專利名稱：一種禽流感基因工程多肽抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽流感基因工程多肽抗原，屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及禽流感病 毒保護(hù)性基因片段的制備、串聯(lián)、表達(dá)，從而制備一種禽流感基因工程多肽抗原。 二
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, AI)是由禽流感病毒引起的一種從呼吸系統(tǒng)到全身性敗血癥 等多種癥狀的傳染性疾病，由H5和H7亞型禽流感病毒引起高致病性禽流感， 一旦爆發(fā)， 往往造成家禽的大量死亡，被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類疾病，在我國(guó)被列為一類傳染病 (Iain Stephenson, Jane Democratis, Influenza: current threat from avian influenza. Published Online May 8,2006.)。最近H5N1、 H9N2和H7N7禽流感病毒感染人的事件表明家禽是人畜傳播潛在 的中間宿主。這也使得世界各國(guó)對(duì)禽流感的關(guān)注程度大大提高。因此，從分子水平開展 對(duì)禽流感病毒的研究，不僅在病毒學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科上有重要的學(xué)術(shù)意義，而且在公共 衛(wèi)生等方面也具有重大的社會(huì)意義。
禽流感病毒基質(zhì)蛋白2 (M2)由97個(gè)氨基酸殘基組成，其中24個(gè)氨基酸(M2e)為胞外 區(qū)，19個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)及54個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)(Hull，D.J.,Gilmore，R.,andLamb，R. A. (1988). Integration of a small integral membrane protein, M2 of influenza virus into the endoplasmic reticulum: analysis of the internal signal-anchor domain of a protein with an ectoplasmic NH， terminus. J. Cell Biol. 706,1489-1498. R. J. SUGRUE，A. J. HAY. Structural Characteristics of the M2 Protein of Influenza A Viruses: Evidence That It Forms a Tetrameric Channel. VIROLOGY 180, 617-624 (199 1).)。 M2的氨基酸序列很保守，在所檢測(cè)的毒株中，其同源性高達(dá)90%，而且氨基端的前10 個(gè)氨基酸在人流感和禽流感病毒中幾乎完全相同。M2功能是質(zhì)子通道作用(Chizhmakov， I.V., Geraghty, F.M.， Ogden, D.C.， Hayhurst， A.， Antonioi^ M.， Hay， A丄，1996. Selective proton permeability and pH regulation of the influenza virus M2 channel expressed in mouse erythroleukaemia cells. J. Physiol. 494， 329~336. Chizhmakov, I.V" Ogd叫D.C.， Geraghty， RM.， Hayhurst， A.， Skinner, A.， Betakovaj T.， Hay, A丄，2003. Differences in conductance of M2 proton channels of two influenza viruses at low and high pH. J.Physiol. 546,427—502. Mould, J.A., Druiy， J.E.， Frings， S.M., Kaupp， U.B., Pekosz， A.， L咖b， R.A., Pinto， L.H., 2000. Permeation and activation of the M2 ion channel of influenza A virus.丄 Biol. Chem. 275, 31038-31050. K. Shimbo, D.L. Brassard, R.A. Lamb, L.H. Pinto, Ion selectivity and activation of the M2 ion channel of influenza virus, Biophys. J. 70 (1996) 1336~ 1346.):在HA合成過(guò) 程中作為質(zhì)子通道控制高爾基體內(nèi)的pH值，在病毒脫殼時(shí)酸化病毒粒子的內(nèi)部環(huán)境；另 外在病毒裝配過(guò)程中也起作用。研究表明，針對(duì)M2氨基端的單克隆抗體可以抑制病毒 蝕斑的增大，因此M2e成為研制針對(duì)流感病毒具有交叉保護(hù)作用亞單位苗的熱點(diǎn)。