多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的制作方法
【專利摘要】實(shí)施方式的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具具備支持體和多個(gè)種類的引物組。支持體以支持液相的反應(yīng)場(chǎng)的方式構(gòu)成。多個(gè)種類的引物組，按每個(gè)種類能夠游離地固定于在由所述液相形成所述反應(yīng)場(chǎng)時(shí)與所述反應(yīng)場(chǎng)相接的所述支持體的至少1個(gè)面的彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域。多個(gè)種類的引物組以擴(kuò)增與其分別對(duì)應(yīng)的目標(biāo)序列的方式構(gòu)成。
【專利說明】多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在，隨著基因檢查技術(shù)的進(jìn)展，在臨床現(xiàn)場(chǎng)、犯罪搜查等各種場(chǎng)面實(shí)施基因檢查。在這些基因檢查中，大多要通過檢出多個(gè)對(duì)象基因、將它們的結(jié)果綜合才能有用。例如，在臨床現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行病原菌特定等。這時(shí)，判定基于患者的癥狀而懷疑感染的多個(gè)種類的微生物、或各微生物的類型。由此進(jìn)行診斷。在犯罪搜查現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行例如個(gè)人特定等。這時(shí)，對(duì)于所有人在其基因組上具有的多個(gè)基因座中的重復(fù)序列，特定重復(fù)的次數(shù)。由特定的多個(gè)基因座中的重復(fù)數(shù)綜合地特定個(gè)人。由此可以以高準(zhǔn)確率特定個(gè)人。這樣，檢出多個(gè)對(duì)象基因的技術(shù)變得非常重要。
[0003]到目前為止，在檢出多個(gè)對(duì)象基因時(shí)，首先在特定的反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行樣品核酸的擴(kuò)增。然后，進(jìn)一步在檢出用的反應(yīng)裝置內(nèi)對(duì)于所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢出。
[0004]擴(kuò)增主要在接下來的多個(gè)或I個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行。在多個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，分別準(zhǔn)備用于擴(kuò)增各個(gè)對(duì)象基因的反應(yīng)容器。在I個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，用于檢出全部對(duì)象基因的試劑被收納于I個(gè)反應(yīng)容器中而進(jìn)行多核酸擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)被檢出的核酸的檢出一般通過將擴(kuò)增產(chǎn)物供于DNA芯片、電泳等來進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明要解決的課題`
[0006]本發(fā)明要解決的課題是提供能夠彼此獨(dú)立地同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)序列的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具。
[0007]用于解決課題的方法
[0008]實(shí)施方式的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具具備支持體和多個(gè)種類的引物組。支持體以支持液相的反應(yīng)場(chǎng)的方式構(gòu)成。多個(gè)種類的引物組，按每個(gè)種類能夠游離地固定于在由所述液相形成所述反應(yīng)場(chǎng)時(shí)與所述反應(yīng)場(chǎng)相接的所述支持體的至少I個(gè)面的彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域。多個(gè)種類的引物組以擴(kuò)增與其分別對(duì)應(yīng)的目標(biāo)序列的方式構(gòu)成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。
[0010]圖2是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。
[0011]圖3是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。
[0012]圖4是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。
[0013]圖5是顯示使用實(shí)施方式的檢出方法的圖解。
[0014]圖6是模擬地顯示檢出由實(shí)施方式所得的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)得到的結(jié)果的圖。
[0015]圖7是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。[0016]圖8是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的圖。
[0017]圖9是顯示多核酸擴(kuò)增檢出反應(yīng)用具的I例的圖。
[0018]圖10是顯示多核酸擴(kuò)增檢出反應(yīng)用具的I例的圖。
