專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害的診斷試劑盒及檢測(cè)方法，主要是針對(duì)對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒(TSV，Taura Syndrome Virus)基因診斷的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
90年代以來(lái)，亞洲許多國(guó)家和地區(qū)蝦病爆發(fā)性流行，對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量銳減，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。蝦病尤其是對(duì)蝦病毒病嚴(yán)重阻礙了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。在眾多的對(duì)蝦病毒中，對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒(TSV)的危害較為嚴(yán)重，是南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的頭號(hào)殺手。關(guān)于TSV的研究也是近年來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)于對(duì)蝦病毒病還未有特效的治療方法，推行對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速檢測(cè)。目前對(duì)于對(duì)蝦病毒的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)組織學(xué)方法、電子顯微技術(shù)、生物指示法、生化檢測(cè)法、免疫學(xué)方法(主要有熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫電鏡技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)方法(主要有分子雜交方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))等。這些檢測(cè)方法有些對(duì)技術(shù)條件要求高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，有些所需要的材料制備麻煩，費(fèi)用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，因此廣大蝦農(nóng)掌握關(guān)鍵的技術(shù)難度很大，難以推廣，限制了這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
早期快速診斷對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒是目前對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少對(duì)蝦損失的有效途徑，因此，簡(jiǎn)便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法是廣大對(duì)蝦養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù))，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快被應(yīng)用于實(shí)踐中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用TSV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立TSV RT-PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提供對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒可批量生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高；可用于對(duì)蝦各時(shí)期養(yǎng)殖過(guò)程中的病毒跟蹤檢測(cè)，也可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的基因診斷試劑盒包括下列部件1).RNA提取液A液，2管，內(nèi)裝Trizol液；2).B液，1管，內(nèi)裝氯仿；3).C液，1管，內(nèi)裝異丙醇；4).D液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；
5).E液，1管，內(nèi)裝DEPC水；6).RT反應(yīng)液F液，1管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsin RI、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT；7).RT-PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE；8).陽(yáng)性對(duì)照H液，1管，內(nèi)裝TSV陽(yáng)性模板；9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中。
上述TSV基因診斷試劑盒中所述的一對(duì)引物F1和R1是根據(jù)TSV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，其DNA序列分別如下F15’-TCA ATG AGA GCT TGG TCCR15’-TTC GCG CCG ACA GAT GAA用本發(fā)明上述試劑盒檢測(cè)對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品加A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min；待檢樣品可以是直接取自待檢動(dòng)物的任何部位組織，最好是內(nèi)臟組織或肌肉組織；2).在上述勻漿液中加入200μlB液，上下顛倒混勻，靜置5～10min；3).4℃，10000～12000r/min離心10～15mim；4).取400μl上清，加入到500μl C液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10～15min；5).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；6).棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃，7500～10000r/min離心5～10min；7).空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55～60℃放置10～15min)，得到RNA提取液(可于-20℃保存)；8).RNA提取液在95℃預(yù)熱5～10min；9).取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到8μl F液中，37℃ 孵育1h；然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板；10).分別取2μl RT-PCR反應(yīng)模板和陽(yáng)性對(duì)照H液加入到48μl G液中，混勻后離心數(shù)秒(通常為500～1000r/min離心5～10秒)，置于PCR儀上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃ 40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃ 7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察。若在與陽(yáng)性對(duì)照同一位置的231bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為T(mén)SV陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶桃拉綜合癥病毒，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法，是以根據(jù)TSV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為主體而設(shè)計(jì)的。利用該對(duì)引物，可以特異性地?cái)U(kuò)增攜帶TSV病毒的待測(cè)樣品的有關(guān)基因片段，所建立優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系保證檢測(cè)結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此使用本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法，可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏而特異地檢測(cè)感染TSV的對(duì)蝦，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于對(duì)蝦各時(shí)期養(yǎng)殖過(guò)程中的病毒跟蹤檢測(cè)，也可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。


圖1是感染對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的對(duì)蝦肝臟組織樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果。其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane1TSV陰性對(duì)照；Lane2TSV陽(yáng)性對(duì)照；Lane3檢測(cè)樣品。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的基因診斷試劑盒該試劑盒由以下各部分構(gòu)成(10樣份)1.RNA提取液(A液)，2管，5ml/管，內(nèi)裝Trizol液。
2.B液，1管，內(nèi)裝氯仿(也可自備)，共2ml(200μl/份×10份)。