抗原表位又被稱為抗原決定簇是伴隨分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)迅速發(fā)展而產(chǎn)生 的。表位疫苗不僅提供了一種更有效的利用病原體中各個(gè)抗原成分的方法，而且對(duì)于流 感病毒這種高度變異的病毒來(lái)說(shuō)， 一方面可以通過(guò)選擇具有交叉保護(hù)性的表位來(lái)達(dá)到預(yù) 防多個(gè)毒株的目的，另一方面可以通過(guò)對(duì)流行毒株的監(jiān)測(cè)來(lái)及時(shí)合成表位，實(shí)現(xiàn)對(duì)變異 毒株的控制。A型流感病毒蛋白中較為保守的蛋白為核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)， 含有誘導(dǎo)具有交叉保護(hù)性T、 B細(xì)胞反應(yīng)的特定多肽，從理論上保證了研究多肽疫苗的 可行性。
三

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種禽流感基因工程多肽抗原及其制備方法，提出 以禽流感病毒基質(zhì)蛋白和核蛋白上的抗原表位進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，以表達(dá)的融合蛋白制備作 為免疫原及其制備方法。 技術(shù)方案
一種禽流感基因工程多肽抗原，其特征在于，以禽流感病毒表面保守的基質(zhì)蛋白2 即M2膜外部分的N端24個(gè)氨基酸肽段(M2e)作為主要抗原，在其C端連接特異性 的T細(xì)胞抗原表位，或分別在其C、 N端連接特異性和非特異性的T細(xì)胞抗原表位，構(gòu) 成融合蛋白，其中特異性T細(xì)胞表位為禽流感病毒核蛋白NP上具有抗原性的氨基酸肽 段，非特異性T細(xì)胞表位為乙肝表面抗原HBs和破傷風(fēng)毒素TT具有抗原性的氨基酸肽 段，在多肽連接處以柔性氨基酸作為接頭連接。
其M2膜外部分的N端24個(gè)氨基酸肽段M2e串聯(lián)成三拷貝3M2e形式，特異性T 細(xì)胞表位是禽流感病毒核蛋白NP366-374位氨基酸肽段和NP383-391位氨基酸肽 段，其非特異T細(xì)胞表位是乙肝表面抗原HBs 19-33氨基酸肽段和破傷風(fēng)毒素TT 580-599位氨基酸肽段。
抗原多肽連接處采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu)3M2eAA-X-NP366.374AA-NP383.391AA或者 HBs19.33AA-X-TT580.599AA-Y-3M2eAA-X-NP366.374AA- NP383.391AA;其中"X"為 GGGGS接頭，T為GLPSGG接頭。
上述多肽疫苗，其具有抗原性的氨基酸多肽序列為SEQ ID N0.2，或SEQID N0.4。 有益效果
為了滿足多肽抗原對(duì)多種亞型禽流感病毒具有交叉保護(hù)能力的效果，在設(shè)計(jì)該融合 蛋白時(shí)主要選取了禽流感病毒中較為保守的蛋白。M2蛋白是流感病毒表面一種囊膜蛋 白，主要保護(hù)性抗原決定簇在其N端的1 24個(gè)氨基酸(M2e)，在所檢測(cè)的毒株中，其 同源性高達(dá)90%，而且N端的前IO個(gè)氨基酸在人流感和禽流感病毒中幾乎完全相同。 以A/Chicken/GuangDong/191/04(H5Nl)和A/Chicken/Henan/62/00(H9N2)兩個(gè)毒株的M2e 序列位參考，對(duì)比其它以報(bào)道的M2e序列，對(duì)24肽中個(gè)別氨基酸進(jìn)行調(diào)整，實(shí)施例中 序列為SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD。在禽流感病毒蛋白中NP蛋白同屬較為保守的蛋白，其中含有大量的輔助性和殺傷性的T細(xì)胞表位，參照上述方法比較禽流感病毒 NP蛋白序列，并綜合考慮各個(gè)表位的抗原性，選取NP366-"4、 NP383-別位兩個(gè)T細(xì)胞表 位串聯(lián)在M2e的C端。并對(duì)NP366.374、 NP383.3W位肽段中的氨基酸做個(gè)別調(diào)整，實(shí)施例
中序列為ASNESMETM和SRYWAIRTR。為了提高融合蛋白的抗原性，本發(fā)明中將氨 基酸序列相對(duì)較短、抗原性較弱的M2e24肽重復(fù)至3拷貝形式(3M2e)，也可采用其 它形式(如6拷貝或12拷貝)，以構(gòu)成抗原的主體部分。由于該序列所含的多為B細(xì)胞 表位，在C端連接兩個(gè)特異性T細(xì)胞表位的基礎(chǔ)上在其N端再連接兩個(gè)非特異性的T 細(xì)胞表位從而進(jìn)一步提高融合蛋白的抗原性。乙肝表面抗原和破傷風(fēng)毒素蛋白上含有廣 譜的T細(xì)胞表位，它突破了MHC限制，能夠提高融合蛋白的抗原性。將乙肝表面抗原 (HBs) 19-33和破傷風(fēng)毒素(TT) 580-599位氨基酸肽段連接在M2e的N端。由于該 氨基酸肽段至于融合蛋白的C端將主要產(chǎn)生針對(duì)它的抗體，所以非特性和特異性T細(xì)胞 表位相對(duì)3M2e的位置是不可調(diào)換的，而兩類T細(xì)胞表位內(nèi)部的兩個(gè)位點(diǎn)在不影響抗原 性的情況下順序是可以調(diào)換的。具有抗原性的氨基酸肽段在連接時(shí)，在肽段連接處加入 適當(dāng)?shù)陌被岫嚯淖鳛榻宇^，接頭中的氨基酸數(shù)目和種類根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，其原則是 不影響整形成融合蛋白后表現(xiàn)足夠的抗原性。
