專利名稱：胰高血糖素樣肽-1衍生物及其制藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性肽領(lǐng)域，即涉及胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)的新型延長(zhǎng)型肽衍 生物。
背景技術(shù)：
已使用一系列不同的方法修飾GLP-I化合物的結(jié)構(gòu)，以便提供更長(zhǎng)的體內(nèi)作用時(shí)程。WO 2006/097535公開(kāi)了具有分泌素樣活性的胰高血糖素家族的多種肽激動(dòng)劑及 其治療用途。在其實(shí)施例3和5中公開(kāi)了包含修飾的GLP-I (7-37)序列的GLP-I (7-37)衍 生物。然而，這些衍生物在22位不具有Glu殘基，以及在26位不具有Arg殘基。WO 01/04156公開(kāi)了降低血糖水平的肽。其化合物4、5、6、7、10、11、12和13為 GLP-I衍生物，然而，這些化合物沒(méi)有一個(gè)在22位具有Glu殘基和在26位具有Arg殘基。EP 1364967公開(kāi)了胰高血糖素樣促胰島素肽、組合物和方法。其實(shí)施例1的5種 GLP-I組合物沒(méi)有一個(gè)包含在22位具有Glu且在26位具有Arg的修飾的GLP-I序列。WO 98/08871公開(kāi)了延長(zhǎng)的GLP-1衍生物，包括利拉魯肽(Iiraglutide)，其為 GLP-I衍生物，每日給予1次，由Novo NordiskA/S開(kāi)發(fā)。預(yù)期利拉魯肽從2009年起上市治 療2型糖尿病。利拉魯肽在22位不具有Glu，在26位不具有Arg。在該參考文獻(xiàn)的實(shí)施例 30中公開(kāi)的衍生物具有，但在18、20、23、30、31、34、36、37或39位未被衍生化。WO 2005/027978公開(kāi)了新的GLP-1衍生物，包括三種，其包含在22位具有Glu且 在26位具有Arg的修飾的GLP-I (7-37)序列。然而，這些衍生物在18、20、23、30、31、34、 36、37或39位未被衍生化。在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日后公布的Runge等人(Journal of BiologicalChemistry, 283卷，第17章，11340-11347頁(yè))公開(kāi)了配體結(jié)合的GLP-I受體的胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。許多糖尿病患者，尤其是處于2型糖尿病的患者存在所謂的“注射恐懼癥 (needle-phobia) ”，即極為畏懼自己注射。在2型糖尿病中，大部分患者用口服降糖藥物治 療，且因?yàn)轭A(yù)期GLP-I化合物是將給予這些患者的注射藥品，所以畏懼注射可能成為廣泛 使用這樣的臨床上非常有前景的化合物的嚴(yán)重障礙。因此，需要開(kāi)發(fā)可低于每日1次給予 的新化合物，例如每2天或3天給予1次，優(yōu)選每周給予1次，同時(shí)保留可接受的臨床特點(diǎn)， 或者任選經(jīng)由非侵入性給予，例如肺部給予、鼻給予、舌下給予、口頰給予或經(jīng)口給予。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供在化學(xué)上、物理上和酶學(xué)上穩(wěn)定的GLP-I衍生物，其優(yōu) 選具有高α-螺旋含量。本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供長(zhǎng)效(即具有上述給予方案)的GLP-I衍生物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供具有高效力(受體親和性)的GLP-I衍生物，以便降 低治療劑量，例如用于每周1次皮下給藥或者替代地非侵入性傳遞。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供對(duì)GLP-I受體(GLP-IR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有高結(jié)合親 和力的GLP-I衍生物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供具有高白蛋白結(jié)合親和力的GLP-I衍生物，其保護(hù)所述肽免于蛋白水解降解并降低所述肽的腎清除率。效力、穩(wěn)定性、半衰期、對(duì)白蛋白的結(jié)合親和力以及對(duì)GLP-I受體的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效、穩(wěn)定、治療有效、有潛力每周給予1次的GLP-I衍生物的整體目標(biāo) 的潛在相關(guān)特性。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包含修飾的GLP-I (7-37)序列的GLP-I衍生物，所述修 飾的GLP-I (7-37)序列具有:i)與GLP-I (7-37) (SEQ IDNo 1)相比總共2-12個(gè)氨基酸修 飾，包括a)在等同于GLP-I (7-37)的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于GLP-I (7_37) 的26位的位置的Arg殘基；和ii)在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化 等同于 GLP-I (7-37)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。又一方面，提供本發(fā)明的衍生物的藥物組合物、方法和用途。發(fā)明描述定義和優(yōu)選實(shí)施方案在本說(shuō)明書(shū)中，以下術(shù)語(yǔ)具有所示含義本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”和“肽”是指由通過(guò)肽鍵連接的至少5個(gè)組成氨基酸組成 的化合物。組成氨基酸可以來(lái)自由遺傳密碼編碼的氨基酸，它們可以為不是由遺傳密碼編 碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不是由遺傳密碼編碼的天然氨基酸為例如Y-羧基谷 氨酸、鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的 氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨 基異丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、β -丙氨酸、3_氨基甲基苯甲酸、鄰 氨基苯甲酸。22種形成蛋白質(zhì)的氨基酸為丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。因此，非形成蛋白質(zhì)的氨基酸(其也可以被稱為非天然氨基酸)是可以經(jīng)由肽鍵 摻入到肽中的部分，但不是形成蛋白質(zhì)的氨基酸。實(shí)例為Y-羧基谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲 氨酸、D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺)。合成的非形成蛋白質(zhì)的氨基酸包括 通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和 D-亮氨酸、Aib ( α -氨基異丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、3_氨基甲 基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、去_氨基-組氨酸(縮寫為去氨基His，替代名稱咪唑并丙酸，縮 寫Impr)、氨基酸的β類似物(例如β -丙氨酸等)、D-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β -羥 基_組氨酸、高組氨酸、N α -乙?；?組氨酸、α -氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、α， α - 二甲基-谷氨酸、Hi-CF3-苯丙氨酸(簡(jiǎn)寫Hi-CF3-Phe)、α，β - 二氨基丙酸(簡(jiǎn)寫Dap)、 3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸、(1-氨基環(huán)丙基)甲酸、(1-氨基環(huán)丁基) 甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨基環(huán) 辛基)甲酸。本文在提到多肽時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“類似物”是指修飾的肽，其中所述肽的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸殘基已被其它氨基酸殘基取代，和/或其中在所述肽的C-末端的一個(gè)氨基酸殘基已 由所述肽缺失，或者其中在所述肽的C-末端添加了一個(gè)氨基酸殘基。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“修飾的肽”是指如上定義的修飾的肽。對(duì)于本發(fā)明用途，該術(shù)語(yǔ) 可以與術(shù)語(yǔ)“修飾的肽序列，，互換使用。與此相符，術(shù)語(yǔ)“修飾，，在本文與肽序列關(guān)聯(lián)使用 時(shí)是指氨基酸取代、添加和/或缺失。對(duì)于本發(fā)明用途，任意的氨基酸取代、缺失和/或添加是指人GLP-I (7-37)的序 列，其在本文作為SEQ ID No:l納入。然而，序列表中的氨基酸殘基的編號(hào)總是以1開(kāi)始， 而對(duì)于本發(fā)明用途，我們依從本領(lǐng)域現(xiàn)有的實(shí)踐想以第7位的氨基酸殘基開(kāi)始，并為其指 定編號(hào)7。因此，一般而言，本文對(duì)GLP-I (7-37)序列的位置編號(hào)的任何提及均是指以7位 的His開(kāi)始并以37位的Gly結(jié)束的序列。經(jīng)常使用簡(jiǎn)單的體系描述類似物例如[Arg34] GLP-I (7-37) Lys是指這樣的 GLP-I (7-37)類似物在34位的天然賴氨酸已被精氨酸取代，并且在C-末端氨基酸殘基 (即Gly37)上添加了一個(gè)賴氨酸。該GLP-I類似物因此與GLP-I (7-37)相比具有兩個(gè)氨基 酸修飾，即一個(gè)取代和一個(gè)添加。表述“等同于......的位置”在本文用于表征修飾的GLP-I (7-37)序列時(shí)，是
指天然GLP-I (7-37)序列(具有SEQ ID No :1的序列)中的相應(yīng)位置。相應(yīng)的位置易 于例如通過(guò)簡(jiǎn)單的手寫和目測(cè)來(lái)推斷。替代地，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)或肽比對(duì)程序，例 如為Needleman-Wunsch比對(duì)的“比對(duì)”。所述算法描述于Needleman，S. B.和Wunsch， C. D. , (1970), Journal of Molecular Biology，48 :443_453，以及 Myers 和 W. Miller 載 于"Optimal Alignments in Linear Space，，CABIOS(computer applicationsin the biosciences) (1988)4 :11-17的比對(duì)程序。為了比對(duì)，可以使用默認(rèn)的計(jì)分矩陣BL0SUM50 和默認(rèn)的單位矩陣，在空位中的第一個(gè)殘基的罰分可以設(shè)定為-12，在空位中的附加殘基的 罰分為-2。作為另一個(gè)實(shí)例，本文的實(shí)施例1的GLP-I衍生物包含以下的修飾的GLP-I (7-37) 序列:[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)酰胺，其具有總共5個(gè)氨基 酸修飾(在此情況下所有的取代)，包括在等同于GLP-I (7-37)的22位的位置的Glu和在 等同于GLP-I (7-37)的26位的位置的Arg。未指明光學(xué)異構(gòu)體的所有氨基酸都被理解為是指L-異構(gòu)體。本文關(guān)聯(lián)肽使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指化學(xué)修飾的肽或其類似物，其中至少一個(gè)取 代在未修飾的肽或其類似物中不存在，即已共價(jià)修飾的肽。典型的修飾為酰胺、碳水化合
物、烷基、?；?、酯等。本發(fā)明的GLP-I衍生物在選自18、20、23、30、31、34、36、37或39位的位置被白蛋 白結(jié)合殘基衍生化或PEG化。所述衍生化是指如上所釋的共價(jià)鍵。例如，可以經(jīng)由化學(xué)鍵將賴氨酸殘基或半胱氨酸殘基連接至白蛋白結(jié) 合殘基。這 樣的化學(xué)鍵可以作為通過(guò)用白蛋白結(jié)合殘基的活性酯如長(zhǎng)脂肪酸?；苌嚢彼岬摩?氨基獲得的實(shí)例。本發(fā)明的GLP-I衍生物(GLP-1 (7-37)的類似物的衍生物)的實(shí)例是 N- ε 37 {2- [2- (2_ {2_ [2_ ((R) -3-羧基-3- {[1_ (19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰基]氨基} 丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞去氨基His7，Glu22， Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I (7-37)酰胺(本文實(shí)施例1的化合物)。在該化合物中，在37 位的天然Gly已被賴氨酸取代，所述賴氨酸已在N- ε 37被以下的白蛋白結(jié)合殘基衍生化{2- [2- (2- {2- [2- ((R) -3-羧基-3- {[1_ (19-羧基十九?；?哌啶_4_羰基]氨基}丙酰氨 基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?結(jié)構(gòu)1) 結(jié)構(gòu)1并且其中，在7位的天然組氨酸已被去氨基His取代，在22位的天然甘氨酸 已被谷氨酸取代，在26位和34位的賴氨酸已被精氨酸取代。在該衍生物中，[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I (7-37)酰胺的 GLP-1 (7-37)類似物已在等同于 GLP-I (7-37)的37位的位置，即在37位的Lys的ε氨基處，被白蛋白結(jié)合殘基衍生化(通 過(guò)酰胺鍵共價(jià)修飾)。因此，GLP-I衍生物為具有兩個(gè)組成部分的化合物彼此共價(jià)連接的 GLP-I肽部分和衍生部分。已衍生化的氨基酸殘基可以包含氨基。包含氨基的氨基酸殘基的實(shí)例為賴氨酸、 鳥(niǎo)氨酸、ε "N-烷基化的賴氨酸(例如ε -N甲基賴氨酸)、0_氨基乙基絲氨酸、0_氨基丙基 絲氨酸或者在側(cè)鏈包含伯氨基或仲氨基的更長(zhǎng)的0烷基化絲氨酸。在本發(fā)明的又一方面， 衍生化的氨基酸殘基在側(cè)鏈包含伯氨基。包含伯氨基的氨基酸殘基的實(shí)例為賴氨酸、鳥(niǎo)氨 酸、0-氨基乙基絲氨酸、0-氨基丙基絲氨酸或者在側(cè)鏈包含伯氨基的更長(zhǎng)的0烷基化絲氨 酸。在本發(fā)明的又一方面，衍生化的氨基酸殘基為賴氨酸。在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的 衍生物僅在一個(gè)位置衍生化，例如僅一個(gè)氨基酸殘基被衍生化。連接用于本發(fā)明的兩個(gè)化學(xué)部分的其它實(shí)例包括但不限于烷基化、酯形成、酰胺 形成或馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“GLP-1 肽”是指 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)或其 GLP-1 (7-37) 類似物。術(shù)語(yǔ)“GLP-1 (7-37) ”意在包括GLP-I (7-37)(即所述肽)，以及相應(yīng)的酰胺，該術(shù)語(yǔ) 還應(yīng)用于GLP-I (7-37)類似物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物為酰胺。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案 中，其為肽，即衍生物的GLP-I肽部分在C-末端具有游離羧基。術(shù)語(yǔ)‘‘GLP-I (7-34)，，、"GLP-1 (7-35)，，、"GLP-1 (7-36)，，、"GLP-1 (7-38)，，、 "GLP-1 (7-39) ”、“GLP-1 (7-40) ”、“GLP-1 (7-41) ”或其衍生物偶爾在本文用于指定本發(fā)明的 衍生物的GLP-I肽部分的確切長(zhǎng)度。例如，“GLP-1 (7-34)衍生物”是指GLP-I (7-37)衍生 物，其中后3個(gè)C-末端氨基酸殘基已缺失。作為另一個(gè)實(shí)例，“GLP-l(7-39)衍生物”是指 GLP-I (7-37)衍生物，其中兩個(gè)氨基酸殘基已被添加至C-末端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有下式(I)的序列=Xaa7-Xaa8-Xa a9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25_Arg —X&&27_1^式(I)(SEQ ID No 2)其中，
(Xaa7-Xaa8)為(L_組氨酸_Aib)、(去氨基-組氨酸-丙氨酸)或(去氨基-組 氨酸-Aib)；Xaa9 為 Glu 或 Glu 衍生物；Xaa16 為 Val 或 Leu ；Xaa18 為 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 為 Leu 或 Lys ；Xaa23 為 Gin、Glu、Lys> Cys 或 Arg ；Xaa24 為 Ala 或 Asn ；Xaa25 為 Ala 或 Val ；Xaa27 為 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28 為 Phe 或 Phe 衍生物；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 為 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Cys, Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在；且所述GLP-I 衍生物在選自等同于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、 31、34、36、37或39位的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化。"Glu衍生物”的非限制性實(shí)例為α，α - 二甲基-Glu。"Phe衍生物”的非限制性實(shí)例為CF3-Phe,例如Hi-CF3-Phe (參見(jiàn)例如實(shí)施例3的化 合物)。術(shù)語(yǔ)ε -氨基-Lys (或ε -Lys)意在表示第38位氨基酸殘基賴氨酸經(jīng)由其ε氨 基結(jié)合GLP-I (7-37)肽，而不(經(jīng)常是這種情況)經(jīng)由其α氨基(參見(jiàn)例如實(shí)施例28的 化合物)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Gl u_G ln_A la_Ala_Arg-G Iu-Phe-1 Ie-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xa
一一 Xa3<4o一 一R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7為L(zhǎng)-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2_氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、高組氨酸、Na-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸； Xaa8 為 Ala、Gly, Val、Leu、lie、Lys, Aib、(1_ 氨基環(huán)丙基)甲酸、(1_ 氨基環(huán)丁 基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨 基環(huán)辛基)甲酸；Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Lys 或 Trp ；Xaa33 為 Val 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在；且所述GLP-I 衍生物在選自等同于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、 31、34、36、37或39位的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接頭，，是指分隔肽和白蛋白結(jié)合殘基或聚乙二醇聚合物的間隔 基(兩個(gè)術(shù)語(yǔ)間隔基和接頭在本說(shuō)明書(shū)中可互換使用)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指適于正常的藥物應(yīng)用，即在患者等當(dāng)中不 產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)事件。本文使用的術(shù)語(yǔ)“賦形劑”是指化學(xué)化合物，其一般被加入到藥物組合物中，例如 緩沖劑、滲透壓劑、防腐劑等。本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指與無(wú)治療相比足以有效治療患者的劑量。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指包含本發(fā)明的活性衍生物或其藥學(xué)上可接受 的鹽、酰胺、烷基、酯等連同藥物賦形劑(例如緩沖劑、防腐劑和任選的滲透壓調(diào)節(jié)劑和/或 穩(wěn)定劑)的產(chǎn)物。因此，藥物組合物在本領(lǐng)域也被稱為藥物制劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)“(某)疾病的治療”或“治療(某)疾病”是指已發(fā)生疾病、病癥 或障礙的患者的管理和照料。治療的目的是對(duì)抗疾病、病癥或障礙。治療包括給予本發(fā)明 的活性衍生物，以消除或控制疾病、病癥或障礙，以及緩解與疾病、病癥或障礙相關(guān)的癥狀 或并發(fā)癥。在本發(fā)明的一個(gè)方面，接頭包含一個(gè)或多個(gè)烷撐二醇單元，例如1-5個(gè)烷撐二醇 單元。烷撐二醇單元在又一方面為乙二醇、丙二醇或丁二醇，但也可以為更高級(jí)的烷撐二 醇。在本發(fā)明的另一方面，接頭為選自-(CHADKognEKogp-Qq-的親水接頭，其中
l、m 和 η 獨(dú)立地為 1-20，ρ 為 0-10，Q 為-Z- (CH2) XD [ (CH2) nG] m (CH2) p-，q為在0-5范圍內(nèi)的整數(shù)， D、E 和 G 各自獨(dú)立選自-0-、-NR3-、-N (COR4)-、-PR5(O)-和-P(ORe) (0)-，其中 R3、 R4> R5和R6獨(dú)立地代表氫或CV6-烷基，Z 選自-C (0) NH-、-C (0) NHCH2-、-OC (0) NH-、-C (0) NHCH2CH2-、-C (0) CH2-、-C (0) CH =CH-、- (CH2) s-、-C (0) -、-C (0) 0-或-NHC (0)-，其中 s 為 0 或 1。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中1為1或2，n和m獨(dú) 立地為1-10，P為0-10。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中D為-0-。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中E為-0-。在本發(fā)明的又一方面，親水接頭為-O^OKCHAOKag^-，其中m為1-10，ρ為 1-3，Q 為-Z-CH2O[(CH2)20]m(CH2)p-,其中 Z 如上定義。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中q為1。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中G為-0-。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中Z選自-C(O) NH-、-C (0) NHCH2-和-OC (0) NH-。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中q為0。在本發(fā)明的另一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中1為2。在本發(fā)明的又一方面，所述接頭為如上定義的親水接頭，其中η為2。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用以化學(xué)部分分隔肽和白蛋白結(jié)合殘基的“親水接頭”。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述親水接頭為-C (0) - (CH2) f0_ [ (CH2CH2-O] m_ (CH2) p-[NHC (O)-(CH2) f0-[ (CH2) n-0]m-(CH2) Ρ]ΓΝΗ-，其中 l、m、n 和 ρ 獨(dú)立地為 1-5，q 為 0-5。在本發(fā)明的又一方面，所述親水接頭為-C(0) -CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 [NHC (0) -CH2 -O-CH2CH2O-CH2CH2] ,-NH-，其中 q 為 0-5。在本發(fā)明的又一方面，所述親水接頭為-C(0) -CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NHC (0) -CH2 -O-CH2CH2O-CH2CH2-NH-。在本發(fā)明的又一方面，所述親水接頭為_(kāi)[CH2CH20]m+1(CH2)pQ「，其中m和ρ獨(dú)立地 為 0-10，而 Q 為如上定義的-Z-(CH2) P [ (CH2)nG]m (CH2)ρ-。在本發(fā)明的又一方面，所述親水接頭為-(CH2) r0- [ (CH2) n-0] m_ (CH2) p- [C (0) NH-(CH2)1-O-[(CH2)n-0]m-(CH2)1Jr，其中 l、m、n 和 ρ 獨(dú)立地為 1-5，q 為 0-5。在本發(fā)明的又一方面，所述接頭包含除Cys之外的氨基酸殘基，或者諸如Gly-Lys 的二肽。在本文中，表述“諸如Gly-Lys的二肽”用于指示一種二肽，其中C-末端氨基酸殘 基為L(zhǎng)ys、His或Trp，優(yōu)選為L(zhǎng)ys，且其中N-末端氨基酸殘基選自Ala、Arg、ASp、ASn、Gly、 Glu、Gin、lie、Leu、Val.Phe 和 Pro。適宜的PEG聚合物通常市售可得，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù) 制備。在本發(fā)明的一個(gè)方面，GLP-I衍生物已被PEG化。在具體的實(shí)施方案中，PEG聚合物具有大于700D的分子量。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分子量大于5kD、大于IOkD和大于20kD。PEG聚合物可為線性的或分支的。就PEG 聚合物大于20KDa的情況而言，PEG聚合物優(yōu)選具有分支結(jié)構(gòu)，例如43kD的分支PEG-肽 (ShearwaterfOOl 目錄號(hào) 2D3XOTOl, mPEG2-MAL)。可以通過(guò)將PEG連接在與受體相互作用的肽表面的對(duì)側(cè)完成PEG在完整的肽上的 連接。有幾種策略將PEG偶聯(lián)至肽(參見(jiàn)例如Veronese，Biomaterials22 :405_417， 2001)，所有這些策略都通過(guò)整體引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員因此將能夠利用眾所 周知的技術(shù)將PEG聚合物連接至本文描述的GLP-I肽。簡(jiǎn)而言之，半胱氨酸PEG化是一種用于位點(diǎn)特異性PEG化的方法，并可以如下實(shí) 現(xiàn)在人胰淀素或胰淀素類似物上的其中一個(gè)特定位置引入唯一的半胱氨酸突變，然后使 所獲得的肽與半胱氨酸特異性PEG化試劑如PEG-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)?？赡鼙仨毻蛔兯鲭模?以便允許位點(diǎn)特異性PEG化。例如，如果所述肽包含半胱氨酸殘基，則需要用保守氨基酸取 代，以便確保位點(diǎn)特異性PEG化。另外，可以將剛性接頭(包括但不限于“GGS”、“GGSGGS” 和“PPPS”)加至C-末端，但在PEG連接位點(diǎn)(即唯一的半胱氨酸殘基)之前。另一方面，本發(fā)明的GLP-I衍生物已被白蛋白結(jié)合殘基衍生化。在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基為親脂殘基。在又一個(gè)實(shí)施方案中，親脂殘基任選地通過(guò)綴合化學(xué)(例如通過(guò)烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成)經(jīng)由接頭連接至賴氨酸 殘基，或者通過(guò)馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)連接至半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基于生理PH帶負(fù)電荷。在本發(fā)明的 另一方面，白蛋白結(jié)合殘基包含可以帶負(fù)電荷的基團(tuán)?？梢詭ж?fù)電荷的一個(gè)優(yōu)選基團(tuán)為羧基。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、支鏈烷基、具有 ω-羧酸基團(tuán)的基團(tuán)以及部分或完全氫化的環(huán)戊烯并菲(cyclopentanophenanthrene)骨
^K O在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基為汽巴克隆(cibacronyl)殘基。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基具有6-40個(gè)碳原子、8-26個(gè)碳原 子或8-20個(gè)碳原子。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基為選自CH3(CH2)XO-的酰基， 其中r為4-38的整數(shù)，優(yōu)選為4-24的整數(shù)，更優(yōu)選選自CH3 (CH2) 6C0_、CH3 (CH2) 8C0_、 CH3 (CH2) 10CO-、CH3 (CH2) 12C0_、CH3 (CH2) 14C0_、CH3 (CH2) 16C0_、CH3 (CH2) 18C0_、CH3 (CH2) 20CO_ 禾口 CH3 (CH2) 22C0-。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合殘基為直鏈或支鏈鏈烷α，ω-二羧 酸的酰基。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物包含在修飾的GLP-I序列和 一個(gè)或多個(gè)白蛋白結(jié)合殘基之間的親水間隔基。親水間隔基可以指在兩個(gè)末端具有合適的官能團(tuán)的未分支的寡乙二醇部分，其在 修飾的GLP-I序列的氨基和白蛋白結(jié)合殘基的官能團(tuán)之間形成橋。本發(fā)明的GLP-I衍生物的優(yōu)選實(shí)施方案、包括它們的組合物以及使用它們的方法 列于題頭為“本發(fā)明的實(shí)施方案”、“本發(fā)明的附加實(shí)施方案”和“本發(fā)明的更具體的實(shí)施方案”的章節(jié)，這些章節(jié)靠近本申請(qǐng)的實(shí)施例部分的開(kāi)始處。功能特性如在實(shí)施例部分所述，已合成并測(cè)試了本發(fā)明的眾多GLP-I衍生物。參閱實(shí)施例，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有如在下文所釋的幾個(gè)有利和有益的特性。第一方面，本發(fā)明的GLP-I衍牛物具有延長(zhǎng)的作用特件，這使該衍牛物潛在地話 于以低于每日1次的頻率給予，優(yōu)選具有每周1次乃至更低頻率給予的潛力。作用特性可 以在藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物如小鼠或豬評(píng)價(jià)。適宜的實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)于本申請(qǐng)的實(shí)施例 39 (小種豬)和實(shí)施例43 (小鼠)。如在小種豬實(shí)施例39中所述，(i)GLP-l衍生物可以皮下或靜脈內(nèi)給予，優(yōu)選皮下 給予；(ii)所述豬優(yōu)選為GSttingen小種豬，優(yōu)選約5月齡，重8-l0kg;(iii)所述動(dòng)物優(yōu) 選在給藥前禁食，優(yōu)選如所述實(shí)施；(iv)注射優(yōu)選按照指示給予；(ν)測(cè)試的動(dòng)物數(shù)優(yōu)選如 所示；(Vi)劑量?jī)?yōu)選如所示；和/或(Vii)血樣也優(yōu)選如在該實(shí)施例中所示獲取、采集并測(cè)定。如實(shí)施例39中的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)獲得所述化合物對(duì)時(shí)間的血漿濃度譜，根據(jù)它 可以確定半衰期τ72，優(yōu)選如在實(shí)施例39中所述。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在18小時(shí)之上，優(yōu)選在24小時(shí)之上，更優(yōu)選在28小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在30小時(shí) 之上，最優(yōu)選在32小時(shí)之上。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在32小時(shí)之上，優(yōu)選在34小時(shí)之上，更優(yōu)選在36小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在38小時(shí) 之上，最優(yōu)選在40小時(shí)之上。在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在45小時(shí)之上，優(yōu)選在50小時(shí)之上，更優(yōu)選在55小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在60小時(shí) 之上，最優(yōu)選在65小時(shí)之上。在第四個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在45小時(shí)之上，優(yōu)選在50小時(shí)之上，更優(yōu)選在55小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在60小時(shí) 之上，最優(yōu)選在65小時(shí)之上。在第五個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在70小時(shí)之上，優(yōu)選在75小時(shí)之上，更優(yōu)選在80小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在85小時(shí) 之上，最優(yōu)選在90小時(shí)之上。在第六個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 半衰期在92小時(shí)之上，優(yōu)選在94小時(shí)之上，更優(yōu)選在96小時(shí)之上，甚至更優(yōu)選在98小時(shí) 之上，最優(yōu)選在100小時(shí)之上。在第七個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予小種豬之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物的 體內(nèi)半衰期為至少50小時(shí)，優(yōu)選在皮下給予小種豬之后的體內(nèi)半衰期為至少80小時(shí)。因此，通過(guò)皮下給予小種豬測(cè)定的本發(fā)明GLP-I衍生物的示例性半衰期間隔 (以小時(shí) h 指示的時(shí)間)為20-100,30-100,40-100,50-100,60-100,70-100,80-100 或 90-100 (小時(shí))。
