專利名稱：去氫表雄酮半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和抗體，還涉 及上述去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和抗體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)化學(xué)名為3(3-羥基雄甾
-5烯-17酮，分子量為288.4， CAS號為53-43-0，其結(jié)構(gòu)式為
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去氫表雄酮是人體腎上腺與性腺分泌的一種C19類固醇素，具有雄性 激素作用，可提高體內(nèi)的睪酮水平，是睪丸激素與雌激素的前體物質(zhì)。研 究發(fā)現(xiàn)其可以阻止內(nèi)臟脂肪的積累，增加肌肉胰島素的抵抗力。經(jīng)常使用 DHEA可能會改變脂肪酶的活性和(33受體激動(dòng)劑的密度，而(33受體為G 蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，興奮后能激動(dòng)腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使依賴cAMP 的脂肪酶活化，UCP表達(dá)增加，對胰島素的敏感性增加。這些作用可以使 體重減輕，糖尿病癥狀改善。同時(shí)，由于DHEA具有擬甲狀腺作用，因此 具有抑制食物和脂肪的攝入，同時(shí)可以增加能量消耗，刺激脂肪氧化，從 而起到一定的減肥作用，對肥胖者有一定的功效。
但是從DHEA的安全性考慮，如果DHEA過多攝入會造成許多并發(fā) 癥，如痤瘡，女性容易獲得男性第二性征以及減少女性體內(nèi)HDL-C，使胰 島素的敏感性和葡萄糖的忍受性受損。此外，飲用過量的DHEA會引起心 血管疾病，肝臟損害(主要包括肝臟腫大，肝臟器系數(shù)增大等)及某些性 激素相關(guān)的腫瘤發(fā)病增加等。1996年11月，去氫表雄酮被國際奧委會醫(yī) 學(xué)委員會列入禁用藥物名單。近年來，去氫表雄酮和其他內(nèi)源性類固醇激 素的濫用已成為一個(gè)嚴(yán)重的問題。含DHEA的保健食品已出現(xiàn)在國內(nèi)外市 場上。對保健食品中DHEA殘留的檢測目前主要采用高效液相色譜法 (HPLC)。然而應(yīng)用HPLC時(shí)其方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟 的影響很大，測定方法復(fù)雜、繁瑣，檢測通量小，檢測成本昂貴，不能實(shí) 現(xiàn)大批量樣品的快速檢測分析。因此，有必要研制更加簡單快捷方便的檢 測方法。
免疫檢測方法，是目前食品安全快速檢測的重要方法之一，檢測成本 很低，使用簡單，適合大量樣品的篩選檢測，已經(jīng)在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮 了重要作用。目前，尚未有保健食品中去氫表雄酮的免疫學(xué)檢測方法。
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種去氫表 雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工 抗原和抗體的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工 抗原和抗體的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種去氫表雄酮半抗原的分子結(jié)構(gòu)式為
白蛋體載—Cn(H2C)COCT v v n為2 4的自然數(shù)。 所述的n優(yōu)選為3。
所述的載體蛋白為BSA (牛血清白蛋白)、KLH (血藍(lán)蛋白)、CONA

發(fā)明內(nèi)容
HOOCn(H2C)COO
n為2 4的自然數(shù)。 所述的n優(yōu)選為3。
一種去氫表雄酮人工抗原的分子結(jié)構(gòu)式為:(伴刀豆球蛋白)、THY (甲狀腺球蛋白)或OVA (卵清蛋白)。
一種去氫表雄酮抗體為能與去氫表雄酮人工抗原發(fā)生特異性免疫反 應(yīng)的免疫球蛋白。
所述去氫表雄酮抗體優(yōu)選為辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體。 所述去氫表雄酮半抗原的制備方法，包括以下步驟
