專利名稱：用于禽流感h9亞型實時熒光rt－pcr檢測的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高致病性禽流感H9亞型核苷酸片斷的RT-PCR擴增引物和探針序列。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza，AI)也叫歐洲雞瘟或真性雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種急性高度接觸性傳染病，是國際公認的一種毀滅性疾病，可以經(jīng)豬或其它動物傳播給人，因此具有十分重要的生態(tài)學和公共衛(wèi)生學意義，尤其是高致病性禽流感被世界動物衛(wèi)生組織列為A類傳染病。
近些年發(fā)現(xiàn)，禽流感不僅嚴重危害禽類，而且也危害哺乳動物，尤其是可以感染人并致人死亡，極大地威脅著人類公共衛(wèi)生安全。禽流感病毒屬于RNA病毒，和所有的RNA病毒一樣，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，基因組轉(zhuǎn)錄時有較高的錯誤率，而且其基因組是分節(jié)段的，極易發(fā)生重排，因此禽流感病毒具有高度的變異性。其基因組中編碼糖蛋白HA和NA的基因片段及編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2的基因片段，在不同的流感毒株之間存在較大差異，而其它基因在禽流感病毒基因組中相對保守。研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒的致病力主要取決于宿主與病毒之間的相互作用關(guān)系，而病毒的不同基因片段在決定病毒致病性方面也有不同的作用，其中起主要作用的是編碼HA蛋白的基因。通過對大量禽流感病毒HA核苷酸序列和氨基酸序列的分析、比較，發(fā)現(xiàn)HA裂解位點的氨基酸序列決定禽流感病毒的毒力，高致病性禽流感的HA裂解位點有6個連續(xù)的堿性氨基酸，而低致病性禽流感有2個堿性氨基酸。
實時熒光PCR技術(shù)是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ母咝聶z測技術(shù)，在許多領(lǐng)域已得到了廣泛應用，因此可以利用其解決禽流感病毒多血清型和高變異性給臨床檢測造成的難題。實時熒光定量PCR技術(shù)是于1996年首次推出的，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期更短、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優(yōu)點，目前已得到廣泛應用。
常規(guī)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴增目的DNA片斷的技術(shù)。熒光實時RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，從而檢測不到該探針熒光基團所發(fā)出的熒光信號，而在PCR擴增時，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在目的擴增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，此時可以檢測到熒光報告基團的熒光信號，熒光信號量的變化與擴增產(chǎn)物量成正比。
由于禽流感病毒具有多個亞型且變異快，國內(nèi)外疫情的發(fā)生情況又較復雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準確可靠、快速簡便的高致病性禽流感檢測方法，用于快速檢測國內(nèi)外主要流行的高致病性禽流感病毒亞型，從而滿足進出口檢驗檢疫和疫病監(jiān)控的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測禽流感病毒H9亞型的PCR引物和熒光探針。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案分析所有已報道的禽流感H9亞型基因組序列，分別設計引物和熒光探針。在常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)的基礎上，添加一條標記了兩個熒光基團的核苷酸探針，熒光報告基團(R)標記在探針的5’端，熒光淬滅基團(Q)標記在探針的3’端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即熒光報告基團所發(fā)射的熒光可被熒光淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告基團熒光信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(Q)的抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，從而進行禽流感H9亞型的檢測。實時熒光RT-PCR檢測反應原理見圖1。
用于檢測禽流感H9亞型的核苷酸擴增用引物序列和探針序列包括1.一種由上游引物H9pf151序列為CCTGTGACACATGCCAAAGA及互補序列為GGACACTGTGTACGGTTTCT，下游引物H9pr302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC及互補序列為GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列；探針H9pb175序列為CTCCACACAGAGCACAAT及互補序列為GAGGTGTGTCTCGTGTTA，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
2.一種由上游引物H9pf302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC及互補序列為GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG，下游引物H9pr103序列為TCAACAAACTCCACRGAAACTGT及互補序列為AGTTGTTTGAGGTGYCTTTGACA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列；探針H9pb179序列為ACACAGAGCACAATGG及互補序列為TGTGTCTCGTGTTACC，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