實(shí)施例(一)中，以融合蛋白3M2eAA-NP366-374AA-NP383-3^AA為抗原制備禽流 感多肽抗原pET-MN。 SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白分子量大小與預(yù)計(jì)的一致， 見(圖l(a))。在條帶"3、 5"可見與預(yù)計(jì)分子量大小相符的融合蛋白，并且該蛋白以 可溶性形式表達(dá)。Western-blotting檢測(cè)該融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能跟標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā) 生特異性抗體反應(yīng)(見圖l(b))。用該抗原免疫雞，ELISA檢測(cè)抗體水平，以H9、 H5 兩個(gè)亞型的M2e24肽包被檢測(cè)出的抗體水平無(wú)明顯差異。文中只給出以H9亞型24肽 包被檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)M2e的抗體(見圖2)。流式細(xì)胞 術(shù)檢測(cè)雞外周血中€04+"08+丁淋巴細(xì)胞數(shù)量在免疫后隨時(shí)間的變化(見圖3)，結(jié)果證 明該疫苗能剌激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例(二)中，以融合蛋白HBsAA-TTAA-3MeAA-NP366-374AA-NP383-391AA為 抗原制備禽流感多肽抗原pET-HTMN。 SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白分子量大 小與預(yù)計(jì)的一致，見(圖4(a))。在條帶"3、 4、 5"可見與預(yù)計(jì)分子量大小相符的融合 蛋白，該蛋白大部分為包涵體少量蛋白為可溶性形式表達(dá)。Western-blotting檢測(cè)該融合 蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能跟標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異性抗體反應(yīng)(見圖4(b))。用該抗原免 疫雞，ELISA檢測(cè)抗體水平，以H9、 H5兩個(gè)亞型的M2e24肽包被檢測(cè)出的抗體水平 無(wú)明顯差異。文中只給出以H9亞型24肽包被檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn) 生針對(duì)M2e的抗體(見圖5)。分離抗血清與H9N2禽流感病毒感染的MDCK細(xì)胞能特 異性結(jié)合(見圖6)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞外周血中CD4+ZCD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在免疫后隨 時(shí)間的變化(見圖7)，結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。文中給出 該抗原免疫后流式檢測(cè)圖片(見圖8)。
設(shè)計(jì)該融合蛋白來(lái)制備新型免疫原用于預(yù)防不同亞型的禽流感，交叉免疫力是其主要特征，但是考慮到疫苗發(fā)揮最大的免疫效力，我們認(rèn)為由于不同亞型的禽流感病毒
M2e的氨基酸序列存在細(xì)微差別，以H5亞型禽流感病毒序列為依據(jù)構(gòu)建的抗原最適合 用于H5亞型禽流感的預(yù)防；以H9亞型禽流感病毒序列為依據(jù)構(gòu)建的抗原最適合用于 H9亞型禽流感的預(yù)防。


1. 圖1和圖10中圖1 (a)為多肽抗原pET-MN的SDS-PAGE電泳圖示，圖1 (b)為 多肽抗原pET-MN的Western-blotting檢測(cè)圖示。
2. 圖2和圖11為多肽抗原pET-MN免疫雞后ELISA檢測(cè)抗M2e抗體圖示。
3. 圖3和圖12為多肽抗原pET-MN免疫雞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞圖示。
4. 圖4和圖13中圖4 (a)為多肽抗原pET-HTMN的SDS-PAGE電泳圖示，圖4 (b) 為多肽抗原pET-HTMN的Western-blotting檢測(cè)圖示。
5. 圖5和圖14為多肽抗原pET-HTMN免疫雞后ELISA檢測(cè)抗M2e抗體圖示。
6. 圖6和圖15為pET-HTMN免疫雞抗血清與H9N2流感病毒感染的MDCK細(xì)胞免疫 熒光。
7. 圖7和圖16為多肽抗原pET-HTMN免疫雞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞圖示。
8. 圖8和圖17為多肽抗原pET-HTMN免疫雞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞圖片。
9. 圖9和圖18為抗原多肽結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，應(yīng)該說(shuō)明的是本實(shí)施例只對(duì)本發(fā)明有說(shuō)明作用，而 沒(méi)有限制作用。在實(shí)施例中詳細(xì)描述了抗原基因的串聯(lián)、克隆、表達(dá)，但并不意味著抗 原基因的克隆表達(dá)僅限于實(shí)施例中的敘述，任何以其它基因工程方法克隆表達(dá)權(quán)利要求 書中所述序列都應(yīng)包括在本發(fā)明所要要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