本發(fā)明的GLP-I衍生物的半衰期也可以在db/db小鼠中以劑量_反應(yīng)研究測(cè)定，例如在實(shí)施例43中所述。如在該實(shí)施例中所述，(i)小鼠優(yōu)選來(lái)自Taconic ； (ii) 10-12周 齡；(iii)自由獲取標(biāo)準(zhǔn)飼料如Altromin 1324和自來(lái)水；(iv)保持于24°C ； (ν)適應(yīng)環(huán)境 1周；(vi)基于匹配平均血糖值分配為7組(優(yōu)選η = 6) ； (vii)如在該實(shí)施例中所述接受 治療；(viii)如所述給藥；(ix)按照所述流程評(píng)價(jià)血糖，優(yōu)選如所述測(cè)定；和/或(χ)基于 血糖對(duì)時(shí)間測(cè)定確定半衰期，優(yōu)選如在該實(shí)施例中所述。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予db/db小鼠之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物 的半衰期為10小時(shí)以上，優(yōu)選11小時(shí)以上，更優(yōu)選12小時(shí)以上，甚至更優(yōu)選13小時(shí)以上， 最優(yōu)選14小時(shí)以上。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予db/db小鼠之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物 的半衰期為15小時(shí)以上，優(yōu)選16小時(shí)以上，更優(yōu)選17小時(shí)以上，甚至更優(yōu)選18小時(shí)以上， 最優(yōu)選19小時(shí)以上。在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予db/db小鼠之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物 的半衰期為20小時(shí)以上，優(yōu)選21小時(shí)以上，更優(yōu)選22小時(shí)以上，甚至更優(yōu)選23小時(shí)以上， 最優(yōu)選24小時(shí)以上。在第四個(gè)具體的實(shí)施方案中，在皮下給予db/db小鼠之后，本發(fā)明的GLP-I衍生物 的半衰期為25小時(shí)以上，優(yōu)選26小時(shí)以上，更優(yōu)選27小時(shí)以上，甚至更優(yōu)選28小時(shí)以上， 最優(yōu)選29小時(shí)以上。因此，通過(guò)皮下給予db/db小鼠測(cè)定的本發(fā)明GLP-I衍生物的示例性半衰期間隔 (以小時(shí)h指示的時(shí)間)為5-30、10-30、15-30、20-30或25-30 (小時(shí))。在第五個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及GLP-I肽衍生物，其在嚙齒動(dòng)物和非嚙 齒動(dòng)物模型中相比于利拉魯肽具有顯著改善的終末半衰期。在嚙齒動(dòng)物或非嚙齒動(dòng)物模型 中的終末半衰期相對(duì)于利拉魯肽優(yōu)選改善至少3倍。或者，在非嚙齒動(dòng)物模型中終末半衰 期相對(duì)于利拉魯肽改善至少6倍，或者在靜脈內(nèi)給予大鼠后，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有至 少10小時(shí)的體內(nèi)半衰期。第二方面，本發(fā)明的GLP-I衍牛物具有改善的穩(wěn)定件。具體地說(shuō)，其具有顯著的 α -螺旋骨架的二級(jí)結(jié)構(gòu)。預(yù)期具有顯著的α -螺旋骨架的二級(jí)結(jié)構(gòu)賦予所述分子化學(xué)、物 理和/或酶學(xué)穩(wěn)定性。α -螺旋含量可以使用圓二色性(CD)光譜測(cè)定，例如在實(shí)施例44中所述。在具 體的實(shí)施方案中，(i)以5 μ M所述化合物的優(yōu)選IOmMTris/C104pH 8. 0溶液記錄遠(yuǎn)-UV⑶ 光譜；( )扣除緩沖背景；(iii)數(shù)據(jù)對(duì)基于肽鍵濃度的克分子橢圓率M-1CnT1標(biāo)準(zhǔn)化；(iv) 求出222nm的密度值(Δ ε) ； (ν)基于(iv)的密度值，假定比例，并為了轉(zhuǎn)換使用-ΙΜΑπΓ1 密度值對(duì)應(yīng)于10% α-螺旋結(jié)構(gòu)的事實(shí)，計(jì)算α-螺旋含量。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有20%以上的α -螺旋含 量，優(yōu)選25%以上，更優(yōu)選30%以上，甚至更優(yōu)選35%以上，最優(yōu)選36%以上。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有40%以上的α -螺旋含 量，優(yōu)選45%以上，更優(yōu)選50%以上，甚至更優(yōu)選55%以上，最優(yōu)選58%以上。因此，本發(fā)明的GLP-I衍生物的α -螺旋含量的示例性范圍為20-60、30-60、40_60 和 50-60 (% )。
在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物對(duì)化學(xué)降解(一般用毒蜥外 泌肽-4觀察，尤其是氧化和去酰胺)是穩(wěn)定的。在第四個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物于中性pH、最優(yōu)選于6-8的范 圍是化學(xué)和物理穩(wěn)定的。在第五個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物幾乎沒(méi)有或沒(méi)有聚集的趨 勢(shì)。當(dāng)以硫黃素測(cè)定法測(cè)試時(shí)，所述聚集趨勢(shì)優(yōu)選相對(duì)于利拉魯肽的聚集趨勢(shì)顯著改善。
第三方面，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有可接受的、優(yōu)選高的K對(duì)于受體)。促 胰島素藥物如本發(fā)明的GLP-I衍生物的效力可如在實(shí)施例40中所述通過(guò)劑量-反應(yīng)曲線 計(jì)算EC5tl值確定。本文使用的術(shù)語(yǔ)“促胰島素藥物”是指為人GLP-I受體激動(dòng)劑的衍生物，即在含有 人GLP-I受體的適宜培養(yǎng)基(下文公開(kāi)了一種這樣的培養(yǎng)基)中刺激cAMP形成的衍生物。在具體的實(shí)施方案中，(i)使用表達(dá)克隆的人GLP-I受體的幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì) 胞，優(yōu)選 BHK-467-12A，更優(yōu)選 BHK-467-12A(tk_tsl3) ；(ii)所述細(xì)胞在加入 100IU/ mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素(1% Pen/Str印)、5%胎牛血清(FCS)和0. 5mg/mL遺傳霉 素G-418 (LifeTechnologies)的DMEM培養(yǎng)基中優(yōu)選于5 % CO2中生長(zhǎng)；(iii)用磷酸緩 沖鹽水(PBS)洗滌優(yōu)選約80%匯合的所述細(xì)胞2次；(iv)用乙二胺四乙酸四鈉鹽水溶 液如Versene收獲細(xì)胞；(ν)通過(guò)勻化由細(xì)胞制備質(zhì)膜，優(yōu)選在緩沖液1中；(vi)例如以 48，OOOxg于4°C離心勻化物15分鐘；和/或(vii)通過(guò)勻化將沉淀懸浮在緩沖液2中；優(yōu) 選重復(fù)步驟(vi)和(viii)，例如1次或2次以上?？扇鐚?shí)施例40所述，通過(guò)檢測(cè)作為對(duì)促胰島素藥物刺激的響應(yīng)的環(huán)AMP(cAMP)， 進(jìn)行功能性受體測(cè)定。形成的cAMP優(yōu)選通過(guò)AScreen cAMP試劑盒(Perkin Elmer Life Sciences)定量。溫育可在半面積96孔微量滴定板中以50 μ L總體積的緩沖液3 (50mM Tris-HCI,5mM HEPES, IOmM MgCl2, pH 7.4)進(jìn)行，所述緩沖液 3 具有以下添加物lmM ATP、 ΙμΜ GTP、0. 5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、0. 01 % 吐溫 _20、0. 1 % BSA、6 μ g 膜制 備物、15 μ g/mL受體珠、與6nM生物素化-cAMP預(yù)溫育的20 μ g/mL供體珠。優(yōu)選用緩沖液 3溶解并稀釋要測(cè)試激動(dòng)劑活性的衍生物。用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的GTP新鮮制備。所述板在黑暗 中于緩慢攪拌下于室溫溫育3小時(shí)，之后以Fusion 設(shè)備(Perkin Elmer Life Sciences) 計(jì)數(shù)。作圖各個(gè)衍生物的濃度_響應(yīng)曲線，并使用優(yōu)選4. 0版或5. 0版的4參數(shù)logistic 模型(GraphPad，Carlsbad, CA)評(píng)估 EC5tl 值。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，據(jù)使用cAMP測(cè)定檢測(cè)，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有 4. 00以下的效力(EC5tl，nM)，優(yōu)選3. 50以下，更優(yōu)選3. 00以下，甚至更優(yōu)選2. 50以下，最優(yōu) 選2. 00(ηΜ)以下。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，據(jù)使用cAMP測(cè)定檢測(cè)，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有 1.80以下的效力(EC5tl，nM)，優(yōu)選1.60以下，更優(yōu)選1.40以下，甚至更優(yōu)選1.20以下，最優(yōu) 選1. 00 (nM)以下。在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，據(jù)使用cAMP測(cè)定檢測(cè)，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有 0. 80以下的效力(EC5tl，nM)，優(yōu)選0.60以下，更優(yōu)選0.40以下，甚至更優(yōu)選0. 20以下，最優(yōu) 選0. 10 (nM)以下。在第四個(gè)具體的實(shí)施方案中，據(jù)使用cAMP測(cè)定檢測(cè)，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有0.090以下的效力(EC5tl，nM)，優(yōu)選0.080以下，更優(yōu)選0.070以下，甚至更優(yōu)選0. 060以下， 最優(yōu)選0.050 (nM)以下。在第五個(gè)具體的實(shí)施方案中，據(jù)使用cAMP測(cè)定檢測(cè)，本發(fā)明的GLP-I衍生物具有 0.040以下的效力(EC5tl，nM)，優(yōu)選0.030以下，更優(yōu)選0.020以下，最優(yōu)選0.010 (nM)以下。
因此，本發(fā)明的GLP-I衍生物的效力(EC5Q，nM,使用cAMP測(cè)定檢測(cè))的 示例性范圍為 0. 010-2. 00、0· 010-1. 80、0· 010-1. 60、0· 010-1. 40、0· 010-1. 20、 0. 010-1. 00,0. 010-0. 80,0. 010-0. 60,0. 010-0. 40,0. 010-0. 30,0. 010-0. 20,0. 010-0. 10 和 0. 010-0. 90 (nM)，優(yōu)選 0. 010-0. 40,0. 010-0. 30,0. 010-0. 20,0. 010-0. 10 和 0. 010-0. 90 (nM)。在第六個(gè)具體的實(shí)施方案中，對(duì)于白蛋白結(jié)合親和力低于IOOnM的非常強(qiáng)的白 蛋白結(jié)合類似物，在cAMP測(cè)定中的GLP-I效力優(yōu)于3μπι01，優(yōu)選效力優(yōu)于Ιμπιο 。對(duì)于 白蛋白結(jié)合親和力低于500ηΜ的強(qiáng)白蛋白結(jié)合衍生物，在cAMP測(cè)定中的GLP-I效力優(yōu)于 1 μ mol,優(yōu)選效力優(yōu)于0. 2μπιο1。在第七個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物可以同時(shí)結(jié)合白蛋白和 GLP-I受體。例如，本發(fā)明的GLP-I衍生物可以在存在2%白蛋白的情況下以低于IOOnM的 親和力、優(yōu)選低于30ηΜ的親和力結(jié)合GLP-I受體。本發(fā)明的GLP-I衍生物還可以對(duì)GLP-I受體具有親和力，在比較存在非常低濃度 (例如0. 005 % -0. 2 % )的人白蛋白時(shí)的親和力與存在2 %人白蛋白時(shí)的親和力時(shí)，該親和 力僅部分降低。在這些條件下的結(jié)合親和力的改變優(yōu)選低于50倍，更優(yōu)選低于30倍，最優(yōu) 選低于10倍。第四方面,本發(fā)明的GLP-I衍牛物具有高白蛋白結(jié)合親和力。所述白蛋白是指人 血清白蛋白(HSA)，所述親和力可以如實(shí)施例41所述測(cè)定。GLP-I衍生物對(duì)人血清白蛋白(HSA)的親和力可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)鄰近閃爍測(cè)定(SPA)檢 測(cè)，優(yōu)選如下檢測(cè)(i)將鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠(例如GE Healthcare RPNQ0009)與 生物素化HSA溫育例如5小時(shí)；(ii)用緩沖液洗滌所述珠；(iii)將所述珠與125I-標(biāo)記 的酰化 GLP-I 類似物優(yōu)選在含 IOOmM !fepes、100mM NaClUOmM MgS04、0. 025 % 吐溫-20， PH 7.4的緩沖液中混合，所述GLP-I類似物例如N- ε 26_[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[ (S) _4_羧 基-4-(17-羧基-十七?；被?丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙 氧基)乙?；鵠[Aib8，125I-Tyrl9，Arg34]GLP-I (7-37)或 N- ε 37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1Η-四唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二?；被?_4_羧 基丁?；被?-4_羧基丁?；被?乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Aib8，125I-Tyrl9， Glu22,Arg26,34,Lys37]GLP-l (7-37)-NH2 ;(iv)使用適宜的體積如 100 μ 1 的待檢測(cè) GLP-1 衍生物優(yōu)選在相同緩沖液中的適宜連續(xù)稀釋液，將混合物轉(zhuǎn)移至閃爍計(jì)數(shù)器如Perkin Elmer0ptiplate-966005290(100y 1/孔)的孔中；(ν)在適宜的溫育時(shí)間如20小時(shí)后離心 所述板，優(yōu)選采用溫和搖動(dòng)，更優(yōu)選于室溫；(vi)計(jì)數(shù)所述板，例如在TopCoimter上；和/ 或(vii)以GLP-I衍生物濃度的函數(shù)作圖結(jié)合的cpm。競(jìng)爭(zhēng)曲線的EC5tl值優(yōu)選用作衍生物 對(duì)HSA親和力的量度。HSA結(jié)合親和力也可以表示為Kd表觀(解離平衡常數(shù)，Kd)。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合親和力(即競(jìng)爭(zhēng)曲線的EC5tl值(nM)，使 用實(shí)施例41的測(cè)定檢測(cè))低于2000nM，優(yōu)選低于1500nM，更優(yōu)選低于ΙΟΟΟηΜ，甚至更優(yōu)選低于800nM，最優(yōu)選低于600nM。
在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合親和力(即競(jìng)爭(zhēng)曲線的EC5tl值(nM)，使 用實(shí)施例41的測(cè)定檢測(cè))低于500nM，優(yōu)選低于400nM，更優(yōu)選低于300nM，甚至更優(yōu)選低于 200nM，最優(yōu)選低于ΙΟΟηΜ。在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I衍生物的白蛋白結(jié)合親和力低于 Ιμπιο ，優(yōu)選低于500ηΜ，甚至更優(yōu)選低于200ηΜ乃至ΙΟΟηΜ。因此，本發(fā)明的GLP-I衍生物的白蛋白結(jié)合親和力(EC5tl，nM)的示例性范圍為 1-2000,100-2000,200-2000,400-1500,600-1500 和 800-1500 (nM)。第五方面，本發(fā)明的GLP-I衍牛物對(duì)孤立的N-末端的GLP-I警體胞外結(jié)構(gòu)域 (nGLP-lR)具有高結(jié)合親和力。所述親和力可以以替代125I-毒蜥外泌肽-4(9-39)結(jié)合 nGLP-lR的能力來(lái)量度，例如在實(shí)施例42中所述。蛋白nGLP-lR 可以如 Runge 等人 2007 (載于 Biochemistry，46 卷，5830-5840 頁(yè))所述制備。所述蛋白然后被生物素化，并優(yōu)選固定在包被鏈霉抗生物素蛋白的 SPA珠上?？梢允褂?5yg BNHS(SigmaH1759)將在適宜的緩沖液如0. IM NaHCO3中的 nGLPIR生物素化至Img蛋白。隨后優(yōu)選對(duì)PBS透析生物素化nGLPIR。所有的試劑和 衍生物優(yōu)選以PBS稀釋，優(yōu)選用0.05% (體積/體積)的吐溫20。結(jié)合測(cè)定例如可以 在96孔OptiPlates (PerkinElmer 6005290)中以200 μ 1終體積進(jìn)行。每個(gè)孔可以含 有包被2mg鏈霉抗生物素蛋白的SPA珠(例如PerkinElmer RPNQ007)、0. Ipmol生物素 化nGLPlR、50pCi125I-毒蜥外泌肽(9_39)和適宜的終濃度的測(cè)試肽，所述終濃度例如在 IOOOnM-O. 064nM的范圍內(nèi)。所述板在搖床上優(yōu)選于RT (室溫)或20°C溫育適宜的時(shí)間，例 如3小時(shí)。SPA粒子可以通過(guò)離心沉降，例如以1500rpm離心10分鐘，并計(jì)數(shù)所述板，例如 用 TopCount-NXT(PerkinElmer)。親和力可以利用IC5tl值表示，所述IC5tl值以替代50 %的125I-毒蜥外泌肽_4 (9-39) 結(jié)合nGLP-lR的GLP-I衍生物濃度由曲線讀取。在第一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)實(shí)施例42的測(cè)定中的IC5tlAiM量度，本發(fā)明 的GLP-I衍生物對(duì)GLP-I受體(nGLP-lR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有1500nM以下的親和力，優(yōu)選 IOOOnM以下，甚至更優(yōu)選500nM以下，最優(yōu)選400nM以下。在第二個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)實(shí)施例42的測(cè)定中的IC5tlAiM量度，本發(fā)明的 GLP-I衍生物對(duì)GLP-I受體(nGLP-lR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有300nM以下的親和力，優(yōu)選200nM 以下，甚至更優(yōu)選150nM以下，最優(yōu)選IOOnM以下。在第三個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)實(shí)施例42的測(cè)定中的IC5tlAiM量度，本發(fā)明的 GLP-I衍生物對(duì)GLP-I受體(nGLP-lR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有80nM以下的親和力，優(yōu)選60nM以 下，甚至更優(yōu)選40nM以下，最優(yōu)選20nM以下。在第四個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)實(shí)施例42的測(cè)定中的IC5tlAiM量度，本發(fā)明的 GLP-I衍生物對(duì)GLP-I受體(nGLP-lR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有15nM以下的親和力，優(yōu)選IOnM以 下，甚至更優(yōu)選8nM以下，最優(yōu)選6nM以下。在第五個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)實(shí)施例42的測(cè)定中的IC5tlAiM量度，本發(fā)明的 GLP-I衍生物對(duì)GLP-I受體(nGLP-lR)的胞外結(jié)構(gòu)域具有5. OnM以下的親和力，優(yōu)選4. OnM 以下，甚至更優(yōu)選3. OnM以下，最優(yōu)選2. OnM以下。
因此，本發(fā)明的GLP-1衍生物對(duì)nGLP-lR的親和力(IC5Q，nM)的示例性范圍為 2-1500,2-1000,2-500,2-300,5-500,10-500 和 2-10(nM)。在該測(cè)定中，毒蜥外泌肽-4以5nM的IC5(1值結(jié)合nGLP-lR，GLP-1 (7_37)以1120nM 的IC5Q值結(jié)合nGLP-lR，利拉魯肽以1500nM的IC5(1值結(jié)合nGLP-lR。在第六個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-1衍生物以低于利拉魯肽的IC5(I值、更 優(yōu)選以低于lOOnM、甚至更優(yōu)選低于lOnM乃至低于5nM的IC5(1值結(jié)合nGLP-lR。第六方面，本t提及多妝俥用的術(shù)語(yǔ)“DPP-IV保護(hù)(的)”是指多妝R被化學(xué)修飾 以使所述衍生物抗血漿肽酶二肽基氨基肽酶_4 (DPP-IV)。已知血漿中的DPP-IV酶參與幾 種肽激素(例如GLP-l、GLP-2、毒蜥外泌肽-4等)的降解。因此，已付出了相當(dāng)多的努力 來(lái)開(kāi)發(fā)對(duì)DPP-IV介導(dǎo)的水解敏感的多肽的類似物和衍生物，以便降低DPP-IV的水解速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物為DPP-IV保護(hù)的衍生物，其比利拉魯肽更抗 DPP-IV。肽對(duì)二肽基氨基肽酶IV降解的抗性通過(guò)以下的降解測(cè)定來(lái)檢測(cè)將等份的肽 (5nmol)于37°C與在100 uL 0. 1M三乙胺-HC1緩沖液，pH7. 4中的1 y L純化的二肽基氨 基肽酶IV (對(duì)應(yīng)于5mU酶活性)溫育10-180分鐘。通過(guò)加入5iiL 10%三氟乙酸終止酶反 應(yīng)，使用HPLC分析分離并定量肽降解產(chǎn)物。一種進(jìn)行該分析的方法是按照Siegel等人， Regul. Pept. 1999 ；79 :93_102 和 Mentlein 等人，Eur. J. Biochem. 1993 ；214 :829_35，將混 合物施加至Vydac C18大孔徑(30nm孔徑，5 y m顆粒)250x4. 6mm柱，并用在0. 1 %三氟乙 酸中的乙腈線性分步梯度(0%乙腈，3分鐘；0-24%乙腈，17分鐘；24-48%乙腈，1分鐘)以 lml/分鐘的流速洗脫。肽及其降解產(chǎn)物可以通過(guò)其在220nm(肽鍵)或280nm(芳香族氨 基酸)的吸光度監(jiān)測(cè)，并通過(guò)積分它們的峰面積相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積定量。于導(dǎo)致低于 10%的肽水解的溫育時(shí)間評(píng)估二肽基氨基肽酶IV水解肽的速率?；蛘撸ㄟ^(guò)以下的降解測(cè)定確定肽對(duì)二肽基氨基肽酶IV降解的抗性在有或沒(méi)有 1.6%人血清白蛋白的情況下，將等份的肽(4nmol)于37°C與10. 9mU純化的二肽基氨基肽 酶IV在40iiL 0. 085MTris-HCl緩沖液，pH 8. 0中溫育22小時(shí)。在0、4和22小時(shí)后，取 10iU樣品，通過(guò)與100 yl的三氟乙酸混合終止酶反應(yīng)。使用HPLC分析分離并定量肽 降解產(chǎn)物。一種進(jìn)行該分析的方法是將混合物施加至Agilent Zorbax 300SB-C18 (5 u m 顆粒)150x 2. 1mm柱，并用30分鐘內(nèi)0. 三氟乙酸至含0. 07% TFA的100%乙腈的線性 梯度以0. 5ml/分鐘的流速洗脫。肽及其降解產(chǎn)物通過(guò)其在214nm的吸光度監(jiān)測(cè)，并通過(guò)積 分它們的峰面積定量。肽對(duì)二肽基氨基肽酶IV的穩(wěn)定性以完整的肽的峰面積相對(duì)于完整 的肽和在切割后缺失兩個(gè)氨基末端氨基酸的降解產(chǎn)物的峰面積之和來(lái)測(cè)定。第七方面，本發(fā)明涉及GLP-1肽的衍牛物,其可以被配制為適于肺部給藥(遞送) 的顆粒。這涉及可用于肺部制劑的物理或化學(xué)方面?；蛘?，衍生物對(duì)氣管和肺中的酶降解 是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)了一種或多種以上特征的組合。白蛋白結(jié)合本文使用的術(shù)語(yǔ)“白蛋白結(jié)合部分”是指非共價(jià)結(jié)合人血清白蛋白的殘基。連接治 療性多肽的白蛋白結(jié)合殘基通常具有低于1 P mol的白蛋白結(jié)合親和力，優(yōu)選低于500nM， 甚至更優(yōu)選低于200nM乃至低于100nM。
已知一類白蛋白結(jié)合殘基屬于含有遠(yuǎn)端酸性基團(tuán)的4-40個(gè)碳原子的線性和分支 親脂部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“親水接頭”是指以化學(xué)部分分隔肽和白蛋白結(jié)合殘基的間隔基， 所述化學(xué)部分包含至少5個(gè)非氫原子，它們中的30-50%為N或0。在下面的結(jié)構(gòu)式中，連接基團(tuán)的末端鍵被視為連接鍵，而不是以亞甲基基團(tuán)終止， 除非另有說(shuō)明。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供含有本發(fā)明的衍生物的藥物制劑，所述衍生物以 0. lmg/ml-25mg/ml的濃度存在，其中所述制劑具有3. 0-9. 0的pH。所述制劑可進(jìn)一步包含 緩沖系統(tǒng)、防腐劑、滲透壓劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。制劑在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑為水性制劑，即含有水的制劑。這樣的制劑 通常為溶液或混懸液。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑為水溶液。術(shù)語(yǔ)“水性制劑”被定義為含有至少50% (重量/重量)水的制劑。同樣，術(shù)語(yǔ) “水溶液”被定義為含有至少50% (重量/重量)水的溶液，術(shù)語(yǔ)“水性混懸液”被定義為 含有至少50% (重量/重量)水的混懸液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑為凍干制劑，醫(yī)師或患者在使用前加入溶劑和/ 或稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑為沒(méi)有任何在先的溶解的情況下備用的干燥制劑 (例如凍干的或噴霧干燥的)。又一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的衍生物的水溶液和緩沖液的藥物制劑，其中 所述衍生物以0. lmg/ml或以上的濃度存在，其中所述制劑具有約3. 0至約9. 0的pH。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH為約7. 0至約9. 5。在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方案中，制劑的PH為約3. 0至約7. 0。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH為約 5.0至約7.5。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH為約7.5至約9.0。在本發(fā)明的另 一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的PH為約7. 5至約8. 5。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH 為約6.0至約7. 5。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH為約6.0至約7.0。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑為8. 0-8. 5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)給藥劑量均包含0. Olmg-lOmg活性衍生物。在 一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含0.05mg以上的活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的 劑量包含0. lmg以上的活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含至多10mg活性衍 生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含至多9mg活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予 的劑量包含至多8mg活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含至多7mg活性衍生 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含至多6mg活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的 劑量包含至多5mg活性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予的劑量包含0. 2mg-5mg活性衍生 物。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘 氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)_氨 基甲烷、N，N-(2-羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、蘋甲酸、琥珀酸鹽、
22馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑的每一個(gè)均構(gòu)成本發(fā)明的 備選實(shí)施方案。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。在本發(fā) 明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述防腐劑選自苯酚、鄰-甲酚、間-甲酚、對(duì)-甲酚、對(duì)-羥基苯 甲酸甲酯、對(duì)_羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對(duì)-羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、芐醇、 氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對(duì)-羥基 苯甲酸乙酯、苯索氯銨、氯苯甘油醚(3對(duì)-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑為苯酚或間-甲酚。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑以0. lmg/ ml-20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑以0. lmg/ml-5mg/ml的濃 度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑以5mg/ml-10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明 的又一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑以10mg/ml-20mg/ml的濃度存在。這些具體防腐劑的每一個(gè) 均構(gòu)成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。防腐劑在藥物組合物中的用途是技術(shù)人員眾所周知的。為 方便起見(jiàn)參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 19 片反，1995。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含等滲劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施 方案中，等滲劑選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨 酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(例如甘油(丙三醇)、1，2_丙二醇 (丙烯二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。在一個(gè) 實(shí)施方案中，等滲劑為丙二醇?？梢允褂萌魏翁?，例如單糖、二糖或多糖，或水溶液聚糖，包 括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支鏈淀粉、 糊精、環(huán)糊精、a和0HPCD、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。在一個(gè)實(shí)施方 案中，糖添加劑為蔗糖。糖醇被定義為具有至少一個(gè)-0H基的C4-C8烴，包括例如甘露醇、 山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖醇添加劑為甘露 醇。以上提及的糖或糖醇可獨(dú)立使用或組合使用。使用量沒(méi)有固定限制，只要糖或糖醇在 液體制劑中是可溶性的，沒(méi)有不利影響使用本發(fā)明方法獲得的穩(wěn)定作用。在一個(gè)實(shí)施方案 中，糖或糖醇濃度在約lmg/ml至約150mg/ml之間。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑 以lmg/ml-50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑以lmg/ml-7mg/ml 的濃度存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑以5mg/ml-7mg/ml的濃度存在。在本發(fā) 明的又一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑以8mg/ml-24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方 案中，等滲劑以25mg/ml-50mg/ml的濃度存在。這些具體等滲劑中的每一個(gè)均構(gòu)成了本發(fā) 明的替代實(shí)施方案。等滲劑在藥物組合物中的用途是技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見(jiàn)參 考 Remington :The Science andPractice of Pharmacy，第 19 片反，1995。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施 方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明 的又一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑以0. lmg/ml-5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方 案中，螯合劑以0. lmg/ml-2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑以 2mg/ml-5mg/ml的濃度存在。這些具體螯合劑中的每一個(gè)均構(gòu)成了本發(fā)明的替代實(shí)施方案。 螯合劑在藥物組合物中的用途是技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見(jiàn)參考Remington :The Science andPractice of Pharmacy,第 19 版，1995。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的用途是技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見(jiàn)參考Remington :The Science and Practice of Pharmacy, % 19 版，1995。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的組合物為穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性組分包括在 儲(chǔ)存過(guò)程中可能于液體藥物制劑中表現(xiàn)出聚集體形成的多肽。所述“聚集體形成”是指多肽分子之間的物理相互作用，該作用導(dǎo)致形成寡聚 物，所述寡聚物可能保持可溶性，或者由溶液沉淀的大的可見(jiàn)聚集物。所述“在儲(chǔ)存過(guò)程 中”是指液體藥物組合物或制劑制成后不立即給予受試者。相反，制備后，其以液體形 式、冷凍狀態(tài)或干燥形式(以后復(fù)溶為液體形式或適于給予受試者的其它形式)包裝儲(chǔ) 存。所述“干燥形式”是指通過(guò)下列方式干燥的液體藥物組合物或制劑冷凍干燥(即凍 干；參見(jiàn)例如 Williams 和 Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48_59)、噴霧干燥 (# JAL Masters (1991)，i 于 Spray-DryingHandbook (第 5 片反；Longman Scientific and Technical，Essez，U. K. )，491-676 頁(yè)；Broadhead 等人，(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18 1169-1206 ；和 Mumenthaler 等人，(1994) Pharm. Res. 11 12-20)或風(fēng)干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology 25 :459_470 ；禾口 Roser (1991) Biopharm. 4 :47_53)。在液體藥物 組合物儲(chǔ)存過(guò)程中多肽形成聚集體可能不利地影響該多肽的生物活性，導(dǎo)致藥物組合物失 去治療效力。此外，聚集體形成可能引起其它問(wèn)題，例如在使用輸注系統(tǒng)給予含多肽的藥物 組合物時(shí)的管路、膜或泵的阻塞。 本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一定量的氨基酸堿基，所述量足以降低組合物儲(chǔ) 存過(guò)程中多肽的聚集體形成。所述“氨基酸堿基”是指氨基酸或氨基酸組合，其中任何給定 的氨基酸都以其游離堿基形式或其鹽形式存在。在使用氨基酸組合的情況下，所有的氨基 酸都可以它們的游離堿基形式存在，全部也可以它們的鹽形式存在，或者一些可以它們的 游離堿基形式存在，而另一些以它們的鹽形式存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明的 組合物的氨基酸是攜帶帶電側(cè)鏈的那些氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。 特定氨基酸(例如甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、 蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、D或其混合物)或這些立體異構(gòu)體的組合可 以存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要特定的氨基酸以其游離堿基形式或其鹽形式存在。 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物還可以用這些氨基酸的類似物配 制。所述“氨基酸類似物”是指天然氨基酸的衍生物，其在本發(fā)明的液體藥物組合物的儲(chǔ)存 過(guò)程中產(chǎn)生降低多肽的聚集體形成的預(yù)期作用。適宜的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥(niǎo) 氨酸和N-單乙基L-精氨酸，適宜的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，適宜的半胱 氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸的情況一樣，氨基酸類似物以它們 的游離堿基形式或它們的鹽形式摻入到組合物中。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸 或氨基酸類似物以足以預(yù)防或延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用。 在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸 類似物)，以在用作治療劑的多肽為包含至少一個(gè)甲硫氨酸殘基的多肽時(shí)，抑制甲硫氨酸殘 基氧化為甲硫氨酸亞砜，其中所述甲硫氨酸殘基對(duì)所述氧化敏感。所述“抑制”是指甲硫氨 酸氧化物質(zhì)隨時(shí)間推移的最小累積。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致為其正確分子形式的多肽的更 大保留?？梢允褂萌魏渭琢虬彼崃Ⅲw異構(gòu)體(L或D)或其組合。要加入的量應(yīng)當(dāng)為足以抑 制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸亞砜的量是管理機(jī)構(gòu)可接受的。通常，這意味著
24組合物包含僅約10%至約30%的甲硫氨酸亞砜。一般而言，這可以通過(guò)加入甲硫氨酸實(shí) 現(xiàn)，使得加入的甲硫氨酸對(duì)甲硫氨酸殘基的比率在約1 1至約1000 1的范圍內(nèi)，例如 10 1 至約 100 1。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含穩(wěn)定劑，其選自高分子量聚合物 或低分子量化合物。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚 乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基纖維素/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)(如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲基硫代乙醇)和不同 的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩(wěn)定劑中的每一種均構(gòu)成了本發(fā)明的替代實(shí)施方案。所述藥物組合物還可以包含其它的穩(wěn)定劑，其進(jìn)一步增強(qiáng)其中的治療活性多肽的 穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保護(hù)多肽抗甲硫氨 酸氧化，以及非離子表面活性劑，其保護(hù)多肽抗與凍_融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方案中，藥物組合物包含兩種不同的表面活性劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指 包含水溶性(親水性)部分、頭和脂溶性(親脂性)部分的任何分子或離子。表面活性劑 優(yōu)選在交界面累積，其中親水性部分朝向水(親水相)，親脂性部分朝向油相或疏水相(即 玻璃、空氣、油等)。表面活性劑開(kāi)始形成膠束的濃度被稱為臨界膠束濃度或CMC。而且，表 面活性劑降低液體的表面張力。表面活性劑還被稱為兩親化合物。術(shù)語(yǔ)“變性劑”是一般 用于表面活性劑的同義詞。陰離子表面活性劑可以選自鵝去氧膽酸、鵝去氧膽酸鈉鹽、膽酸、脫氫膽酸、脫氧 膽酸、脫氧膽酸甲酯、洋地黃皂甙、毛地黃毒苷配基、N, N-二甲基十二烷胺N-氧化物、多庫(kù) 酯鈉、甘氨鵝去氧膽酸鈉、甘氨膽酸水合物、甘氨脫氧膽酸一水合物、甘氨脫氧膽酸鈉鹽、甘 氨脫氧膽酸鈉鹽、甘氨石膽酸3-硫酸二鈉鹽、甘氨石膽酸乙酯、N-十二烷酰肌氨酸鈉鹽、 N-十二烷酰肌氨酸鈉鹽、N-十二烷酰肌氨酸、N-十二烷酰肌氨酸、十二烷基硫酸鋰、Lugol、 1-辛烷磺酸鈉鹽、1"辛烷磺酸鈉鹽、1" 丁烷磺酸鈉、1"癸烷磺酸鈉、1"十二烷磺酸鈉、1"庚 烷磺酸鈉、1-庚烷磺酸鈉、1-壬烷磺酸鈉、1-丙烷磺酸鈉一水合物、2-溴乙烷磺酸鈉、膽酸 鈉水合物、?；蜓蚰懼?、膽酸鈉水合物、絡(luò)膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基 硫酸鈉、己烷磺酸鈉、辛基硫酸鈉、戊烷磺酸鈉、?；悄懰徕c、?；蛆Z去氧膽酸鈉鹽、牛磺脫 氧膽酸鈉鹽一水合物、牛磺石膽酸3-硫酸二鈉鹽、牛熊脫氧膽酸鈉鹽、丁rizma 十二烷基硫 酸鹽、DSS (多庫(kù)酯鈉，CAS注冊(cè)號(hào)[577-11-7]，多庫(kù)酯鈣，CAS注冊(cè)號(hào)[128-49-4]，多庫(kù)酯 鉀，CAS注冊(cè)號(hào)[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、十二烷基磷酸膽堿 (F0S-膽堿-12)、癸基磷酸膽堿(F0S-膽堿-10)、壬基磷酸膽堿(F0S-膽堿-9)、二棕櫚酰 磷脂酸、辛酸鈉和/或?yàn)跛髅撗跄懰?。?yáng)離子表面活性劑可以選自烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、苯扎氯銨、芐基二甲 基十六烷基氯化銨、芐基二甲基十四烷基氯化銨、芐基三甲基四氯碘酸銨、二甲基雙十八烷 基溴化銨、十二烷基乙基二甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、 乙基十六烷基二甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、聚氧乙烯 (10)-N-牛油-1，3-二氨基丙烷、通佐溴胺和/或三甲基(十四基)溴化銨。
非離子表面活性劑可以選自BigCHAP、雙(聚乙二醇雙[咪唑基羰基])、嵌 段共聚物如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物例如泊洛沙姆、泊洛沙姆-188和泊 洛沙姆-407、Brij 35、Brij 56、Brij 72、Brij 76、Brij 92V、Brij 97、Brij 58P、 Cremophor EL、十乙二醇單十二烷基醚、N-癸酰-N-甲基葡糖胺、n-十二?；?N-甲基 葡糖胺、烷基-多聚葡糖苷、乙氧化蓖麻油、七乙二醇單癸基醚、七乙二醇單十二烷基醚、七 乙二醇單十四烷基醚、六乙二醇單十二烷基醚、六乙二醇單十六烷基醚、六乙二醇單十八烷 基醚、六乙二醇單十四烷基醚、Ig印alCA-630、Igepal CA-630、甲基-6_0-(N-庚基氨基甲 酰吡喃葡糖苷、九乙二醇單十二烷基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、N-壬酰-N-甲基 葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇單十二烷基醚、八乙二醇單十六烷基醚、八乙二醇單 十八烷基醚、八乙二醇單十四烷基醚、辛基-D-吡喃葡糖苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二 醇單十二烷基醚、五乙二醇單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單十八烷基醚、五 乙二醇單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧 乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、 聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯雙(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二 醇硬脂酸酯、來(lái)自 Quillaja樹(shù)皮的皂苷、Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、Span 85、Tergitol (15-S-12 型)、Tergitol (15-S-30 型)、Tergitol (15-S-5 型)、 Tergitol(15-S-7 型)、Tergitol(15-S-9 型)、Tergitol(NP-10 型)、Tergitol(NP-4 型)、 Tergitol (NP-40 型)、Tergitol (NP-7 型)、Tergitol (NP-9 型)、十四基-0 _D_ 麥芽苷、四乙 二醇單癸基醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、三乙二醇單癸基醚、三乙 二醇單十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、 Triton CF-21、Triton CF-32、TritonDF_12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、 Triton QS-44,Triton X-100,Triton X-102,Triton X-15,Triton X_151、Triton X-200、 Triton x-207,Triton x-100,Triton x-l 14,Triton x-165 溶液、Triton x-305 溶液、 Triton x-405,Triton x-45,Triton X-705-70.TWEEN 20.XWEEN 40.TWEEN 60、TWEEN 6、TWEEN 65、TWEEN 80、TWEEN 81、TWEEN §5、四 丁酚醛、鞘 磷脂(神經(jīng)鞘磷脂)和鞘糖脂類(神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、磷脂和/或正十一烷基0 -D-批 喃葡糖苷。兩性離子表面活性劑可以選自CHAPS、CHAPS0、3_(癸基二甲銨)丙磺酸內(nèi)鹽、 3_(十二烷基二甲銨)丙磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二甲銨)丙磺酸內(nèi)鹽、3-(N，N-二甲基 十四烷基銨)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十八烷銨)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基辛銨)丙 磺酸內(nèi)鹽、3_(N，N-二甲基十六烷銨)丙磺酸鹽、N-烷基-N，N-二甲銨-1-丙磺酸鹽、 3-膽酰胺-1-丙基二甲銨-1-丙磺酸鹽、十二烷基磷酸膽堿、肉豆蔻酰溶血磷脂酰膽堿、 Zwittergent 3-12 (N-十 二烷基 _N，N- 二甲基-3-銨基 丙磺酸鹽)、Zwittergent 3-10 (3-(癸基-二甲銨)丙磺酸內(nèi)鹽)、Zwittergent 3-08 (3-(辛基二甲銨)丙磺酸鹽)、 甘油磷脂類(卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰絲氨酸)、甘油糖脂類(吡喃半乳糖苷)、溶血磷脂酰 膽堿和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰膽 堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，以及極性頭基的修飾，所述頭基為膽 堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸、
26酰基肉毒堿和衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Ne_?；苌铮蛘哔嚢彼峄蚓彼?的側(cè)鏈?；苌?，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽 的Ne_?；苌?，包含中性氨基酸和兩個(gè)帶電荷氨基酸的任意組合的三肽的Ne_酰化衍 生物，或者表面活性劑可選自咪唑啉衍生物、長(zhǎng)鏈脂肪酸及其鹽C6_C12 (例如油酸和辛酸)、 N-十六烷基-N，N_ 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、陰離子型(烷基_芳基-磺酸酯)單價(jià) 表面活性劑、棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸 的1-?；鵢sn-甘油-3-磷酸酯)或其混合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“烷基_多聚葡糖苷”涉及經(jīng)一個(gè)或多個(gè)糖苷部分(例如麥芽苷、 糖等)取代的直鏈或支鏈c5_2(l-烷基、-鏈烯基或_炔基鏈。這些烷基_多聚葡糖苷的實(shí)施 方案包括c6_18-烷基-多聚葡糖苷。這些烷基_多聚葡糖苷的具體實(shí)施方案包括偶數(shù)碳鏈， 例如c6、c8、c1(1、c12、c14、c16、c18和c2(1烷基鏈。糖苷部分的具體實(shí)施方案包括吡喃糖苷、吡喃 葡糖苷、麥芽苷、麥芽三糖苷和蔗糖。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，少于6個(gè)的糖苷部分連 接至烷基基團(tuán)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，少于5個(gè)的糖苷部分連接至烷基基團(tuán)。在本發(fā) 明的多個(gè)實(shí)施方案中，少于4個(gè)的糖苷部分連接至烷基基團(tuán)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中， 少于3個(gè)的糖苷部分連接至烷基基團(tuán)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，少于2個(gè)的糖苷部分連 接至烷基基團(tuán)。烷基_多聚葡糖苷的具體實(shí)施方案是烷基葡糖苷，如正癸基0 -D-吡喃葡糖 苷、癸基3-D-吡喃麥芽糖苷、十二烷基3-D吡喃葡糖苷、正十二烷基3-D-麥芽糖苷、正 十二烷基3-D-麥芽糖苷、正十二烷基3-D-麥芽糖苷、十四烷基3-D-吡喃葡萄糖苷、癸 基日-D-麥芽糖苷、十六烷基3-D-麥芽糖苷、癸基3-D-麥芽三糖苷、十二烷基3-D-麥 芽三糖苷、十四烷基3-D-麥芽三糖苷、十六烷基3-D-麥芽三糖苷、正十二烷基-蔗糖、正 癸基_蔗糖、蔗糖單葵酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單十四烷酸酯以及蔗糖單棕櫚酸酯。表面活性劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見(jiàn)，參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包括蛋白酶抑制劑，例如EDTA(乙二 胺四乙酸)和芐脒HC1，但也可以使用其它可商購(gòu)獲得的蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的使 用對(duì)含有蛋白酶酶原的藥物組合物特別有用，以便抑制自動(dòng)催化。在本發(fā)明的肽藥物制劑中有可能存在其它成分。這些附加成分可以包括濕潤(rùn)劑、 乳化劑、抗氧化劑、填充劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)溶媒、蛋白質(zhì)(例如人血 清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))以及兩性離子(例如，氨基酸，如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨 酸、賴氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這些附加成分不應(yīng)該不利地影響本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定 性。含有本發(fā)明衍生物的藥物組合物可以在若干位點(diǎn)給予需要這種治療的患者，例如 在局部位點(diǎn)(例如皮膚和粘膜位點(diǎn))、在不經(jīng)過(guò)吸收的位點(diǎn)(例如在動(dòng)脈、靜脈、心臟給藥) 以及在涉及吸收的位點(diǎn)(例如在皮膚、皮下、肌肉或腹部給藥)?？梢酝ㄟ^(guò)幾種給藥途徑，例如舌、舌下、口頰、口中、經(jīng)口、在胃和腸內(nèi)、鼻、肺(例 如通過(guò)細(xì)支氣管和肺泡或其組合)、表皮、真皮、透皮、陰道、直腸、眼(例如通過(guò)結(jié)膜)、輸尿 管和腸胃外，將本發(fā)明的藥物組合物給予需要這種治療的患者。本發(fā)明的組合物可以以幾種劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù) 合型乳劑、泡沫劑、油膏劑、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、香口膠、沖洗劑、膠囊劑(例如硬明膠膠囊劑和軟明膠膠囊劑)、栓劑、直腸用膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、 氣霧齊IJ、吸入齊IJ、滴眼齊IJ、眼膏齊IJ、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏齊IJ、注射溶液、原 位轉(zhuǎn)化溶液(例如原位凝膠化、原位固定、原位沉淀、原位結(jié)晶)、輸注溶液和植入劑。本發(fā)明的組合物還可以例如通過(guò)共價(jià)、疏水性和靜電相互作用混合進(jìn)或連接至藥 物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級(jí)藥物遞送系統(tǒng)，以便進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明衍生物的穩(wěn)定性、提高 生物利用率、增強(qiáng)溶解性、降低不利效應(yīng)、達(dá)到本領(lǐng)域那些技術(shù)人員眾所周知的時(shí)間治療， 以及增強(qiáng)患者的順應(yīng)性或其任意組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級(jí)藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包 括但不限于聚合物(例如纖維素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生 物)、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和丙烯酸甲酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚 乙二醇、載體蛋白(例如白蛋白)、凝膠(例如熱凝膠系統(tǒng)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的嵌段共聚體系統(tǒng))、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米微粒、液晶及其分散相、L2相及其分散相， 脂-水系統(tǒng)的相行為領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的高分子膠束、復(fù)合型乳劑、自乳化、自微乳化、 環(huán)糊精及其衍生物，以及樹(shù)狀分子。本發(fā)明的組合物可為用于肺部給予本發(fā)明衍生物的固體、半固體、粉末和溶液制 劑，使用例如定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器，所有這些裝置都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周 知的。本發(fā)明的組合物尤其可用于控釋、持續(xù)釋放、延長(zhǎng)釋放、阻釋和緩釋藥物遞送系統(tǒng) 的制劑。更具體地說(shuō)，但不作為限制，組合物可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的腸胃外控釋 系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)的制劑(這兩個(gè)系統(tǒng)都導(dǎo)致給藥次數(shù)減少許多倍)。甚至更優(yōu)選地，組 合物可為皮下給予的控釋系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)。無(wú)意于限制本發(fā)明的范圍，有用的控釋系 統(tǒng)和組合物的實(shí)例是水凝膠、油性凝膠、液晶、高分子膠束、微球、納米微粒。生產(chǎn)可用于本發(fā)明組合物的控釋系統(tǒng)的方法包括但不限于結(jié)晶、縮合、共結(jié) 晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻化、囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶 劑蒸發(fā)產(chǎn)生微球、擠出和超臨界流體處理。一般參考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L.編輯，Marcel Dekker, New York,2000)禾口 Drug and thePharmaceutical Sciences 99 卷Protein Formulation and Delivery(MacNally, E. J.編輯，Marcel Dekker, New York，2000)。腸胃外給藥可以用注射器(任選筆式注射器)通過(guò)皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注 射進(jìn)行。備選地，腸胃外給藥可以通過(guò)輸注泵實(shí)施。進(jìn)一步的選擇是可以為溶液或混懸劑 或粉劑的組合物，用于以鼻或肺液體或粉末噴霧形式給予本發(fā)明的衍生物。作為更進(jìn)一步 的選擇，含有本發(fā)明衍生物的藥物組合物也能夠適合例如通過(guò)無(wú)針注射或通過(guò)藥貼(任選 電離子導(dǎo)入藥貼)透皮給予，或者經(jīng)粘膜(例如口頰)給予。本發(fā)明的衍生物可以使用適合肺部藥物遞送的任何已知類型的裝置，在溶媒中 作為溶液、混懸劑或干粉劑通過(guò)肺部途徑給予。這些裝置的實(shí)例包括但不限于用于肺 部藥物遞送的三種通用型氣溶膠發(fā)生器，并且可以包括噴射霧化器或超聲霧化器、定量 吸入器或干粉吸入器(參見(jiàn) Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery physiologic andmechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997)395-453)?；跇?biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試方法學(xué)，將粒子的氣體動(dòng)力學(xué)直徑(da)定義為單位密度(lg/ cm3)的參考標(biāo)準(zhǔn)球形粒子的幾何等效直徑。在最簡(jiǎn)單的情形中，對(duì)于球形微粒，九作為密度比率的平方根函數(shù)與基準(zhǔn)直徑(d)相關(guān)，如下所述對(duì)非球形顆粒，該氣體動(dòng)力學(xué)直徑關(guān)系需要修改(參見(jiàn)EdwardsDA，Ben-Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drugdelivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385)。術(shù)語(yǔ) “MMAD” 禾口 “MMEAD” 是本領(lǐng)域 已充分描述并已知的(參見(jiàn)Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R，其提供了一種空氣動(dòng) 力學(xué)粒子直徑分布的中值測(cè)量° Recent advances in pulmonary drugdelivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379—385)。質(zhì)量中值 空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMAD)和質(zhì)量中值有效空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMEAD)可以互換使用，是統(tǒng)計(jì) 參數(shù)，并且經(jīng)驗(yàn)性地描述氣溶膠粒子大小(該大小與它們?cè)诜沃械某练e潛力相關(guān))，與實(shí) 際形狀、大小或密度無(wú)關(guān)(參見(jiàn) Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaledparticles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385)。MMAD通常由以碰撞器(一種測(cè)量空氣中的粒子慣性行為的裝置) 實(shí)施的測(cè)量計(jì)算。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述制劑可以通過(guò)任何已知的氣霧化技術(shù)(例如噴霧技 術(shù))而氣霧化，以達(dá)到氣溶膠粒子的MMAD，其小于10 u m,更優(yōu)選1-5 u m,最優(yōu)選1-3 u m。優(yōu) 選的粒子大小基于遞送藥物進(jìn)肺深部(在那里蛋白質(zhì)得以最佳吸收)的最有效大小(參見(jiàn) EdwardsDA,Ben-Jebria A,Langer A,Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379—385)。含有本發(fā)明衍生物的肺用制劑在肺深部的沉積可任選地通過(guò)使用吸入技術(shù)的改 變形式進(jìn)一步優(yōu)化，所述吸入技術(shù)的改變形式例如但不限于緩慢吸入氣流(例如30L/分 鐘)、屏氣和定時(shí)釋放。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定制劑”是指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或增加的物理和 化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)蛋白制劑的“物理穩(wěn)定性”是指蛋白由于接觸熱_機(jī)械應(yīng)力和/ 或與失穩(wěn)的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成生物學(xué)上失活的和/或不可 溶的蛋白聚集物的傾向性。含水蛋白制劑的物理穩(wěn)定性可通過(guò)在不同溫度下將置于合適容 器(如藥筒或小瓶)中的制劑接觸機(jī)械/物理應(yīng)力(如攪動(dòng))不同時(shí)間后通過(guò)視覺(jué)檢查和 /或濁度測(cè)量來(lái)評(píng)估。制劑的視覺(jué)檢查在具有黑色背景的精確聚焦光下進(jìn)行。制劑的濁度 通過(guò)視覺(jué)打分評(píng)定混濁程度等級(jí)來(lái)表征，例如以0-3的等級(jí)來(lái)表征(未顯示濁度的制劑對(duì) 應(yīng)視覺(jué)打分0，而在日光下顯示肉眼濁度的制劑對(duì)應(yīng)視覺(jué)打分3)。當(dāng)制劑在日光下顯示肉 眼濁度時(shí)，將蛋白制劑分類為就蛋白聚集而言是物理不穩(wěn)定的。備選地，制劑濁度可通過(guò)技 術(shù)人員眾所周知的簡(jiǎn)單濁度測(cè)量法評(píng)估。含水蛋白制劑的物理穩(wěn)定性還可以通過(guò)使用光譜 劑或蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)探針來(lái)評(píng)估。該探針優(yōu)選為優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小 分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個(gè)實(shí)例是硫磺素T。硫磺素T是一種已廣泛用于 檢測(cè)淀粉樣蛋白原纖維的熒光染料。在存在原纖維以及或許還存在其它蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況 下，硫磺素T在結(jié)合原纖維蛋白質(zhì)形式時(shí)在約450nm處產(chǎn)生新的激發(fā)極大值，并在約482nm 處發(fā)射增強(qiáng)。未結(jié)合的硫磺素T在這些波長(zhǎng)下基本上是無(wú)熒光的。其它小分子可以用作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變(從天然到非天然狀態(tài))的探針。例如，“疏 水補(bǔ)丁”(hydrophobic patch)探針優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的暴露的疏水補(bǔ)丁。疏水補(bǔ)丁通常包埋
