專利名稱：一種乙型肝炎病毒基因分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種乙型肝炎病毒基因分型方法，尤其是一種利用逆向點(diǎn)雜交技術(shù)建立的乙型肝炎病毒基因分型方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球性分布，有超過3.5億病毒攜帶者，是導(dǎo)致急性、爆發(fā)性和慢性肝炎、以及肝硬化、肝功能衰竭和原發(fā)性肝癌的主要危險(xiǎn)因素。HBV基因組變異性強(qiáng)，目前根據(jù)HBV全基因核苷酸序列的異源性≥8％，可將不同病毒株分為A～H8個(gè)基因型。病毒的不同基因型與地區(qū)分布、感染途徑、致病性、疾病進(jìn)程及對(duì)治療的反應(yīng)等都可能有一定的相關(guān)性。因此，對(duì)HBV進(jìn)行基因分型有利于對(duì)HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W和臨床診治進(jìn)行更加深入的研究。全基因測(cè)序的基因分型方法雖然結(jié)果可靠，但費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜，難以在臨床推廣應(yīng)用，因此探索簡單易行的基因分型方法成為研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明研究旨在采用逆向點(diǎn)雜交技術(shù)，建立一種適合臨床應(yīng)用的HBV基因分型新方法。
目前用于HBV基因組分型的方法有，序列測(cè)定、聚合酶鏈反應(yīng)-限制片斷長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、特異性引物分型、單克隆抗體ELISA基因型分型和PCR微板核酸雜交-ELISA技術(shù)等，但由于各自都存在著價(jià)格昂貴、操作煩瑣或?qū)嶒?yàn)條件要求高等不同的缺陷。因此，探索一種簡單易行，適合臨床推廣應(yīng)用的HBV基因分型方法有著重要的臨床意義。
逆向點(diǎn)雜交技術(shù)(RBD)是Saiki等人于1989年提出的，該方法將多種核酸檢測(cè)探針固定在膜條上，通過與擴(kuò)增后的待檢靶序列雜交，一次即可進(jìn)行多種基因亞型的分類，因此有很高的檢測(cè)效率而且簡單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。近年來，此法已在遺傳病的基因診斷、HLA基因分型、病原微生物鑒定，以及癌基因點(diǎn)突變分析等領(lǐng)域的應(yīng)用中顯示出良好的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和潛力。但將該技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒基因分型領(lǐng)域，尚未見有相應(yīng)的文獻(xiàn)公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡單、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高的、適合臨床推廣應(yīng)用的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種乙型肝炎病毒基因分型方法，其具體步驟為1、以乙型肝炎病毒HBV基因組的X區(qū)序列為主設(shè)計(jì)分型引物與探針；2、將活性氨基標(biāo)記的探針依次固定在尼龍膜上，制成檢測(cè)膜條；3、用標(biāo)記生物素的引物進(jìn)行HBV DNA擴(kuò)增；4、將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)膜條雜交，以過氧化物酶(POD)與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色；5、判斷基因分型結(jié)果。其中，引物與探針為針對(duì)國際基因庫Genbank中已經(jīng)發(fā)表的78株HBV(包括A～F)，選擇集保守性和可變性為一體的前C區(qū)與X區(qū)(nt1550～nt1798)，設(shè)計(jì)出引物、一條HBV通用探針(S)以及6條針對(duì)基因型的型特異性探針(A～F)。在上游引物的5’端標(biāo)記生物素，在探針5’端修飾活性氨基。引物和各型探針序列為上游引物5’-CGT CTG TGC CTT CTC A(G)TC TG-3’，下游引物5’-ACC AAT TTA TGC CTA CAG CCTC-3’。
探針A5’-TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC-3’，探針B5’-TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC-3’，探針C5’-TTG GGC AAG ACC TGG TGG GC-3’，探針D5’-TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC-3’，探針E5’-TTG GGC AAT ATT TGG TGG GC-3’，
探針F5’-GAC TGT TGG CAG ATT CCA GG-3’，探針S5’-TCA CGG TGG TCT CCA TGC GA-3’。