實(shí)施例中將禽流感病毒3M2e、 NP抗原多肽進(jìn)行串聯(lián)，并在其N端連接非特異性T 細(xì)胞表位，構(gòu)成融合蛋白。抗原采用3拷貝的M2e肽段和NP蛋白366-374、 383-391 位氨基酸肽段，以及適當(dāng)選取乙肝表面抗原和破傷風(fēng)毒素抗原表位，并將其組成 3M2eAA-NP366.374AA-NP383-391AA和HBs19-33AA-TT580.599AA-3M2eAA-NP366—374AA-NP383.391AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，并在多肽連接處加入適當(dāng)?shù)陌被峤宇^，采用 3M2eAA-GGGGS ("X") -NP366_374AA-NP383-391AA禾卩HBs19_33AA- GLPSGG ("Y，,) -TT580.599AA-GGGGS ("X") -3MeAA-GGGGS ("X") -NP366.374AA-NP383.391AA的抗 原多肽結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖7。
串聯(lián)結(jié)構(gòu)的融合蛋白其基因序列是SEQ IDNO.l，編碼的抗原多肽氨基酸序列 是SEQIDN0.2;串聯(lián)結(jié)構(gòu)的融合蛋白其基因序列是SEQIDNO.3,編碼的抗原多 肽氨基酸序列是SEQIDN0.4。其結(jié)構(gòu)特征如下
編碼融合蛋白3M2eAA-NP366.374AA-NP383.391AA的基因大小為306bp，融合蛋白 的大小為11.2kDa，加上表達(dá)載體pET-32a (+)自身蛋白20kDa，整個(gè)融合蛋白為31.2kDa;
編碼融合蛋白HBsAA-TTAA-3MeAA-NP366-374AA-NP383-391AA的基因大小為 466bp，融合蛋白的大小為16.2kDa，加上表達(dá)載體pET-32a (+)自身蛋白20kDa， 整個(gè)融合蛋白為36.2kDa。
實(shí)施例(一)以禽流感多肽抗原pET-MN為例具體描述本發(fā)明。
比較GenBank中公布的禽流感M2e序列SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD，根據(jù) 密碼子的偏嗜性和簡(jiǎn)并性原則人工合成連續(xù)的三拷貝M2e基因(3M2e),并在全基因的 5'端加入五coRI， 3'端加入BawHI酶切位點(diǎn)終止密碼子及酶切位點(diǎn)，送上海Invitrogen 公司合成并連接到pMD-18T載體中，命名為pMD18T-3M2e。以該質(zhì)粒為模板，在下游 引物非配對(duì)部分引入NP表位，第一次擴(kuò)增引入表位NP366-374，第二次擴(kuò)增引入表位 NP383-391，經(jīng)兩次PCR擴(kuò)增，得到片段3M2e-NP366-374-NP383-391 (SEQIDNO.l)， 將該片段與表達(dá)載體pET-32a經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，在T41igase等作 用下發(fā)生連接反應(yīng)。獲得的重組DNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3菌株感受態(tài)細(xì)胞，培 養(yǎng)于氨芐青霉素平板，37'C倒置過(guò)夜。隨意挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)雙酶切鑒定、DNA測(cè)序分 析，從而獲得陽(yáng)性克隆。序列分析證明插入的基因片段與設(shè)計(jì)相符，將此克隆命名為 pET-畫。
將pET-MN以含50ug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37。C攪拌速度200rmp 通氣培養(yǎng)2h，加入IPTG誘導(dǎo)后，3(TC攪拌速度150rmp繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后收集菌體。 將菌體配成油乳劑后，即可獲得一種新型禽流感基因工程多肽抗原，其具有抗原性的 氨基酸多肽序列為SEQ ID NO,2。
其結(jié)果如下
SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白分子量大小與預(yù)計(jì)的一致，見(圖l(a))。圖中 "1 "為蛋白質(zhì)分子量Marker;"2、3、4、5"分別是空質(zhì)粒pET-32a轉(zhuǎn)化受體菌BL21-DE3、 重組質(zhì)粒pET-MN轉(zhuǎn)化BL21-DE3、重組質(zhì)粒pET-MN轉(zhuǎn)化BL21-DE3后超聲波裂解沉 淀和重組質(zhì)粒pET-MN轉(zhuǎn)化BL21-DE3后超聲波裂解上清蛋白表達(dá)條帶。在條帶"3、 5" 可見與預(yù)計(jì)分子量大小相符的融合蛋白，并且該蛋白以可溶性形式表達(dá)。Western-blotting 檢測(cè)該融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能跟標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異性抗體反應(yīng)(見圖l(b))。