29于天然態(tài)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，但當(dāng)?shù)鞍组_(kāi)始去折疊或變性時(shí)其變?yōu)楸┞兜?。這些小分子光 譜探針的實(shí)例是芳香族疏水染料，例如蒽、吖啶、鄰二氮雜菲等。其它光譜探針是金屬-氨 基酸絡(luò)合物，例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸等的鈷金 屬絡(luò)合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)蛋白制劑的“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價(jià)變化，其 導(dǎo)致形成與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比具有潛在較小的生物學(xué)效力和/或潛在增加的免疫原特性 的化學(xué)降解產(chǎn)物?？梢孕纬啥喾N化學(xué)降解產(chǎn)物，這取決于天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)以及該 蛋白質(zhì)所暴露的環(huán)境。化學(xué)降解的消除幾乎不可能完全避免，且在蛋白制劑的存儲(chǔ)和使用 過(guò)程中經(jīng)常可見(jiàn)化學(xué)降解產(chǎn)物的量增加，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。大部分蛋白質(zhì) 傾向于脫酰胺，脫酰胺是谷氨酰胺或天冬酰胺殘基中的側(cè)鏈酰胺基水解形成游離羧酸的過(guò) 程。其它降解途徑包括形成高分子量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中兩個(gè)或更多個(gè)蛋白分子通過(guò)轉(zhuǎn)酰胺 作用和/或二硫化物相互作用彼此共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致形成共價(jià)結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚 j^Mr^ (Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern. T. J. Manning M. C. ,Plenum Press, New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)可被認(rèn)為是化學(xué)降解的另一種 變體。蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性可通過(guò)在其接觸不同的環(huán)境條件(降解產(chǎn)物的形成經(jīng)?？赏?過(guò)例如增加溫度來(lái)加速)后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量化學(xué)降解產(chǎn)物的量來(lái)評(píng)估。每種單獨(dú)的降解 產(chǎn)物的量經(jīng)?？筛鶕?jù)分子大小和/或電荷使用多種不同的色譜技術(shù)(例如SEC-HPLC和/ 或RP-HPLC)通過(guò)分離降解產(chǎn)物來(lái)測(cè)定。因此，如上概述，“穩(wěn)定的制劑”是指具有增強(qiáng)的物理學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性 或增強(qiáng)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。一般而言，制劑在使用和存儲(chǔ)過(guò)程中(依照建議的使 用和存儲(chǔ)條件)必須是穩(wěn)定的，直到達(dá)到有效期。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明衍生物的藥物制劑在6周以上的使用和 3年以上的存儲(chǔ)中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明衍生物的藥物制劑在4周以上的使用 和3年以上的存儲(chǔ)中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明衍生物的藥物制劑在4周以上的使用 和2年以上的存儲(chǔ)中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明衍生物的藥物制劑在2周以上的使用 和2年以上的存儲(chǔ)中是穩(wěn)定的。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的衍生物制備藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物用于制備治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、 葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌 梗塞、中風(fēng)、冠心病和其它心血管疾病、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍的藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物用于制備延緩或預(yù)防2型糖尿病的疾病發(fā) 展的藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物用于制備減少食物攝取、減少細(xì)胞凋 亡、增強(qiáng)0"細(xì)胞功能和0"細(xì)胞量和/或恢復(fù)0"細(xì)胞的葡萄糖敏感性的藥物。用本發(fā)明的衍生物的治療還可以與第二種或更多種藥理活性物質(zhì)組合，所述藥理 活性物質(zhì)例如選自抗糖尿病藥、減肥藥、食欲調(diào)節(jié)劑、抗高血壓藥、用于治療和/或預(yù)防由
30糖尿病引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā)癥的藥物以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥引發(fā)或與其相 關(guān)的并發(fā)癥和障礙的藥物。這些藥理活性物質(zhì)的實(shí)例是胰島素、磺脲類、雙胍、美格列奈 類、葡糖苷酶抑制劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制劑、涉及刺激糖異 生和/或糖原分解的肝酶抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂類代謝的化合物如抗高血脂 藥劑如HMG CoA抑制劑(他汀類)、胃抑制性多肽(GIP類似物)、降低食物攝取的化合物、 RXR激動(dòng)劑和作用于細(xì)胞的ATP依賴性鉀通道的制劑；考來(lái)烯胺、考來(lái)替泊、安妥明、 吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普羅布考、右旋甲狀腺素、那格列奈、瑞格列奈； 阻滯劑，例如烯丙心安、氨酰心安、噻嗎心安、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾；ACE(血 管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑，例如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、法西 多曲(alatriopril)、喹那普利和雷米普利；鈣通道阻滯劑，例如硝苯吡啶、非洛地平、尼卡 地平、依拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米；以及a “阻滯劑，例如多沙唑嗪、烏拉地 爾、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動(dòng)劑、NPY(神經(jīng)肽Y)拮 抗劑、PYY激動(dòng)劑、Y2受體激動(dòng)劑、Y4受體激動(dòng)劑、混合的Y2/Y4受體激動(dòng)劑、MC4(黑皮 質(zhì)素4)激動(dòng)劑、阿立新拮抗劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動(dòng)劑、CRF(促皮質(zhì)素釋放因子) 激動(dòng)劑、CRF BP(促皮質(zhì)素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)素激動(dòng)劑、03激動(dòng)劑、胃 泌酸調(diào)節(jié)素和類似物、MSH(黑素細(xì)胞-刺激激素)激動(dòng)劑、MCH(黑素細(xì)胞-濃縮激素， melanocyte-concentrating hormone)拮抗劑、CCK (膽囊收縮素)激動(dòng)劑、血清素重吸收抑 制劑、血清素和去甲腎上腺素重吸收抑制劑、混合的血清素和去甲腎上腺素化合物、5HT (血 清素)激動(dòng)劑、蛙皮素激動(dòng)劑、神經(jīng)節(jié)肽拮抗劑、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放化合物、TRH(促甲 狀腺激素釋放激素)激動(dòng)劑、UCP 2或3 (解偶聯(lián)蛋白2或3)調(diào)節(jié)劑、瘦素激動(dòng)劑、DA激動(dòng) 劑(溴隱停、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(視黃醇類X受體)調(diào)節(jié)劑、TR0激動(dòng) 劑；組胺H3拮抗劑、胃抑制性多肽激動(dòng)劑或拮抗劑(GIP類似物)、胃泌素和胃泌素類似物。用本發(fā)明的衍生物治療還可以與外科手術(shù)(即影響葡萄糖水平和/或脂質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài) 的外科手術(shù))例如胃束帶術(shù)或胃旁路術(shù)聯(lián)合。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的衍生物與一種或多種上文提及的化合物以及任選的一種 或多種其它藥理活性物質(zhì)的任意適宜組合被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。制備方法根據(jù)序列，可以通過(guò)以下方法生產(chǎn)本發(fā)明的類似物所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞， 所述宿主細(xì)胞包含編碼多肽的DNA序列，并能夠在允許表達(dá)所述肽的條件下在適宜的營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基中表達(dá)所述多肽，之后由培養(yǎng)物回收所獲得的肽。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于培育宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，例如包含適 當(dāng)添加物的基本培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商處獲得，或者可根據(jù) 公開(kāi)的處方(例如在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。細(xì)胞產(chǎn)生的肽然后可通過(guò) 常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收，包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，利用鹽如硫酸 銨沉淀上清液或?yàn)V過(guò)液的蛋白質(zhì)組分，通過(guò)多種色譜方法純化，如離子交換色譜、凝膠過(guò)濾 色譜、親和色譜等，這取決于所述肽的類型。編碼治療性多肽的DNA序列可適當(dāng)?shù)貫榛蚪M或cDNA來(lái)源，例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) (參見(jiàn)例如 Sambrook, J, Fritsch, EF 禾口 Maniatis, T, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York，1989)，通過(guò)制備基因組或cDNA文庫(kù)并用合成寡核苷酸探針通過(guò)雜交篩選編碼全長(zhǎng)或部分多肽的DNA序列而獲 得。編碼多肽的DNA序列也可通過(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，所述標(biāo)準(zhǔn)方法例如由 Beaucage 禾口 Caruthers，Tetrahedron Letters 22 (1981)，1859-1869 描述的亞磷酰胺 (phosphoamidite)方法或由 Matthes 等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805 描述的方法。 所述DNA序列也可使用特異性引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如按在US 4，683，202或 Saiki 等人，Science 239 (1988)，487-491 中所述。所述DNA序列可插入至任何可方便地接受重組DNA操作的載體中，載體的選擇經(jīng) 常取決于其將被引入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí) 體存在的載體，所述載體的復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。備選地，所述載體可以是 當(dāng)將其引入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞基因組中并與其已經(jīng)整合入的染色體一起復(fù)制的 載體。所述載體優(yōu)選為表達(dá)載體，其中編碼所述肽的DNA序列有效連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需 的其它片段如啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列， 并可源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適于在多種宿主細(xì)胞中引導(dǎo)編碼本 發(fā)明肽的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例在本領(lǐng)域是眾所周知的，參見(jiàn)例如Sambrook等人，如前 所述。如果需要，也可將編碼所述肽的DNA序列有效連接至合適的終止子、多腺苷酸化 信號(hào)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯增強(qiáng)子序列。本發(fā)明的重組載體還可以包含能使該載體在所 述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述載體還可包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因或賦予對(duì)下列 藥物抗性的基因如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。為了引導(dǎo)本發(fā)明的親本肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌路徑，可在重組載體中提供分泌信 號(hào)序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。在正確的讀框內(nèi)將分泌信號(hào)序列連接至 編碼肽的DNA序列上。分泌信號(hào)序列通常位于編碼肽的DNA序列的5'端。分泌信號(hào)序列 可以是通常與該肽相關(guān)的分泌信號(hào)序列，或者可以來(lái)自編碼另一種分泌蛋白的基因。用于 分別連接編碼本發(fā)明肽的DNA序列、啟動(dòng)子和任選的終止子和/或分泌信號(hào)序列并將它們 插入至含有復(fù)制所需信息的合適載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)例如 Sambrook等人，如前所述)。引入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能產(chǎn)生本發(fā)明肽的任何細(xì)胞，包括細(xì) 菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知并使用的合適宿主細(xì)胞的實(shí)例是但不限于大腸 桿菌(E. coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳動(dòng)物BHK或CH0細(xì)胞系。本發(fā)明的實(shí)施方案1. 一種包含修飾的GLP-1序列7_37(SEQ ID No 1)的GLP-1衍生物，所述修飾的 GLP-1序列7-37具有i)與SEQ ID No 1的序列7-37相比總共2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg殘基；ii)任選1個(gè)氨基酸殘基的C末端延長(zhǎng)，iii)任選在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基酸可以不存在，和
iv)任選C末端酰胺基團(tuán)，而且其在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。2.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其包含修飾的GLP-1序列7-37 (SEQ ID No 1)，所 述修飾的GLP-1序列7-37具有i)與SEQ ID No 1的序列7-37相比總共2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg殘基；而且其在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。3.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQ ID No 1的37位的位置沒(méi)有氨 基酸，所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、23、31、34 或 36 位的位置，且其中GLP-1類似物的總長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸。4.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有長(zhǎng)1個(gè)氨基酸殘基的C末 端延伸，其中所述GLP-1類似物的總長(zhǎng)度為32個(gè)氨基酸。5.實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有C_末端酰胺基團(tuán)。6.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(I)的序 列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-G lu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe_I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-X
一 一 一 R式(I)(SEQ ID No 2)，優(yōu)選具有除了在20位具有Leu之外與式⑴相同的式(I’ )的序列，其中，Xaa7-Xaa8為L(zhǎng)_組氨酸_Aib、去氨基-組氨酸-丙氨酸或去氨基-組氨酸_Aib ；Xaa9為Glu或Glu衍生物，例如a，a 二甲基-GluXaa16 為 Val 或 Leu ；Xaa18 為 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 為 Leu 或 LysXaa23 為 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 為 Ala 或 AsnXaa25 為 Ala 或 Val ;Xaa27 為 Glu、Ala 或 Leu ;Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg，優(yōu)選為 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa31 為 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 為 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Cys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 為 Gly 或 Aib ;Xaa36 為 Arg 或 Lys，Xaa37 為 Gly、Aib、Cys、Lys 或不存在，Xaa38 為 Lys、Glu 或不存在；R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37不存在，則Xaa38也不存在，所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、 34、36 或 37 位。7.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(II)的序 列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln -Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa3o_Trp-Leu-Xaa33_Xaa34_Xaa35_Xaa36-Xaa37-Xaa38-R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7為L(zhǎng)_組氨酸、D_組氨酸、去氨基-組氨酸、2_氨基-組氨酸、0 -羥基-組氨 酸、高組氨酸、Na-乙酰基-組氨酸、a-氟甲基-組氨酸、a-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Xaa8 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基環(huán)丙基)甲酸、(1_ 氨基環(huán)丁 基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨 基環(huán)辛基)甲酸；Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 為 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 為 Val 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 為 Gly 或 Aib ；Xaa36 為 Arg 或 Lys,Xaa37 為 Gly、Aib、Lys 或不存在，
Xaa38 為 Lys、Glu 或不存在，R為酰胺或不存在，所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、 34、36 或 37 位。8.實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中至少一個(gè)氨基酸殘基被 A-B-C-D-衍生化，其中A-選自
34 其中n 選自 14、15、16、17、18 和 19，p 選自 10、11、12、13 和 14，d 選自 0、1、2、3、4 和5，-B-選自
和其中x 選自 0、1、2、3 和 4，y 選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12，-C-選自 其中b和e各自獨(dú)立地選自0、1和2，c和f各自獨(dú)立地選自0、1和2，條件是當(dāng)c 為0時(shí)b為1或2，或者當(dāng)c為1或2時(shí)b為0，且當(dāng)f 為0時(shí)e為1或2，或者f 為1或2 時(shí)e為0，和-D-連接至所述氨基酸殘基，并為接頭。9.實(shí)施方案52-55中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中所述衍生化的氨基酸殘基為賴氨酸。10. 一種藥物組合物，其包含實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)的衍生物和藥學(xué)上可接受的 賦形劑。11.實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)的衍生物，所述衍生物用于治療或預(yù)防高血糖癥、2型 糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬 化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
人GLP-1(7_37)的氨基酸序列作為SEQ ID No 1包括在序列表中，SEQ ID No :2和 3為依據(jù)本發(fā)明的衍生物。在序列表中，編號(hào)以第1號(hào)氨基酸殘基開(kāi)始。因此，例如，SEQ ID No 1 的 1 位等同于 GLP-1 (7-37)的 7 位(His)，SEQ ID No 1 的 16 位等同于 GLP-1 (7-37) 的22位(Gly)，SEQ ID No 1的20位等同于GLP-1 (7-37)的26位(Lys)，其它位和其它序 列反之亦然。因此，本發(fā)明還在優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的權(quán)利要求1中提供包含修飾的GLP-1(7_37)序列 的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有i)與SEQ ID No 1的序列相比總共2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的取代，包括a)在等同于GLP-1 (7-37)的22位(SEQ ID No 1的16位)的位置的Glu殘基，和b)在等同于GLP-1 (7-37)的26位(SEQ ID No 1的20位)的位置的Arg殘基；ii)任選地1個(gè)氨基酸殘基的C末端延長(zhǎng)，iii)任選地在等同于GLP-1 (7-37)的37位(SEQ ID No 1的31位)的位置的氨 基酸可以不存在，和iv)任選地C末端酰胺基團(tuán)，所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37)的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位(分別為 SEQ ID No 1 的 12、14、17、24、25、 28、30或31位)的位置；本發(fā)明另外提供GLP-1衍生物、其方法和用途，以及其內(nèi)容物對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的任 一項(xiàng)權(quán)利要求和具體的實(shí)施方案的藥物組合物，其中相應(yīng)的位置編號(hào)修正已如上所述解 釋，并在上文針對(duì)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的權(quán)利要求1的GLP-1衍生物顯示。本發(fā)明的其它實(shí)施方案1. 一種包含修飾的GLP-1序列7_37(SEQ ID No 1)的GLP-1衍生物，所述修飾的 GLP-1序列7-37具有i)與SEQ ID No 1的序列7-37相比總共2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg殘基；ii)任選1個(gè)氨基酸殘基的C末端延長(zhǎng)，iii)任選在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基酸可不存在，和iv)任選C末端酰胺基團(tuán)，而且其在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，已修飾最多6個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，已修飾 最多5個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，已修飾最多4個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案 中，已修飾最多3個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，已修飾最多2個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的 實(shí)施方案中，已修飾1個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，已在C-末端加入1個(gè)氨基酸。在 本發(fā)明的實(shí)施方案中，已在C-末端缺失1個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，存在C-末端 酰胺基團(tuán)。2.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其包含修飾的GLP-1序列7-37 (SEQ ID No 1)，所
36述修飾的GLP-1序列7-37具有i)與SEQ ID No 1的序列7-37相比總共2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg殘基；而且其在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。3.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基 酸不存在，所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34 或 36 位的位置，且其中GLP-1類似物的總長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸。4.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其具有長(zhǎng)度為1個(gè)氨基酸殘基的C末端延長(zhǎng)，其中 GLP-1類似物的總長(zhǎng)度為32個(gè)氨基酸。5.實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有C_末端酰胺基團(tuán)。6.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ ID NO 1的序列7_37相比具 有3個(gè)氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。7.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ ID NO 1的序列7_37相比在 選自以下的位置具有取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37位。8.實(shí)施方案7的GLP-1衍生物，其具有選自以下的取代去氨基His7、Aib8、 Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、 Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 和 Lys37。9.實(shí)施方案7-8中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的取代去氨基His7、 Aib8、Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34 禾口 Lys37。10.實(shí)施方案7-9中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的取代去氨基His7 和 Aib8。11.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ ID NO 1的序列7_37相比 具有4個(gè)氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。12.實(shí)施方案1-5和11中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ IDN0 1的序列7_37 相比在選自以下的位置具有兩個(gè)取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37位。13.實(shí)施方案11-12中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的兩個(gè)取代去 MS His7、Aib8、Lysl8> Cysl8、Lys20> Cys20、Lys23> Cys23>Asn24> Val25> Ala27> Leu27> Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 和 Lys37。14.實(shí)施方案11-13中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代 去氨基His7和Aib8，并具有選自以下的氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。15.實(shí)施方案11-14中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代 去氨基His7和Aib8，并具有選自以下的氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。16.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ ID NO 1的序列7-37相比具有5個(gè)氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。17.實(shí)施方案1-5和16中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ IDN0 1的序列7_37 相比在選自以下的位置具有3個(gè)氨基酸取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37。18.實(shí)施方案16-17中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的3個(gè)氨基酸取 代去氨基 His7、Aib8、Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、 Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 禾口 Lys37。19.實(shí)施方案16-18中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有選自以下的兩個(gè)氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。20.實(shí)施方案16-19中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有選自以下的兩個(gè)氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。21.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與SEQ ID NO 1的序列7-37相比 具有6個(gè)氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。22.實(shí)施方案1-5和21中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其在選自以下的位置具有4個(gè) 氨基酸取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34 和 37。23.實(shí)施方案21-22中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的4個(gè)氨基酸取 代去氨基 His7、Aib8、Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、 Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 禾口 Lys37。24.實(shí)施方案21-23中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有選自以下的三個(gè)氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。25.實(shí)施方案21-24中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有選自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有選自以下的三個(gè)氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。26.實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在18位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。27.實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在23位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。28.實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在31位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。29.實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在34位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。30.實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在36位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。31.實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已在37位被PEG化或被白蛋白結(jié)
