專利名稱：一種?？窠?jīng)毒素基因Sr7及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種?？窠?jīng)毒素基因Sr7及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
?？?anthopleura)，屬腔腸動物門(soelenterata)，珊瑚綱(anthozoa)，是海洋中較原始的動物類。在長期的生物進化過程中，為了抵御敵害及捕獲食物，?？|手的刺絲囊能夠分泌多種?？舅?，基本上是多肽類毒素，對人和動物有多種生理活性作用。根據(jù)?？舅氐纳砉δ軐⑵浞譃?類?？窠?jīng)毒素、?？芗毎丶昂？涬x子通道抑制劑。
國外對?？窠?jīng)毒素的研究始于七十年代。1976年美國夏威夷大學(xué)Shibata等人從黃?？?Anthopleuraxanthogrammica)中分離純化了Ap-A和Ap-B二種毒素，發(fā)現(xiàn)有增強心肌收縮的作用；1977年，Tanaka等對Ap-A的氨基酸序列進行了測定；隨后，又有多種?？窠?jīng)毒素被發(fā)現(xiàn)，并做了氨基酸序列測定，以及二級、三級結(jié)構(gòu)的分析。1992年，Gallagher等根據(jù)天然的Ap-B的氨基酸序列，體外合成了編碼Ap-B的基因，在大腸桿菌中進行了重組表達，重組蛋白與天然的Ap-B在氨基酸組成、序列、二級結(jié)構(gòu)、高壓液相圖譜及生物活性方面相同。?？窠?jīng)毒素的藥理研究結(jié)果顯示，這類毒素專一地和鈉離子通道膜蛋白3位點結(jié)合，能延遲鈉通道的失活。一方面，毒素作為分子探針可用于鈉通道的生物學(xué)研究；另一方面，毒素對心肌組織產(chǎn)生非常強的正性收縮作用，而且，對實驗動物的心率和血壓沒有影響；另外，海葵毒素還具有抗心律失常的作用，它能夠延長心肌細胞復(fù)極過程中的有效不應(yīng)期和動作電位時程，屬3類抗心律失常作用。因此，研究開發(fā)海葵神經(jīng)毒素用于治療心衰和心律失常，是一項很有意義的工作。
?？谖覈Ｓ蚍植驾^廣，但產(chǎn)量較少。我國的海葵種類主要有黃?？?Anthopleuraxanthogrammica)、縱條肌?？?Haliplanella luciae)、日本側(cè)花?？?Anhopleura Japonica)、太平洋側(cè)花海葵(Anthopleura pacifica)、暗側(cè)花?？?Anthopleura nigrescens)、青島側(cè)花海葵(Aanthopleura Qingdaoensis)、華麗黃?？?anthopleura elegantissima)、須毛細指?？?Metridium dianthus)、疣?？?Adamsia palliata)、紅?？?Actinia equina)等。目前，國內(nèi)對?？窠?jīng)毒素的研究報道較少。對我國特有的?？Y源進行研究，發(fā)現(xiàn)新的有應(yīng)用前景的強心類及抗心律失常?？舅兀M行基因重組、表達，具有很重要的意義。
從所有已經(jīng)純化的?？窠?jīng)毒素一級結(jié)構(gòu)來看，大部分為46～49個氨基酸，稱為長鏈神經(jīng)毒素，分子量在5kDa左右；另一些分子量在3kDa左右的多肽，稱為短鏈神經(jīng)毒素。目前文獻報道的海葵長鏈神經(jīng)毒素已有20多種，氨基酸序列比較可以看出其共性為存在6個Cys殘基；3對二硫鍵；多肽鏈末端都是親水性氨基酸。這些?？窠?jīng)毒素根據(jù)來源又可以分為兩類來源于?？频腡ype-I類毒素稱為?？念惗舅?Actiniid)；而來源于刺?？频腡ype-II類毒素稱為刺海葵肽類毒素(Stichodactylid)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的海葵神經(jīng)毒素基因Sr7及其編碼的蛋白。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明用RT-PCR的方法，從玫瑰紅綠?？|手總RNA中分離得到的?？窠?jīng)毒素基因Sr7，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本發(fā)明基因Sr7編碼的蛋白(重組海葵神經(jīng)毒素，命名為Sr-p7)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；該蛋白等電點為8.21，分子量為4,967道爾頓。
該蛋白是通過表達載體pETTRX-Sr7在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達的。
所述表達載體pETTRX-Sr7是建立以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入His的親和標記位點及蛋白酶3C識別位點的高效表達載體，該系統(tǒng)使Sr7基因在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達，表達量可達150mg/L。