用該多肽抗原免疫雞，ELISA檢測(cè)抗體水平，結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì) M2e的抗體(見圖2)。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間間隔，縱坐標(biāo)表示抗體滴度，由圖可見抗 體滴度隨時(shí)間變化的消漲。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞外周血中CD4VCD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在免 疫后隨時(shí)間的變化(見圖3),結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。圖 中橫坐標(biāo)表示免疫后時(shí)間間隔，縱坐標(biāo)表示淋巴細(xì)胞數(shù)量，由圖可見淋巴細(xì)胞數(shù)量在免 疫后不同時(shí)間間隔的變化。實(shí)施例(二)以禽流感多肽抗原pET-HTMN為例具體描述本發(fā)明。
人工合成編碼HBs-TT以及柔性氨基酸接頭的基因片段(序列見SEQ ID N0.3中 1-150位)，將片段3M2e-NP366-374-NP383.391與其串聯(lián)，獲得融合基因 HBs-TT-3Me-NP366.374 -NP383.391 ( SEQ ID N0.3 )，將該片段與表達(dá)載體pET-32a經(jīng)限 制性內(nèi)切酶雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，在T4 ligase等作用下發(fā)生連接反應(yīng)。獲得的重組 DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3菌株感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于氨芐青霉素平板，37'C倒置過(guò) 夜。隨意挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)雙酶切鑒定、DNA測(cè)序分析，從而獲得陽(yáng)性克隆。序列分析 證明插入的基因片段與設(shè)計(jì)相符，將此克隆命名為pET-HTMN。
將pET-HTMN以含50ug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37°C攪拌速度200rmp 通氣培養(yǎng)2h，加入IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后收集菌體。將菌體重懸于裂解液中，超聲破破碎 15min,超聲后8000rmp離心20min收集包涵體。以8M尿素溶解包涵體，經(jīng)Ni柱純化 復(fù)性包涵體。最后純化后的融合蛋白配成油乳劑后，即可獲得一種新型禽流感基因工程 多肽抗原，其具有抗原性的氨基酸多肽序列為SEQIDN0.4。
其結(jié)果如下
SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白分子量大小與預(yù)計(jì)的一致，見(圖4(a))。圖中 "l"為蛋白質(zhì)分子量Marker;"2、3、4、5"分別是空質(zhì)粒pET-32a轉(zhuǎn)化受體菌BL21-DE3、 重組質(zhì)粒pET-HTMN轉(zhuǎn)化BL21-DE3、重組質(zhì)粒pET-MN轉(zhuǎn)化BL21-DE3后超聲波裂解 沉淀和重組質(zhì)粒pET-HTMN轉(zhuǎn)化BL21-DE3后超聲波裂解上清蛋白表達(dá)條帶。在條帶 "3、 4、 5"可見與預(yù)計(jì)分子量大小相符的融合蛋白，該蛋白大部分為包涵體少量蛋白 為可溶性形式表達(dá)。Western-blotting檢測(cè)該融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能跟標(biāo)準(zhǔn)抗體 發(fā)生特異性抗體反應(yīng)(見圖4(b))。
用該抗原免疫雞，ELISA檢測(cè)抗體水平，結(jié)果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)M2e 的抗體(見圖5)。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間間隔，縱坐標(biāo)表示抗體滴度，由圖可見抗體滴度 隨對(duì)間變化的消漲?？贵w能夠與病毒表達(dá)在感染細(xì)胞表面的M2結(jié)合，用免疫的血清 1:100稀釋與感染病毒的MDCK細(xì)胞孵育，加熒光二抗在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果表明， 在感染細(xì)胞的表面能夠觀察到熒光(圖6 (A))，而陰性血清對(duì)照細(xì)胞表面沒(méi)有熒光(圖 6 (B))。從而證明了表達(dá)的融合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗血清能夠與流感病毒結(jié)合。流式 細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞外周血中CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在免疫后隨時(shí)間的變化(見圖7),結(jié) 果證明該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。圖中橫坐標(biāo)表示免疫后時(shí)間間隔， 縱坐標(biāo)表示淋巴細(xì)胞數(shù)量，由圖可見淋巴細(xì)胞數(shù)量在免疫后不同時(shí)間間隔的變化。通過(guò) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)可以看出構(gòu)建的抗原具有較的免疫原性，可以用于疫苗的制備。序列表