[0019]圖11是顯示芯片原料的I例的圖。
[0020]圖12是顯示多核酸擴(kuò)增檢出反應(yīng)用具的I例的圖。 [0021]圖13是顯示多核酸擴(kuò)增檢出反應(yīng)用具的I例的圖。
[0022]圖14是顯示多核酸擴(kuò)增檢出反應(yīng)用具的I例的圖。
[0023]圖15是顯示多核酸反應(yīng)用具的I例的圖。
[0024]圖16是顯示由多核酸反應(yīng)用具所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0025]圖17是核酸檢出用器件的概略圖。
[0026]圖18是核酸檢出用器件的概略圖。
[0027]圖19是核酸檢出用器件的概略圖。
[0028]圖20是核酸檢出用器件的概略圖。
[0029]圖21是支持體的概略圖。
[0030]圖22是核酸檢出用器件的概略圖。
[0031]圖23是核酸檢出用器件的概略圖。
[0032]圖24是顯示核酸擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果的圖。
[0033]圖25是核酸檢出用器件的概略圖。
[0034]圖26是核酸檢出用器件的概略圖。
[0035]圖27是核酸檢出用器件的概略圖。
[0036]圖28是核酸檢出用器件的概略圖。
[0037]圖29是核酸檢出用器件的概略圖。
[0038]圖30是核酸檢出用器件的概略圖和顯示核酸擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果的圖。
[0039]圖31是顯示核酸檢出用器件的制成步驟的圖。
[0040]圖32是顯示核酸檢出用器件的概略構(gòu)成的剖面圖。
[0041]圖33是顯示核酸檢出用器件的概略構(gòu)成的圖。
[0042]圖34是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0043]圖35是顯示核酸檢出用器件內(nèi)藏盒的概略構(gòu)成的圖。
[0044]圖36是顯示核酸檢出用器件與反應(yīng)部規(guī)定用部件的對(duì)向配置的圖。
[0045]圖37是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0046]圖38是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0047]圖39是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0048]圖40是顯示核酸擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果的圖。
[0049]圖41是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0050]圖42是顯示由各電極得到的結(jié)果的圖。
[0051]圖43是核酸檢出用器件的表面的反應(yīng)區(qū)域附近的放大圖。
[0052]圖44顯示由各電極得到的結(jié)果的圖。
[0053]圖45是顯示核酸反應(yīng)用具的平面圖。
[0054]圖46是顯示核酸反應(yīng)用具的透視圖。[0055]圖47是顯示核酸反應(yīng)用具的透視圖。
[0056]圖48是顯示核酸反應(yīng)用具的透視圖。
[0057]圖49是顯示核酸反應(yīng)用具的透視圖。
[0058]圖50是顯示芯片原料的圖。
[0059]圖51是顯示陣列型引物探針芯片的圖。
[0060]圖52是顯示陣列型引物探針芯片的圖。
[0061]圖53是顯示陣列型引物探針芯片的圖。
[0062]圖54是顯示核酸檢出盒的概略構(gòu)成的分解立體圖。
[0063]圖55是顯示核酸檢出盒的概略構(gòu)成的立體圖。
[0064]圖56是顯示核酸檢出裝置的概略構(gòu)成的立體圖。
【具體實(shí)施方式】
[0065]以下，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施的方式進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0066]1.定義
[0067]“多核酸擴(kuò)增”是指將應(yīng)被擴(kuò)增的多個(gè)種類的目標(biāo)序列同時(shí)擴(kuò)增?！皵U(kuò)增”是指使用引物組將模板核酸連續(xù)地復(fù)制的工序。能夠使用的擴(kuò)增法只要是使用引物組擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法即可,不限于這些,例如`,包含PCR擴(kuò)增、LAMP擴(kuò)增、RT-LAMP擴(kuò)增、SMAP擴(kuò)增和ICAN擴(kuò)增等。
[0068]“目標(biāo)序列”是指要通過引物組進(jìn)行擴(kuò)增的序列，也包含使用的引物所結(jié)合的區(qū)域。
[0069]“目標(biāo)核酸”是至少包含目標(biāo)序列的序列，是被使用的引物組作為模板使用的核酸，也稱為“模板核酸”。
[0070]“引物組”是為了擴(kuò)增I種目標(biāo)核酸而所需的引物的集合體。例如，在PCR擴(kuò)增用的引物組的情況下，I種引物組包含用于擴(kuò)增I種目標(biāo)核酸的I種正向引物和I種反向引物即可。另外例如，在LAMP擴(kuò)增用的引物組的情況下，I種引物組至少包含用于擴(kuò)增I種目標(biāo)核酸的FIP引物、BIP引物即可，根據(jù)需要還可以包含F(xiàn)3引物、B3引物、LP引物、即LF引物和/或LB引物。
[0071]“目的序列”是指應(yīng)被該陣列型引物探針芯片檢出的序列。應(yīng)被檢出的目的核酸包含“目的序列”。將由目的序列組成的核酸稱為“目的序列鏈”。目的序列鏈與包含其互補(bǔ)序列的探針核酸雜交，通過檢出該雜交的有無或量，來檢出或測(cè)定目的核酸的有無或量。
[0072]“雜交信號(hào)”是通過探針核酸與其互補(bǔ)序列的雜交而產(chǎn)生的信號(hào)，根據(jù)該微陣列的檢出方式不同，是作為例如電流值、熒光光度、發(fā)光光度等被檢出的檢出信號(hào)的總稱。