(1) 去氫表雄酮與酸酐按摩爾比1:1 1:8混合，加入無水吡啶至溶 解，同時(shí)加入與去氫表雄酮摩爾比為1:5 1:15的DMAP (1，4-二甲氨基吡 啶)作為催化劑，室溫反應(yīng)過夜；
(2) 反應(yīng)結(jié)束后加入5 15 ml的飽和鹽水中，繼續(xù)混勻5 20分鐘； 水不溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，取水層，重復(fù)萃取至少3次；
G)冷卻水層，再用鹽酸酸化水層，使其pH2 4，過濾，收集沉淀； (4)飽和鹽水洗滌沉淀至中性，干燥，得到去氫表雄酮半抗原。 所述的酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐的一種。 所述飽和鹽水為飽和氯化鈉溶液或飽和碳酸鈉溶液。 所述水不溶性有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、三氯甲垸、二氯甲烷或石油醚。 所述去氫表雄酮人工抗原的制備方法為活潑脂法或混合酸酐法。 所述活潑酯方法包括以下步驟
(1) 將30 50pmo1的去氫表雄酮半抗原溶解于1 2 ml 二甲基亞砜 (DMSO);
(2) 在步驟(1)的溶液中分別加入與去氫表雄酮等摩爾的DCC (N， N-二環(huán)己基碳二亞胺)和NHS (N-羥基琥珀酸亞胺)，室溫避光反應(yīng)過夜；
(3) 0 4。C離心，取上清液，將上清液緩慢加入到4 6ml0.1mol/L pH9.0 9.5碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，然后在4。C下反應(yīng)過夜；所述的碳 酸鹽緩沖液含有載體蛋白，其中載體蛋白的濃度為10 20mg/ml;
(4) 步驟(3)的溶液反應(yīng)完成后，將其裝入透析袋，再用生理鹽水 透析，得到去氫表雄酮人工抗原。
所述活潑脂法步驟(3)中的載體蛋白為BSA、 OVA、 KLH、 CONA 或THY。
所述的混合酸酐法包括以下步驟
(1) 將100 200pmo1去氫表雄酮半抗原溶于2 4ml二甲基甲酰胺 (DMF)中，再加入60 90nl正三丁胺，冰??；
(2) 接著，緩慢滴加0.1 0.2mmol氯甲酸異丁酯到步驟(1)的溶液中，0 4'C反應(yīng)0.5 1小時(shí)，得到甲液；將60 80mg載體蛋白溶于4 6mllmol/LpH9.0 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，得到乙液；將甲液緩 慢滴加到乙液中，4'C反應(yīng)過夜；
(3)步驟(2)的溶液反應(yīng)完成后，將其裝入透析袋，再用生理鹽水 透析，得到去氫表雄酮人工抗原。
所述混合酸酐法步驟(2)中的載體蛋白為BSA、 KLH、 CONA、 THY 或OVA。
所述去氫表雄酮抗體的制備方法，具體步驟如下
(1) 實(shí)驗(yàn)選用健康的雄性小鼠或雄性兔作為實(shí)驗(yàn)對象，免疫劑量基
礎(chǔ)免疫為0.25 lmg/kg，使用抗原與弗氏完全佐劑乳化免疫，加強(qiáng)免疫為 0.5 1 mg/kg，使用抗原與弗氏不完全佐劑乳化免疫。雄性兔子采用背部 皮下多點(diǎn)注射，雄性小鼠采用腹腔注射，基礎(chǔ)免疫15 20天后進(jìn)行加強(qiáng) 免疫，每隔15天加強(qiáng)免疫一次，第4次加強(qiáng)免疫后8 10天內(nèi)，耳緣靜 脈采血，測定效價(jià)和特異性，待其血清效價(jià)和特異性合格后，兔子采用心 臟采血，分離出抗血清；或用小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞， 進(jìn)而獲得單克隆抗體(劉秀梵，《單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用》)；
(2) 采用辛酸-硫酸銨法或采用蛋白A親和層析法，得到兔抗血清或 是小鼠腹水中的免疫球蛋白G;所述的免疫球蛋白G是去氫表雄酮抗體。
所述去氫表雄酮抗體的制備方法步驟(1)中的雄性小鼠優(yōu)選為雄性 Balb/c小鼠，雄性兔優(yōu)選為雄性新西蘭兔。
所述的去氫表雄酮抗體特異性、效價(jià)、親和力高。
所述辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體的制備方法為過碘酸鹽氧 化法，純化方法同所述去氫表雄酮抗體的制備方法步驟(2)。