合殘基衍生化。32.實(shí)施方案1-31中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已被PEG化。33.實(shí)施方案1-32中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQID No 1的37位的位置的氨基酸已被Lys取代，所述Lys殘基被PEG化或被白蛋白結(jié)合殘基衍生化。34.實(shí)施方案1-33中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已被白蛋白結(jié)合殘基衍生化。35.實(shí)施方案1-34中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有下式(I)的序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-G lu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe_I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-X
一一 一 R式(I)(SEQ ID No :2)，優(yōu)選具有除在20位具有Leu之外與式⑴相同的式(I’)，其中，Xaa7-Xaa8為L(zhǎng)_組氨酸_Aib、去氨基-組氨酸-丙氨酸或去氨基-組氨酸_Aib ；Xaa9為Glu或Glu衍生物，例如a，a 二甲基-Glu ；Xaa16 為 Val 或 Leu ；Xaa18 為 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 為 Leu 或 LysXaa23 為 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 為 Ala 或 AsnXaa25 為 Ala 或 Val ；Xaa27 為 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg，優(yōu)選為 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa31 為 Trp、Cys 或 Lys ；Xaa33 為 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Cys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 為 Gly 或 Aib ；Xaa36 為 Arg 或 Lys ；Xaa37 為 Gly、Aib、Cys、Lys 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu 或不存在；R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37不存在，則Xaa38也不存在，且所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 SEQID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、 31、34、36 或 37 位。36.實(shí)施方案1-35中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln -Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa3o_Trp-Leu-Xaa33_Xaa34_Xaa35_Xaa36-Xaa37-Xaa38-R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7為L(zhǎng)_組氨酸、D_組氨酸、去氨基-組氨酸、2_氨基-組氨酸、0 -羥基-組氨 酸、高組氨酸、Na-乙酰基-組氨酸、a-氟甲基-組氨酸、a-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；
Xaa8 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基環(huán)丙基)甲酸、(1_ 氨基環(huán)丁 基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨 基環(huán)辛基)甲酸；Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 為 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 為 Val 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 為 Gly 或 Aib ；Xaa36 為 Arg 或 Lys，Xaa37 為 Gly、Aib、Lys 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu 或不存在；R為酰胺或不存在且所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，優(yōu)選在 SEQ ID No 1 的 18、23、 31、34、36 或 37 位。37.實(shí)施方案35-36中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中Xaa38不存在。38.實(shí)施方案35-37中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，Xaa37和Xaa38均不存在。39.實(shí)施方案35-38中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中Xaa37和Xaa38均不存在，而 Xaa36 為 Xaa36-酰胺。40.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中3個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7為去氨基-組氨酸。41.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中4個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7為去氨基-組氨酸。42.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中5個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7為去氨基-組氨酸。43.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中6個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7為去氨基-組氨酸。44.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中3個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8為Aib。45.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中4個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8為Aib。46.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中5個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8為Aib。47.實(shí)施方案35-39中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中6個(gè)氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8為Aib。48.實(shí)施方案35-47中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中Xaa7為去氨基-組氨酸。49.實(shí)施方案1-48中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其在修飾的GLP-1序列和一個(gè)或多 個(gè)白蛋白結(jié)合殘基之間含有親水間隔基。50.實(shí)施方案49的GLP-1衍生物，其中所述親水間隔基為在兩個(gè)末端具有合適的
40官能團(tuán)的未分支的寡乙二醇部分，其在修飾的GLP-1序列的氨基和白蛋白結(jié)合殘基的官能 團(tuán)之間形成橋。51.實(shí)施方案1-59中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其已被白蛋白結(jié)合殘基衍生化。52.實(shí)施方案1-51中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中至少一個(gè)氨基酸殘基被 A-B-C-D-衍生化，
其中A-選自 和5，
和無(wú)磺酰胺的四唑，
其中 n 選自 14、15、16、17、18 和 19，p 選自 10、11、12、13 和 14，d 選自 0、1、2、3、4
-B-選自
和 其中x 選自 0、1、2、3 和 4，y 選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12，-C-選自 其中b和e各自獨(dú)立地選自0、1和2，c和f各自獨(dú)立地選自0、1和2，條件是當(dāng)c 為0時(shí)b為1或2，或者當(dāng)c為1或2時(shí)b為0，且當(dāng)f 為0時(shí)e為1或2，或者當(dāng)f 為1或2時(shí)e為0，和-D-連接至所述氨基酸殘基，并為接頭。53.實(shí)施方案52的GLP-1衍生物，其中一個(gè)氨基酸殘基被A-B-C-D-衍生化。54.實(shí)施方案52-53中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸殘基包含氨基。55.實(shí)施方案52-54中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸殘基在側(cè)鏈包
含伯氨基。56.實(shí)施方案52-55中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸殘基為賴氨酸。57.實(shí)施方案52-56中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中僅一個(gè)氨基酸殘基被衍生化。58.實(shí)施方案52-57中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中A-為 59.實(shí)施方案52-58中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中n選自15和17，更優(yōu)選17。60.實(shí)施方案52-57中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中A-為 61.實(shí)施方案52-57和60中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中p選自12、13和14，更 優(yōu)選為13。62.實(shí)施方案52-57和60-61中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中d選自0、1、2、3和 4，更優(yōu)選為0、1和2，最優(yōu)選為1。63.實(shí)施方案52-57和52-62中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中d選自0、1和2，p選 自12、13或14，更優(yōu)選地d選自1和2，p選自13和14，最優(yōu)選地d為l，p為13。64.實(shí)施方案52-63中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_B_為 65.實(shí)施方案52-63中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_B_為 66.實(shí)施方案52-63中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_B_為 67.實(shí)施方案52-63中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_B_為 68.實(shí)施方案67的GLP-1衍生物，其中x選自0、1和2，更優(yōu)選地x選自0和1，最 優(yōu)選地x為0或1，優(yōu)選為0。69.實(shí)施方案52-63中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_B_為 70.實(shí)施方案69的GLP-1衍生物，其中y選自2、3、4、5、6、7、8、9和10，更優(yōu)選地 y 選自 2、3、4、5、6、7 和 8。71.實(shí)施方案52-70中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_C_為 72.實(shí)施方案71的GLP-1衍生物，其中c選自0和l，b選自1和2，更優(yōu)選地b為 1或2，優(yōu)選為2;c為0。73.實(shí)施方案52-70中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_C_為 74.實(shí)施方案73的GLP－1衍生物，其中F選自0和1，e選自1和2，更優(yōu)選的e為1，f為0
75.實(shí)施方案52-70中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_C_為 76.實(shí)施方案52-70中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中D選自 其中k 選自 0、1、2、3、4、5、11 和 27，m 選自 0、1、2、3、4、5 和 6。77.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 78.實(shí)施方案77的GLP-1衍生物，其中k選自1、2、3、11和27，更優(yōu)選的k為1。79.實(shí)施方案77-78中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選 的m選自0、1和2。80.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 81.實(shí)施方案80的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選的m選自0、1 和2。82.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 83.實(shí)施方案82的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選的m選自0、1 和2。84.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 85.實(shí)施方案84的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選的m選自0、1 和2。86.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 87.實(shí)施方案86的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選的m選自0、1 和2。88.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中_D_為 89.實(shí)施方案88的GLP-1衍生物，其中m選自0、1、2、3和4，更優(yōu)選的m選自0、1 和2。90.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-選自以下并由以下
組合
45 91.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-選自以下并由以下 組合 92.實(shí)施方案52-76中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-選自
93.以上實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其選自
N-e 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l (7-37)酰胺，N-e 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-e 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((1 )-3-[1-(17-羧基十七?；?哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-1- (7-37)酰胺，N-e 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys30] GLP-1-(7-37)，N-e 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞Aib8，Glu22， Arg26, Lys31] GLP-1-(7-37)，N-￡31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(⑶-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九?；?哌 啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；? [Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-1-(7-37)，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)， N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)，N-￡ 20-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16-(lH_ 四 唑-5-基)十六酰基氨磺?；?丁酰基氨基]十二?；被鶀 丁?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-￡ 37-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16-(lH_ 四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二?；被鶀 丁?；被?丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-￡ 37-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(lH-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二?；被鶀 丁酰基氨基)丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺，
[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-1-(7-37) Lys [2-(2-{2-[4-羧 基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六?；被酋；?丁?；被鵠丁?；?氨基}丁?；被?丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；鵠，N- e 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺，N- e 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙酰基)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺，N- e 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六?；被?_4_羧基丁?；被?乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六?；被?_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺，N-e 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺， N- e 36- (2_ (2_ (2_ ((2_ [2_ (2_ (17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36]GLP-l-(7-37)Glu-酰 胺，N-e 37-[4-(16_(lH-四唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；鵠[去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37_ [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ (19_ 羧基十九?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)，和N- e 31_[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基-4_(17_ 羧基-十七?；被?丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-1-(7-37)。94. 一種增加GLP-1類似物在患者中的作用時(shí)間的方法，其特征在于修飾的GLP-1 序列7-37(SEQ ID No 1)被衍生化或PEG化，如在前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)中所公開(kāi)的。95. 一種用于將GLP-1衍生物在患者中的作用時(shí)間增加至約40小時(shí)以上的方法， 其特征在于修飾的GLP-1序列7-37(SEQ ID No 1)被衍生化或PEG化，如在前述實(shí)施方案 的任一項(xiàng)中所公開(kāi)的。96. 一種藥物組合物，其包含實(shí)施方案1-93中的任一項(xiàng)的衍生物和藥學(xué)上可接受 的賦形劑。97.實(shí)施方案96的藥物組合物，其適于胃腸外給藥。98.實(shí)施方案1-93中的任一項(xiàng)的衍生物用于制備藥物的用途。99.實(shí)施方案1-93中任一項(xiàng)的衍生物在制備用于治療或預(yù)防下列疾病的藥物中 的用途高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂 異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。100.實(shí)施方案1-93中任一項(xiàng)的衍生物在制備用于延遲或預(yù)防2型糖尿病的疾病 發(fā)展的藥物中的用途。101.實(shí)施方案1-93中任一項(xiàng)的衍生物在制備用于減少食物攝取、減少0 _細(xì)胞凋 亡、增強(qiáng)細(xì)胞功能和細(xì)胞量和/或恢復(fù)細(xì)胞的葡萄糖敏感性的藥物中的用途。102.實(shí)施方案1-93中任一項(xiàng)的衍生物，其用于治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、 葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌 梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。本發(fā)明進(jìn)一步的具體實(shí)施方案1. 一種包含修飾的GLP-1 (7-37)序列的GLP-1衍生物，所述修飾的GLP-1 (7-37) 序列具有i)與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相比總共2-12個(gè)氨基酸修飾，包括a)在等同于GLP-1 (7-37)的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于GLP-1 (7-37)的26位的位置的Arg殘基；和ii)其在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于GLP-1 (7-37) 的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。2.實(shí)施方案1的GLP-1衍生物，其包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸修 飾；優(yōu)選4-12個(gè)修飾，例如4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸修飾；或者例如4、5、6、7、8、
9或12個(gè)氨基酸修飾；更優(yōu)選5-11個(gè)氨基酸修飾；甚至更優(yōu)選6-10個(gè)氨基酸修飾；最優(yōu)選 7-9個(gè)氨基酸修飾。3.實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相 比，包含2-8個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸取代。4.實(shí)施方案3的GLP-1衍生物，其包含3_8個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選4_8個(gè)氨基酸取 代，更優(yōu)選5-8個(gè)氨基酸取代，甚至更優(yōu)選6-8個(gè)氨基酸取代，最優(yōu)選7-8個(gè)氨基酸取代。5.實(shí)施方案3的61^-1衍生物，其包含1)4、^)5、^1)6、^)7或力8個(gè)氨基酸取 代。6.實(shí)施方案 3-5 中任一項(xiàng)的 GLP-1 衍生物，其在 7、8、20、25、28、30、31、34、35、36 或37位中的一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選在7位和/或8位被取代。7.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其在7位或8位包含非天然氨基酸。8.實(shí)施方案7的GLP-1衍生物，其包含7_去氨基-組氨酸或8_Aib。9.實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其包含7-去氨基-組氨酸、8_Aib、20K、 25V、28F(m-CF3)、30E、30K、31K、34-Dap、34R、35-Aib、35K、35R、36K、37K、37K- e、37P 和 / 或 37R中的一個(gè)或多個(gè)。10.實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相 比，包含1-3個(gè)氨基酸缺失，優(yōu)選1、2或3個(gè)氨基酸缺失。11.實(shí)施方案10的GLP-1衍生物，其中所述缺失處于C-末端。12.實(shí)施方案 11 的 GLP-1 衍生物，其為 GLP-l(7-36)、GLP-l(7-35)或 GLP_1(7_34) 衍生物。13.實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相
53比，包含1-4個(gè)氨基酸添加，優(yōu)選1、2、3或4個(gè)氨基酸添加。14.實(shí)施方案13的GLP-I衍生物，其中所述添加處于C-末端。15.實(shí)施方案 14 的 GLP-I 衍生物，其為 GLP-1 (7-38)、GLP-I (7-39)、GLP-I (7-40) 或GLP-I (7-41)衍生物。16.實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其具有(i)C_末端酰胺基團(tuán)；或(ii) C-末端羧基，優(yōu)選游離羧基(-C00H)，或其鹽。17.優(yōu)選實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其具有下式(I)的序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-X&&23_Xa￡l24_Xa￡l25_Arg_X￡l￡l27_Xa￡l28_I 1
38 _Xclclgg __X&&41_R式(I)(SEQ ID No 2)其中，(Xaa7-Xaa8)為(L_組氨酸-Aib)、(去氨基-組氨酸-丙氨酸)或(去氨基-組 氨酸-Aib)；Xaa9為Glu或Glu衍生物，例如α，α 二甲基-Glu ；Xaa16 為 Val 或 Leu ；Xaa18 為 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 為 Leu 或 Lys ；Xaa23 為 Gin、Glu、Lys> Cys 或 Arg ；Xaa24 為 Ala 或 Asn ；Xaa25 為 Ala 或 Val ；Xaa27 為 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28 為 Phe 或 Phe 衍生物，例如 m-CF3_Phe ；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 為 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg, Lys, Aib 或不存在；Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Cys, Lys, ε -氨基-Lys, Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在； 前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，那么其下游的氨基酸殘基也不存 在；且所述GLP-I衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。
18.實(shí)施方案17的GLP-I衍生物，其中，(Xaa7-Xaa8)為(L_組氨酸-Aib)或(去氨基-組氨酸-丙氨酸)；Xaa9 為 Glu ；Xaa16 為 Val ；Xaa18 為 Ser ；Xaa20 為 Leu 或 Lys ；Xaa23 為 Gln ；Xaa24 % Ala ；Xaa25 為 Ala 或 Val ；Xaa27 為 Glu ；Xaa28 為 Phe 或 Phe 衍生物，例如 m-CF3_Phe ；Xaa30 為 Ala、Glu 或 Lys ；Xaa31 為 Trp 或 Lys ；Xaa33 為 Val ；Xaa34 為 Lys、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg, Lys, Aib 或不存在；Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在；且所述GLP-I衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。19.優(yōu)選實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Gl u_G ln_A la_Ala_Arg-G Iu-Phe-1 Ie-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xa
已38 ___X&&41_R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7為L(zhǎng)-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2_氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、高組氨酸、Na-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Xaa8 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基環(huán)丙基)甲酸、(1_ 氨基環(huán)丁 基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨 基環(huán)辛基)甲酸；
Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Lys 或 Trp ；Xaa33 為 Val 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；
Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys > Glu、Arg 或不存在； Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在；且所述GLP-I衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I(7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。20.實(shí)施方案19的GLP-I衍生物，其中，Xaa7為L(zhǎng)-組氨酸或去氨基_組氨酸；Xaa8 為 Ala 或 Aib ；Xaa18 為 Ser ；Xaa30 為 Ala、Glu 或 Lys ；Xaa31 為 Lys 或 Trp ；Xaa33 為 Val ；Xaa34 為 Lys > Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 為 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 為 Gly、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys> Glu、Arg 或不存在；Xaa39 為 Lys、Arg 或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在；且所述GLP-I衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I(7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。21.實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其在一個(gè)位置被衍生化。22.實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其在一個(gè)或多個(gè)位置、優(yōu)選在兩個(gè)位 置、在三個(gè)位置或在四個(gè)位置被衍生化。
23.實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其在以下位置被衍生化i) 18位、 土土)20位、^丨)23位、&)30位^)31 位、vi) 34 位、vii) 36 位、viii) 37 位、ix) 38 位和 / 或 χ) 39 位。24.實(shí)施方案1-23中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其在以下位置被衍生化i)20位、 ii)30 位、iii)31 位、iv) 36 位、ν) 37 位、vi)38 位或 vii) 39 位。25.實(shí)施方案1-24中任一項(xiàng)的GLP-1衍生物，其被PEG化。26.實(shí)施方案1-24中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其中白蛋白結(jié)合殘基選自i)直鏈 烷基，優(yōu)選C15烷基；ii)式CH3 (CH2)rCO-的?；?，其中優(yōu)選r為14或16。27.實(shí)施方案1-24和26中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其包括在白蛋白結(jié)合殘基和 GLP-I部分之間的接頭，其中所述接頭包含、優(yōu)選為i) 一個(gè)或多個(gè)烷撐二醇單元，例如1-10個(gè)，優(yōu)選5-8個(gè)，更優(yōu)選6個(gè)；ii)式X的化合物C，其中c為0，b為2;iii)式XVI的化合物，其中q為1或2 ；或iv)i)-iii)的任意組合，例如ii)和iii)的組合。28.優(yōu)選依據(jù)實(shí)施方案1-27中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其中至少一個(gè)氨基酸殘基 被A-B-C-D-衍生化，其中A-選自 其中四唑環(huán)任選為N-取代的，和其中η 選自 14、15、16、17、18 和 19，ρ 選自 10、11、12、13 和 14，d 選自 0、1、2、3、4 和5，-B-選自
