專利名稱：用于禽流感h5亞型實(shí)時(shí)熒光rt－pcr檢測(cè)的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高致病性禽流感H5亞型核苷酸片斷的RT-PCR擴(kuò)增引物和探針序列。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza，AI)也叫歐洲雞瘟或真性雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種急性高度接觸性傳染病，是國際公認(rèn)的一種毀滅性疾病，可以經(jīng)豬或其它動(dòng)物傳播給人，因此具有十分重要的生態(tài)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)意義，尤其是高致病性禽流感被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類傳染病。
近些年發(fā)現(xiàn)，禽流感不僅嚴(yán)重危害禽類，而且也危害哺乳動(dòng)物，尤其是可以感染人并致人死亡，極大地威脅著人類公共衛(wèi)生安全。禽流感病毒屬于RNA病毒，和所有的RNA病毒一樣，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，基因組轉(zhuǎn)錄時(shí)有較高的錯(cuò)誤率，而且其基因組是分節(jié)段的，極易發(fā)生重排，因此禽流感病毒具有高度的變異性。其基因組中編碼糖蛋白HA和NA的基因片段及編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2的基因片段，在不同的流感毒株之間存在較大差異，而其它基因在禽流感病毒基因組中相對(duì)保守。研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒的致病力主要取決于宿主與病毒之間的相互作用關(guān)系，而病毒的不同基因片段在決定病毒致病性方面也有不同的作用，其中起主要作用的是編碼HA蛋白的基因。通過對(duì)大量禽流感病毒HA核苷酸序列和氨基酸序列的分析、比較，發(fā)現(xiàn)HA裂解位點(diǎn)的氨基酸序列決定禽流感病毒的毒力，高致病性禽流感的HA裂解位點(diǎn)有6個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，而低致病性禽流感有2個(gè)堿性氨基酸。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ母咝聶z測(cè)技術(shù)，在許多領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，因此可以利用其解決禽流感病毒多血清型和高變異性給臨床檢測(cè)造成的難題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是于1996年首次推出的，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、檢測(cè)周期更短、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。
常規(guī)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴(kuò)增目的DNA片斷的技術(shù)。熒光實(shí)時(shí)RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，從而檢測(cè)不到該探針熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，而在PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在目的擴(kuò)增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，此時(shí)可以檢測(cè)到熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比。
由于禽流感病毒具有多個(gè)亞型且變異快，國內(nèi)外疫情的發(fā)生情況又較復(fù)雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準(zhǔn)確可靠、快速簡(jiǎn)便的高致病性禽流感檢測(cè)方法，用于快速檢測(cè)國內(nèi)外主要流行的高致病性禽流感病毒亞型，從而滿足進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫和疫病監(jiān)控的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)禽流感病毒H5亞型的PCR引物和探針序列。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案分析所有已報(bào)道的禽流感H5亞型基因組序列，分別設(shè)計(jì)引物和熒光探針。在常規(guī)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，添加一條標(biāo)記了兩個(gè)熒光基團(tuán)的核苷酸探針，熒光報(bào)告基團(tuán)(R)標(biāo)記在探針的5’端，熒光淬滅基團(tuán)(Q)標(biāo)記在探針的3’端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即熒光報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光可被熒光淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(tuán)(Q)的抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而進(jìn)行禽流感H5亞型的檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)原理見圖1。
用于檢測(cè)禽流感H5亞型的核苷酸擴(kuò)增用引物序列和探針序列包括由上游引物H5pf1673序列為GACCAGCTACCATGATTGCCA及互補(bǔ)序列為CTGGTCGATGGTACTAACGGT；和下游引物H5pr1600序列為GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG及互補(bǔ)序列為CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC組成的引物對(duì)，以及該引物對(duì)的上游引物位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基、向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列。探針H5pb1655序列為TGCTAGGGAACTCGCCA，互補(bǔ)序列為ACGATCCCTTGAGCGGT，及該探針向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
引物和探針設(shè)計(jì)通過分別對(duì)所有已經(jīng)報(bào)道的禽流感病毒H5亞型基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的引物區(qū)段設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長度一般為20個(gè)堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針序列如下H5pf16735’-GACCAGCTACCATGATTGCCA-3’H5pr16005’-GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG-3’H5pb16655’-TGCTAGGGAACTCGCCA-3’。
將上述引物、探針序列優(yōu)化組合后，建立檢測(cè)禽流感H5亞型的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，并制成用于檢測(cè)禽流感H5亞型的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的方法采用以下步驟(1)選取權(quán)利要求1-4中所述的引物和探針；(2)制備待測(cè)模板，提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA；(3)反應(yīng)體系的建立，a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定反轉(zhuǎn)錄酶(AMVRnaseXL)用量；d、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；e、確定dNTPs濃度；f、確定最佳探針濃度；(4)選擇儀器的檢測(cè)通道；(5)上機(jī)檢測(cè)。
禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法中的待測(cè)模板的制備可采用QIAamp Viral RNAMini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA。
本發(fā)明的顯著特點(diǎn)是充分運(yùn)用PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，具有結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、降低檢測(cè)成本、提高檢測(cè)效率等優(yōu)點(diǎn)。


圖1Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)原理圖。
圖2禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)曲線圖。
圖3禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的特異性試驗(yàn)檢測(cè)曲線圖。
圖4禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)檢測(cè)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化利用滅活的禽流感病毒H5亞型毒株作為待檢樣品，利用QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?br> (1)引物濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將H5的引物濃度分別從0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μmol/L。
(2)鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。
(3)反轉(zhuǎn)錄酶(AMV RnaseXL)用量的優(yōu)化經(jīng)過使用不同濃度AMV RNaseXL的試驗(yàn)結(jié)果比較，選定5U作為試劑盒反應(yīng)體系中AMV RnaseXL的用量。
(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定5U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。
(5)dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)估后選1mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。)(6)探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將禽流感H5亞型的探針濃度分別從0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.2μmol/L。
利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的禽流感H5實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系為25μl體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表1。
表1禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)中的各組分情況

注1.在多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體積不同時(shí)，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
2.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
3.根據(jù)檢測(cè)樣本來源不同，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整模板加量。
儀器檢測(cè)通道的選擇
在進(jìn)行禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對(duì)所用儀器中反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測(cè)通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。
實(shí)施例1(1)待測(cè)模板的制備方法一利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA，具體操作步驟如下a.取560μl含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的微量離心管中；b.加入140μl血漿、血清、尿樣、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或拭子的PBS清洗液，旋渦振蕩15sec；c.于室溫(15-25℃)下孵育10min；d.瞬時(shí)離心以便將蓋上的液體離心至離心管內(nèi)；e.再加入560μl無水乙醇，旋渦振蕩15sec，瞬時(shí)離心，將蓋上的液體離心至離心管內(nèi)；f.小心吸取630μl上述液體至QIAamp離心柱內(nèi)(置于2ml的收集管內(nèi))，不要弄濕管口邊緣，8000rpm離心1min。棄去含有液體的收集管，將QIAamp離心柱放置于另一2ml的收集管中；g.小心打開QIAamp離心柱蓋，重復(fù)步驟f；h.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW1緩沖液，8000rpm離心1min。將QIAamp離心柱放置于另一個(gè)干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管；i.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW2緩沖液，14000rpm離心3min。將QIAamp離心柱放置于另一個(gè)干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管，再次14000rpm離心1min；j.將QIAamp離心柱放置于一個(gè)干凈的1.5ml的離心管中，小心打開柱蓋，加入60μl AVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min后，8000rpm離心1min即獲得病毒RNA，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 方法二用Trizol核酸抽提試劑的提取方法a.收獲禽流感病毒致死雞胚的尿囊液，12000rpm離心去除大分子雜質(zhì)。將100μl上清液加入1.5ml的離心管中，再向其中加入300μl的TrizoL組織抽提液，于振蕩器上充分振蕩。然后13000rpm離心15min，將上清移至1.5ml的離心管中；
b.向上清液中加400μl的預(yù)冷異丙醇，在振蕩器上充分振蕩后；c.13000rpm離心10min以便獲得RNA沉淀；d.小心倒掉上清，加入600μl 75％乙醇，用手上下顛倒數(shù)次洗滌。(注意不能劇烈振蕩，防止RNA的斷裂和RNA沉淀溶解后難以重新沉淀)；e.13000rpm離心10min，緩慢吸棄上清，室溫干燥約25min，待乙醇完全揮發(fā)后加25-40μl無RNA酶的水溶解(充分彈動(dòng)混勻，或用槍反復(fù)吹打)，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> (2)禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件根據(jù)表1加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)熒光收集條件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下50℃30min進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，95℃3min滅活反轉(zhuǎn)錄酶；95℃15sec變性，55℃30sec退火，72℃1min延伸，如此重復(fù)5個(gè)循環(huán)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；95℃10sec變性，60℃40sec退火、延伸，如此重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