所述的去氫表雄酮抗體應(yīng)用于去氫表雄酮含量的免疫檢測。
所述的去氫表雄酮特抗體應(yīng)用于食品中去氫表雄酮含量的免疫檢測， 特別是應(yīng)用于減肥類保健食品中去氫表雄酮含量的免疫檢測。
所述的免疫檢測為酶聯(lián)免疫吸附劑測定(即ELISA)。
本發(fā)明的原理由于去氫表雄酮是小分子物質(zhì)(分子量小于1000)， 本身不具有免疫原性，必須與大分子載體偶聯(lián)制備人工抗原，才能誘導(dǎo)特 異性抗體的產(chǎn)生。由于去氫表雄酮本身并不具有活性基團(tuán)，不能與大分子 載體偶聯(lián)，因此需要對去氫表雄酮分子進(jìn)行改造，引入活性基團(tuán)(-COOH、 -NH2、 -OH等)，合成去氫表雄酮半抗原。本發(fā)明以去氫表雄酮為原料，與酸酐反應(yīng)生成含羧基的去氫表雄酮半抗原；然后通過活潑脂法或者混合 酸酐法將去氫表雄酮半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備去氫表雄酮人工抗原。將去 氫表雄酮人工抗原免疫動(dòng)物后產(chǎn)生對去氫表雄酮高特異性抗體。再將去氫 表雄酮抗體與辣根過氧化物結(jié)合，得到辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗 體。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果-
(1) 本發(fā)明制備的去氫表雄酮半抗原，其純化方法與國外已有技術(shù) 相比，更為簡單快速，使用萃取的方法取代了原來的柱層析方法；
(2) 本發(fā)明制備的去氫表雄酮抗體的親合力高，可以在90分鐘內(nèi)實(shí) 現(xiàn)檢測；
(3) 應(yīng)用本發(fā)明制備的去氫表雄酮人工抗原和抗體的免疫檢測分析 方法，與儀器方法相比較，其檢測成本低，其成本只是儀器檢測的1/10 左右；
(4) 應(yīng)用本發(fā)明制備的去氫表雄酮人工抗原和抗體的免疫檢測分析 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，其檢測線性檢測范圍為5.7 279.3ng/ml，最低 檢測限為1.5 ng/ml;
(5) 應(yīng)用本發(fā)明制備的的去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和 抗體的免疫檢測分析方法能夠同時(shí)檢測大批量的樣品，速度較快，方便操 作，因此本發(fā)明制備的的去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和抗體適 用于去氫表雄酮含量的現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析。


圖1為去氫表雄酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí) 施方式不限于此。 實(shí)施例1
(1)去氫表雄酮半抗原(n=3)的制備，如下反應(yīng)式所示-將250mg (0.827 mmol) DHAE， 511 mg (4.48mmo1)戊二酸酐與11mg (90 nmol)的DMAP溶于1 ml的無水吡啶中，在室溫下攪拌反應(yīng)23小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入10 ml飽和碳酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘；然后使用乙酸乙酯萃取，取水層，重復(fù)萃取3次；冷卻水層，并用2mol/L的鹽酸酸化水層，使其pH為3，過濾，收集沉淀；使用飽和碳酸鈉溶液洗滌沉淀至中性，然后真空干燥沉淀，得到去氫表雄酮半抗原。
(2) 去氫表雄酮人工抗原的制備，采用活潑酯法制備免疫抗原，混合酸酐法制備包被抗原-
免疫抗原的制備將50 pmol的去氫表雄酮半抗原溶解于1.5 ml的DMSO中，然后在該溶液里加入50拜olDCC和50 pmolNHS，室溫避光反應(yīng)過夜，4"C離心棄沉淀，留上清液；將上清液其緩慢加入到6ml0.1mol/LpH9.5的含有載體蛋白BSA的Na2C03-NaHC03緩沖液中，其中BSA的濃度為15mg/ml。混合物在4'C下反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8 14kD的透析袋，然后用質(zhì)量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到去氫表雄酮人工抗原(DHEA-BSA)。