本發(fā)明所選擇的海葵屬于玫瑰紅綠?？?Sagartia rosea)，采自采自廣西北海潿洲島。
玫瑰紅綠海葵觸手cDNA文庫的構(gòu)建首先分離?？|手，提取總RNA。然后比較已發(fā)現(xiàn)的?？窠?jīng)毒素，它們的氨基酸組成及序列有很大的保守性，依據(jù)Ap-B兩端的保守氨基酸序列，設(shè)計簡并引物，運用RT-PCR方法，擴增得到目的條帶，將目的條帶連接到T載體，并轉(zhuǎn)化E.coli挑選重組克隆。
本發(fā)明通過對以上重組克隆大規(guī)模序列測定，從中得到了1個新的編碼玫瑰紅綠?？舅氐目寺?，命名為Sr7(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因編碼47個氨基酸的成熟肽(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等電點為8.21，分子量為4,967道爾頓，具有典型的?？窠?jīng)毒素一級結(jié)構(gòu)的特征，分子內(nèi)含有6個半胱氨酸，形成3對二硫鍵。
本發(fā)明通過設(shè)計了一對引物，將編碼側(cè)花海葵神經(jīng)毒素的新基因Sr7用PCR方法從T載體上擴增出來，克隆到原核融合表達載體pETTRX上，構(gòu)建成表達質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。此表達載體(pETTRX-Sr7)以T7為啟動子，采用分子伴侶TRX為融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6×His結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所設(shè)計的上游引物含有蛋白酶3C位點，以便外源蛋白單體的獲得。通過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)時間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，Sr-p7融合蛋白的表達量可達到150mg/L，并且基本上處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組Sr-p7蛋白的純化條件，表達產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到純度較高的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶切割和進一步的G50凝膠柱層析，可得到純度在95％以上的成熟重組海葵神經(jīng)毒素蛋白。
本發(fā)明獲得的重組?？窠?jīng)毒素具有生物活性。該重組海葵神經(jīng)毒素對大鼠離體心房具有強烈的促進收縮作用。對重組海葵神經(jīng)毒素進行的活性實驗，檢測Sr-p7重組蛋白對大鼠離體心房的作用，發(fā)現(xiàn)用藥后的大鼠心房收縮明顯增強，最高可增強276.46％。此外，它還有3類抗心律失常作用，能夠延長大鼠心肌細胞有效不應(yīng)期17％。因此，本發(fā)明的重組海葵毒素蛋白具有強心作用和抗心律失常作用，可用于制備治療心血管疾病藥物。
由本發(fā)明的含有Sr7?？窠?jīng)毒素成熟肽編碼序列的表達質(zhì)粒pETTRX-Sr7經(jīng)Kpn I/Not I雙酶切，可得到191bp的片段，即為側(cè)花海葵神經(jīng)毒素Sr7成熟肽編碼序列(其中包含蛋白酶3C識別位點)。
本發(fā)明的表達質(zhì)粒的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細菌，堿法提取質(zhì)粒。


圖1為本發(fā)明的?？窠?jīng)毒素蛋白和Ap-A類的幾個毒素蛋白的比較結(jié)果，其中“*”表示相同；“:”表示差異較??；“.”表示差異明顯；空格表示完全不同。
圖2為玫瑰紅綠?？|手總RNA電泳結(jié)果。
圖3為玫瑰紅綠?？窠?jīng)毒素Sr7基因的RT-PCR電泳結(jié)果。1PCR目的條帶；2100bp DNA marker。
圖4為含基因Sr7的pETTRX-Sr7表達質(zhì)粒酶切鑒定圖。1100bp DNA marker；2pETTRX-Sr7 Kpn I/Not I雙酶切。
圖5為重組Sr-p7蛋白誘導(dǎo)表達、親和層析電泳圖。1低分子量標準蛋白質(zhì)marker；2未經(jīng)誘導(dǎo)的pETTRX-Sr7菌體總蛋白；3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pETTRX-Sr7菌體總蛋白；4誘導(dǎo)菌超聲上清總蛋白；5Ni2+親和層析穿流蛋白峰；6C液洗脫峰總蛋白；7D液洗脫峰總蛋白。
圖6為重組Sr-p7分子篩層析的SDS-PAGE(Tricine)分析。1低分子量標準蛋白質(zhì)marker；2G-50分子篩純化的重組Sr-p7；3TRX-Sr-p7融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶(Prescissionprotease)切割；4經(jīng)過親和層析得到的TRX-Sr-p7融合蛋白。
