專利名稱：從粗樣品直接擴(kuò)增核酸的方法
從粗樣品直接擴(kuò)增核酸的方法
領(lǐng)域 本申請(qǐng)一般地涉及從粗樣品直接擴(kuò)增核酸的方法。
介紹 快速而準(zhǔn)確的測(cè)定DNA概況是法醫(yī)學(xué)案件調(diào)查樣品分析的一個(gè)重要方面。如血液 和頰拭子的粗樣品包含了可以抑制用于以PCR為基礎(chǔ)的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分型的聚合 酶的活性的物質(zhì)。歷史上，在進(jìn)行如PCR擴(kuò)增的下游酶處理之前，有必要移除抑制劑和純化 DNA。很多種DNA分離和純化方法及試劑盒已經(jīng)市售。但是它們的使用增加了時(shí)間和金錢。
概要 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，所述方法包括提供含有 脫氧核糖核酸的粗樣品；用直接緩沖液溫育所述粗樣品；從溫育后的直接緩沖液中移去洗 出液，其中洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核酸；并在脫氧核糖核酸上進(jìn)行PCR，其中 所述直接緩沖液包含至少5種PCR引物對(duì)，10-16mM的Tris-HCl， 25_75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM 的MgC12，以及至少20ng/iil的ssb(單鏈結(jié)合蛋白)。 在某些實(shí)施方案中，直接緩沖液包含10mM pH8. 3的Tris-HCl，50mM的KCl，每 dNTP200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA，. 16單位/ ii 1的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 6mM的 MgC12，以及60ng/ii 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。 在某些實(shí)施方案中，ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種確定人的身份的方法，所述方法包括提供
含有來自人的脫氧核糖核酸的粗樣品；用直接緩沖液溫育所述粗樣品，其中直接緩沖液包
含復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中每種引物對(duì)位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；
從溫育后的直接緩沖液中移去洗出液，其中洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核酸；并在
來自粗樣品的脫氧核糖核酸上進(jìn)行PCR從而形成復(fù)數(shù)種PCR擴(kuò)增子，其中每種PCR擴(kuò)增
子都有可確定的尺寸；并通過參考PCR擴(kuò)增子的尺寸鑒定人，其中直接緩沖液進(jìn)一步包含
10-16mM的Tris-HCl， 25_75mM的KC1 ，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA，
2U-8U的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種為下游酶處理制備核酸的方法，所述方法
包括提供含有脫氧核糖核酸的粗樣品；用直接緩沖液溫育所述粗樣品形成洗出液；從溫
育后的直接緩沖液中移去洗出液，其中洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核酸；并在洗出
液上進(jìn)行下游酶處理，其中直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl，25-75mM的KCl，每dNTP
200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM
的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，下游酶處理是PCR。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中每種 引物對(duì)位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；和直接緩沖液，其中所述 直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl， 25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaqGold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少 20ng/u 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種反應(yīng)混合物，包含直接緩沖液和復(fù)數(shù)種引 物對(duì)，其中每種引物對(duì)位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；和其中所 述直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl，25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA，2U-8U的AmpliTaqGold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及20-60ng/ y 1的ssb。示例性實(shí)施方案的描述 在本申請(qǐng)中，除特別說明，使用單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)。在本申請(qǐng)中，除特別說明，詞 語"一 (a) ， (an)"意為"至少一"。在本申請(qǐng)中，除特別說明，使用"或"意為"和/或"。而且，使 用術(shù)語"包括(including)"，以及其它形式，例如"包括(includes)"和"包括(included)" 都不是限制性的。 本文所用的部分標(biāo)題只是出于組織的目的，并不解釋為對(duì)所述主題的限制。本申 請(qǐng)引用的所有文獻(xiàn)、文獻(xiàn)的部分，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、論文、書和專題論文都由此 明確地通過援引全文并入，用于任何目的。如果一篇或更多的并入的文獻(xiàn)定義了和本申請(qǐng) 中術(shù)語定義相矛盾的術(shù)語，由本申請(qǐng)控制。 一些定義 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"粗樣品"是指疑似含有核酸的生物學(xué)來源的樣品，其未經(jīng)實(shí) 質(zhì)的程序?qū)@些核酸進(jìn)行分離。例如，血樣是一種粗樣品。而且，點(diǎn)在紙(例如Whatman銷 售的FTA試紙)上的血樣是粗樣品。頰細(xì)胞的頰拭子是粗樣品的另一個(gè)例子。血、紙上血 和頰拭子都是粗樣品的示例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明將會(huì)促進(jìn)多種其它粗樣品的 分析。 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"直接緩沖溶液"是指可以將粗樣品置于其中的緩沖液。直 接緩沖溶液含有用于進(jìn)行下游酶處理，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物和酶。直接緩 沖溶液允許核酸釋放并可進(jìn)行它們從洗出液的擴(kuò)增反應(yīng)，而不需要任何其它純化。PCR的 示例性的循環(huán)次數(shù)和溫度可在Sambrook等，分子克隆(第三版)(Molecular Cloning, f Edition)中找到。