包被抗原的制備將lOOpmol去氫表雄酮半抗原溶于2ml無水DMF中，加入60^il正三丁胺，冰浴下緩慢滴加0.15mmol氯甲酸異丁酯，4'C攪拌反應(yīng)1小時(shí)，得到甲液；將80mg OVA溶于4ml lmol/L pH9.6的Na2C03-NaHC03緩沖液中，得到乙液；將甲液緩慢滴加到乙液中，4'C磁力攪拌反應(yīng)過夜，待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8 14kD的透析袋，然后用質(zhì)量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到去氫表雄酮人工抗原(DHEA-OVA)。
按照分光光度法測定去氫表雄酮半抗原、載體蛋白以及去氫表雄酮人工抗原的最大吸收值，計(jì)算去氫表雄酮人工抗原的偶聯(lián)比。掃描波長為200 400nm，計(jì)算得到去氫表雄酮半抗原與BSA的偶聯(lián)比為14.1:1，去氫表雄酮半抗原與OVA的偶聯(lián)比為8.2:1。
(3) 兔去氫表雄酮抗體的制備
10實(shí)驗(yàn)選用2 3月、體重2 2.5 kg健康雄性的新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)對象，同時(shí)免疫兩只兔子，基礎(chǔ)免疫劑量為0.5mg/kg，使用DHEA-BSA抗原與弗氏完全佐劑乳化免疫；加強(qiáng)免疫劑量為1 mg/kg，使用DHEA-BSA抗原與弗氏不完全佐劑乳化免疫。采用背部皮下多點(diǎn)注射，基礎(chǔ)免疫20天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每隔15天加強(qiáng)免疫一次，第4次免疫后8 10天內(nèi)，耳緣靜脈采血，測定效價(jià)，待其血清效價(jià)穩(wěn)定不再增長后，兔子采用心臟采血，分離出抗血清。得到的抗血清的效價(jià)為1/320000。
抗血清采用辛酸-硫酸銨鹽析法純化在抗血清內(nèi)加入同抗血清等體積的pH4.0、 60 mmol/L醋酸鹽緩沖液，并用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至4.5。在振蕩下滴加正辛酸(33 pl/ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘，4X:靜置1小時(shí)，然后在4 'C10000rpm離心30分鐘。棄沉淀，取上清液，用定性濾紙過濾，加入0.1mol/LPBS，用1 mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，在4。C條件下預(yù)冷15分鐘。每毫升混合液加入0.277 g硫酸銨，攪拌30分鐘后在4T:冰箱內(nèi)靜置2 3小時(shí)，10000 rpm離心30分鐘，棄上清。沉淀用少量0.01 mol/L PBS溶解，并于4。C下在pH7.4 0.01mol/LPBS中透析，每天換液3 5次，得到純化的兔去氫表雄酮抗體。
抗體特異性的檢測將純化的兔去氫表雄酮抗體與與去氫表雄酮相似的抗原混合，測兩者之間的結(jié)合率。純化的兔去氫表雄酮抗體與雄烯二酮、甲基睪丸酮、孕酮、皮質(zhì)醇、雌二醇或L-甲狀腺素鈉的結(jié)合率分別為10.0%、0.04%、 0.52%、 0.06%、 0.01%和小于0.01%，可知制備得到的兔去氫表雄酮抗體的特異性較好。
(4)辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體的制備，具體步驟為稱5 mgHRP溶解于1 ml蒸餾水中，加入0.2 ml新配制的0.1 mol/L過碘酸鈉，室溫下避光攪拌20min。反應(yīng)完后裝入透析袋，用0.001 mol/L pH 4.4醋酸鹽緩沖液在4 。C透析過夜。加20 pl 0.2 mol/L碳酸緩沖液，然后立即加入1 mL含有10 mg純化抗體的0.01 ml/L pH9.0-9.5的Na2C03-NaHC03緩沖液。室溫避光反應(yīng)2小時(shí)。加入100ial4mg/mL硼氫化鈉，4 'C冰箱反應(yīng)2小時(shí)；然后按上述辛酸-硫酸銨鹽析法純化方法進(jìn)行純化。