3.一種由上游引物H9pf805序列為TAATTGCTCCATGGTATGGACAC及互補序列為ATTAACGAGGTACCATACCTGTG，下游引物H9pr990序列為CCAACTGCCAGTTTGAGACTCTT及互補序列為GGTTGACGGTCAAACTCTGAGAA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列；探針H9pb843序列為AGCCATGGAAGAATC及互補序列為TCGGTACCTTCTTAG，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。引物和探針設計通過分別對所有已經(jīng)報道的禽流感病H9亞型基因組序列進行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的核苷酸區(qū)段設計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補序列。最優(yōu)引物、探針序列如下H9pf1515’-CCTGTGACACATGCCAAAGA-3’H9pr3025’-CTTTCGACRATGTAGGACCATTC-3’H9pb1755’-CTCCACACAGAGCACAAT-3’將上述引物、探針序列優(yōu)化組合后，建立檢測禽流感H9亞型的實時熒光RT-PCR檢測方法，并制成用于檢測禽流感H9亞型的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。
禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的方法采用以下步驟(1)選取權(quán)利要求1-12中所述的引物和探針；(2)制備待測模板，提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA；(3)反應體系的建立，a、確定的最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定反轉(zhuǎn)錄酶(AMVRnaseXL)用量；d、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；e、確定dNTPs濃度；f、確定最佳探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。
禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測方法中的待測模板的制備可采用方法QIAampViral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA。
本發(fā)明的顯著特點是充分運用PCR技術(shù)的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術(shù)的快速敏感性，具有結(jié)果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本、提高檢測效率等優(yōu)點。


圖1Taqman探針的實時熒光RT-PCR檢測原理圖。
圖2禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
圖3禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗檢測曲線圖。
圖4禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗檢測曲線圖。
具體實施例方式
反應體系的建立和優(yōu)化禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應體系的建立和優(yōu)化利用滅活的禽流感病毒H9亞型毒株作為待檢樣品，利用QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲存于-20℃?zhèn)溆谩?br> (1)引物濃度的優(yōu)化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將H9的引物濃度分別從0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μmol/L。
(2)鎂離子濃度的優(yōu)化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L遞增，經(jīng)過多次重復實驗選定5mmol/L為試劑盒反應體系中的鎂離子濃度。
(3)反轉(zhuǎn)錄酶(AMV RnaseXL)用量的優(yōu)化 經(jīng)過使用不同濃度AMV RNaseXL的試驗結(jié)果比較，選定5U作為試劑盒反應體系中AMV RnaseXL的用量。
(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優(yōu)化實驗結(jié)果，選定5U作為試劑盒反應體系中Taq酶的用量。
(5)dNTPs濃度的優(yōu)化 通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選1mmol/L作為試劑盒反應體系中dNTPs的使用量。
(6)探針濃度的優(yōu)化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將禽流感H9亞型的探針濃度分別從0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.2μmol/L。
利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應體系為25μl體系，所需各組分及相應濃度見表1。
表1禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應中的各組分情況

注1.在多重實時熒光RT-PCR反應體積不同時，各試劑應按比例調(diào)整。
2.使用的儀器不同，應將反應參數(shù)作適當調(diào)整。
3.根據(jù)檢測樣本來源不同，應適當調(diào)整模板加量。
儀器檢測通道的選擇在進行禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。
實施例1(1)待測模板的制備方法一利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA，具體操作步驟如下a.取560μl含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的微量離心管中；b.加入140μl血漿、血清、尿樣、細胞培養(yǎng)上清液或拭子的PBS清洗液，旋渦振蕩15sec；c.于室溫(15-25℃)下孵育10min；d.瞬時離心以便將蓋上的液體離心至離心管內(nèi)；e.再加入560μl無水乙醇，旋渦振蕩15sec，瞬時離心，將蓋上的液體離心至離心管內(nèi)；f.小心吸取630μl上述液體至QIAamp離心柱內(nèi)(置于2ml的收集管內(nèi))，不要弄濕管口邊緣，8000rpm離心1min。棄去含有液體的收集管，將QIAamp離心柱放置于另一2ml的收集管中；g.小心打開QIAamp離心柱蓋，重復步驟f；h.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW1緩沖液，8000rpm離心1min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管；i.