強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱，規(guī)格1.2cmX6cm2)緩沖液A:0.02MpH4.0的醋酸鹽緩沖液B:相應(yīng)pH值的緩沖液A+0.5MnaCl配制的洗脫液123)流速lml/min4)檢測(cè)波長(zhǎng)280nm5)梯度A100%—0%;B0%—50100%。6)收集收集不同時(shí)間洗脫物，超濾后凍干濃縮。每一種反應(yīng)液的分離鑒定操作結(jié)果分別得到三個(gè)洗脫峰，洗脫峰分別為多修飾聚乙二醇修飾的海葵神經(jīng)毒素rhk2a、單一修飾聚乙二醇修飾的海葵神經(jīng)毒素rhk2a和?？窠?jīng)毒素rhk2a。修飾產(chǎn)物的離子交換柱層析分離圖見(jiàn)附圖4所示。將上述三個(gè)洗脫峰適當(dāng)透析、濃縮，采用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)，分離膠12.5%，濃縮膠5%。修飾產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖1、2、3所示，附圖中，分別標(biāo)識(shí)為?？窠?jīng)毒素rhk2a、蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣以及經(jīng)柱層析分離后得到的聚乙二醇修飾的海葵神經(jīng)毒素rhk2a和未被修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a，表明分離效果良好。其中，附圖l中從左至右依次標(biāo)示為mPEG-5000修飾產(chǎn)物、?？舅?、蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣(MARKER)和層析分離產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果；附圖2中從左至右依次標(biāo)示為海葵毒素、mPEG-10000修飾產(chǎn)物、層析分離產(chǎn)物和蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣(MARKER)的檢測(cè)結(jié)果；附圖3中從左至右依次標(biāo)示為海葵毒素、mPEG-20000修飾產(chǎn)物、層析分離產(chǎn)物和蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣(MARKER)的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施例3修飾純化產(chǎn)物的RP-HPLC鑒定RP-HPLC法是基于溶質(zhì)、極性流動(dòng)相和固定相表面非極性基團(tuán)之間疏水相互作用建立的一種色譜分離模式。經(jīng)親水性聚乙二醇修飾后，蛋白質(zhì)其表面疏水基團(tuán)數(shù)量、種類(lèi)及分布發(fā)生改變，因而與固定相表面的非極性基團(tuán)之間的疏水相互作用就會(huì)不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。取純化分離后聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a凍干產(chǎn)物，用少量超純水溶解后，通過(guò)PR-HPLC法進(jìn)行分析鑒定。分析條件如下1)色譜柱watersSy腿etry300C18，規(guī)格250腿X4.6mm2)流動(dòng)相A:0.1%三氟乙酸(W/V)B:乙腈內(nèi)含O.1%三氟乙酸(W/V)3)流速1.0ml/min4)檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，215nm5)梯度洗脫程序見(jiàn)表5所示表5時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%0955351090記錄出峰時(shí)間、峰面積，以面積歸一化法計(jì)算相對(duì)百分含量作為聚乙二醇修飾的?？窠?jīng)毒素rhk2a純度的大小。結(jié)果說(shuō)明，所采用的純化分離方法最終獲得的聚乙二醇定點(diǎn)修飾重組?？窠?jīng)毒素rhk2a純度為90.33%。實(shí)施例4豚鼠在體心衰模型檢驗(yàn)聚乙二醇修飾神經(jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物強(qiáng)心活性的實(shí)驗(yàn)取體重300400g，每組68只的豚鼠，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后頸動(dòng)脈插管至心臟，以LVdp/dtmax作為收縮力指標(biāo)，靜脈恒速滴注3%戊巴比妥鈉后，LVdp/dtmax逐漸下降，當(dāng)下降到200400mmHg/s，5分鐘無(wú)上升傾向，視為形成急性心衰，然后靜脈恒速滴注所試藥物的濃度應(yīng)適當(dāng)，死亡時(shí)間以30min左右為宜。聚乙二醇修飾海葵治療心衰模型心內(nèi)壓示意圖見(jiàn)附圖5所示，從附圖3可看出，靜脈推注本發(fā)明聚乙二醇修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a后，心內(nèi)壓明顯升高，藥物具有明顯的強(qiáng)心活性。權(quán)利要求1、一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，其特征在于是在重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a的氨基N末端單一位點(diǎn)特異性連接一條聚乙二醇鏈制備得到。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，其特征在于所述的聚乙二醇鏈的分子量為500020000。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，其特征在于所述聚乙二醇鏈來(lái)自于活化聚乙二醇或其衍生物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物，其特征在于所述衍生物為單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。5、一種權(quán)利要求1所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物的修飾方法，其特征在于包括以下步驟(1)將重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a溶解于醋酸鹽緩沖液中；(2)加入活化聚乙二醇或其衍生物，攪拌反應(yīng)l小時(shí)；(3)加入還原劑反應(yīng)615小時(shí)；(4)采用離子交換色譜柱進(jìn)行色譜分離，即得聚乙二醇定點(diǎn)修飾重組?？窠?jīng)毒素rhk2a。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾方法，其特征在于步驟(1)所述醋酸鹽緩沖液的濃度為0.02M，pH值為3.56.0。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的修飾方法，其特征在于所述pH值為4.0。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾方法，其特征在于步驟(2)所述活化聚乙二醇或其衍生物的加入量按照其與重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的摩爾比為1:130確定。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾方法，其特征在于步驟(3)所述還原劑為氰基硼氫化鈉，氰基硼氫化鈉加入后的終濃度為0.020.16mol/ml;所述反應(yīng)時(shí)間為812小時(shí)。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾方法，其特征在于步驟(4)所述色譜分離采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱；修飾反應(yīng)混合物在含0.30.6MNaCl醋酸鹽緩沖液中洗脫。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物、其修飾方法及應(yīng)用。所述重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物是在重組海葵神經(jīng)毒素rhk2a的氨基N末端單一位點(diǎn)特異性連接一條聚乙二醇鏈制備得到。本發(fā)明修飾產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單、活性回收率高，聚乙二醇定點(diǎn)修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a在治療充血性心力衰竭方面有極好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C07K17/00GK101538330SQ20091003861公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者帆楊,潘育方,彤雷,慧黃申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院