實(shí)施例2
(1)去氫表雄酮半抗原(n=2)的制備，如下反應(yīng)式所示將250mg (0.827 mmol) DHAE， 120mg (0.827 mmol) 丁二酸酐與20 mg( 165 pmol)的DMAP溶于2 ml的無水吡啶中，在室溫下攪拌反應(yīng)23小 時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入5ml的飽和氯化鈉溶液中，繼續(xù)攪拌20min; 二氯甲烷 萃取，取水層，重復(fù)萃取3次；冷卻水層，并用2mol/L的鹽酸酸化水層， 使其pH為2，過濾，收集沉淀；使用飽和氯化鈉溶液洗滌沉淀至中性，然 后干燥沉淀，得到去氫表雄酮半抗原。
(2) 去氫表雄酮人工抗原的制備，采用活潑酯法制備免疫抗原，混合 酸酐法制備包被抗原
免疫抗原的制備:將30 pmol的去氫表雄酮半抗原溶解于1 ml的DMSO 中，然后在該溶液里加入30pmolDCC和30^imolNHS,室溫避光反應(yīng)過 夜，4。C離心棄沉淀，留上清液;將上清液其緩慢加入到4 ml O.lmol/L pH9.0 的含有載體蛋白BSA的Na2C03-NaHC03緩沖液中，其中BSA的濃度為10 mg/ml?；旌衔镌?'C下反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8-14kD的透 析袋，然后用質(zhì)量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到去氫表雄酮人工 抗原(DHEA-BSA)。
包被抗原的制備將150pmol去氫表雄酮半抗原溶于3 ml無水DMF 中，加入80^d正三丁胺，冰浴下緩慢滴加0.1mmol氯甲酸異丁酯，4。C攪 拌反應(yīng)0.5小時(shí)，得到甲液；將60 mg KLH溶于5 ml lmol/L pH 9.0的 Na2C03-NaHC03緩沖液中，得到乙液；將甲液緩慢滴加到乙液中，4'C磁力 攪拌反應(yīng)過夜，待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8 14kD的透析袋，然后用質(zhì) 量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到去氫表雄酮人工抗原 (DHEA-KLH)。
按照分光光度法測定去氫表雄酮半抗原、載體蛋白以及去氫表雄酮人 工抗原的最大吸收值，計(jì)算去氫表雄酮人工抗原的偶聯(lián)比。掃描波長為 200 400nm，計(jì)算得到去氫表雄酮半抗原與BSA的偶聯(lián)比為17.5:1 ，去 氫表雄酮半抗原與KLH的偶聯(lián)比為10.3:1。
(3) 兔去氫表雄酮抗體的制備按照實(shí)施例1步驟(3)進(jìn)行兔抗體 的制備。實(shí)施例3
(1)去氫表雄酮半抗原(n=4)的制備，如下反應(yīng)式所示:
將250mg (0.827 mmol) DHAE， 680 mg (6.62mmo1)己二酸酐與6.7 mg (55 (imol)的DMAP溶于lml的無水吡瞎中，在室溫下攪拌反應(yīng)23小 時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入15ml的飽和碳酸鈉中，繼續(xù)攪拌5min;石油醚萃取， 取水層，重復(fù)萃取3次；冷卻水層，并用2 mol/L的鹽酸酸化水層，使其 pH為4，過濾，收集沉淀；使用飽和鹽水洗滌沉淀至中性，然后干燥沉淀， 得到去氫表雄酮半抗原。
(2)去氫表雄酮人工抗原的制備，采用活潑酯法制備免疫抗原，混合 酸酐法制備包被抗原
免疫抗原的制備將40 pmol的去氫表雄酮半抗原溶解于1.2 ml的 DMSO中，然后在該溶液里加入40 nmolDCC和40 j^molNHS，室溫避光 反應(yīng)過夜，4'C離心棄沉淀，留上清液；將上清液其緩慢加入到5 ml 0.1mol/L pH9.3的含有載體蛋白OVA的Na2C03-NaHC03緩沖液中，其中OVA的濃 度為20mg/ml?；旌衔镌趂C下反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8 14kD的透析袋，然后用質(zhì)量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到去氫 表雄酮人工抗原(DHEA-OVA)。