雖然本發(fā)明關(guān)注直接緩沖溶液在PCR中的應(yīng)用，可理解的是本領(lǐng)域技術(shù) 人員能容易的將本發(fā)明的直接緩沖溶液用作其它類型的下游酶處理，例如使用逆轉(zhuǎn)錄酶的 逆轉(zhuǎn)錄，或使用連接酶的寡核苷酸連接測(cè)定，的前端程序。 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"洗出液"是指由溫育直接緩沖溶液與粗樣品產(chǎn)生的含有核酸 的溶液。具體描述 改變所需直接緩沖溶液中每種成分，包括Tris-HCl、 KC1、 dNTPs、 BSA、 AmpliTaq Gold聚合酶、MgC12，以及單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，的各自濃度，進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)。例如，這些實(shí) 驗(yàn)使用腐殖酸模擬通常存在于難分析的生物材料樣品中的抑制劑，并由此作為容易產(chǎn)生的 粗樣品的替代物。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得到如下制劑。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種直接緩沖溶液，其包含10-16mM的 Tris-HCl， 25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的 AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及20ng/ ii 1或更高的ssb。
5
在某些實(shí)施方案中，直接緩沖液包含10mM pH8. 3的Tris-HCl，50mM的KCl，每 dNTP 200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， 16單位/ ii 1的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 6mM 的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，直接緩沖液進(jìn)一步包含疊氮化鈉，例如.2%。
在某些實(shí)施方案中，ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白，可從例如Ambion，目 錄號(hào)#2424購得。通常，ssb的所需濃度為20-60ng/iU。更高的濃度當(dāng)然也可以，但是最 高應(yīng)該是大約60ng/ ii 1 。在某些實(shí)施方案中，ssb是60ng/ y 1 。 直接緩沖溶液中使用的試劑可從銷售商處購得。例如，AmpliTaq Gold可從 A卯lied Biosystems處購得。BSA可通過多種來源購得，例如Roche的目錄號(hào)10711454001。 FTA試紙可從Whatman購得。 在某些實(shí)施方案中，直接緩沖溶液包含復(fù)數(shù)種PCR引物對(duì)。例如，在某些實(shí)施方案 中，直接緩沖溶液包含5種引物對(duì)。在某些實(shí)施方案中，直接緩沖溶液包含IO種引物對(duì)。在 某些實(shí)施方案中，直接緩沖溶液包含多于IO種引物對(duì)。在某些實(shí)施方案中，直接緩沖溶液 不包含PCR引物對(duì)，而是在粗樣品的核酸利用直接緩沖溶液釋放后向洗出液中加入PCR引 物對(duì)。
實(shí)施例 在第一個(gè)實(shí)施例中，將血液施加于FTA試紙(Whatman)并經(jīng)空氣干燥。制作一個(gè)
1. 2mm的FTA試紙的圓形穿孔，將其置于含有來自市售的IdentifilerHuman Identity試劑
盒(A卯lied Biosystems)的PCR引物的直接緩沖溶液中。將圓形穿孔溫育于直接緩沖溶
液中，輕度的間斷渦流攪拌下在室溫溫育10分鐘，將洗出液轉(zhuǎn)移至新試管。(如果必要，可
用PCR master mix對(duì)洗出液進(jìn)行另外的稀釋。)然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。在第二個(gè)實(shí)施例中，用TE緩沖液(10mM的Tris-HCl和.lmM、pH8. 0的EDTA)產(chǎn)生
血液的100倍稀釋，1 y 1稀釋后的血液用于在直接緩沖液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。 在第三個(gè)實(shí)施例中，收集頰拭子樣品并置于500iU TE緩沖液中。將得到的懸濁
液在97t:加熱5分鐘。10 1產(chǎn)生的懸濁液用于在直接緩沖液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。按照本發(fā)
明的一些實(shí)施方案的示例性試劑盒 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供為了為加快進(jìn)行某種方法而設(shè)計(jì)的試劑盒。在 某些實(shí)施方案中，試劑盒通過組合實(shí)施方法中使用的兩種或更多的成分以加快感興趣方法 的進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包含預(yù)先測(cè)量的單位量的成分，以將終端使用者測(cè)量 的需求最小化。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以包括實(shí)施本發(fā)明的一種或更多種方法的用 法說明。在某些特定的實(shí)施方案中，試劑盒成分被優(yōu)化以互相結(jié)合使用。
雖然本發(fā)明描述了示例性實(shí)施方案和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解這些示 例性實(shí)施方案的變化和修飾都是可能的，而不需要過度的實(shí)驗(yàn)。所有這些變化和修飾都落 在本發(fā)明范圍內(nèi)。 因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中 每種引物對(duì)位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；和直接緩沖液，其中所 述直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl，25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaqGold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少20ng/iU的ssb。這種試劑盒可使用如毛細(xì)管電泳，通過對(duì)分析的多態(tài)性微衛(wèi)星的收集來 用于鑒定如人的有機(jī)體。進(jìn)行這種人類鑒定的說明性過程可在如Applied Biosystems銷 售的Identifier HID試劑盒中，以及美國(guó)專利6221598、6479235、5843660和7008771中找 到。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的試劑盒、方法和反應(yīng)混合物都可用于降解樣品的多重 PCR程序，舉例可見Dimsoski和Woo的W005054515。 在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的直接緩沖液包含10mM pH8. 3的Tris-HCl， 50mM的 KCl，每dNTP 200iiM的dNTPs，800iig/ml的BSA，. 16單位/ii 1的AmpliTaq Gold聚合酶， 1. 6mM的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。 在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。