由于本發(fā)明采用了逆向點(diǎn)技術(shù)，該技術(shù)將多種核酸檢測(cè)探針固定在膜條上，通過與擴(kuò)增后的待檢靶序列雜交，一次即可進(jìn)行多種基因亞型的分類，因此有很高的檢測(cè)效率而且簡單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。其次，在應(yīng)用DNASIS軟件和treeview軟件對(duì)Genbank中78株HBV的S、C、X基因區(qū)序列進(jìn)行充分比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，選擇集保守區(qū)與可變區(qū)為一體的X基因區(qū)(nt1550-1789)作為主要分型片段，設(shè)計(jì)出一條HBV通用探針和6條針對(duì)基因型(A～F)的型特異性探針，對(duì)HBV進(jìn)行基因分型。由于通用探針的存在，可在很大程度上減少因可變區(qū)出現(xiàn)的罕見變異所帶來的分型漏檢。為了最大程度的減少因各探針中CG含量不同所導(dǎo)致的在同一雜交與洗膜溫度下復(fù)性不均的問題，我們?cè)陔s交體系中加入了3mol/L的氯化四甲胺(Me4NCl)，通過其選擇性地與A:T對(duì)結(jié)合，升高Tm值，可使A:T對(duì)和G:C對(duì)的解鏈溫度趨于相同。同時(shí)，通過300例HBV DNA陽性的血清標(biāo)本，對(duì)本發(fā)明利用PCR-RBD技術(shù)所建立的HBV基因分型新方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。包括80份HBV在103拷貝/ml的低病毒量血清在內(nèi)的全部血清均能被明確分型，并與測(cè)序分型結(jié)果完全一致。50份健康人HBV陰性血清均未出現(xiàn)假陽性，這表明本發(fā)明建立的逆向點(diǎn)雜交HBV基因分型方法具有很好的靈敏度和特異性。并且，本發(fā)明是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡單、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高的、適合臨床推廣應(yīng)用的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型方法。
四

下面以附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
圖1為HBV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的示意圖。
在圖1中，MDNA標(biāo)準(zhǔn)分子；1基因型B；2基因型C；3基因型B+C；4基因型C+D；5陰性對(duì)照。
圖2為PCR-RBD技術(shù)HBV基因分型結(jié)果的示意圖。
在圖2中，A～F分型探針；SHBV通用探針；1基因型B；2基因型C；3基因型B+C；4基因型D；5陰性對(duì)照；6空白對(duì)照。
五具體實(shí)施例方式
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和積極效果可從以下實(shí)施例中得以體現(xiàn)，但是它們并不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
實(shí)施例。
1.標(biāo)本來源從在佛山市第一人民醫(yī)院進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)為陽性的10000份患者的血清中，隨機(jī)抽取300份作為分型檢測(cè)對(duì)象。健康人對(duì)照血清50份來自自愿義務(wù)獻(xiàn)血者，經(jīng)PCR檢測(cè)HBV DNA均為陰性。
2.標(biāo)本處理儲(chǔ)藏，將血清分裝后放置于-80℃條件下儲(chǔ)存；HBV DNA提取，取待測(cè)血清50μl，加入DNA提取液50μl，混勻，100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清待用。
3.主要試劑Biodyne C膜為美國PALL公司產(chǎn)品、EDC〔1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽〕和SDS為美國Sigma公司產(chǎn)品，氯化四甲胺為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，以及Taq酶為華美生物公司產(chǎn)品，并由相應(yīng)公司購得；熒光定量PCR檢測(cè)試劑、DNA提取液、TMB、POD由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供。
4.HBV定量測(cè)定采用熒光定量PCR法，按操作說明在PE5700熒光定量PCR儀(美國ABI公司產(chǎn)品)上進(jìn)行。