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>一種禽流感基因工程多肽抗原
<130>說(shuō)明書
<140>00
<141>2008-05-09
<160>4
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>297
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>融合蛋白基因1
<222〉(l)..闊
<223>
<400>1
atgggctctt tgttgaccga agttgaaacc ccaacccgta acgaatggga atgccgttgc 60
tctgattctt ctgattcctt attaactgag gtcgagactc caactcgtaa tgagtgggag 120
tgtcgttgtt ccgactcctc cgactcttta ttgactgaag tcgaaactcc aacccgtaat 180
gaatgggagt gccgttgttc tgactcttcc gatggatccg gtggtggtgg ttctgcttca 240 aatgagagca tggaaacaat gtctagaagt cgttattggg ctattcgtac ccgctaa 297
<210> 2 <211> 98 <212> PRT <213>融合蛋白 <220>
<221>融合蛋白1 <222> (1)..(98) <223> <400> 2
Met Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp 15 10 15
Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu 20 25 30
Thi Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
35 40 45
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys
50 55 60
Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser 65 70 75 80
Asn Glu Ser Met Glu Thr Met Ser Arg Ser Arg Tyr Trp Ala lie Arg
85 90 95
Thr Arg <210> 3 <211> 441 <212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>融合蛋白基因2 <222> (1)..(441) <223> <400> 3
atgtteccat tgttgacccg tattcttacc attcctcaga gtttggatgg ettgccagta 60 ggcggcaata gtgtggatga tgcgttgatt aattccacga agatttattc atatttecca 120agtgtgggtg gtggtggttc tcccgggggc tctttgttga ccgaagttga aaccccaacc 180 cgtaacgaat gggaatgccg ttgctctgat tcttctgatt ccttattaac tgaggtcgag 240 aetecaactc gtaatgagtg ggagtgtcgt tgttccgact cctccgactc tttattgact 300 gaagtcgaaa ctccaacccg taatgaatgg gagtgccgtt gttctgactc ttccgatgga 360 tccggtggtg gtggttctgc ttcaaatgag agcatggaaa caatgtctag aagtcgttat 420 tgggctattc gtacccgcta a 441 <210> 4 <211> 146 <212> PRT <213>融合蛋白 <220>
<221>融合蛋白2 <222> (1)..(146) <223> <400> 4
Met Phe Pro Leu Leu Thr Arg He Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp 15 10 15
Gly Leu Pro Val Gly Gly Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu lie Asn Ser 20 25 30
Thr Lys lie Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp
50 55 60
Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu 65 70 75 80
Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
85 90 95
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys 100 105 110
Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser
115 120 125
Asti Glu Ser Met Glu Thr Met Ser Arg Ser Arg Tyr Trp Ala lie Arg
130 135 140
ThtArg 14權(quán)利要求
1、一種禽流感基因工程多肽抗原，其特征在于，以禽流感病毒表面保守的基質(zhì)蛋白2即M2膜外部分的N端24個(gè)氨基酸肽段即M2e作為主要抗原，在其C端連接特異性的T細(xì)胞抗原表位，或在其C、N端分別連接特異性和非特異性的T細(xì)胞抗原表位，構(gòu)成融合蛋白，其中特異性T細(xì)胞表位為禽流感病毒核蛋白NP上具有抗原性的氨基酸肽段，非特異性T細(xì)胞表位為乙肝表面抗原HBs和破傷風(fēng)毒素TT具有抗原性的氨基酸肽段，在多肽連接處以柔性氨基酸作為接頭連接。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽抗原，其中M2的N端24個(gè)氨基酸肽段即M2e 串聯(lián)成三拷貝即3M2e形式。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽抗原，其特異性T細(xì)胞抗原表位是禽流感病 毒核蛋白NP366-374位氨基酸肽段和NP383-391位氨基酸肽段。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽抗原，其非特異T細(xì)胞表位是乙肝表面抗 原HBsl9-33位氨基酸肽段和破傷風(fēng)毒素TT580-599位氨基酸肽段。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽抗原，其非特異T細(xì)胞表位是乙肝表面抗原 HBsl9-33位氨基酸肽段和破傷風(fēng)毒素TT580-599位氨基酸肽段。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽抗原，其特征在于， 多肽連接處采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu)3M2eAA-X-NP366.374AA-NP383.391AA或者HBs19.33AA-X-TT580.599 AA-Y-3M2eAA-X-NP366.374AA-NP383-391AA;其中"X"為 GGGGS接頭，"Y，，為GLPSGG接頭。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽抗原，其特征在于，多肽連接處采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu) 3M2eAA-X-NP366-374AA-NP383-391AA或者 HBs19.33AA-Y-TT580.599 AA-X-3M2eAA-X-NP366.374AA-NP383.391AA;其中"X"為 GGGGS接頭，"Y，，為GLPSGG接頭。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽抗原，其特征在于，多肽連接處采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu)3M2eAA-X-NP366.374AA-NP383.391AA或者 HBs19-33AA- X- TT580.599 AA- Y-3M2eAA-X-NP366.374AA- NP383.39iAA;其中"X"為 GGGGS接頭，"Y"為GLPSGG接頭。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽抗原，其具有抗原性的氨基酸多肽序列為SEQID N0.2或SEQ ID N0.4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種禽流感基因工程多肽抗原及其構(gòu)建、制備方法。本發(fā)明以禽流感病毒較為保守的基質(zhì)蛋白2的膜外部分(M2e)為抗原主體，并在其兩端連接T細(xì)胞抗原表位增加抗原性，制備新型禽流感基因工程多肽抗原。人工合成編碼禽流感病毒M2e和非特異性T細(xì)胞表位肽段基因，結(jié)合PCR擴(kuò)增方法引入特異性T細(xì)胞表位，將此基因進(jìn)行串聯(lián)并插入融合表達(dá)載體，經(jīng)發(fā)酵制備成抗原。該抗原能有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生體液、細(xì)胞免疫反應(yīng)，抗血清能特異性的與H9N2病毒結(jié)合，并且對(duì)不同亞型的流感病毒有交叉反應(yīng)的潛力，為制備“通用型”禽流感疫苗打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/005GK101531719SQ20081012269
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者侯紅巖, 侯繼波, 海 徐 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院