在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
權(quán)利要求
一種進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，所述方法包括；提供含有脫氧核糖核酸的粗樣品；用直接緩沖液溫育所述粗樣品；從溫育后的直接緩沖液中移去洗出液，其中所述洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核酸；并且在該脫氧核糖核酸上進(jìn)行PCR，其中所述直接緩沖液包含至少5種PCR引物對(duì)，10-16mM的Tris-HCl，25-75mM的KCl，每dNTP 200-400μM的dNTPs，160-960μg/ml的BSA，2U-8U的AmpliTaq Gold聚合酶，1.25-2.2mM的MgCl2，以及至少20ng/μl的ssb。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述直接緩沖液包含lOmM pH8.3的Tris-HCl， 50mM的KC1，每dNTP 200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， 16單位/ ii 1的AmpliTaq Gold 聚合酶，1. 6mM的MgC12，以及60ng/ii 1的ssb。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
5. —種確定人的身份的方法，所述方法包括 提供含有來自人的脫氧核糖核酸的粗樣品；用直接緩沖液溫育所述粗樣品，其中直接緩沖液包含復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中每種引物對(duì) 位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；從溫育后的直接緩沖液中移去洗出液，其中所述洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核酸；在來自粗樣品的脫氧核糖核酸上進(jìn)行PCR從而形成復(fù)數(shù)種PCR擴(kuò)增子，其中每種PCR 擴(kuò)增子都有可確定的尺寸；并且通過參考PCR擴(kuò)增子的尺寸鑒定人，其中直接緩沖液進(jìn)一步包含10-16mM的Tris-HCl ， 25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述直接緩沖液包含10mM pH8. 3的Tris-HCl， 50mM的KC1，每dNTP 200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， 16單位/ ii 1的AmpliTaq Gold 聚合酶，1. 6mM的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
9. 一種為下游酶處理制備核酸的方法，所述方法包括 提供含有脫氧核糖核酸的粗樣品； 用直接緩沖液溫育所述粗樣品形成洗出液；從溫育后的直接緩沖液中移去洗出液，其中所述洗出液含有來自粗樣品的脫氧核糖核 酸；并且在洗出液上進(jìn)行下游酶處理，其中所述直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl，25-75mM 的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的AmpliTaq Gold聚合 酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述下游酶處理是PCR。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述直接緩沖液包含10mM pH8. 3的Tris-HCl，50mM的KC1，每dNTP 200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， 16單位/ ii 1的AmpliTaq Gold 聚合酶，1. 6mM的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
14. 一種試劑盒，包括復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中每種引物對(duì)位于包含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè) 翼；和直接緩沖液，其中所述直接緩沖液包含10-16mM的Tris-HCl，25-75mM的KCl，每dNTP 200-400 iiM的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA，2U_8U的AmpliTaqGold聚合酶，1. 25-2. 2mM 的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述直接緩沖液包含10mM pH8.3的 Tris-HCl，50mM的KC1，每dNTP 200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， . 16單位/ ii 1的 AmpliTaq Gold聚合酶，1. 6mM的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含.2 %的疊氮化鈉。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
18. —種反應(yīng)混合物，其包含直接緩沖液和復(fù)數(shù)種引物對(duì)，其中每種引物對(duì)位于包 含短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的基因組座位的側(cè)翼；和其中所述直接緩沖液包含10-16mM的 Tris-HCl， 25-75mM的KC1，每dNTP 200-400 ii M的dNTPs， 160-960 ii g/ml的BSA， 2U-8U的 AmpliTaq Gold聚合酶，1. 25-2. 2mM的MgC12，以及至少20ng/ ii 1的ssb。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的反應(yīng)混合物，其中所述直接緩沖液包含10mMpH8.3的 Tris-HCl，50mM的KC1，每dNTP200 ii M的dNTPs， 800 ii g/ml的BSA， . 16單位/ ii 1的 AmpliTaq Gold聚合酶，1. 6mM的MgC12，以及60ng/ ii 1的ssb。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的反應(yīng)，其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含.2%的疊氮化鈉。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述ssb是來自噬菌體T4的T4基因32蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及擴(kuò)增核酸的改進(jìn)方法、試劑盒和反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，提供了一種新穎的直接緩沖液制劑，其允許使用最少的樣品純化在粗樣品中進(jìn)行核酸的直接擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101796061SQ200880016371
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者C·-W·張, D·Y·王, L·K·亨尼西 申請(qǐng)人:應(yīng)用生物系統(tǒng)有限責(zé)任公司