3.C液，1管，內(nèi)裝異丙醇(也可自備)，共5ml(500μl/份×10份)。
4.D液，1管，內(nèi)裝70％乙醇(也可自備)，共10ml(1ml/份×10份)。
5.E液，1管，0.5ml/管，內(nèi)裝DEPC水。
6.RT反應(yīng)液(F液)，1管，0.1ml/管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液(10μl體系)，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsin(RI)、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RT)。
7.RT-PCR反應(yīng)液(G液)，1管，0.5ml/管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液(50μl體系)，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE。
8.陽(yáng)性對(duì)照(H液)，1管，20ul/管，內(nèi)裝TSV陽(yáng)性模板。
9.長(zhǎng)方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
10.一塊泡沫板，其大小與長(zhǎng)方體盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個(gè)孔，孔徑1.3cm，第二排五個(gè)孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個(gè)孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于長(zhǎng)方體盒子中。
該試劑盒中的內(nèi)外一對(duì)引物的DNA序列如下F15’-TCA ATG AGA GCT TGG TCCR15’-TTC GCG CCG ACA GAT GAART反應(yīng)液體系(10μl體系)如下5×Buffer 2μldNTP 1μlDEPC-H2O 3.3μl
隨機(jī)引物 1μlRNA酶抑制劑RNAsin(RI)0.2μl反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RT)0.5μlRT-PCR反應(yīng)液體系(50μl體系)如下10×Buffer(含mg2+) 10μldNTP 1μl正向引物F1 1μl反向引物R1 1μlddH2O 34.7μlTaqE 0.3μl實(shí)施例2對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的檢測(cè)方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1.用無(wú)菌操作方法，取新鮮對(duì)蝦肝臟組織0.1g加1ml A 液稀釋?zhuān)趧驖{器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min。
2.在上述勻漿液中加入200μl B 液，上下顛倒混勻，靜置5min。
3.4℃下，12000r/min離心15min。
4.取400μl上清，加入到500μl C液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10min。
5.4℃下，12000r/min離心15min。
6.棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃下7500r/min離心5min。
7.空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μl E 液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。
8.將RNA提取液在95℃預(yù)熱5min。
9.取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到8μl F 液中，37℃下孵育1h；然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板。
10.分別取2μl RT-PCR反應(yīng)模板和陽(yáng)性對(duì)照H液加入到48μl G 液中，混勻后1000r/min離心10秒，置于PCR儀上。
11.按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃ 40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃ 7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12.反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl(擴(kuò)增產(chǎn)物)加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在231bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽(yáng)性對(duì)照在同一位置)，則為T(mén)SV陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶桃拉綜合癥病毒，否則為陰性(見(jiàn)圖1)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).RNA提取液A液，2管，內(nèi)裝Trizol液；2).B液，1管，內(nèi)裝氯仿；3).C液，1管，內(nèi)裝異丙醇；4).D液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝DEPC水；6).RT反應(yīng)液F液，1管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsin RI、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT；7).RT-PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液，包括含mg2+的10×Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE；F1為5’-TCAATGAGAGCTTGGTCC，R1為5’-TTCGCG CCG ACA GAT GAA；8).陽(yáng)性對(duì)照H液，1管，內(nèi)裝TSV陽(yáng)性模板；9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測(cè)對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品加A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min；2).在上述勻漿液中加入200μl B液，上下顛倒混勻，靜置5～10min；3).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；4).取400μl上清，加入到500μl C液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10～15min；5).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；6).棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃，7500～10000r/min離心5～10min；7).空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μl E液水溶解，得到RNA提取液；8).RNA提取液在95℃預(yù)熱5～10min；9).取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到8μl F液中，37℃孵育1h；然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板；10).分別取2μl RT-PCR反應(yīng)模板和陽(yáng)性對(duì)照H液加入到48μl G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃ 40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃ 7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察；若在與陽(yáng)性對(duì)照同一位置的231bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為桃拉綜合癥病毒陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶桃拉綜合癥病毒，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)蝦桃拉綜合癥病毒(TSV，Taura Syndrome Virus)的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒及檢測(cè)方法是以根據(jù)桃拉綜合癥病毒保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為主體而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明采用反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)技術(shù)，對(duì)桃拉綜合癥病毒的特異性RNA核酸片段進(jìn)行定性檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高；可用于對(duì)蝦各時(shí)期養(yǎng)殖過(guò)程中的病毒跟蹤檢測(cè)，也可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1580284SQ20041002724
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2004年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者何建國(guó), 黃志堅(jiān), 翁少萍, 陸輝 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 廣州漢坤生物科技有限公司