5.HBV DNA擴(kuò)增利用PCR技術(shù)，在含1×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTp、引物各200nmol/L、Taq酶1.5U的50ul反應(yīng)體系中，加入3μl由標(biāo)本處理步驟獲得的模板，設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃ 3min，循環(huán)條件94℃55s、55℃55s、72℃55s，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。以無模板的空白作為陰性對(duì)照。
6.PCR產(chǎn)物電泳HBV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，在5V/cm電壓條件下，用含5μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在260nm紫外透射儀下進(jìn)行觀察。
7.HBV基因分型應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-逆向點(diǎn)雜交(PCR-RBD)技術(shù)，將基因擴(kuò)增、核酸雜交和酶聯(lián)顯色技術(shù)結(jié)合，自行建立HBV基因分型新方法。其方法如下，引物與探針選擇Genbank中已經(jīng)發(fā)表的78株HBV(包括A～F)，根據(jù)DNASIS軟件和tree view軟件確定HBV的基因型特點(diǎn)，選擇集保守性和可變性為一體的前C區(qū)與X區(qū)(nt1550～nt1798)，采用primer premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物、一條HBV通用探針(S)和6條型特異性探針(A～F)。在上游引物的5’端標(biāo)記生物素，在探針5’端修飾活性氨基。引物和各型探針序列為，上游引物5’-CGT CTG TGC CTT CTC A(G)TC TG-3’，下游引物5’-ACC AAT TTA TGCCTA CAG CCTC-3’；探針A5’-TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC-3’，探針B5’-TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC-3’，探針C5’-TTG GGC AAG ACCTGG TGG GC-3’，探針D5’-TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC-3’，探針E5’-TTG GGC AAT ATT TGG TGG GC-3’，探針F5’-GAC TGT TGG CAG ATTCCA GG-3’，探針S5’-TCA CGG TGG TCT CCA TGC GA-3’。
膜條制備Biodyne C膜條用HCl快速飄洗后，在20％EDC溶液中浸泡15min；將A-F6個(gè)分型探針及通用探針S分別溶于碳酸鹽緩沖液中，從左到右依次點(diǎn)于膜上，室溫孵育15min，再用NaOH、雙蒸水飄洗，風(fēng)干待用。逆向點(diǎn)雜交把雜交液(2×SSC-0.1％SDS，3mol/L Me4NCl)、膜條和擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交管內(nèi)，100℃變性10min后置42℃雜交過夜。次日42℃洗液(0.5×SSC-0.1％SDS，3mol/LMe4NCl)洗膜后，加入過氧化物酶(POD)作用15min，然后將膜條在含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液中避光顯色10min。結(jié)果判斷在某基因型探針位點(diǎn)及通用探針位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則將HBV判斷為該類型；在不同基因型探針位點(diǎn)及通用探針位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為混合型。例如，在探針A處及通用探針S處同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則該血清標(biāo)本所含的HBV為A型；在探針B、C和S處同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為B、C混合型。無藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)，則為HBV DNA陰性。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)300份已經(jīng)進(jìn)行分型鑒定的血清中隨機(jī)挑選100份，重新進(jìn)行基因分型鑒定，對(duì)比前后分型結(jié)果。
8.PCR產(chǎn)物序列測(cè)定隨機(jī)挑選經(jīng)膜條檢測(cè)為基因型B、C、D的擴(kuò)增產(chǎn)物各2份，經(jīng)醋酸鈉/乙醇純化后，以PCR引物為直接測(cè)序引物，由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心協(xié)助完成測(cè)序。將測(cè)得的序列輸入DNAstar分析軟件中，與Genbank中已知HBV各基因型序列進(jìn)行同源性比較與序列排列對(duì)比分析，明確其基因型。