(式 VI)， H
(式 VII)，
(式 VIII)，和
(式 IX)，
其中χ 選自 0、1、2、3 和 4，y 選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12， 其中b和e各自獨(dú)立地選自0、1和2，c和f各自獨(dú)立地選自O(shè)、1和2，條件是當(dāng)c 為O時(shí)b為1或2，或者當(dāng)C為1或2時(shí)b為0，當(dāng)f為O時(shí)e為1或2，或者當(dāng)f為1或2 時(shí)e為0，和-D-連接至所述氨基酸殘基并為接頭。29.實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其中衍生化的氨基酸殘基為賴氨酸， 其優(yōu)選通過(guò)ε氨基衍生化。30.優(yōu)選依據(jù)實(shí)施方案1-29中任一項(xiàng)的GLP-I衍生物，其選自以下物質(zhì)Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I (7-37)酰胺；Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37)酰胺；Ν-ε 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-羧基十七酰基)哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-I- (7-37)酰胺；Ν-ε 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞Aib8，Glu22， Arg26, Lys30]GLP-I-(7-37)；Ν-ε 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys31]GLP-I-(7-37)；N-ε 31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九酰基)哌
啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?[Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-I-(7-37)；
N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基圯87，611122，六『826，六『834，1^837]61^-1-(7-37)；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)；N-ε 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二酰基氨基} 丁?；被?丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺；N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4-((S)_4-羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁酰基氨基]十二?；被鶀 丁?；被?丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8, Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁酰基氨基]十二?；被鶀 丁?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰 胺；[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-1-(7-37) Lys [2_ (2_ {2_ [4_ 羧
基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六?；被酋；?丁?；被鵠丁酰基 氨基} 丁?；被?丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；鵠；N- ε 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺；N- ε 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙?；?[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺；N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六?；被?_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六?；被?_4_羧基丁?；被?乙氧基) 乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺；Ν-ε 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1 (7-37)酰胺
N- ε 36- (2_ (2_ (2_ ((2_ [2_ (2_ (17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36] GLP-I-(7-37) Glu-酰 胺；N-ε 37-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺?；?丁酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九?；被?丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 31-[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基 _4-(17_ 羧基-十七?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-I-(7-37)；N- ε 20- (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [2_ ((S) _4_ 羧基 _4_ 十六?；被?丁酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙?；?[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30， Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- (2_ {2_ [2~ ((S) ~4~ 羧基 _4_ {(S) ~4~ 羧基 _4_ [ (S) ~4~ 羧基-4-(19-羧 基_十九酰氨基)丁?；被鵠丁?；被鶀 丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?[去 氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N-ε 37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-叔 丁 基-2H-四 唑-5-基)-十六?；被酋；鵠丁?；被鶀十二?；被?-4-羧基丁酰基氨基]-4-羧 基丁?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；鶀[去氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I(7-37)；N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37).N- α 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七?；被?-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, ε-Lys37]GLP-I-(7-37)肽；N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙?；鵠[去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 36- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (15-羧基-十五?；被?-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙?；鵠[去氨基His7， Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys 肽；[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys (2- (2- {2-[2-(2- {2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁?；被鵠-乙氧基}-乙氧基)-乙 酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基)肽； N- ε 37- [2~ (2~ {2_ [2~ (2~ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基十九酰基氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I-(7-37)；
N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙?；鵠_[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Aib35, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[ (S)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37] GLP-I-(7-37)；Ν-ε 31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4_(17-羧基-十七?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-仏讓8，611122，￥￡1125^印26， Lys31，Arg34，Arg35，Arg37)] GLP-I (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41]；N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[ (S)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；被?丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Lys35, Lys36]GLP-l-(7_36)酰胺；N- ε 31-{2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基 _4-(17_ 羧基-十七?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鶀_Ν-β34-(2-(雙-羧基甲基 氨基)乙酰基)[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-I (7-34)酰胺；和^￡-37-[(5)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17_羧基十七酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，34， Lys37]GLP-I(7-37)。31. 一種藥物組合物，其包含實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)的衍生物或其藥學(xué)上可接受 的鹽、酰胺、烷基或酯等，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。32.實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)的衍生物或?qū)嵤┓桨?1的藥物組合物，其用作藥物。33.實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)的衍生物或?qū)嵤┓桨?1的藥物組合物，其用于治療 或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異 常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不 良和胃潰瘍。34.實(shí)施方案33的衍生物或藥物組合物，其用于治療或預(yù)防2型糖尿病。35.實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)的衍生物或?qū)嵤┓桨?1的藥物組合物在制備用于治 療或預(yù)防下列疾病的藥物中的用途高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、 肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾 病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。36.實(shí)施方案35的用于治療或預(yù)防2型糖尿病的用途。37. 一種通過(guò)給予藥物活性量的實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)的衍生物或?qū)嵤┓桨?1 的藥物組合物治療或預(yù)防下列疾病的方法高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖 尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血 管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。38.用于治療或預(yù)防2型糖尿病的實(shí)施方案37的方法。本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利，都通過(guò)引用結(jié)合到本文 中，其程度如同每個(gè)參考文獻(xiàn)都單獨(dú)地并具體地被指出通過(guò)引用結(jié)合到本文中并全文闡 述。
本文所使用的所有標(biāo)題和子標(biāo)題僅是為了方便起見(jiàn)使用，不應(yīng)被視為以任何方式 限制本發(fā)明。
除非本文中另行指明或除非明顯與本文相抵觸，否則本發(fā)明包括在其所有可行變 體中的上述要素的任何組合。除非本文中另行指明或明顯與本文相抵觸，否則用于描述本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”、 “一種”、“所述”和“該”和類似對(duì)象被視為既包括單數(shù)又包括復(fù)數(shù)。除非另行指明，否則本文對(duì)數(shù)值范圍的記載僅為簡(jiǎn)化記載方法，其包括落在該范 圍內(nèi)的每個(gè)獨(dú)立數(shù)值，且每個(gè)獨(dú)立數(shù)值都加入本說(shuō)明書(shū)，就像其在本文中被逐一列舉一樣。 除非另行指明，否則本文提供的所有精確數(shù)值是相應(yīng)近似值的代表(例如，關(guān)于特定因素 或測(cè)量值提供的所有精確示例性數(shù)值可以被視為也提供在適當(dāng)時(shí)用“大約”修飾的相應(yīng)近 似測(cè)量值)。除非本文中另行指明或明顯與本文相抵觸，否則本文所述的所有方法可以以任何 合適的次序進(jìn)行。除非另行指明，否則本文提供的任何和所有實(shí)例或示例性用語(yǔ)(例如“如”)的使 用僅用于更好地闡述本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的范圍施加限制。除非明確指明，否則本說(shuō)明書(shū) 中的用語(yǔ)都不應(yīng)被視為表明任何要素對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐是必要的。本文中專利文獻(xiàn)的引用和結(jié)合僅為方便起見(jiàn)，并且不反映對(duì)這些專利文獻(xiàn)的有效 性、可專利性和/或法律可執(zhí)行性的任何看法。關(guān)于一種或多種要素，本文中使用“包含”、“具有”、“包括”或“含有”之類的術(shù)語(yǔ) 對(duì)本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨傅拿枋鲋荚谔峁?duì)“由該特定要素構(gòu)成”、“基本由該特定 要素構(gòu)成”或“基本包含該特定要素”的本發(fā)明的類似方面或?qū)嵤┓桨傅闹С?，除非本文?另行指明或明顯與本文相抵觸(例如，除非本文中另行指明或明顯與本文相抵觸，否則本 文中被描述為包含特定要素的制劑應(yīng)該被理解為也描述了由該要素構(gòu)成的制劑)。本發(fā)明包括適用法律最大程度允許的本文提供的實(shí)施方案、方面和權(quán)利要求中所 提及的主題的所有修飾和等同物。以下述代表性方法和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但是，所述代表性方法和實(shí)施例 無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在前述和以下實(shí)施例中公開(kāi)的特征可以既獨(dú)立地又以其組合地為以其多種不同 形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
實(shí)施例使用的縮寫r. t 室溫DIPEA 二異丙基乙胺H2O :7jCCH3CN 乙腈DMF NN 二甲基甲酰胺HBTU :2-(1Η-苯并三唑-1-基_) -1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽Fmoc :9H_芴_9_基甲氧基羰基
Boc 叔丁氧羰基OtBu 叔丁酯tBu 叔丁基Trt:三苯甲基 Pmc :2，2，5，7，8-五甲基-色烷-6-磺?；鵇de (4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)亞己基)乙基ivDde 1_(4，4_ 二甲基 _2，6_ 二氧環(huán)亞己基)_3_ 甲基丁基Mtt 4-甲基三苯甲基Mmt 4-甲氧基三苯甲基DCM: 二氯甲烷TIS 三異丙基硅烷TFA:三氟乙酸Et2O:乙醚NMP 1-甲基-吡咯烷-2-酮DIPEA 二異丙基乙胺 HOAt 1-羥基-7-氮雜苯并三唑HOBt 1-羥基苯并三唑DIC: 二異丙基碳二亞胺MW:分子量A 結(jié)合樹(shù)脂的肽的合成SPPS 方法 A使用制造商提供的FastMoc UV方法，在Applied Biosystems 433肽合成儀上根 據(jù)Fmoc策略合成0. 25mmol或1. Ommol量級(jí)的經(jīng)保護(hù)的肽基樹(shù)脂，所述FastMoc UV方法采 用在NMP (N-甲基吡咯烷酮)中冊(cè)1^(2-(1!1-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鐺六氟 磷酸鹽)或HATU(0-(7_氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽)介導(dǎo) 的偶聯(lián)，并且UV監(jiān)測(cè)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)。用于合成肽酰胺的初始樹(shù)脂是Rink-Amide 樹(shù)脂，并將Wang或氯三苯甲基樹(shù)脂用于具有羧基C-末端的肽。除了非天然的氨基酸 如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基異丁酸)以外，所用的經(jīng)保護(hù)的氨基酸衍生物是在適合用于 ABI433A合成儀的預(yù)稱量筒中提供的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem 提供)。N末端氨基酸在α氨基處Boc保護(hù)(例如將Boc-His (Boc) OH用于N末端具有His 的肽)。26位的賴氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保護(hù)，這取決于連接白蛋 白結(jié)合部分和間隔基的路線。肽的合成在某些情況下可以利用在二肽酰胺鍵上用酸性條件 下能夠被切割的基團(tuán)保護(hù)的二肽來(lái)改善，所述基團(tuán)例如是但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧 基芐基或2，4，6-三甲氧基芐基。在肽中存在絲氨酸或蘇氨酸的情況中，可以使用假脯氨酸 二肽(參見(jiàn)例如 Novobiochem 2002/2003 或更新版的目錄，或 W. R. Sampson (1999)，J. Pep. Sci. 5，403)。SPPS 方法 B:一種替代的肽合成方法(方法B)是在基于微波的Liberty肽合成儀(CEM Corp.， North Carolina)上進(jìn)行Fmoc化學(xué)。樹(shù)脂為載量為0. 24mmol/g的Tentagel S RAM。偶聯(lián)化學(xué)為DIC/HOAt的NMP溶液，使用在NMP中的0. 3M氨基酸溶液，摩爾過(guò)量8_10倍。偶聯(lián) 條件為最高70°C、5分鐘。去保護(hù)采用最高70°C、5%哌啶的NMP溶液。當(dāng)需要化學(xué)修飾賴 氨酸側(cè)鏈時(shí)，賴氨酸作為L(zhǎng)ys(Mtt)摻入。如下除去Mtt基團(tuán)將樹(shù)脂在純六氟異丙醇中懸 浮20分鐘，之后用DCM和NMP洗滌。通過(guò)人工合成或在Liberty上的一個(gè)或多個(gè)自動(dòng)化步 驟，之后人工偶聯(lián)，進(jìn)行賴氨酸的化學(xué)修飾。另一個(gè)肽合成方法是在ABI 433上采用HBTU 偶聯(lián)的Fmoc化學(xué)。在合成后，用DCM洗滌樹(shù)脂，并干燥，用TFA/TIS/水(92. 5/5/2. 5)處理 2小時(shí)，之后用二乙醚沉淀，由樹(shù)脂裂解肽。將所述肽溶解在30%乙酸或相似的溶劑中，并 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)RP-HPLC在C18柱上使用乙腈/TFA純化。肽的身份通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。SPPS 方法 C使用制造商提供的方法，在Advanced ChemTech Synthesiser (APEX 348)上根據(jù) Fmoc策略合成0. 25mmol量級(jí)的經(jīng)保護(hù)的肽基樹(shù)脂，所述方法采用在NMP (N-甲基吡咯烷 酮)中DIC(二環(huán)己基碳二亞胺)和HOBtd-羥基苯并三唑)介導(dǎo)的偶聯(lián)。用于合成肽酰 胺的初始樹(shù)脂是Rink-Amide樹(shù)脂，并將Wang或氯三苯甲基樹(shù)脂用于具有羧基C-末端的 肽。所用的經(jīng)保護(hù)的氨基酸衍生物是標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem 提供)。N末端氨基酸在α氨基處Boc保護(hù)(例如將Boc-His (Boc) OH用于N末端具有His 的肽)。26位的賴氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保護(hù)，這取決于連接白蛋 白結(jié)合部分和間隔基的路線。肽的合成在某些情況下可以利用二肽來(lái)改善，所述二肽例如 得自 Novabiochem 的假脯氨酸、Fmoc-Ser (tbu) - Ψ Ser (Me，Me)_0H，參見(jiàn)例如 Novobiochem 2002/2003 或更新版的目錄，或 W. R. Sampson (1999)，J. Pep. Sci. 5，403。除去ivDde或Dde-保護(hù)的方法 將樹(shù)脂(0.25mmol)置于一個(gè)手動(dòng)振蕩器/過(guò)濾裝置中，并用在N-甲基吡咯烷 酮中的2%胼(20ml，2xl2分鐘)處理，以除去Dde或ivDde基團(tuán)，并用N-甲基吡咯烷酮 (4x20ml)洗滌。除去Mtt或Mmt-保護(hù)的方法將樹(shù)脂(0.25mmol)置于手動(dòng)振蕩器/過(guò)濾裝置中，并用在DCM中的2 % TFA和 2-3 % TIS處理(20ml，5-10分鐘，重復(fù)6-12次)，以除去Mtt或Mmt基團(tuán)，并用DCM (2x20ml)、 10% MeOH和5% DIPEA的DCM(2x20ml)溶液和N-甲基吡咯烷酮(4x20ml)洗滌。除去Mtt-保護(hù)的替代方法將樹(shù)脂置于注射器中，并用六氟異丙醇處理2X10分鐘，以除去Mtt基團(tuán)。然后如 上所述用DCM和NMP洗滌樹(shù)脂。將側(cè)鏈連接至賴氨酸殘基的方法白蛋白結(jié)合殘基(式I的B-U-側(cè)鏈)可以使用標(biāo)準(zhǔn)?；噭?例如但不限于DIC、 H0Bt/DIC、H0At/DIC或HBTU)?；两Y(jié)合樹(shù)脂的肽上或在溶液中?；廖词鼙Ｗo(hù)的肽上而 連接至所述肽。連接至結(jié)合樹(shù)脂的肽路徑I將活化的(活化酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合殘基(式I的A-B)-側(cè)鏈)例如十八 烷二酸單_(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等人，EP511600，相對(duì)于結(jié)合樹(shù)脂的 肽4摩爾當(dāng)量)溶解于NMP(25mL)中，在室溫下加入至樹(shù)脂并搖動(dòng)過(guò)夜。過(guò)濾反應(yīng)混合物，并用NMP、二氯甲烷、2-丙醇、甲醇和二乙醚仔細(xì)洗滌樹(shù)脂。路徑II將白蛋白結(jié)合殘基(式I的A-(B)-側(cè)鏈)溶解于N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷 (1 1,10ml)中。加入活化試劑例如羥基苯并三唑(HOBt)(相對(duì)于樹(shù)脂4摩爾當(dāng)量)和二 異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹(shù)脂4摩爾當(dāng)量)，并攪拌溶液15分鐘。將該溶液加入至樹(shù)脂中， 并加入二異丙基乙胺(相對(duì)于樹(shù)脂4摩爾當(dāng)量)。將樹(shù)脂在室溫下?lián)u動(dòng)2-24小時(shí)。用N-甲 基吡咯烷酮(2x20ml)、N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷(1 1) (2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml) 洗滌樹(shù)脂。路徑III將活化的(活化酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合殘基(式I的A-B-側(cè)鏈)例如十八 烷二酸單_(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等人，EP511600，相對(duì)于結(jié)合樹(shù)脂的 肽1-1. 5摩爾當(dāng)量)溶解于有機(jī)溶劑(例如乙腈、THF、DMF、DMS0)或水/有機(jī)溶劑混合物 (l-2ml)中，并連同10摩爾當(dāng)量DIPEA—起加入所述肽的水溶液(10-20ml)。就白蛋白結(jié) 合殘基上的保護(hù)基團(tuán)例如叔丁基的情況而言，凍干反應(yīng)混合物過(guò)夜(0/N)，并將分離的粗肽 產(chǎn)物去保護(hù)，隨后就叔丁基的情況而言，將所述肽溶解于三氟乙酸、水和三異丙基硅烷的混 合物(90 5 5)中。在30分鐘后，真空蒸發(fā)混合物，并通過(guò)制備級(jí)HPLC純化最終的肽。除去Fmoc-保護(hù)的方法將樹(shù)脂(0. 25mmol)置于手動(dòng)振蕩器裝置的濾瓶中，并用N-甲基吡咯烷酮/ 二氯 甲烷(1 1) (2x20ml)和N-甲基吡咯烷酮(1x20ml)、20 %哌啶的N-甲基吡咯烷酮溶液 (3x20ml，每次10分鐘)處理。用N-甲基吡咯烷酮(2x20ml)、N_甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷 (1 1) (2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml)洗滌樹(shù)脂。用于將肽從樹(shù)脂裂解開(kāi)的方法用三氟乙酸、水和三異丙基硅烷的混合物(95 2.5 2. 5至92 4 4)在室 溫下攪拌180分鐘將肽從樹(shù)脂裂解。過(guò)濾裂解混合物，并將濾過(guò)液通過(guò)氮?dú)饬鳚饪s為油狀 物。用45ml乙醚從該油狀物中沉淀出粗肽，并用45ml乙醚洗滌1至3次。將粗肽在裝填有5 μ或7 μ C_18 二氧化硅的20mmX250mm柱上通過(guò)半制備 HPLC純化。根據(jù)所述肽使用一個(gè)或兩個(gè)純化系統(tǒng)。TFA:干燥后，將所述粗肽溶解于5ml 50%乙酸H2O中，用H2O稀釋至20ml，并將其 注射至柱上，隨后將該柱在40°C下于50分鐘內(nèi)用40-60% CH3CN的0. TFA梯度以IOml/ 分鐘洗脫。收集含有所述肽的級(jí)分。用水稀釋洗脫物后凍干純化的肽。硫酸銨該柱用經(jīng)濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 2. 5的40 % CH3CN的0. 05M (NH4) 2S04溶液平 衡。干燥后，將粗肽溶解于5ml 50%乙酸H2O中，用H2O稀釋至20ml，并注射至柱上，隨后在 40°C下于50分鐘內(nèi)用40-60% CH3CN的0. 05M(NH4)2SO4梯度，pH 2. 5以IOml/分鐘洗脫。收
集含有所述肽的級(jí)分，并用3倍體積的H2O稀釋，使其通過(guò)已用ο. ι% TFA平衡的Sep-Pak
C18柱(Waters件號(hào)51910)。隨后用含有0. 1% TFA的70% CH3CN將其洗脫，并在用水稀 釋洗脫物后通過(guò)冷凍干燥來(lái)分離純化的肽。獲得的終產(chǎn)物通過(guò)分析型RP-HPLC(保留時(shí)間)和LCMS鑒定。RP-HPLC分析可以用 214nm下的 UV檢測(cè)和例如 Vydac218TP544. 6mmx250mm5 μ C-18 二氧化硅柱(The Separations Group,Hesperia,USA)進(jìn)行，并在 42°C下以例如 lml/分鐘洗脫。最經(jīng)常使用以下的具體條件之一方法03_A1_1HPLC (方法03_A1_1)使用配有Waters 996 二極管陣列檢測(cè)器的Waters 2690系 統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。在 218TP544. 6mmx250mm5 μ C-18 二氧化硅柱(The S印erations Group, Hesperia)上于214、254、276和301nm收集UV檢測(cè)，所述柱于42°C以Iml/分鐘洗脫。所 述柱用以4M硫酸調(diào)節(jié)至pH 2. 5的10% 0. 5M硫酸銨平衡。在注射后，以0% -60%乙腈在 相同水性緩沖液中的梯度在50分鐘內(nèi)洗脫樣品。方法03_B1_2HPLC (方法03_B1_2)使用配有Waters 996 二極管陣列檢測(cè)器的Waters 2690系統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。在 Zorbax 300SB C-18 (4，5x150mm，5 μ )上于 214、254、276 和 301nm 收 集UV檢測(cè)，所述ZorbaX300SBC-18柱于42 V以0. 5ml/分鐘洗脫。所述柱用TFA的水溶液 (0. 1% )平衡。在注射后，以0% -60%乙腈(+0. 1% TFA)在TFA水溶液(0. 1 % )中的梯 度在50分鐘內(nèi)洗脫樣品。方法02_B1_1HPLC(方法 02_B1_1)使用配有 Waters 2487 雙頻帶檢測(cè)器的 Alliance Waters 2695 系統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。使用 Vydac 218TP53, C18,300A, 5um, 3. 2mmx250mm 柱于 42°C于 214nm和254nm收集UV檢測(cè)。以0-60%乙腈、95-35%水和5%三氟乙酸(1. 0% )的水溶 液的線性梯度在50分鐘內(nèi)以0. 50ml/分鐘的流速洗脫。方法01_B4_2HPLC (方法01_B4_2)使用配有Waters 996 二極管陣列檢測(cè)器的Waters 600S系 統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。使用 Symmetry300C18，5um, 3. 9mmx 150mm 柱于 42°C于 214nm 和 254nm 收 集UV檢測(cè)。以5-95%乙腈、90-0%水和5%三氟乙酸(1.0% )的水溶液的線性梯度在15 分鐘內(nèi)以1. Oml/分鐘的流速洗脫。方法02_B4_4HPLC(方法 02_B4_4)使用配有 Waters 2487 雙頻帶檢測(cè)器的 Alliance Waters 2695 系統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。使用 Symmetry300C18，5um，3. 9mmxl50mm 柱于 42°C 于 214nm 和 254nm收集UV檢測(cè)。以5-95%乙腈、90-0%水和5%三氟乙酸(1. 0% )的水溶液的線性梯 度在15分鐘內(nèi)以1. Oml/分鐘的流速洗脫。方法02_B6_1HPLC(方法 02_B6_1)使用配有 Waters 2487 雙頻帶檢測(cè)器的 Alliance Waters 2695 系統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。使用 Vydac 218TP53, C18,300A, 5um, 3. 2mmx250mm 柱于 42°C于 214nm和254nm收集UV檢測(cè)。以0-90%乙腈、95-5%水和5%三氟乙酸(1.0%)的水溶液 的線性梯度在50分鐘內(nèi)以0. 50ml/分鐘的流速洗脫。方法03_B6_1HPLC (方法03_B1_1)使用配有Waters 996 二極管陣列檢測(cè)器的Waters 2690系 統(tǒng)進(jìn)行 RP-分析。在 218TP544. 6mmx250mm 5 μ C-18 二氧化硅柱(The S印erations Group, Hesperia)上于214、254、276和301nm收集UV檢測(cè)，所述柱于42°C以Iml/分鐘洗脫。所 述柱用5%乙腈(+0. 1% TFA)的TFA水溶液(0. 1 % )平衡。在注射后，以0% -90%乙腈 (+0. 1% TFA)的TFA水溶液(0. )梯度在50分鐘內(nèi)洗脫樣品。