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW2緩沖液，14000rpm離心3min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管，再次14000rpm離心1min；i.將QIAamp離心柱放置于一個干凈的1.5ml的離心管中，小心打開柱蓋，加入60μlAVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min后，8000rpm離心1min即獲得病毒RNA，-20℃儲存?zhèn)溆谩?br> 方法二 用Trizol核酸抽提試劑的提取方法a.收獲禽流感病毒致死雞胚的尿囊液，12000rpm離心去除大分子雜質(zhì)。將100μ1上清液加入1.5ml的離心管中，再向其中加入300μl的TrizoL組織抽提液，于振蕩器上充分振蕩。然后13000rpm離心15min，將上清移至1.5ml的離心管中；b.向上清液中加400μl的預冷異丙醇，在振蕩器上充分振蕩后；c.13000rpm離心10min以便獲得RNA沉淀；d.小心倒掉上清，加入600μl 75％乙醇，用手上下顛倒數(shù)次洗滌。(注意不能劇烈振蕩，防止RNA的斷裂和RNA沉淀溶解后難以重新沉淀)；e.13000rpm離心10min，緩慢吸棄上清，室溫干燥約25min，待乙醇完全揮發(fā)后加25-40μl無RNA酶的水溶解(充分彈動混勻，或用槍反復吹打)，-20℃儲存?zhèn)溆谩?br> (2)禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應的擴增條件根據(jù)表1加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設置相應熒光收集條件后進行擴增，反應程序如下50℃ 30min進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，95℃ 3min滅活反轉(zhuǎn)錄酶；95℃ 15sec變性，55℃ 30sec退火，72℃ 1min延伸，如此重復5個循環(huán)進行預擴增；95℃ 10sec變性，60℃ 40sec退火、延伸，如此重復40個循環(huán)進行目的片段的擴增檢測，試驗結(jié)果可以實時監(jiān)測。
(3)禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR的檢測結(jié)果在25μl反應體系中，利用針對禽流感H9亞型的特異性引物和探針進行實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H9亞型基因組RNA的陽性樣品，結(jié)果可以得到特異性的熒光曲線(圖2)。
以上試驗結(jié)果表明，本發(fā)明設計的引物和探針特異且工作性能良好，并建立了禽流感H9亞型的實時熒光RT-PCR檢測的方法。
實施例2禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗在25μl反應體系中，同時加入禽流感病毒H5、H7、H9亞型的基因組RNA作為模板，運用針對禽流感H9亞型的引物、探針進行實時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果只得到H9亞型的特異性熒光曲線，表明該方法只對H9亞型具有特異性擴增，對H5、H7亞型無擴增，證實本發(fā)明涉及的針對禽流感H9亞型的引物、探針具有很強的特異性(圖3)。
實施例3禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗在25μl禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR反應體系中，將禽流感病毒H9亞型的基因組RNA作10倍連續(xù)稀釋，進行針對H9亞型的實時熒光RT-PCR敏感性檢測，得到稀釋梯度系列擴增曲線(圖4)。
以上試驗結(jié)果表明，本發(fā)明涉及的禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR方法敏感性很高，可以檢測到樣品中微量存在的禽流感H9亞型。
本發(fā)明提供的用于檢測禽流感H9亞型的熒光探針的使用進一步提高了檢測的特異性，從而可以達到省時省力、降低檢測成本、提高檢測速度和效率的目的。
本發(fā)明對禽流感H9亞型的檢測靈敏度為10-5，可以滿足各種樣品的檢測要求。
利用本發(fā)明進行檢測，操作簡便快速，一般可在2小時左右完成，而且可以在檢測過程中實時監(jiān)測結(jié)果，不需要進行擴增產(chǎn)物的電泳觀察，避免了擴增產(chǎn)物之間的污染以及電泳觀察時EB對環(huán)境的污染。
H9序列表序列表<110>深圳太太基因工程有限公司中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局<120>用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物和探針序列<140>200410027812.1<141>2004-06-25<160>18<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1cctgtgacac atgccaaaga 20<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2ctttcgacra tgtaggacca ttc 23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ggacactgtg tacggtttct 20<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4gaaagctgyt acatcctggt aag 23<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5
H9序列表ctccacacag agcacaat 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6gaggtgtgtc tcgtgtta 18<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7ctttcgacra tgtaggacca ttc 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8tcaacaaact ccacrgaaac tgt 23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9gaaagctgyt acatcctggt aag 23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>10agttgtttga ggtgyctttg aca 23<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>11acacagagca caatgg 16