9.結(jié)果。熒光定量PCR測(cè)定300份慢性乙型肝炎患者的HBV DNA陽性血清，定量測(cè)定拷貝數(shù)在103～109/ml范圍之間。PCR產(chǎn)物電泳不同基因型的HBV陽性血清均可見到一條249bp大小的擴(kuò)增片段，與預(yù)期片段大小相符，見圖1。HBV基因分型應(yīng)用新建的PCR-RBD方法對(duì)300份HBV DNA拷貝數(shù)在103～109/ml范圍之間的陽性血清，均可以進(jìn)行基因分型，其中包括80份拷貝數(shù)為103/ml的低病毒量血清。分型結(jié)果為B型147例，占49.0％；C型136例，占45.3％；D型1例，占0.3％；B、C混合型12例，占4.0％；C、D混合型4例，占1.3％；未發(fā)現(xiàn)A、E和F型?；旌闲椭卸鄶?shù)病例的藍(lán)色斑點(diǎn)呈現(xiàn)出一強(qiáng)一弱的特點(diǎn)。50份健康體檢者血清全部為陰性，見圖2。測(cè)序結(jié)果對(duì)6例經(jīng)隨機(jī)挑選的PCR-RBD檢測(cè)為基因型B、C、D的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，用DNAstar分析軟件比較所測(cè)序列與Genbank中基因序列的同源性，確定其基因型，結(jié)果與PCR-RBD基因分型完全一致。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取的100份血清應(yīng)用本PCR-RBD方法再次分型，前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合率為100％。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因分型方法，其特征在于，該方法包括下述具體步驟(1)以乙型肝炎病毒(HBV)基因組的X區(qū)序列為主設(shè)計(jì)分型引物與探針；(2)將活性氨基標(biāo)記的探針依次固定在尼龍膜上，制成檢測(cè)膜條；(3)用標(biāo)記生物素的引物進(jìn)行HBV DNA擴(kuò)增；(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)膜條雜交，以過氧化物酶(POD)與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色；(5)判斷基因分型結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒基因分型方法，其特征在于，所述的引物與探針為針對(duì)國際基因庫Genbank中已經(jīng)發(fā)表的78株HBV(包括A～F)，選擇集保守性和可變性為一體的前C區(qū)與X區(qū)(nt1550～nt1798)，設(shè)計(jì)出引物、一條HBV通用探針(S)以及6條針對(duì)基因型的型特異性探針(A～F)。在上游引物的5’端標(biāo)記生物素，在探針5’端修飾活性氨基。引物和各型探針序列為上游引物5’-CGT CTG TGC CTT CTC A(G)TC TG-3’，下游引物5’-ACC AAT TTA TGC CTA CAG CCTC-3’。探針A5’-TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC-3’，探針B5’-TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC-3’，探針C5’-TTG GGC AAG ACC TGG TGG GC-3’，探針D5’-TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC-3’，探針E5’-TTG GGC AAT ATT TGG TGG GC-3’，探針F5’-GAC TGT TGG CAG ATT CCA GG-3’，探針S5’-TCA CGG TGG TCT CCA TGC GA-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用逆向點(diǎn)雜交技術(shù)建立的乙型肝炎病毒基因分型方法。它包括下述具體步驟(1)以乙型肝炎病毒(HBV)基因組的X區(qū)序列為主設(shè)計(jì)分型引物與探針；(2)將活性氨基標(biāo)記的探針依次固定在尼龍膜上，制成檢測(cè)膜條；(3)用標(biāo)記生物素的引物進(jìn)行HBV DNA擴(kuò)增；(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)膜條雜交，以過氧化物酶(POD)與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色；(5)判斷基因分型結(jié)果。本發(fā)明是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡單、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高的、適合臨床推廣應(yīng)用的乙型肝炎病毒基因分型方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1584053SQ20041002743
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者楊光, 陳姝, 崔金環(huán), 司建華, 譚家駒 申請(qǐng)人:佛山市第一人民醫(yī)院, 楊光