(3)禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果在25μl反應(yīng)體系中，利用針對(duì)禽流感H5亞型的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，檢測(cè)含有禽流感病毒H5亞型基因組RNA的陽性樣品，結(jié)果可以得到特異性的熒光曲線(圖2)。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針特異且工作性能良好，并建立了禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的方法。
實(shí)施例2禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的特異性試驗(yàn)在25μl反應(yīng)體系中，同時(shí)加入禽流感病毒H5、H7、H9亞型的基因組RNA作為模板，運(yùn)用針對(duì)禽流感H5亞型的引物、探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果只得到H5亞型的特異性熒光曲線，表明該方法只對(duì)H5亞型具有特異性擴(kuò)增，對(duì)H7、H9亞型無擴(kuò)增，證實(shí)本發(fā)明涉及的針對(duì)禽流感H5亞型的引物、探針具有很強(qiáng)的特異性(圖3)。
實(shí)施例3禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)在25μl禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系中，將禽流感病毒H5亞型的基因組RNA作10倍連續(xù)稀釋，進(jìn)行針對(duì)H5亞型的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR敏感性檢測(cè)，得到稀釋梯度系列擴(kuò)增曲線(圖4)。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明涉及的禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法敏感性很高，可以檢測(cè)到樣品中微量存在的禽流感H5亞型。
本發(fā)明提供的用于檢測(cè)禽流感H5亞型的熒光探針的使用進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性，從而可以達(dá)到省時(shí)省力、降低檢測(cè)成本、提高檢測(cè)速度和效率的目的。
本發(fā)明對(duì)禽流感H5亞型的檢測(cè)靈敏度為10-5，可以滿足各種樣品的檢測(cè)要求。
利用本發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便快速，一般可在2小時(shí)左右完成，而且可以在檢測(cè)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果，不需要進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳觀察，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物之間的污染以及電泳觀察時(shí)EB對(duì)環(huán)境的污染。
H5系列表序列表<110>深圳太太基因工程有限公司中華人民共和國深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>用于禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和探針序列<140>200410027814.0<141>2004-06-25<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gaccagctac catgattgcc a 21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2ggagtcaaat ttggaatcaa tgg 23<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ctggtcgatg gtactaacgg t 21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cctcagttta aaccttagtt acc 23<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>5
H5系列表tgctagggaa ctcgcca 17<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6acgatccctt gagcggt 1權(quán)利要求
1.一種用于禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H5pf1673的序列為GACCAGCTACCATGATTGCCA和下游引物H5pr1600的序列為GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG組成的引物對(duì)，以及上游引物的互補(bǔ)序列CTGGTCGATGGTACTAACGGT和下游引物的互補(bǔ)序列CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H5pf1673位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物H5pr1600位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基，向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列。
3.一種用于禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的探針序列，其特征在于所述的探針H5pb1655序列為TGCTAGGGAACTCGCCA，以及其互補(bǔ)序列ACGATCCCTTGAGCGGT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于禽流感H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H5pb1655向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
全文摘要
一種用于高致病性禽流感H5亞型核苷酸片斷的RT－PCR擴(kuò)增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物H5pf1673序列為GACCAGCTACCATGATTGCCA和下游引物H5pr1600序列為GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG組成的引物對(duì)，以及上游引物的互補(bǔ)序列CTGGTCGATGGTACTAACGGT和下游引物的互補(bǔ)序列 CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC，還包括上游引物H5pf1673位置向5’端方向延伸10個(gè)堿基，下游引物H5pr1600位置向3’端方向延伸10個(gè)堿基，向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列。探針序列包括探針H5pb 1655序列為TGCTAGGGAACTCGCCA及互補(bǔ)序列ACGATCCCTTGAGCGGT，以及該探針序列向3’端方向延伸10個(gè)堿基和向5’端方向延伸10個(gè)堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1693477SQ20041002781
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者肖性龍, 呂建強(qiáng), 秦智鋒, 林鏡中, 鐘安清, 劉勝利, 金顯忠 申請(qǐng)人:深圳太太基因工程有限公司, 中華人民共和國深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局