[0073]“樣品”只要是包含應(yīng)被核酸反應(yīng)用具擴(kuò)增和/或檢出的核酸的物質(zhì)即可。樣品不限于這些，可以是例如，血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、活組織檢查、口腔內(nèi)粘膜、培養(yǎng)細(xì)胞、喀痰等，或通過任何其本身公知的手段從所述的任一或其混合物中作為核酸成分提取出的物質(zhì)。
[0074]2.多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具
[0075]<第I實(shí)施方式>
[0076](I)多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具[0077]參照?qǐng)D1 (a)和(b)來說明多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例。該多核酸反應(yīng)用具是用于多擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的例子。
[0078]圖1 (a)是多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的I例的立體圖。圖1 (a)所記載的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具I具有容器形狀的支持體2。支持體2的內(nèi)側(cè)底面配置彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域
3。圖1(b)是將固定化區(qū)域3的部分放大而得的模式圖。如其中所示，在I個(gè)固定化區(qū)域3固定I個(gè)種類的引物組4。在多個(gè)固定化區(qū)域3各自按每個(gè)種類而分別固定多種引物組
4。多種引物組4根據(jù)需要可以彼此不同，也可以一部分是彼此不同的序列，或者也可以一部分是彼此相同的序列。
[0079]弓丨物組4為了分別擴(kuò)增作為目的的多種目標(biāo)核酸而準(zhǔn)備多個(gè)種類。自愛I個(gè)固定化區(qū)域3固定用于擴(kuò)增特定的I種目標(biāo)核酸的I種引物組4。例如，在PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)用具的情況下，I個(gè)固定化區(qū)域包含為了擴(kuò)增I種特定的目標(biāo)核酸所需的正向引物和反向引物分別多條。另外，在LAMP擴(kuò)增用的反應(yīng)用具的情況下，I個(gè)固定化區(qū)域包含為了擴(kuò)增I種特定的目標(biāo)核酸所需的FIP引物、BIP引物、根據(jù)需要的F3引物、B3引物、和LP引物分別多條。
[0080]引物組4以與用于提供反應(yīng)場(chǎng)的液相接觸而游離的方式、以能夠游離的狀態(tài)固定于固定化區(qū)域3。引物組4向固定化區(qū)域3的固定化，例如，可以通過將包含I組引物組的溶液滴加于I個(gè)固定化區(qū)域3中，然后使其干燥來實(shí)現(xiàn)。進(jìn)而，同樣地，對(duì)于其他固定化區(qū)域3，將分別包含所期望的引物組4的溶液滴加和干燥，將所期望的數(shù)的多種引物組固定于支持體2即可。由此，在獨(dú)立配置于支持體2的I個(gè)面的全部固定化區(qū)域3固定引物組4。然而，引物組4向固定化區(qū)域3的固定化只要以與用于提供反應(yīng)場(chǎng)的液相接觸而能夠游離的狀態(tài)固定即可。因此，還可以使用能夠進(jìn)行這樣的固定化的其本身公知的任何固定化法。在滴加包含引物組的溶液的方法的情況下，包含引物組的溶液可以是例如，水、緩沖液或有機(jī)溶劑等。
[0081]配置于支持體2的多個(gè)固定化區(qū)域3彼此獨(dú)立地配置即可。獨(dú)立地配置是指，以不妨礙反應(yīng)場(chǎng)中對(duì)于每個(gè)引物組開始和/或進(jìn)行的擴(kuò)增的間隔配置。例如，相鄰的固定化區(qū)域3可以彼此相接而配置，也可以隔開微小的距離而配置在彼此附近，或者，可以隔開與通常使用的所謂DNA芯片等檢出裝置中所固定化的探針同樣的距離而彼此配置。例如，相鄰的固定化區(qū)域3的之間的距離可以為0.Ιμπι~Ιμπκ?μηι~ΙΟμπκΙΟμηι~100 μ m、100 μ m~I臟、I臟~ICtam、或其以上，優(yōu)選為100 μ m~10mnin
[0082]該引物的長(zhǎng)度雖然不限于此，但可以為約5個(gè)堿基以上、約6個(gè)堿基以上、約7個(gè)堿基以上、約8個(gè)堿基以上、約9個(gè)堿基以上、約10個(gè)堿基以上、約15個(gè)堿基以上、約20個(gè)堿基以上、約25個(gè)堿基以上、約30個(gè)堿基以上、約35個(gè)堿基以上、約40個(gè)堿基以上、約45個(gè)堿基以上或約55個(gè)堿基以上，也可以為約80個(gè)堿基以下、約75個(gè)堿基以下、約70個(gè)堿基以下、約65個(gè)堿基以下、約60個(gè)堿基以下、約55個(gè)堿基以下、約50個(gè)堿基以下、約45個(gè)堿基以下、約40個(gè)堿基以下、約35個(gè)堿基以下、約30個(gè)堿基以下、約25個(gè)堿基以下、約20個(gè)堿基以下、約25個(gè)堿基以下或約20個(gè)堿基以下，還可以是將這些下限上限的任一者組合而得的范圍。例如，優(yōu)選的堿基長(zhǎng)度的例子可以是約10個(gè)堿基~約60個(gè)堿基、約13~40個(gè)堿基、約10~30個(gè)堿基等。另 外，同時(shí)固定于I個(gè)支持體的引物的長(zhǎng)度可以全部引物相同，也可以全部引物不同，可以一部分引物為相同的長(zhǎng)度，也可以一部分引物為不同的長(zhǎng)度。另外，也可以每個(gè)引物組不同。另外，可以固定于I個(gè)區(qū)域的引物組按每個(gè)種類而為不同的長(zhǎng)度，也可以固定于I個(gè)區(qū)域的引物組全部為相同的長(zhǎng)度。