包被抗原的制備將20(^mol去氫表雄酮半抗原溶于4 ml無水DMF 中，加入90pl正三丁胺，冰浴下緩慢滴加0.211111101氯甲酸異丁酯，4'C攪 拌反應(yīng)1小時(shí)，得到甲液；將80 mg THY溶于6 ml lmol/L pH9.5的 Na2CCVNaHC03緩沖液中，得到乙液；將甲液緩慢滴加到乙液中，(C磁力 攪拌反應(yīng)過夜，待反應(yīng)完成后，裝入孔徑為8 14kD的透析袋，然后用質(zhì) 量百分比0.9%的生理鹽水透析3天，得到透析好去氫表雄酮人工抗原 (DHEA-THY)。
按照分光光度法測定去氫表雄酮半抗原、載體蛋白以及去氫表雄酮人 工抗原的最大吸收值，計(jì)算去氫表雄酮人工抗原的偶聯(lián)比。掃描波長為 200 400nm，計(jì)算得到去氫表雄酮半抗原與OVA的偶聯(lián)比為15.2:1 ，去氫表雄酮半抗原與THY的偶聯(lián)比為8.6:1。
(3)兔去氫表雄酮抗體的制備按照實(shí)施例1步驟(3)進(jìn)行兔抗體 的制備。
實(shí)施例4
使用實(shí)施例1制備得到到的DHEA-VOA和辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表 雄酮抗體進(jìn)行免疫檢測。
(1) 包被在96孔酶標(biāo)板上每孔加入lOOpl含有DHEA-VOA包被抗 原的包被液，4'C過夜；包被液中DHEA-VOA包被抗原的濃度為100ng/ml;
(2) 封閉取出包被好的酶標(biāo)板，使用PBST (磷酸鹽吐溫20緩沖溶 液)洗板兩次，每孔加入120 pl脫脂牛奶封閉液，與37"C溫箱中溫育3小 時(shí)后將脫脂牛奶封閉液甩干，置烘箱1小時(shí)；
(3) 加樣在封閉好的酶標(biāo)板中每孔加入經(jīng)系列稀釋制備的去氫表雄 酮標(biāo)準(zhǔn)液50pl，濃度梯度(單位為ng/ml)為0、 1、 5、 25、 125、 625、 3125、 10000，再加入抗體稀釋液稀釋2500倍的辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮 抗體50(il，在室溫下反應(yīng)30分鐘，使用PBST洗液洗板6次；
(4) 顯色每孔加入底物TMB-過氧化氫溶液100 W，即的 O.lmol/L的TMB與2^1 30%的過氧化氫溶液混合，使用10ml底物緩沖液稀 釋；，室溫顯色10分鐘后用50 10%的H2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上450 nm波長下測吸光值。根據(jù)百分吸光度值與去氫表雄酮濃度之間的半對數(shù)關(guān) 系按照四參數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示
其中所述百分吸光度值的計(jì)算式為 百分吸光度值(％)= (B/B0) X100
B為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光值，B0為0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。 實(shí)施例1制備得到到的DHEA-VOA和辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體 對去氫表雄酮線性檢測范圍為5.7-279.3 ng/mL，最低檢測限為1.5 ng/ml。 其方法的批內(nèi)平均變異系數(shù)為10.32%，其批間平均變異系數(shù)為14.5%。
表1 ELISA的基本參數(shù)
抗原濃度抗體倍數(shù)檢測時(shí)間檢領(lǐng)!j溫度線性范圍檢測限
謹(jǐn)ng/ml2500倍90 min37 。C5.7畫279.3ng/ml1.5 ng/ml
14實(shí)施例6:
將減肥茶樣品使用研缽磨碎后，稱取lg置于三角瓶中。使用甲醇:水-8:2 作為提取液，在超聲波上超聲20min。超聲提取后使用離心方法將上清液 與沉淀分離。上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸干后，使用20%的甲醇溶解，再使用二氯甲 烷萃取，將目標(biāo)物萃取至二氯甲烷層，蒸干二氯甲垸層，使用10%甲醇溶 解并定容至10ml，使用實(shí)施例1制備得到到的DHEA-OVA和辣根過氧化 物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體進(jìn)行免疫學(xué)方法檢測，得到方法的平均回收率為 81.59%，平均變異系數(shù)為12.59%。由于方法的準(zhǔn)確度是使用加標(biāo)回收率 來評價(jià)的，回收率在80% 120°/。之間，表明該方法準(zhǔn)確，可以進(jìn)行實(shí)際 應(yīng)用；變異系數(shù)表示方法的重復(fù)性， 一般CV〈15M時(shí)，表明方法的重復(fù)性 好。可見應(yīng)用本發(fā)明所制備的去氫表雄酮人工抗原及其抗體的免疫學(xué)檢測 方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上 述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種去氫表雄酮半抗原，其特征在于分子結(jié)構(gòu)式為n為2～4的自然數(shù)。
2、 一種去氫表雄酮人工抗原，是由權(quán)利要求1所述的去氫表雄酮人 半抗原與載體蛋白結(jié)合而成，其特征在于所述去氫表雄酮人工抗原分子 結(jié)構(gòu)式為-白蛋體載—Cn(H2C)C00 v v n為2 4的自然數(shù)；所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、伴 刀豆球蛋白、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白的一種。
3、 一種去氫表雄酮抗體，是能與權(quán)利要求2所述的去氫表雄酮人工 抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的去氫表雄酮抗體，其特征在于所述的去 氫表雄酮抗體為辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體。
5、 權(quán)利要求1所述去氫表雄酮半抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 去氫表雄酮與酸酐按摩爾比1:1 :18混合，加入無水吡啶至溶 解，同時(shí)加入與去氫表雄酮摩爾比為1:5 :115的1,4-二甲氨基吡啶作為催 化劑，室溫反應(yīng)過夜；(2) 反應(yīng)結(jié)束后加入5 15 ml的飽和鹽水中，繼續(xù)混勻5 20分鐘； 水不溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，取水層，重復(fù)萃取至少3次；G)冷卻水層，再用鹽酸酸化水層，使其pH2 4，過濾，收集沉淀; (4)飽和鹽水洗滌沉淀至中性，干燥，得到去氫表雄酮半抗原。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述去氫表雄酮半抗原的制備方法，其特征在于: 所述的酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐的一種；所述飽和鹽水為飽和氯化鈉溶液或飽和碳酸鈉溶液；所述水不溶性有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、三 氯甲烷、二氯甲烷或石油醚。
7、 權(quán)利要求2所述去氫表雄酮人工抗原的制備方法為活潑脂法或混 合酸酐法，其特征在于所述活潑酯方法包括以下步驟 (1 )將30 5Oprno1的去氫表雄酮半抗原溶解于1 2 ml二甲基亞砜；(2) 在步驟(1)的溶液中分別加入與去氫表雄酮等摩爾的N， N-二 環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酸亞胺，室溫避光反應(yīng)過夜；(3) 0 4。C離心，取上清液，將上清液緩慢加入到4 6ml0.1mol/L pH9.0 9.5碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，然后在4'C下反應(yīng)過夜；所述的碳 酸鹽緩沖液含有載體蛋白，其中載體蛋白的濃度為10 20mg/ml;(4) 步驟(3)的溶液反應(yīng)完成后，將其裝入透析袋，再用生理鹽水 透析，得到去氫表雄酮人工抗原；所述活潑脂法歩驟(3)中的載體蛋白為為牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、 伴刀豆球蛋白、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白的一種； 所述的混合酸酐法包括以下步驟(1) 將100 200pmo1去氫表雄酮半抗原溶于2 4 ml 二甲基甲酰 胺中，再加入60 90pl正三丁胺，冰??