或者，可以如上所示進(jìn)行制備型梯度洗脫，并指示其中洗脫化合物的乙腈百分率。 身份通過(guò)MALDI證實(shí)。使用下列儀器LCMS 在由 Sciex API IOOSingle quadropole Mif Perkin Elmer200 % ^lJ Quard 泵、Perkin Elmer 200 系列自動(dòng)采樣器、AppliedBiosystems 785A UV 檢測(cè)器、Sedex 75蒸發(fā)光散射檢測(cè)器組成的裝置上進(jìn)行。儀器控制和數(shù)據(jù)采集由在Windows 2000計(jì)算機(jī)上運(yùn)行的SciexSample控制軟件 完成。HPLC泵連接至兩個(gè)洗脫液貯液器，貯液器含有A :0. 05%三氟乙酸的水溶液B 0. 05%三氟乙酸的乙腈溶液 在室溫下，通過(guò)注射適宜量樣品(優(yōu)選20 μ 1)至經(jīng)乙腈梯度洗脫的柱上進(jìn)行分 析。使用的HPLC條件、檢測(cè)器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置在下表中給出。柱=Waters Xterra MS C-18X 3mm，直徑 5μπι梯度 在7. 5分鐘內(nèi)以1. 5ml/分鐘進(jìn)行的5% -90%乙腈線性梯度檢測(cè) 210nm(從DAD模擬輸出)ELS (從 ELS 模擬輸出)，40°CMS離子化模式API-ES備選地，LCMS在由HewlettPackard 1100系列G1312A BinPump,Hewlett Packard 1100 系列柱室、Hewlett Packard 1100 系列 G1315A DAD 二極管陣列檢測(cè)器、Hewlett Packard 1100系列MSD和經(jīng)HP Chemstation軟件控制的Sedere 75蒸發(fā)光散射檢測(cè)器組 成的裝置中實(shí)施。HPLC泵連接至兩個(gè)洗脫液貯液器，該貯液器含有A IOmMNH4OH 的水溶液B =IOmM NH4OH 的 90 % 乙腈溶液該分析在23°C下通過(guò)將適當(dāng)體積的樣品(優(yōu)選20 μ 1)注射至以A和B梯度洗脫 的柱上進(jìn)行。使用的HPLC條件、檢測(cè)器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置在下表中給出。柱 Waters Xterra MS C-18X 3mm，直徑 5μπι梯度 在6. 5分鐘內(nèi)以1. 5ml/分鐘進(jìn)行的5% -100%乙腈線性梯度
檢測(cè) 210nm(從DAD模擬輸出)ELS (從ELS模擬輸出)MS 離子化模式 API-ES。掃描 lOO-lOOOamu，步長(zhǎng)為 0. IamuMALDI-MS 所述肽的分子量使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-MS)測(cè)定，并 記錄在Microflex (Bruker)上。使用基質(zhì)α -氰基-4-羥基肉桂酸。分析型HPLC條件(方法I)用0. 1 % TFA/H20 平衡柱子(Xterra TM MS C18，5 μ m，4，6x150mm 柱，P7N 1860 00490)，并在 25 分鐘內(nèi)以 0% CH3CN/0. 1 % TFA/H20-60% CH3CN/0. 1 % TFA/H20 的梯度洗脫，之后在5分鐘內(nèi)以60% -100%的梯度洗脫。在本發(fā)明的實(shí)施例中，命名和結(jié)構(gòu)圖解釋如下對(duì)天然氨基酸使用單字母符號(hào)，例如H為L(zhǎng)-組氨酸，A為L(zhǎng)-丙氨酸等。還可以對(duì) 氨基酸使用三字母縮寫，例如His為L(zhǎng)-組氨酸，Ala為L(zhǎng)-丙氨酸等。對(duì)于非天然氨基酸， 使用三字母縮寫，例如Aib為氨基異丁酸。氨基酸的位置可以氨基酸符號(hào)之后的上標(biāo)數(shù)字 表示，例如Lys37，或者為L(zhǎng)ys37。N-末端氨基可以用符號(hào)NH2或H表示。C-末端羧基可以 用符號(hào)-OH或-COOH表示。C-末端酰胺基以符號(hào)-NH2表示。亞結(jié)構(gòu) 均是指His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe。賴氨酸的ε氨基可以希臘字母“ ε ”或拼寫“印silon”描述。在以下實(shí)施例中的結(jié)構(gòu)在幾種情況下為用于天然氨基酸的單字母符號(hào)和用于氨 基異丁酸的三字母縮寫Aib的組合。在幾種情況下，某些氨基酸以擴(kuò)展的完整結(jié)構(gòu)顯示。因 此，已被衍生化的賴氨酸可以顯示為實(shí)施例1中的擴(kuò)展的完整結(jié)構(gòu)，其中在37位的賴氨酸 是擴(kuò)展的。在36位的精氨酸和37位的擴(kuò)展的賴氨酸之間的氮(帶有指示的H)因此是實(shí) 施例1中連接兩個(gè)氨基酸的肽鍵的氮。按照以上方法，制備以下的衍生物，作為本發(fā)明的非限制性實(shí)施例實(shí)施例1Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I (7-37)酰胺 制備方法AHPLC 方法 B6 RT = 35，49 分鐘LCMS :m/z = 1096，2 (M+3H)3+理論分子量=4380，0實(shí)施例2Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37)酰胺
—Η—Hn^Le gtftsdvssyleeqaaref I AWLVRG R-口 H3C^CH3制備方法Β所述肽以66 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。
理論分子量=4409. 1實(shí)施例3Ν-ε 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-羧基十七酰基)哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-I- (7-37)酰胺 制備方法AHPLC (方法 B)RT =11. 92 分鐘LCMS :m/z = 1474. 8 (M+3H)3+理論分子量=4420. 0實(shí)施例4Ν-ε 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞Aib8，Glu22， Arg26, Lys30] GLP-I-(7-37) 制備方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制備，使用 8-10倍摩爾過(guò)量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基團(tuán)用六氟異丙醇去保護(hù)。終產(chǎn) 物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I RT = 27，6 分鐘MALDI-MS :4367，9實(shí)施例5Ν-ε 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys31] GLP-I-(7-37) 制備方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制備，使用 8-10倍摩爾過(guò)量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基團(tuán)用六氟異丙醇去保護(hù)。終產(chǎn) 物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I RT = 28，4 分鐘MALDI-MS :4252，5實(shí)施例6N-ε 31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九?；?哌 啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；? [Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-I-(7-37) 制備方法B
所述肽以66 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4280. 9 實(shí)施例7 N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以67 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4451. 1實(shí)施例8N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B 所述肽以68 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4422. 1實(shí)施例9N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制備方法B所述肽以69 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4423. 1實(shí)施例10N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制備方法B所述肽以68 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4481. 1實(shí)施例11N-ε 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二?；被鶀 丁?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8, Lys20, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以62 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4638. 3實(shí)施例12N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺?；?丁?；被鵠十二?；被鶀 丁酰基氨基)丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8, Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以69 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4624. 3實(shí)施例13N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六?；被酋；?丁?；被鵠十二酰基氨基} 丁?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基圯87，611122^印26^印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以65 %乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4595. 3實(shí)施例14[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-I-(7-37) Lys [2-(2-{2-[4-羧 基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰基氨磺?；?丁?；被鵠丁?；?氨基}丁?；被?丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠 制備方法所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制備，硫代酰胺接頭的連接 以兩步實(shí)現(xiàn)。首先使用DIC和H0At/H0Bt(l 1)使4-氨磺?；∷崤悸?lián)樹(shù)脂。然后，將 與羰基二咪唑的NMP溶液混合的16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸加入樹(shù)脂，隨后加入DBU。 要不然為實(shí)施例章節(jié)開(kāi)始時(shí)描述的相同方案。理論分子量=4640. 2實(shí)施例15N- ε 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺 制備方法路徑IIIHPLC (方法 Al)RT = 40. 88 分鐘LCMS :m/z =異質(zhì)但對(duì)應(yīng)于起始物質(zhì)+平均2000理論(M+H)+=5519實(shí)施例16N- ε 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙?；?[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺 制備方法路徑IIIHPLC (方法 B6)RT = 42. 3 分鐘LCMS :m/z = 1353. 3 (M+3H)3+理論(M+H)+4055.7實(shí)施例17Ν-ε 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基) 乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-l-(7-37)酰胺 制備方法AHPLC (方法 B6)RT = 36. 1 分鐘LCMS :m/z = 1419. 0 (M+3H)3+理論(M+H)+= 4254. 8實(shí)施例18N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六?；被?_4_羧基丁?；被?乙氧基) 乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基見(jiàn)87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺 制備方法AHPLC (方法 B6)RT = 36. 06 分鐘LCMS :m/z = 1399 (M+3H)3+理論(M+H)+= 4196. 8實(shí)施例19Ν-ε 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I (7-37)酰胺 制備方法AHPLC (方法 B6)RT = 40. 1 分鐘LCMS :m/z = 1414. 6 (M+3H)3+理論(M+H)+= 4240. 9實(shí)施例20N- ε 36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36] GLP-I-(7-37) Glu-酰 胺 制備方法B所述肽以68%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4069. 6[1041]實(shí)施例21N-ε 37-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六?；被酋；?丁酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以64%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=3994. 6實(shí)施例22N- ε 37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九?；被?丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37) 制備方法B所述肽以67%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4283. 9實(shí)施例23N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基 _4-(17_ 羧基-十七?；被?丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-I-(7-37) 制備方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制備，使用 8-10倍摩爾過(guò)量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基團(tuán)用六氟異丙醇去保護(hù)。終產(chǎn)物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I:RT = 27，2 分鐘MALDI-MS 4127, 9實(shí)施例24N- ε 20- (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [2_ ((S) _4_ 羧基 _4_ 十六?；被?丁?；被?乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙?；?[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30， Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺 制備方法B所述肽以66%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4239. 8實(shí)施例25N- ε 37-(2-{2-[2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(19-羧 基_十九酰氨基)丁?；被鵠丁?；被鶀 丁?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?[去 氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) ο 制備方法B所述肽以65%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4397. O實(shí)施例26N-ε 37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-叔 丁 基-2H-四 唑-5-基)-十六酰基氨磺?；鵠丁酰基氨基}十二?；被?-4-羧基丁酰基氨基]-4-羧 基丁?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；鶀[去氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I (7-37) 制備方法B所述肽以74%乙腈洗脫。結(jié)構(gòu)通過(guò)MALDI-MS證實(shí)。理論分子量=4652. 4實(shí)施例27N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙?；鵠[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37). 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 02_Β6_1 RT = 34. 27 分鐘LCMS :m/z = 1072 (M+4H)4+理論分子量=4284. 9實(shí)施例28N- α 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七?；被?-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙?；鵠[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, ε -Lys37]GLP-I-(7-37)肽 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 10. 19 分鐘LCMS :m/z = 1072 (M+4H)4+理論分子量=4284. 9實(shí)施例29N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙?；鵠[去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 9. 96 分鐘LCMS :m/z = 1064 (M+4H)4+理論分子量=4255. 8實(shí)施例30N- ε 36- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (15-羧基-十五?；被?-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys 肽 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 6. 40 分鐘LCMS :m/z = 1111 (M+4H)4+理論分子量=4444. O實(shí)施例31[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34]GLP-I-(7-37)-Glu-Lys (2-(2-{2-[2-(2- {2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁?；被鵠-乙氧基}-乙氧基)-乙 酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙?；?肽 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 6. 52 分鐘LCMS :m/z = 1119 (M+4H)4+理論分子量=4472實(shí)施例32N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基十九?；?基)甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙?；鵠[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制備類似于SPPS方法B。HPLC 方法 02_B6_1 RT = 33. 58 分鐘[1129]LCMS :m/z = 1114 (M+4H)4+理論分子量=4451.1實(shí)施例33N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基-4-(17-羧基-十七?；被?_ 丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基]_[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Aib35, Lys37]GLP-I-(7-37) 制備類似于SPPS方法B。UPLC 方法 04_A3_1 RT = 9.81 分鐘LCMS :m/z = 1079 (M+4H)4+理論分子量=4312. 9實(shí)施例34N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37] GLP-I-(7-37) 制備方法所述肽通過(guò)SPPS方法C制備，終產(chǎn)物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B4-4) :RT = 7，9 分鐘HPLC(中性，16 分鐘內(nèi) 30-60% ) :RT = 5，6 分鐘MALDI-MS 4395理論分子量=4397實(shí)施例35Ν-ε 31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4_ 羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鶀-仏讓8，611122，￥￡1125^印26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37)] GLP-I (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41] 制備方法所述肽通過(guò)SPPS方法C制備，終產(chǎn)物通過(guò)分析型HPLC和LC-MS表征。HPLC (02-B4-4) :RT = 7，36 分鐘HPLC(中性):RT = 17，5 分鐘MALDI-MS 5022理論分子量=5021，8實(shí)施例36N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Lys35, Lys36]GLP-l-(7_36)酰胺 制備方法所述肽通過(guò)SPPS方法C制備，終產(chǎn)物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B4-2) :RT = 8，4 分鐘HPLC (04-A3-1) :RT = 7，8 分鐘MALDI-MS 4141理論分子量=4140，8實(shí)施例37 N-ε 31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七?；被?丁?；?基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鶀_Ν-β34-(2-(雙-羧基甲基 氨基)乙?；?[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-I (7-34)酰胺制備方法所述肽通過(guò)SPPS方法C制備，終產(chǎn)物通過(guò)分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B6-1) :RT = 36，7 分鐘HPLC (A4-A3-1) :RT = 8，9 分鐘[1169]MALDI-MS 4015, 9理論分子量=4015，5實(shí)施例38^￡-37-[(5)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17_羧基十七?；被?乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，34， Lys37]GLP-I(7-37) 制備類似于SPPS方法B。UPLC 方法 04_A3_1 RT=IO. 26 分鐘LCMS :m/z = 1071. 7 (M+4H)4+理論分子量=4284. 9生物學(xué)發(fā)現(xiàn)GLP-I衍生物在靜脈內(nèi)或皮下給藥后的延長(zhǎng)情況使用下文描述的方法，監(jiān)測(cè)本發(fā)明的多種GLP-I衍生物在皮下給予健康豬后在血 漿中的濃度，來(lái)測(cè)定它們的延長(zhǎng)效果。為了比較，還跟蹤GLP-I (7-37)在皮下給予后在血漿 中的濃度?？梢砸韵嗤绞綔y(cè)定本發(fā)明的其它GLP-I衍生物的延長(zhǎng)情況。實(shí)施例39 在小種豬中的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試在小種豬中對(duì)本發(fā)明的多種GLP-I衍生物(實(shí)施例1、4、5、7、8、9、13和22的化合 物)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試。為比較目的將利拉魯肽納入測(cè)試中。還包括第二種比較性化合 物，即具有取代(22E+26R)的GLP-I衍生物，其描述于WO 2005/027978的實(shí)施例63。一般來(lái)說(shuō)，將測(cè)試物質(zhì)溶解在適于皮下或靜脈內(nèi)給藥的溶媒中。調(diào)節(jié)濃度，使得給 藥體積為約lml。在本研究中，皮下給予測(cè)試物質(zhì)。研究在12 只雄性Gdttingen小種豬(EllegaardGSttingenMinipigsApS)中進(jìn)行。 在動(dòng)物進(jìn)入研究前容許約10天的適應(yīng)期。在適應(yīng)期開(kāi)始時(shí)，小種豬約5月齡，體重8-10kg。研究在合適的動(dòng)物房中進(jìn)行，室溫設(shè)為21_23°C，相對(duì)濕度彡50%。房間照明循環(huán) 為12小時(shí)光照和12小時(shí)黑暗。光照為06:00至18:00。使動(dòng)物生活在以草為墊的圍欄中， 每欄共六只。在研究過(guò)程中，動(dòng)物可以自由獲取家用品質(zhì)的飲用水，但是在給藥前一天約16 時(shí)開(kāi)始禁食，直至給藥后約12小時(shí)。在動(dòng)物到達(dá)時(shí)和給藥日稱重。動(dòng)物接受一次皮下注射。皮下注射在頸右側(cè)進(jìn)行，距離耳朵大約5-7cm，距離頸中部7-9cm。給予注射，在針上帶有檔位，容許插入0. 5cm的針。將每種測(cè)試物注射三只動(dòng)物。 每只動(dòng)物接受2nmol/kg體重的劑量。每周給六只動(dòng)物服藥，而其余六只動(dòng)物休息。由每只動(dòng)物獲得完整血漿濃度-時(shí)間曲線。依照如下時(shí)間表采集血樣靜脈內(nèi)給藥后(不適用于本研究) 給藥前(0)、注射后0. 17(10 分鐘)、0· 5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 和 120 小時(shí)。皮下給藥后給藥前(0)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120 小時(shí)。每次取樣時(shí)，由每只動(dòng)物采集2ml血液。血樣由頸靜脈采集。將血樣收集到裝有用于穩(wěn)定的緩沖液的試管中，以預(yù)防GLP-I衍生物的酶促降解。立即將血漿轉(zhuǎn)移到Micronic管，每只管裝入約200 μ 1血漿。將血漿保存于_20°C， 直至測(cè)定。使用免疫測(cè)定法測(cè)定血漿樣品的GLP-I衍生物含量。通過(guò)非房室藥代動(dòng)力學(xué)分析來(lái)分析血漿濃度-時(shí)間曲線。對(duì)每種情況計(jì)算下列藥 代動(dòng)力學(xué)參數(shù)=AUC, AUC/ 劑量、AUC% Ertrap、Cmax、tmax、λ z、t1/2、CL、CL/f、Vz、Yjf 和 MRT。所有測(cè)試的本發(fā)明GLP-I衍生物在皮下給予小種豬后具有40-100小時(shí)的半衰期 范圍。比較化合物利拉魯肽和化合物135的半衰期分別為18小時(shí)和28小時(shí)。選定的本發(fā)明衍生物在丹麥蘭德瑞斯(Danish Landrace)豬中測(cè)試。GLP-I衍牛物在豬中的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試豬(50%杜洛克豬、25%約克夏豬、25%丹麥蘭德瑞斯豬、約40kg)自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí) 禁食。對(duì)每頭豬給予在50 μ M等滲液(5mM磷酸鹽，pH7. 4,0.02%Tween -20 (Merck), 45mg/ml甘露醇(無(wú)熱原，NovoNordisk))中的0. 5nmol測(cè)試化合物/kg體重。由頸靜脈中 的導(dǎo)管采集血樣。將5ml血樣倒入含175 μ 1如下溶液的冷玻璃杯中0. 18MEDTA、15000ΚΙΕ/ ml 抑肽酶(Novo Nordisk)和 0. 30mM 纈氨酸-吡咯烷胺(Valine-Pyrrolidide) (Novo Nordisk),pH 7.4。在30分鐘內(nèi)，將樣品以5_6000*g離心10分鐘。將溫度保持于4°C。將 上清液吸取到不同的玻璃杯中，并保存于-20°C，直至使用。以?shī)A心ELISA或通過(guò)RIA使用不同的單克隆抗體或多克隆抗體測(cè)定所述肽的血漿 濃度?？贵w的選擇取決于GLP-I衍生物。根據(jù)選定的具體GLP-I衍生物，達(dá)到血漿峰值濃 度的時(shí)間在寬限內(nèi)變化。在96孔微量滴定板中進(jìn)行夾心ELISA的通用測(cè)定方案包被緩沖液(PBS)磷酸鹽緩沖鹽水pH7. 2清洗緩沖液(PBS-清洗液) 磷酸鹽緩沖鹽水、0.05% (體積/體積) 吐溫 20，pH 7. 2測(cè)定緩沖液(BSA-緩沖液) 磷酸鹽緩沖鹽水、10g/l牛血清白蛋白 (Fluka 05477) ,0. 05% (體積 / 體積)吐溫 20，pH 7. 2鏈霉抗生物素蛋白緩沖液 磷酸鹽緩沖鹽水、0.5M NaCl、0.05% (體 積/體積)吐溫20，pH 7. 2標(biāo)準(zhǔn)品血漿基質(zhì)中的各種衍生物A-TNP:Nonsens 抗體AMDEX鏈霉抗生物素蛋白-辣根-過(guò)氧化物酶(Amersham RPN4401V)TMB-底物3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(< 0.02% )、過(guò)氧 化氫如下進(jìn)行測(cè)定(體積/孔)1.)用100 μ 1溶于PBS-緩沖液的5 μ g/ml捕獲抗體進(jìn)行包被· 4°C溫育過(guò)夜(ο/η).SxPBS-清洗 ·用最后一次清洗液封閉至少30分鐘 然后將板倒空2.) 20 μ 1 樣品 +100 μ 1 生物素化檢測(cè)抗體(1 μ g/ml，在含 10 μ g/mlA-TNP 的 BSA 緩沖液中)·在搖床上于室溫溫育2小時(shí)· 5xPBS-清洗，然后將板倒空3.)在鏈霉抗生物素蛋白-緩沖液中的100 μ 1 AMDEX 1 8000·在搖床上于室溫溫育45-60分鐘· 5xPBS-清洗，然后將板倒空4. ) 100 μ 1 TMB-底物·在搖床上于室溫溫育χ分鐘 用 100 μ 1 4Μ H3PO4 終止反應(yīng)讀取450nm的吸光度，以620nm作為參照。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。RIA的通用測(cè)定方案DB-緩沖液80mM磷酸鹽緩沖液、0. 1 %人血清白蛋白、IOmM EDTA、0. 6mM 硫柳汞，pH 7. 5FAM-緩沖液 40mM磷酸鹽緩沖液、0. 1 %人血清白蛋白、0. 6mM 硫柳汞，PH 7. 5活性炭40mM磷酸鹽緩沖液、0. 6mM硫柳汞、16. 7%牛血 漿、15g/l活性炭，pH 7. 5 (使用前將懸浮液于4°C 混合至少1小時(shí))標(biāo)準(zhǔn)品血漿基質(zhì)中的各種衍生物如下在minisorp管12x75mm中進(jìn)行測(cè)定(體積/管) 混合-于4°C溫育30分鐘-以3000rpm離心30分鐘-將上清液轉(zhuǎn)移到新管中后， 立即用塞子封上，并用Y _計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)1分鐘。由各條標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。GLP-I放射性受體測(cè)定(RRA)該方法是使用LEADseeker成像顆粒的放射性-配體結(jié)合測(cè)定。該測(cè)定由包含 GLP-I受體的膜碎片、未標(biāo)記的GLP-I類似物、用125I標(biāo)記的人GLP-I和用小麥胚芽凝集 素(WGA)包被的PS LEADseeker顆粒組成。冷的125I標(biāo)記GLP-I將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體。在加入 LEADseeker顆粒時(shí)，它們將經(jīng)由WGA-殘基結(jié)合膜碎片上的碳水化合物殘基。125I-分子與 LEADseeker顆粒之間的接近引起顆粒發(fā)光。LEADseeker將發(fā)出的光成像，而且它與樣品中 存在的GLP-I類似物的數(shù)量成反比。試劑和材料動(dòng)物血漿的預(yù)處理將動(dòng)物血漿于56°C熱處理4小時(shí)，并以10. OOOrpm離心10分 鐘。然后，加入 Val-Pyr(IOyM)和抑肽酶(aprotenin) (500KIE/mL)，并保存于<-18°C，直 至使用。GLP-I類似物校準(zhǔn)物將GLP-I類似物摻入經(jīng)過(guò)熱處理的血漿，以產(chǎn)生范圍約1 μ M 至IpM的稀釋系列。GLP-IRRA 測(cè)定緩沖液:25mM Na-HEPES (pH = 7. 5)，2. 5mMCaCl2, ImM MgCl2, 50mM NaCl，0. 卵清蛋白，0. 003%吐溫 20,0. 005%桿菌肽，0. 05% NaN3。GLP-I受體懸浮液由穩(wěn)定表達(dá)人胰腺GLP-I受體的幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞純化 GLP-I受體膜碎片。保存于<-80°C，直至使用。WGA-偶聯(lián)的聚苯乙烯 LEADseeker 成像珠(RPNQ0260, Amersham)將珠用 GLP-IRRA測(cè)定緩沖液重構(gòu)至13. 3mg/mL的濃度。然后加入GLP-I受體膜懸浮液，并低溫 (2-8 0C )溫育至少1小時(shí)備用。Γ-Ι1-GLP-I (7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)保存于< _18°C，直至使用。[1247]99. 9% (體積)乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)保存于< _18°C ,直至使用。Multiscreen Solvinert 0. 45μπι 疏 7k 件 PTFE 板(MSRPN0450, Millipore Corp.)聚丙烯板(目錄號(hào)650201，Greiner Bio-One)白餼聚苯乙烯384孔板(目錄號(hào)781075，Greiner Bio-One)裝置水平板混合儀裝配標(biāo)準(zhǔn)翻斗微量滴定板轉(zhuǎn)子組件的離心機(jī)UltraVap-Drydown 樣品濃縮器(Porvair)LEADseeker 多模態(tài)成像系統(tǒng)(Amersham)測(cè)定程序樣品制備將Multiscreen Solvinert濾板安裝在化學(xué)相容的接收板(即聚丙烯板)上，以收集濾過(guò)液。向Multiscreen Solvinert濾板的空孔中加入150 μ L冰冷的99. 9%乙醇，隨后 加入50 μ L校準(zhǔn)物或血漿樣品。將貯藏蓋蓋到濾板上。在水平板混合儀上于18_22°C溫育15分鐘。將裝配好的濾板和接收板連同蓋子放到標(biāo)準(zhǔn)翻斗微量滴定板轉(zhuǎn)子組件中。然后以 1500rpm離心2分鐘，將濾過(guò)液收集在接收板的空孔中。