[0083]用于提供反應(yīng)場(chǎng)的液相只要是在固定的引物游離之后，能夠使用它們進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的液相即可，例如，可以是所期望擴(kuò)增所需的反應(yīng)液。
[0084]容器形態(tài)的支持體可以是例如，管、孔、室、流路、杯和盤以及具備多個(gè)上述構(gòu)造的板、例如多孔板等。另外支持體的材質(zhì)只要是其本身不參與反應(yīng)的材質(zhì)即可，只要是能夠在其中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的材質(zhì)即可?？梢詮睦绻?、玻璃、樹脂和金屬等中任意選擇。另外，容器形態(tài)的支持體還可以利用能夠商業(yè)購(gòu)買的任何容器。
[0085]圖1中顯示了固定化區(qū)域3配置于支持體2的內(nèi)側(cè)底面的例子，但不限于此，可以配置于支持體22的內(nèi)側(cè)側(cè)面的至少一部分，也可以配置于內(nèi)側(cè)底面和內(nèi)側(cè)側(cè)面、頂棚面的
任一者或全部。
[0086](2)使用了多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)
[0087]圖2是顯示使用了與第I實(shí)施方式同樣的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣子的圖。圖2(a)是反應(yīng)前的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21。配置于支持體22的內(nèi)側(cè)底面的多個(gè)固定化區(qū)域23中分別固定了多種引物組24。在多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21中添加反應(yīng)液26，將收容了該反應(yīng)液26的狀態(tài)示于圖2(b)。
[0088]反應(yīng)液26含有所期望的擴(kuò)增反應(yīng)所需要的成分即可。雖然不限于這些，可以含有例如，聚合酶等酶、以引物為起點(diǎn)形成新的多核苷酸鏈時(shí)所需的脫氧核苷三磷酸等底物、同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶和其所需的底物等、以及用于維持適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增環(huán)境的鹽類等緩沖劑。
[0089]如圖2(b)所示，在添加了反應(yīng)液26之后的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具中，如圖2(c)所模式地顯示那樣，固定于內(nèi)側(cè)底面的引物游離而緩緩地?cái)U(kuò)散。將游離和擴(kuò)散的區(qū)域模式地用區(qū)域27表示。游離、擴(kuò)散的引物與存在于其附近的模板核酸、聚合酶和底物等擴(kuò)增所需的其他成分相遇，從而擴(kuò)增反應(yīng)開始。按每個(gè)種類獨(dú)立地多個(gè)固定化的引物組，可以按其每個(gè)種類而獨(dú)立地對(duì)于模板核酸開始和進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。由此，使用了多個(gè)種類的引物組的對(duì)于多種模板序列的擴(kuò)增，獨(dú)立且同時(shí)地實(shí)現(xiàn)。這里，“反應(yīng)場(chǎng)”理論上是指由能夠在其中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液26所規(guī)定的區(qū)域，即反應(yīng)液所存在的區(qū)域。另外，將反應(yīng)場(chǎng)中實(shí)際在其中開始并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的區(qū)域稱為“反應(yīng)區(qū)域”。假設(shè)實(shí)際上擴(kuò)增反應(yīng)僅在區(qū)域27內(nèi)進(jìn)行的情況下，區(qū)域27被理解為反應(yīng)區(qū)域。
[0090]反應(yīng)液26只要是在固定的引物組游離之后，能夠進(jìn)行引物組與目標(biāo)核酸之間的擴(kuò)增反應(yīng)的液相即可。對(duì)固定化了引物的反應(yīng)場(chǎng)(最初被空氣填滿)，在擴(kuò)增反應(yīng)開始前機(jī)械地或人工地通過某些手法注入該反應(yīng)液即可。
[0091]在上述的例子中，顯示了僅引物組被固定化于支持體的例子。然而，不限于此，在引物組按每個(gè)種類而被固定于各固定化區(qū)域的條件下，也可以將擴(kuò)增所需的其他成分，例如聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等酶、底物、底物和/或緩沖劑等與引物一起固定于支持體。此時(shí)，使要固定的物質(zhì)與引物一起包含在所期望的液體介質(zhì)中，與上述的方法同樣地通過滴加和干燥等來固定即可。在這樣的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，根據(jù)被固定的成分而選擇在其中添加的反應(yīng)液的組成即可。
[0092]<第2實(shí)施方式>[0093]參照?qǐng)D3來說明多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的另外I例。