圖7為含基因Sr7的重組表達質(zhì)粒pETTRX-Sr7構(gòu)建圖。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例一玫瑰紅綠?？|手總RNA的提取和RT-PCR擴增總RNA的提取和cDNA合成分離玫瑰紅綠?？|手，采用異硫氰酸胍法提取觸手總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。獲得100μg毒腺總RNA，其A260/A280＝2.03，經(jīng)1％甲醛變性膠電泳檢測可見清晰的18s和28s兩條帶，比值＞1(見圖2)，表明總RNA完整性良好。
取1ug總RNA以SMART III olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10μlcDNA第一鏈產(chǎn)物。
引物設(shè)計和RT-PCR擴增依據(jù)Ap-B的兩端氨基酸序列，用oligo引物設(shè)計軟件輔助分析，設(shè)計出兩條簡并引物。
Ap-B兩端氨基酸序列(N端)GVPCLCD-----------GWCCKK(C端)；正義鏈(A1)5’GG(A/C/T/G)GT(A/C/T/G)CC(A/C/T/G)TG(T/C)(T/C)T(A/C/T/G)TG(T/C)GA3’；反義鏈(A2)5’(T/C)TT(T/C)TT(A/G)CA(A/G)CA CCA(A/C/T/G)CC3’；每50μl PCR反應(yīng)體積加入1μl cDNA單鏈作為模板，PCR擴增，電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在150bp附近出現(xiàn)預(yù)期的特異性擴增帶(見圖3)，回收此帶。
實施例二重組?？窠?jīng)毒素基因序列的測定和分析將回收的電泳產(chǎn)物連接至T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑選重組克隆測序。一共測定了25個克隆，Blast同源分析表明，這25個克隆都是神經(jīng)毒素基因序列，基因長度都是141bp，各編碼47個氨基酸的毒素蛋白，其中有1個毒素蛋白編號為Sr-p7，它和已報導(dǎo)的?？窠?jīng)毒素蛋白的氨基酸序列不完全相同，是1個新的毒素蛋白。
目前，已報導(dǎo)的?？窠?jīng)毒素有20多種，氨基酸數(shù)目介于46-49(另外還有幾個毒素的氨基酸殘基介于27-31，稱短鏈神經(jīng)毒素)，其中12個氨基酸保守。根據(jù)它們的氨基酸序列又可分為兩個亞類，以Ap-A、Ap-B為代表，屬第一亞類；以ShI、RpI為代表，屬第二亞類。兩個亞類之間，氨基酸序列的同源性為30％左右，而屬同一個亞類的毒素蛋白，氨基酸序列之間的同源性超過60％，我們所發(fā)現(xiàn)的這個毒素蛋白屬于第一亞類。用Clustalw分析軟件，對這個毒素蛋白和Ap-A類的幾個毒素蛋白進行多序列比較，結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出，Sr-p7與Ap-C非常相似，它們之間只是第22位、25位、37位和47位4個氨基酸的差異。與Ap-C的Blast分析結(jié)果表明，Sr-p7和Ap-C的同源性是93％。另外，它和As V的序列也很接近，Blast分析結(jié)果顯示，Sr-p7和As V的同源性是89％。
在PCR擴增反應(yīng)中，用普通的Taq酶會出現(xiàn)約10-4的錯配，由于目的片段較小，PCR的循環(huán)數(shù)不超過30個，降低了錯誤參入的概率。
實施例三重組?？窠?jīng)毒素表達質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)Sr7基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含Kpn I和Prescission Protease切割位點，下游引物含BamH I切割位點。
上游引物(B1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCGGG GTGKpn I Precision Protease siteCCTTGTTTG TGC GAC 3’；下游引物(B2)5’CGCGGA TCCTTA TTA TTT TTT GCA GCA CCA GCC AAT G3’；RamH I
以含Sr7基因的pGEM-T Easy質(zhì)粒(購自Promega公司)為模板，B1、B2為引物PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產(chǎn)物大小在200bp左右。PCR擴增產(chǎn)物先以Kpn I/BamHI的組合克隆到BSK質(zhì)粒上構(gòu)建成BSK-Sr7，然后以Kpn I/Not I的組合克隆到原核融合表達載體pETTRX上，得到重組表達載體pETTRX-Sr7(其構(gòu)建過程如圖7所示)。表達載體pETTRX-Sr7經(jīng)Kpn I/Not I進行雙酶切鑒定(酶切結(jié)果見圖4)?？寺≥d體BSK-Sr7和表達載體pETTRX-Sr7中的外源基因經(jīng)測序鑒定正確。所設(shè)計的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位點，以便切除融合伴侶TRX。