H9序列表<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtgtctcgt gttacc 16<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>13taattgctcc atggtatgga cac 23<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14ccaactgcca gtttgagact ctt 23<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>15attaacgagg taccatacct gtg 23<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>16ggttgacggt caaactctga gaa 23<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>17agccatggaa gaatc 15<210>18
H9序列表<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>18tcggtacctt cttag 1權(quán)利要求
1.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf151序列為CCTGTGACACATGCCAAAGA和下游引物H9pr302序列為CTTTCGACCATGTAGGACCATTC組成的引物對，以及上游引物的互補序列GGACACTGTGTACGGTTTCT和下游引物的互補序列GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf151位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H9pr302位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列。
3.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H9pb175序列為CTCCACACAGAGCACAAT，以及其互補序列為GAGGTGTGTCTCGTGTTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H9pb175向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
5.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC和下游引物H9pr103序列為TCAACAAACTCCACRGAAACTGT組成的引物對，以及上游引物的互補序列GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG和下游引物的互補序列AGTTGTTTGAGGTGYCTTTGACA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf302位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H9pr103位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列。
7.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H9pb179序列為ACACAGAGCACAATGG，以及其互補序列為TGTGTCTCGTGTTACC。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H9pb179向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
9.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf805序列為TAATTGCTCCATGGTATGGACAC和下游引物H9pr990序列為CCAACTGCCAGTTTGAGACTCTT組成的引物對，以及上游引物的互補序列ATTAACGAGGTACCATACCTGTG和下游引物的互補序列GGTTGACGGTCAAACTCTGAGAA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf805位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H9pr990位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列。
11.一種用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H9pb843序列為AGCCATGGAAGAATC，以及其互補序列為TCGGTACCTTCTTAG。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于禽流感H9亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H9pb843向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
全文摘要
一種用于高致病性禽流感H9亞型核苷酸片斷的RT－PCR擴增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物H9pf151序列為CCTGTGACACATGCCAAAGA和下游引物H9pr302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC組成的引物對，以及上游引物的互補序列GGACACTGTGTACGG TTTCT和下游引物的互補序列GAAAGCTGYTACATCCTGG TAAG，并由上游引物位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補序列等。探針序列包括探針H9pb175序列為CTCCACACACAGCACAAT及互補序列為GAGGTGTGTGT CGTGTTA，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補序列等。
文檔編號C12Q1/68GK1670219SQ20041002781
公開日2005年9月21日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者秦智鋒, 肖性龍, 呂建強, 林鏡中, 鐘安清, 劉勝利, 金顯忠 申請人:深圳太太基因工程有限公司, 中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局