；(2) 接著，緩慢滴加0.1 0.2 mmol氯甲酸異丁酯到步驟(1)的溶 液中，0 4°。反應(yīng)0.5 1小時(shí)，得到甲液；將60 80mg載體蛋白溶于4 6mllmol/LpH9.0 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，得到乙液；將甲液緩 慢滴加到乙液中，4t反應(yīng)過夜；(3) 步驟(2)的溶液反應(yīng)完成后，將其裝入透析袋，再用生理鹽水 透析，得到去氫表雄酮人工抗原；所述混合酸酐法步驟(2)中的載體蛋白為為牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋 白、伴刀豆球蛋白、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白的一種。
8、 權(quán)利要求4所述去氫表雄酮抗體的制備方法，其特征在于(1)實(shí)驗(yàn)選用健康的雄性小鼠或雄性兔作為實(shí)驗(yàn)對象，免疫劑量基 礎(chǔ)免疫為0.25 lmg/kg，使用抗原與弗氏完全佐劑乳化免疫，加強(qiáng)免疫為 0.5 1 mg/kg，使用抗原與弗氏不完全佐劑乳化免疫。雄性兔子采用背部 皮下多點(diǎn)注射，雄性小鼠采用腹腔注射，基礎(chǔ)免疫15 20天后進(jìn)行加強(qiáng) 免疫，每隔15天加強(qiáng)免疫一次，第4次加強(qiáng)免疫后8 10天內(nèi)，耳緣靜脈采血，測定效價(jià)和特異性，待其血清效價(jià)和特異性合格后，兔子采用心臟采血，分離出抗血清；或用小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞， 進(jìn)而獲得單克隆抗體；(2) 采用辛酸-硫酸銨法或采用蛋白A親和層析法，得到兔抗血清或 是小鼠腹水中的免疫球蛋白G;所述的免疫球蛋白G是去氫表雄酮抗體；(3) 辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體的制備方法為過碘酸鹽氧 化法，純化方法同步驟(2)所述純化方法。
9、權(quán)利要求3或4所述的去氫表雄酮抗體的應(yīng)用，其特征在于所述去氫表雄酮抗體應(yīng)用于去氫表雄酮含量的免疫檢測。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述去氫表雄酮抗體的應(yīng)用，其特征在于所述 的去氫表雄酮抗體應(yīng)用于減肥類保健食品中去氫表雄酮含量的免疫檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去氫表雄酮半抗原及其相應(yīng)的人工抗原和抗體，同時(shí)本發(fā)明也公開了所述去氫表雄酮半抗原、人工抗原和抗體的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明以去氫表雄酮為原料，與酸酐反應(yīng)生成含羧基的去氫表雄酮半抗原；然后通過活潑脂法或者混合酸酐法將去氫表雄酮半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備去氫表雄酮人工抗原。將去氫表雄酮人工抗原免疫動(dòng)物后產(chǎn)生對去氫表雄酮高特異性抗體。再將去氫表雄酮抗體與辣根過氧化物結(jié)合，得到辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體。應(yīng)用所述辣根過氧化物標(biāo)記的去氫表雄酮抗體和去氫表雄酮人工抗原免疫檢測方法可用于去氫表雄酮現(xiàn)場快速檢測，對實(shí)現(xiàn)保健食品安全的快速檢測具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號C07K14/765GK101538307SQ20091003902
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 徐曉艷, 楊金易, 沈玉棟, 弘 王, 敏 石, 雷紅濤 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)