[0094]圖3是顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具另外I例的平面圖。圖3所記載的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具31是使用基板作為支持體32的例子。在支持體32的I個(gè)面配置彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域33。固定化區(qū)域33中與圖1同樣地，在I個(gè)固定化區(qū)域33固定I個(gè)種類的引物組34。在多個(gè)固定化區(qū)域33各自按每個(gè)種類而分別固定多種引物組34。I個(gè)固定化區(qū)域33所含的引物組34的構(gòu)成與第I實(shí)施方式同樣地，包含為了擴(kuò)增I種特定的目標(biāo)核酸所需的不同種類的引物。
[0095]使用第2實(shí)施方式的擴(kuò)增，通過至少對(duì)支持體32固定化了引物組34的區(qū)域裝載反應(yīng)液來形成反應(yīng)場(chǎng)即可。
[0096]固定化區(qū)域33還可以配置于在支持體32表面預(yù)先形成的凹部面、或由凹部或凸部形成的流路的內(nèi)壁。
[0097]使用基板作為支持體時(shí)，其材質(zhì)只要是其本身不參與反應(yīng)的材質(zhì)即可，只要是能夠在其中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的材質(zhì)即可?？梢詮睦绻?、玻璃、樹脂和金屬等中任意選擇。另外，引物34向支持體的固定化與第I實(shí)施方式同樣地進(jìn)行即可。
[0098]進(jìn)而另外，還可以將第2實(shí)施方式的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具配置于能夠維持該用具的容器內(nèi)，通過在該容器內(nèi)添加反應(yīng)液來形成反應(yīng)場(chǎng)。另外此時(shí)，可以在支持體32的兩面固定引物組34。由此，可以對(duì)本多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具固定更多種類的引物組，從而可以擴(kuò)增更多的目標(biāo)序列。在這一側(cè)面，多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具只要是至少在I表面獨(dú)立地固定了多種引物組的支持體，就可以是任何形狀的支持體。此時(shí)的支持體的材質(zhì)和引物的固定化法可以與第I實(shí)施方式和第2實(shí)施方式同樣。這樣的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具可以作為具備基體和在其至少I個(gè)表面的彼此獨(dú)立`的固定化區(qū)域按每個(gè)種類而可以游離地固定的多個(gè)種類的引物組的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)載體使用。此時(shí)，基體的大小和形狀可以由實(shí)施者任意選擇。例如，可以是板狀、球狀、棒狀和包含它們的一部分的形態(tài)。
[0099]〈第3實(shí)施方式〉
[0100]參照?qǐng)D4說明多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具的另外I例。圖4所示的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具41是使用具有流路的支持體的例子。圖4(a)是平面圖，圖4(b)是沿線m-m’切割而得的剖面圖。
[0101]多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具41具備:在配置于在支持體42的內(nèi)部形成的流路44的內(nèi)側(cè)底面的、彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域43，按每個(gè)種類能夠游離地固定的多種引物。
[0102]支持體42具有基體42a和覆蓋體42b。覆蓋體42b具有用于規(guī)定流路的凹部。固定化區(qū)域43配置于面向流路44的內(nèi)側(cè)的基體42a表面?；w42a與覆蓋體42b以能夠維持收納于內(nèi)部的液體的方式密合。該密合可以通過例如固定和/或接合等其本身公知的手段來實(shí)現(xiàn)，或者，也可以一體化，還可以在一體化了的狀態(tài)下形成支持體42。
[0103]該多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具41例如使用第I基板42a和第2基板42b來制造。首先，在第I基板42a的預(yù)先確定的固定化區(qū)域43按每個(gè)種類能夠游離地固定多種引物組44。該固定化可以通過與第I實(shí)施方式同樣的方法來進(jìn)行。另一方面，在第2基板42b上與所需的流路形狀對(duì)應(yīng)地形成凹部45。凹部45的形成可以根據(jù)使用的基板的材質(zhì)通過其本身公知的方法來進(jìn)行。另外，固定化區(qū)域43的配置以包含在由形成于第2基板42b的凹部45所形成的流路內(nèi)的方式確定。接著，將第I基板42a和第2基板42b —體化。此時(shí)，以第2基板42b的凹部45面向第I基板42a側(cè)的方式一體化。另外，可以在第2基板42b的凹部45的一部分設(shè)置貫通孔(未圖示)。該貫通孔可以作為反應(yīng)液等向流路的出入口利用。
[0104]第I基板42a的材質(zhì)和第2基板42b的材質(zhì)可以相同，也可以不同。另外，第I基板42a和第2基板42b的材質(zhì)只要是其本身不參與反應(yīng)的材質(zhì)即可，只要是能夠在其中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的材質(zhì)即可。可以從例如硅、玻璃、樹脂和金屬等中任意選擇。
[0105]在本實(shí)施方式中，顯示了在具有流路46的支持體42的流路的內(nèi)側(cè)底面固定引物組的例子，但流路的配置和形狀不限于此。固定化引物組的面可以是構(gòu)成流路的任何面，弓丨物組可以固定于構(gòu)成流路的全部面，也可以固定于多個(gè)面。