實施例四重組海葵神經(jīng)毒素融合蛋白的表達將pETTRX-Sr7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達產(chǎn)物帶，分子量與用軟件DNA TOOL5.1預(yù)測的理論值18.6kD相符(圖5)。
經(jīng)過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索菌體擴大培養(yǎng)不同時間后誘導(dǎo)表達比較，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴大培養(yǎng)約2 h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后離心收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析分析表明，在此條件下Sr-p7融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的20％以上，基本上處于可溶狀態(tài)(圖5)。
實施例五重組?？窠?jīng)毒素融合蛋白的純化及成熟蛋白的獲得將收獲的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，再用Tis(50mM，pH7.0)懸浮，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析一步純化，經(jīng)SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達到80％(圖5)。以1L基因工程菌培養(yǎng)物為材料，最終獲得約120mg純化的融合蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實驗步驟，縮短對重組蛋白的處理時間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時，我們采用一步法進行純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pETTRX所表達的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強的特點，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMTris，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(B液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(C液)；300mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重組Sr-p7多肽在D液被洗脫下來(圖5)。從SDS-PAGE結(jié)果來判斷分離效果最好的部分。
利用Folin-酚法測定重組Sr-p7的蛋白濃度，收獲濃度在0.7mg/ml以上的洗脫液，加入Precision Protease進行切割，用SDS-PAGE檢測酶切結(jié)果，可明顯看到5kD附近代表成熟Sr-p7的譜帶(圖6)。將反應(yīng)液用Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析柱純化(條件同前)，收獲含成熟Sr-p7的穿流液，并用Sephadex G-50進一步純化(洗脫液為PBS)，便得純度在95％以上的成熟重組?？窠?jīng)毒素蛋白Sr-p7(圖6)。
實施例六急性毒性實驗(LD50)體重20±2g的NIH小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，其中5組為給藥組，1組為對照組。腹腔注射給藥，1小時內(nèi)，小鼠出現(xiàn)發(fā)呆、抽搐等中毒癥狀，繼續(xù)觀察7天，用Bliss法計算小鼠的半致死量。結(jié)果顯示，重組Sr-p7蛋白對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為3.0mg/kg。
實施例七重組Sr-p7蛋白對大鼠離體心房的強心實驗重組Sr-p7的生物活性參照Shibata的方法，采用大鼠離體心房進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組Sr-p7具有增強大鼠心肌收縮的能力。對心肌收縮力增強的程度用以下方法計算心房收縮增加百分率＝(給藥后的心房收縮幅度-給藥前的心房收縮幅度)/給藥前的心房收縮幅度×100％，重組Sr-p7能明顯增強大鼠離體心房的收縮能力，與西地蘭(去乙酰毛花苷C)比較，其作用更強(數(shù)據(jù)見表1)。