使用UltraVap用熱(40°C)N2干燥濾過(guò)液15分鐘。向每個(gè)孔中加入IOOyL GLP-IRRA測(cè)定緩沖液，使干物質(zhì)重構(gòu)。在水平混合儀上溫育5分鐘。GLP-I放射性受體測(cè)定使用以下移液流程和白色聚苯乙烯384孔板· 35 μ L GLP-IRRA 測(cè)定緩沖液·5μ 重構(gòu)的濾過(guò)液· 10 μ L[125I]-GLP-I (7-36)酰胺。使用前用GLP-1RRA測(cè)定緩沖液將母液稀釋至 20. OOOcpm/ 孑L ο·預(yù)包被至WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0. 2mg/孔)的15 μ L GLP-I受體 ( 0. 5 μ g/ 孔)將板密封，并于18_22°C溫育過(guò)夜。使用LEADseeker 多模態(tài)成像系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)孔的發(fā)光，持續(xù)10分鐘。實(shí)施例40 在表達(dá)克隆的人GLP-I受體的細(xì)胞系中刺激cAMP形成如下所述測(cè)定本發(fā)明的眾多GLP-I衍生物的效力，即在含人GLP-I受體的培養(yǎng)基 中刺激環(huán)AMP(cAMP)的形成。為了比較，還測(cè)定了兩種已知的GLP-I衍生物的效力，即利拉 魯肽的效力和化合物135的效力，化合物135是一種具有取代(22E+26R)的GLP-I衍生物， 描述于WO 2005/027978的實(shí)施例63。用所述GLP-I衍生物刺激來(lái)自表達(dá)人GLP-I受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 BHK467-12A(tk-tsl3)的純化質(zhì)膜，并使用 Perkin Elmer Life Sciences 的 AScreen cAMP測(cè)定試劑盒檢測(cè)cAMP生產(chǎn)效力。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系已在NN A/S，Denmark制備，并選擇高表達(dá)克隆用于篩選。在DMEM,5% FCSU % Pen/Str印(青霉素/鏈霉素)和0. 5mg/ml選擇標(biāo)記G418中于5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。用PBS(磷酸緩沖鹽水)將約80%匯合的細(xì)胞清洗2次，并用Versene(乙二胺四乙 酸四鈉鹽的水溶液)收獲細(xì)胞，以IOOOrpm離心5分鐘，并除去上清液。其它步驟都在冰上 進(jìn)行。將細(xì)胞沉淀在 IOml 緩沖液 l(20mM Na-HEPES, IOmM EDTA，pH = 7. 4)中用 Ultrathurax 勻漿20-30秒，以20. OOOrpm離心15分鐘，并將沉淀重懸于IOml緩沖液2 (20mM Na-HEPES, 0. ImM EDTA, pH = 7. 4)中。將懸浮液勻漿20-30秒，并以20. OOOrpm離心15分鐘。將懸 浮于緩沖液2、勻漿和離心重復(fù)一次，并將膜重懸浮于緩沖液2中，準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)一步的分析 或保存于_80°C。通過(guò)The AScreen Technology測(cè)量由所述肽誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)量進(jìn)行功能受體測(cè) 定。The AScreen Technology的基本原理是內(nèi)源cAMP與外源加入的生物素-cAMP之間的 競(jìng)爭(zhēng)。使用綴合在受體珠上的特異性抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)CAMP的捕獲。以AFusion微板分析儀對(duì) 形成的cAMP進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。使用Graph-Pad Prisme軟件(第5版)計(jì)算EC5tl值。表1 :GLP_1衍牛物的效力 由表1顯而易見(jiàn)，非常多的GLP-I衍生物比先有技術(shù)的GLP-I衍生物利拉魯肽更 有效(EC5tl值越低越好)。所有的本發(fā)明GLP-I衍生物都遠(yuǎn)比化合物135有效。實(shí)施例41 白蛋白結(jié)合親和力如下所述通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)閃爍鄰近測(cè)定(SPA)檢測(cè)本發(fā)明的眾多GLP-I衍生物對(duì)人血清 白蛋白(HSA)的親和力。將鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠(GE Healthcare RPNQ0009)與生物素化HAS溫育5 小時(shí)。所述珠用緩沖液洗滌，以除去未結(jié)合的HAS。將所述珠與在含IOOmM HepesUOOmM NaClUOmM MgS04、0. 025%吐溫20的緩沖液，pH 7. 4中的125I-標(biāo)記的?；疓LP-1類似物(N -ε 37- [2- (2- [2- ((S) _4_ ((S) -4-(12- [4- (16- (1Η-四唑-5-基)十六酰基氨磺?；?丁酰 基氨基]十二酰基氨基)-4-羧基丁?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基]乙氧基)乙 ?；鵠[Aib8，125I-Tyrl9，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I (7-37)-NH2)混合。將混合物移 取入Perkin Elmer 0ptiplate-966005290的孔中(100 μ 1/孔)，加入在相同緩沖液中的要檢測(cè)的100 u 1連續(xù)稀釋的GLP-1衍生物。于室溫溫和振搖20小時(shí)后，離心所述板，并用 TopCounter計(jì)數(shù)。結(jié)合的cpm作為GLP-1衍生物濃度的函數(shù)作圖，競(jìng)爭(zhēng)曲線的EC5(1值用作 衍生物對(duì)HSA的親和力的量度。本發(fā)明的多種GLP-1衍生物的白蛋白結(jié)合親和力(EC5Q，nM)示于下表2。表2泊舶齢麵力 由表2顯而易見(jiàn)，本發(fā)明的幾種GLP-1衍生物具有對(duì)應(yīng)于2000nM以下的EC5(1的高 白蛋白結(jié)合親和力(EC5Q越低，白蛋白結(jié)合親和力越高)。實(shí)施例42 結(jié)合GLP-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ诒景l(fā)明的眾多GLP-1 衍生物(實(shí)施例 1、3、4、5、6、14、15、16、17、18、19、21、22、 23和24的化合物)，如下所述檢測(cè)結(jié)合孤立的N-末端的GLP-1R受體(nGLP-lR)胞外結(jié)構(gòu) 域的親和力。納入利拉魯肽用于比較。親和力是所述GLP-1衍生物取代1251_毒蜥外泌肽-4 (9-39)結(jié)合nGLP_lR 的能力的量度，以下列測(cè)定檢測(cè)與nGLP-lR的結(jié)合蛋白nGLP-lR如Runge等人 2007 (Biochemistry, 46卷，5830-5840頁(yè))所述制備，生物素化，并固定在包被鏈霉抗生物 素蛋白的SPA珠上。使用75 ii g BNHS (Sigma H1759)將在0. 1M NaHC03中的nGLPIR生物素化 至lmg蛋白。隨后將生物素化的nGLPIR對(duì)PBS透析。所有的試劑和衍生物以含0. 05% (體 積 / 體積)吐溫 20 的 PBS 稀釋。在 96 孔 OptiPlates(PerkinElmer 6005290)中以 200 ii 1 終 體積進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。每個(gè)孔含2mg鏈霉抗生物素蛋白包被的SPA珠(PerkinElmerRPNQ007)、 0. lpmol生物素化的nGLPlR、50pCi 125I-毒蜥外泌肽(9-39)和終濃度在lOOOnM-O. 064nM 范圍內(nèi)的測(cè)試肽。將所述板于搖床上于室溫溫育3小時(shí)。通過(guò)以1500rpm離心10分鐘沉 淀 SPA 顆粒，用 TopCount-NXT(PerkinElmer)計(jì)數(shù)所述板。以取代50%的125I-毒蜥外泌肽-4 (9-39)結(jié)合nGLP-lR的所述GLP-1衍生物的濃 度由相應(yīng)的曲線讀取IC5Q值。利拉魯肽對(duì)nGLP-lR的親和力(IC5Q)經(jīng)測(cè)定為1500nM。測(cè)試的本發(fā)明GLP-1衍 生物具有在2. 0-276 (nM)范圍內(nèi)的親和力，6種化合物在2. 0-10. OnM的范圍內(nèi)。因此，相對(duì) 于利拉魯肽，所有的測(cè)試的本發(fā)明GLP-1衍生物都表現(xiàn)出對(duì)N-末端GLP-1受體的改善的結(jié) 合親和力(IC5Q值越低，結(jié)合越好)。實(shí)施例43 在db/db小鼠中的劑量_反應(yīng)研究[1294]如下所述，以肥胖的糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)在劑量_反應(yīng)研究中測(cè)試眾多 本發(fā)明的GLP-1衍生物(實(shí)施例1、7、8、9、11、12、13、20、22和27的化合物)。按照Novo Nordisk的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物福利法規(guī)圈養(yǎng)50只10_12周齡的db/db小鼠 (Taconic, Denmark)，這些小鼠自由獲取標(biāo)準(zhǔn)詞料(例如 Altromin 1324，Brogaarden, Gentofte, Denmark)和自來(lái)水，并保持于24°C。在適應(yīng)環(huán)境1周后，評(píng)價(jià)基礎(chǔ)血糖2次?；?于平均血糖值，選擇42只小鼠進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，并分配為具有匹配血糖水平的7組(n = 6)。小鼠在3-6天長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)中使用至多4次，此后使它們安樂(lè)死。7組接受如下的治療1:溶媒，皮下給予2 :GLP-1 衍生物，0. 3nmol/kg，皮下給予3 :GLP-1 衍生物，lnmol/kg，皮下給予4 :GLP-1 衍生物，3nmol/kg，皮下給予5 :GLP-1 衍生物，10nmol/kg，皮下給予6 :GLP-1 衍生物，30nmol/kg,皮下給予7 :GLP-1 衍生物，100nmol/kg，皮下給予溶媒50mM磷酸鹽，0. 05%吐溫80，pH 8。將GLP-1衍生物溶解在溶媒中，例如至 0. 05,0. 17、0. 5、1. 7、5和17nmol/ml的濃度，每只稱重50g的小鼠皮下給予300 yl (6ml/ kg)。在給藥當(dāng)天，于約上午9點(diǎn)給藥所述化合物(0小時(shí))。在」/2小時(shí)(上午8:30) 評(píng)價(jià)血糖，之后稱重小鼠。在給藥當(dāng)天評(píng)價(jià)血糖幾次，通常于1、3和6小時(shí)(上午10點(diǎn)、12 點(diǎn)和下午3點(diǎn))。在第二天，在給藥后24、48、72和96小時(shí)(即在第2、3、4、5天的上午9點(diǎn))評(píng)價(jià) 血糖，之后稱重。此外，在某些研究中，在給藥后120小時(shí)(第6天)評(píng)價(jià)血糖和體重。在數(shù)字稱上單獨(dú)地稱重小鼠。由清醒小鼠的尾尖毛細(xì)血管獲得用于檢測(cè)血糖的樣品。將10iU血液收集入肝 素化毛細(xì)管中，并轉(zhuǎn)移至500 ill葡萄糖緩沖液(EBI0緩沖溶液，Eppendorf, Germany)中。 使用葡萄糖氧化酶方法(葡萄糖分析儀Biosen 5040，EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Germany)檢測(cè)葡萄糖濃度。最終分析之前樣品于室溫保持至多1小時(shí)。如果分析不得不延 遲，則樣品于4°C保持最多24小時(shí)。依據(jù)以下的數(shù)學(xué)模型計(jì)算半衰期(T72)假定(1)化合物由血漿中消失為單指數(shù)的；(2)對(duì)血糖的作用(8 BG)可以標(biāo)準(zhǔn)S型劑量-反應(yīng)曲線描述；(3)忽略前6個(gè)小時(shí)的吸收和分布，僅擬合葡萄糖由底部回到基線(最小值至0)；然后可以通過(guò)以下等式描述葡萄糖響應(yīng)(Y)(例如SBG)Y =底部 + (頂部-底部)/ (1+ 劑量 *exp (_ln2*t/T72) /ED50)，其中變量ED50和了72如下定義ED50是產(chǎn)生對(duì)BG的半最大作用的劑量(nmol/kg)172為半衰期(小時(shí))；以下為全局常量[1319]頂部(在回到基線葡萄糖后的反應(yīng))和底部(于最大葡萄糖下降時(shí)的反應(yīng))；以 下為每個(gè)數(shù)據(jù)組的常數(shù)(每個(gè)劑量)劑量(給藥劑量(nmol/kg))。所有的數(shù)據(jù)組都同時(shí)擬合。所有測(cè)試化合物都具有10-30小時(shí)的半衰期(T72)。實(shí)施例44 a -螺旋含量如下所述使用圓二色性(⑶)光譜評(píng)估眾多本發(fā)明的GLP-1衍生物(實(shí)施例3、4、 5、7、8、9、11、12、13、14、21、22和24的化合物)的a -螺旋(a -螺旋)結(jié)構(gòu)的含量。為了 比較目的，在測(cè)試中納入利拉魯肽。用Jasco J-715 分光旋光儀對(duì)在 10mM Tris/C104pH 8. 0 中的 5 y M( y M，u mol)肽 記錄遠(yuǎn)_UV圓二色性光譜。原始數(shù)據(jù)扣除緩沖液背景，并對(duì)基于肽鍵濃度的以M—icnT1為單 位的克分子橢圓率標(biāo)準(zhǔn)化，求出222nm的密度值。222nm的密度用作a _螺旋含量的檢測(cè)，即信號(hào)與a-螺旋含量成比例，使 得-lM—cnT1 的值對(duì)應(yīng)于 10% 的 a -螺旋結(jié)構(gòu)(Venyaminov 和 Yang 1996 ^‘Determination of protein secondary structure",載于 CircularDichroism and conformational analysis of biomolecules (Fasman GD 編輯，Plenum Press NY), 69-108 頁(yè))。由光譜得出克分子橢圓率的值(A e或delta印silon)，并評(píng)價(jià)相應(yīng)的a -螺旋 含量。GLP-1衍生物在200-250nm范圍內(nèi)的總體光譜特征分別由最低在206nm和222nm的 兩條帶描述。這與具有顯著a-螺旋骨架的二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。5 u M濃度的利拉魯肽于222nm的A e值低于-3. 6，對(duì)應(yīng)于利拉魯肽的a -螺旋 含量低于36%。5iiM濃度的實(shí)施例4、5、11和14的化合物于222nm的A e值在-2. 0至_3. 6的 范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)于在20-36%范圍內(nèi)的a-螺旋含量。5iiM濃度的實(shí)施例3、7、8、9、12、13、21、22和24的化合物于222nm的A e值 在-3. 7至-6.0的范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)于在37-60%范圍內(nèi)的a-螺旋含量。
9權(quán)利要求
一種包含修飾的GLP-1(7-37)序列的GLP-1衍生物，所述修飾的GLP-1(7-37)序列具有i)與GLP-1(7-37)(SEQ ID No1)相比總共2-12個(gè)氨基酸修飾，包括a)在等同于GLP-1(7-37)的22位的位置的Glu殘基，和b)在等同于GLP-1(7-37)的26位的位置的Arg殘基；和ii)在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于GLP-1(7-37)的18、20、23、30、31、34、36、37或39位的位置。
2.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物與GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含2-8個(gè)氨基酸取代。
3.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物與GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含1-3個(gè)氨基酸缺失。
4.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物與GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含1-4個(gè)氨基酸添加。
5.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物在等同于GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)的7位或8位的位置包含非天然氨基酸。
6.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有游離的C-末端羧酸基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(I)的序列 Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa233<39 一 Xa3<4o 一 一R式(I) (SEQ ID No 2) 其中，(Xaa7-Xaa8)為(L_組氨酸_Aib)、(去氨基-組氨酸-丙氨酸)或(去氨基-組氨 酸-Aib)；Xaa9為Glu或Glu衍生物；Xaa16 為 Val 或 Leu ；Xaa18 為 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 為 Leu 或 Lys ；Xaa23 為 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 為 Ala 或 Asn ；Xaa25 為 Ala 或 Val ；Xaa27 為 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28為Phe或Phe衍生物；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Trp、Cys 或 Lys ；Xaa33 為 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36為Arg、Lys或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Cys、Lys、e -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39為L(zhǎng)ys、Arg或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在； 并且所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。
8.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(II)的序列 Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe—I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-X式(II) (SEQ ID No 3) 其中，Xaa7為L(zhǎng)-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2_氨基-組氨酸、0 -羥基-組氨酸、 高組氨酸、Na-乙?；?組氨酸、a-氟甲基-組氨酸、a-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨酸、 2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1_ 氨基環(huán)丁基)甲 酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨基環(huán)辛 基)甲酸；Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 為 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 為 Lys 或 Trp ；Xaa33 為 Val 或 Lys ；Xaa34 為 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 為 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36為Arg、Lys或不存在；Xaa37 為 Gly、Aib、Lys、e -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 為 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39為L(zhǎng)ys、Arg或不存在；Xaa40為Arg或不存在；Xaa41為Arg或不存在；禾口R為酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，則其下游的氨基酸殘基也不存在； 并且所述GLP-1衍生物在選自以下的位置被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。
9.權(quán)利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物選自以下物質(zhì)N-￡37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l (7-37)酰胺；N-￡37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- [2_ (2_ [2_ (2- ((R) -3- [ 1- (17-羧基十七?；?哌啶-4-基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-1- (7-37)酰胺；N-￡30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22, Arg26, Lys30]GLP-1-(7-37)；N- e 31 {2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九?；?哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；鵞Aib8，Glu22, Arg26, Lys31]GLP-1-(7-37)；N- e 31-(2- {2- [2- (2_ {2_ [2_ (⑶-3-羧基-3- {[1_ (19-羧基-十九?；?哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?[Aib8， Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙?；鵠[Aib8, Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) -4-羧基-4- ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙?；鵠[去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六酰基氨磺?；?丁酰基氨基]十二?；被鶀丁?；被?丁酰基氨基]乙氧基}乙 氧基)乙?；鵠[Aib8, Lys20, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六?；被酋；?丁?；被鵠十二酰基氨基}丁?；被?丁酰基氨基]乙氧基}乙 氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六?；被酋；?丁?；被鵠十二?；被鶀丁酰基氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙 氧基)乙?；鵠[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺；[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-羧基 ~4~(4-羧 基-4-{4-[4-(16-lH-四唑-5-基-十六酰基氨磺?；?丁?；被鵠丁酰基氨基} 丁酰 基氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰基]；N- e 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺；N-￡ 37 (3-((2-(2-(2-(2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧 基))丙?；?[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)-酰胺；N-￡ 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六?；被?-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙 氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基附87，611122，4印26，611130，4印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺；N-￡ 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六?；被?-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙 氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基見(jiàn)87，611122，4印26，4印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺；N-￡ 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基見(jiàn)87，611122^印26， Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺N-￡ 36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰氨基) 乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Lys36]GLP-l-(7_37)Glu-酰胺； N-e 37-[4-(16-(lH-四唑-5-基)十六酰基氨磺?；?丁酰基][去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~羧基-4- (19-羧基十九?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4_(17_羧基-十七?；被?丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-1-(7-37)；N- e 20- (2- {2- [2_ (2_ {2_ [2- ((S) ~4~羧基-4-十六?；被?丁?；被?乙氧基] 乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙酰基)[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-(2-{2-[2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九 酰氨基)丁?；被鵠丁?；被鶀 丁?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- {2- [2- (2_ {(S) ~4~ [ (S) -4-(12- {4- [16- (2-叔 丁 基-2H-四唑 _5_ 基)-十六 ?；被酋；鵠丁?；被鶀十二?；被?-4-羧基丁?；被鵠-4-羧基丁酰基氨基} 乙氧基)乙氧基]乙?；鶀[去氨基見(jiàn)87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁?；?基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- a 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁酰基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, e-Lys37]GLP-l-(7-37)肽；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁?；?基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基][去氨基His7，Glu22， Arg26，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)；N- e 36- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) -4-羧基-4- (15-羧基-十五?；被?~ 丁酰基氨 基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙?；鵠[去氨基His7，Glu22， Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-1-(7-37) -Glu-Lys 肽；[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34]GLP-1- (7-37) -Glu-Lys (2- (2- {2-[2- (2-{2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁?；被鵠-乙氧基}-乙氧基)-乙酰 氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基)肽；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基十九?；被? 甲基]環(huán)己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙?；鵠[Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七?；被?-丁?；?基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙?；鵠-[Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, Aib35, Lys37]GLP-1-(7-37)；N-e31-[2-(2-{2-[2_(2_{2_[ (S) ~4~羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31， Arg34，Arg35，Arg37] GLP-1-(7-37)；N-￡31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七?；被?丁?；被鵠乙 氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鶀-仏讓8，611122^￡1125^印26，1^831， Arg34, Arg35, Arg37)]GLP-1 (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41]；N-e31-[2-(2-{2-[2_(2_{2_[ (S) ~4~羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁?；被鵠 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31， Lys35, Lys36]GLP-1-(7-36)酰胺；N-￡31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七?；被?丁酰基氨基]乙 氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鶀-N-0 34-(2-(雙-羧基甲基氨基) 乙酰基)[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-1 (7-34)酰胺；和N-e-37-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-羧基十七?；被?乙氧基]乙 氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁?；鵠[Aib8，Glu22，Arg26，34，Lys37] GLP-1 (7-37)。
10.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的衍生物或其藥學(xué) 上可接受的鹽、酰胺、烷基或酯，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的衍生物或權(quán)利要求10的藥物組合物，所述衍生物或藥物 組合物用作藥物。
12.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的衍生物或權(quán)利要求10的藥物組合物，所述衍生物或藥物 組合物用于治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高血壓、 X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
13.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的衍生物或權(quán)利要求10的藥物組合物在制備用于治療或預(yù) 防下列疾病的藥物中的用途高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、肥胖、高 血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、 炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
14.一種通過(guò)給予藥物活性量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的衍生物或權(quán)利要求10的藥物 組合物治療或預(yù)防下列疾病的方法高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受受損、1型糖尿病、 肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾 病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
全文摘要
本發(fā)明涉及延長(zhǎng)的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)衍生物及其治療用途。本發(fā)明的GLP-1衍生物包含修飾的GLP-1(7-37)序列，其具有總共2-12個(gè)氨基酸修飾，包括Glu22和Arg26，在18、20、23、30、31、34、36、37或39位被白蛋白結(jié)合殘基衍生化或PEG化。這些化合物可用于治療或預(yù)防2型糖尿病和相關(guān)疾病。所述化合物是有效的、穩(wěn)定的，具有長(zhǎng)半衰期、結(jié)合白蛋白的高親和力和/或結(jié)合GLP-1受體(GLP-1R)的胞外結(jié)構(gòu)域的高親和力，所有這些都與獲得長(zhǎng)效的、穩(wěn)定的且有活性的并有可能每周給予1次的GLP-1衍生物的總體目標(biāo)潛在相關(guān)。
文檔編號(hào)C07K14/605GK101868476SQ200880106356
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者H·索格森, I·彼得森, J·劉, J·斯佩茨勒, L·沙弗, P·W·加里貝, S·倫奇, T·克魯斯 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司