[0106]或者，對(duì)預(yù)先形成凹部45或溝而形成了流路的第I基板42a，可以通過在其流路的一部分壁面獨(dú)立地固定多種引物組，然后，用硅膠加蓋，從而制造圖4的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具。
[0107]<第4實(shí)施方式>
[0108]多核酸擴(kuò)增和檢出
[0109]如圖5所示，多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具51可以具備作為支持體的管52、獨(dú)立地固定于管52的內(nèi)面的多種引物組(未圖示)。在這樣的管型的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具51中也可以擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸。然后，可以將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物加入到固定了多種不同的核酸探針56的DNA芯片55等裝置中進(jìn)行檢出。這樣實(shí)施方式中示例的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，可以使檢出用樣品的調(diào)制比現(xiàn)有更簡(jiǎn)便，并且可以獨(dú)立地進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增。
[0110]<第5實(shí)施方式>
[0111]多核酸擴(kuò)增法`
[0112]作為另外的實(shí)施方式，還提供以下多核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法，該多核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法包括:對(duì)由特定的容器、管、盤或形成了流路的基板等形成的支持體的至少I個(gè)內(nèi)側(cè)表面，能夠游離地固定為了分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸而設(shè)計(jì)的多個(gè)種類的引物組的工序。
[0113]這樣的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法例如可以具備以下步驟:對(duì)所期望的支持體的至少I個(gè)表面能夠游離地固定為了分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸而設(shè)計(jì)的多個(gè)種類的引物組的步驟；以多個(gè)種類的引物組包含在I個(gè)反應(yīng)場(chǎng)的方式添加包含擴(kuò)增所需的試劑的反應(yīng)液的步驟，所述擴(kuò)增所需的試劑例如，聚合酶等酶、以引物為起點(diǎn)形成新的多核苷酸鏈時(shí)所需的脫氧核苷三磷酸等底物、同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶和其所需的底物等、以及用于維持適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增環(huán)境的鹽類等緩沖劑；通過將固定了該引物的支持體加熱或冷卻來進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)等、調(diào)節(jié)適合擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境的步驟；和由此進(jìn)行多核酸擴(kuò)增反應(yīng)的步驟。
[0114]具體的擴(kuò)增反應(yīng)可以根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的種類而利用其本身公知的技術(shù)來進(jìn)行。
[0115]進(jìn)而，作為另外的實(shí)施方式，還提供以下多核酸擴(kuò)增反應(yīng)，該多核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括:對(duì)微珠、板小片或棒等基體的表面能夠游離地固定為了分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸而設(shè)計(jì)的多個(gè)種類的引物組的工序。
[0116]這樣的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法例如可以具備以下步驟:對(duì)所要求的基體的至少I個(gè)表面能夠游離地固定為了分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸而設(shè)計(jì)的多個(gè)種類的引物組的步驟；將基體配置于包含擴(kuò)增所需的試劑的反應(yīng)液內(nèi)的步驟，所述擴(kuò)增所需的試劑例如，聚合酶等酶、以引物為起點(diǎn)形成新的多核苷酸鏈時(shí)所需的脫氧核苷三磷酸等底物、同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶和其所需的底物等、以及用于維持適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增環(huán)境的鹽類等緩沖劑；通過將反應(yīng)液加熱或冷卻來進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)等、調(diào)節(jié)適合擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境的步驟；和由此進(jìn)行多核酸擴(kuò)增反應(yīng)的步驟。