表1重組Sr-p7對大鼠離體心房增強收縮結(jié)果(n＝6 x±s)劑量分組 給藥后對離體心房收縮增加百分率(％)(mol/L) 1min 3min5min西地蘭(20μg/ml)3.75±4.1210.85±6.23 15.16±10.04高劑量Sr-p7(2.0×10-8) 63.33±21.40 138.07±67.24 200.98±110.75中劑量Sr-p7(2.0×10-9) 15.19±19.61 39.06±31.4769.67±39.87低劑量Sr-p7(2.0×10-10) 8.08±7.5413.80±12.5928.42±17.38
序列表<110>中山大學(xué)<120>一種?？窠?jīng)毒素基因Sr7及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>141<212>DNA<213>玫瑰紅綠海葵(Sagartia rosea)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(141)<400>1ggg gtg cct tgt ttg tgc gac agt gac ggt eca agc gtt cga ggc aat 48Gly Val Pro Cys Leu Cys Asp Ser Asp Gly Pro Ser Val Arg Gly Asn1 5 10 15acc tta tca ggg aca ctc tgg ctg ttc ggc tgc cca tcc ggt tgg cat 96Thr Leu Ser Gly Thr Leu Try Leu Phe Gly Cys Pro Ser Gly Try His20 25 30aac tgc aag gcc cgt gga ccg acc att ggc tgg tgc tgc aaa aaa141Asn Cys Lys Ala Arg Gly Pro Thr lle Gly Try Cys Cys Lys Lys35 40 45<210>2<211>47<212>PRT<213>玫瑰紅綠?？?Sagartia rosea)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(47)<400>2Gly Val Pro Cys Leu Cys Asp Ser Asp Gly Pro Ser Val Arg Gly Asn1 5 10 15Thr Leu Ser Gly Thr Leu Try Leu Phe Gly Cys Pro Ser Gly Try His20 25 30Asn Cys Lys Ala Arg Gly Pro Thr lle Gly Try Cys Cys Lys Lys35 40 4權(quán)利要求
1.用RT-PCR的方法，從玫瑰紅綠?？|手總RNA中分離得到的?？窠?jīng)毒素基因Sr7，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白Sr-p7，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；該蛋白等電點為8.21，分子量為4,967道爾頓。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白Sr-p7，其特征在于該蛋白是通過表達載體pETTRX-Sr7在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達的。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白Sr-p7，其特征在于所述表達載體pETTRX-Sr7是建立以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入His的親和標記位點及蛋白酶3C識別位點的高效表達載體，該系統(tǒng)使Sr7基因在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達，表達量可達150mg/L。
5.權(quán)利要求2，3或4所述的蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種?？窠?jīng)毒素基因Sr7及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明用RT－PCR的方法，從玫瑰紅綠海葵觸手總RNA中分離得到的?？窠?jīng)毒素基因Sr7，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的蛋白(重組?？窠?jīng)毒素Sr－p7)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本發(fā)明的重組海葵毒素蛋白具有強心作用和抗心律失常作用，可用于制備治療心血管疾病藥物。
文檔編號C12N15/30GK1594572SQ200410027968
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者徐安龍, 陳慧萍, 王磊, 董美玲, 楊文利, 姜孝玉, 涂洪斌 申請人:中山大學(xué)