[0117]對(duì)于通過這樣的多核酸擴(kuò)增而擴(kuò)增目標(biāo)核酸，然后用DNA芯片進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出時(shí)的結(jié)果進(jìn)行說明。
[0118]圖6(a_l)是顯示在添加于反應(yīng)容器61內(nèi)的反應(yīng)液62中，使用多個(gè)種類的引物組、即第I引物組(A)63a和第2引物組(B)63b，分別擴(kuò)增目標(biāo)序列的樣子的圖。圖(a_l)的反應(yīng)體系64不是這里公開的該多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，而是現(xiàn)有的一般反應(yīng)體系。即，對(duì)反應(yīng)容器61的任何面均不固定任何引物組，在直接在反應(yīng)液中混合的狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增反
應(yīng)。
[0119]圖6 (b-Ι)顯示具有與上述的第2實(shí)施方式同樣的構(gòu)成的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21。多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21具備容器22、和配置于其內(nèi)側(cè)底部的第I引物固定化區(qū)域23a和第2引物固定化區(qū)域23b。在第I引物固定化區(qū)域23a能夠游離地固定第I引物組(A) 24a。在第2引物固定化區(qū)域23b能夠游離地固定第2引物組(B) 24b。
[0120]利用圖6(a_l)的反應(yīng)體系的擴(kuò)增，由于引物組(A)63a與引物組(B)63b之間的擴(kuò)增效率、擴(kuò)增特異性等不同，因而所得的擴(kuò)增量產(chǎn)生差異。通過這樣的擴(kuò)增所得的結(jié)果的I例示于圖6 (a-2)。例如，在想要檢出基因表達(dá)量時(shí)，這樣的一般方法中不能反映真正的表達(dá)量。
[0121]在圖6 (a-2)所示的作為另外實(shí)施方式的I例的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具21的情況下，利用能夠游離地固定于容器22第I引物(A)24a和第2引物(B) 24b的擴(kuò)增，彼此獨(dú)立地對(duì)于目的的目標(biāo)核酸進(jìn)行。因此，在第I引物(A) 24a和第2引物(B) 24b各自的模板核酸以等量存在于反應(yīng)場(chǎng)中的情況下，可以得到如圖6(b-2)所示那樣的相同的大小的檢出信號(hào)。
[0122]通過作為I例在上述的實(shí)施方式中顯示多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，可以在不受由不同的序列產(chǎn)生的干擾的條件下將多個(gè)種類的目標(biāo)序列獨(dú)立地同時(shí)進(jìn)行。現(xiàn)有技術(shù)中，將多個(gè)種類的引物在I個(gè)容器內(nèi)使用而進(jìn)行多元擴(kuò)增時(shí)，存在反應(yīng)效率發(fā)生偏倚、種類的數(shù)有限這樣的問題。即，有時(shí)在不同種類的引物之間發(fā)生必要的酶和/或dNTP的競(jìng)爭(zhēng)。另外，有時(shí)根據(jù)目標(biāo)序列的序列和/或引物的序列而反應(yīng)特異性和/或反應(yīng)效率出現(xiàn)差異。此時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生根據(jù)引物種類不同而擴(kuò)增反應(yīng)開始點(diǎn)不同、僅對(duì)于一部分引物組的擴(kuò)增開始并進(jìn)行、或者對(duì)于一部分引物組的擴(kuò)增不能充分實(shí)現(xiàn)等問題。這樣的現(xiàn)有問題也通過本說明書中公開的實(shí)施方式而被解決。
[0123]即，如果使用以實(shí)施方式為例顯示的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，則僅在固定的擴(kuò)增試劑附近進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因而雖然是在同一容器中和/或同一溶液中，但擴(kuò)增反應(yīng)不彼此干擾，可以獨(dú)立地進(jìn)行各種目標(biāo)的擴(kuò)增反應(yīng)。另外，還可以在個(gè)別反應(yīng)某種程度進(jìn)行之后進(jìn)一步補(bǔ)加不同的引物組，還可以將第I實(shí)施方式所示的容器形態(tài)的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具與上述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)載體組合使用。
[0124]<實(shí)施例1 >
[0125]以下，記載可以進(jìn)行10種LAMP多擴(kuò)增的多擴(kuò)增用容器的實(shí)施例。
[0126](I)多擴(kuò)增用容器的制作
[0127]使用的引物的堿基序列示于表1-1和表1-2。[0128]表1-1引物組一覽
【權(quán)利要求】
1.多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，具備:以支持液相的反應(yīng)場(chǎng)的方式構(gòu)成的支持體；彼此獨(dú)立地配置于在由所述液相形成所述反應(yīng)場(chǎng)時(shí)與所述反應(yīng)場(chǎng)相接的所述支持體的至少I個(gè)面的多個(gè)引物固定化區(qū)域；和按每個(gè)種類能夠游離地固定于所述多個(gè)引物固定化區(qū)域的、以分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)序列的方式構(gòu)成的多個(gè)種類的引物組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述支持體具有容器形態(tài)或流路形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，進(jìn)一步具備能夠游離地固定于所述引物固定化區(qū)域的增稠劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，進(jìn)一步具備安裝于所述支持體的、與支持體一起構(gòu)成維持反應(yīng)液的室的覆蓋體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述支持體由基板形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，是核酸檢出用器件，其中， 所述支持體在其第I面具備溝部， 所述溝部具備用于核酸樣品進(jìn)行反應(yīng)的流路型室， 所述流路型室的剖面積，大于所述溝部中除了所述流路型室以外部分的剖面積。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，進(jìn)一步具備: 在所述支持體上形成的核酸檢出用的傳感器部`；在所述支持體上形成的、與所述傳感器連接的配線；和在所述支持體上形成的保護(hù)膜， 所述多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具是在用于所述傳感器部與核酸樣品反應(yīng)的室內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，然后通過所述傳感器部進(jìn)行核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出的核酸檢出器件， 所述保護(hù)膜具備在所述基板上的所述核酸樣品的接液區(qū)域使包含一部分所述基板的下層部露出的I個(gè)以上的開口。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述傳感器部是電極。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述保護(hù)膜在所述接液區(qū)域覆蓋所述配線。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述保護(hù)膜是選自聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/ 丁二烯/苯乙烯共聚物、硅樹脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、碳化硅和金屬氧化物中的至少I種。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述保護(hù)膜包含酚醛清漆樹脂、環(huán)氧樹脂、聚烯烴樹脂和硅樹脂。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具，所述支持體由第I板形成，所述第I板由硬質(zhì)材料構(gòu)成， 所述多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具進(jìn)一步具備:由軟質(zhì)材料一體構(gòu)成的流路包裝、和由硬質(zhì)材料構(gòu)成的第2板， 所述流路包裝具備:核酸反應(yīng)流路；貯存核酸樣品的第I注射器；貯存核酸反應(yīng)中使用的試劑液的第2注射器；貯存從所述核酸反應(yīng)流路流出的液體的第3注射器；連接所述第I注射器和所述第2注射器以及所述核酸反應(yīng)流路的第I流路；和連接所述核酸反應(yīng)流路和所述第3注射器的第2流路， 所述多核酸擴(kuò)增反應(yīng)用具是所述第I板與所述流路包裝的第I面相對(duì)、所述第2板與所述第I面的相反側(cè)的第2面相對(duì)并與所述第I板一起密封所述流路包裝的核酸反應(yīng)盒。
13.多核酸擴(kuò)增反應(yīng)載體，具備:基體；彼此獨(dú)立地配置于所述基體的至少I個(gè)面的多個(gè)引物固定化區(qū)域；和按每個(gè)種類能夠游離地固定化于所述多個(gè)引物固定化區(qū)域的、以分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)序列的方式構(gòu)成的多個(gè)種類的引物組。
14.多核酸擴(kuò)增方法，具備:在支持體的至少I個(gè)面的彼此獨(dú)立的多個(gè)固定化區(qū)域，將用于分別擴(kuò)增多個(gè)種類的目標(biāo)核酸的多個(gè)種類的引物組，按每個(gè)種類能夠游離地進(jìn)行固定的步驟，所述支持體是以支持液相的I個(gè)反應(yīng)場(chǎng)的方式構(gòu)成的，所述至少I個(gè)面是在由所述液相形成所述反應(yīng)場(chǎng)時(shí)與所述反應(yīng)場(chǎng)相接的面； 對(duì)所述支持體添加用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)液而形成I個(gè)反應(yīng)場(chǎng)的步驟； 在所述I個(gè)反應(yīng)場(chǎng)中對(duì) 于所述多個(gè)種類的目標(biāo)核酸分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的步驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103797108SQ201280044309
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】高橋匡慶, 橋本幸二, 二階堂勝, 源間信弘, 岡田純, 廣澤大二, 山本惠一, 桑原徹也, 高瀨圓, 下條明子, 中村明義 申請(qǐng)人:株式會(huì)社 東芝