專利名稱：從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從畜禽血液中同時分離出纖維蛋白原和免疫球蛋白的方 法，屬于生物活性物質(zhì)的分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景近年來，全球以規(guī)模化、集約化經(jīng)營為特點的養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展，大幅度提 高了人們生活水平，但是畜禽廢棄物(糞便、屠宰下腳料、血液等)的大量排 放也給生態(tài)環(huán)境帶來巨大壓力。這些廢棄物，尤其是血液，含有豐富的蛋白質(zhì)、 多種微量元素、維生素和礦物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值，但是任意排放卻造成 了嚴重的環(huán)境污染，并可能導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。充分而有效地利用畜禽血液 資源，不僅能減輕環(huán)境污染，而且可以變廢為寶，制備出高附加值產(chǎn)品。我國，每年產(chǎn)生的畜禽血液的量非常大，以我國最大量的畜禽血液豬血為例，我國每年出欄生豬約4億頭，年豬血產(chǎn)量可達100萬噸。目前除部分豬血 被加工成血粉，作為飼料添加劑及用于生化制藥外，大部分沒有被利用而自然 排放，造成了資源嚴重浪費和增加了環(huán)境處理的壓力。豬血中的纖維蛋白原， 是構(gòu)成血液凝塊的主要骨架，可以制備纖維蛋白封閉劑，是新一代生物止血材 料，用于外科急性止血。豬血中免疫球蛋白含量高達2%，具有抗菌、抗病毒等 生物活性和免疫活性，有潛在的醫(yī)藥用途。其它的畜禽血液同樣富含纖維蛋白 原和免疫球蛋白，開發(fā)合適的分離工藝，從畜禽血液中提取多種高附加值的蛋 白產(chǎn)品，實現(xiàn)多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。血液組分復(fù)雜，在體內(nèi)很穩(wěn)定，離體后卻很快會發(fā)生一系列生化變化，如凝 血、溶血、氧化等。血液蛋白的分離純化過程十分復(fù)雜，需要一系列有效的生 化分離手段。鹽析沉淀是蛋白質(zhì)分離的有效方法，也是從血液中分離纖維蛋白 原的主要方法，不過鹽析后上清液的鹽濃度仍較高，嚴重影響了后續(xù)的分離純 化，直接排放又會造成環(huán)境污染。因此，尋找一種有效的耐鹽的分離方法是關(guān) 鍵?；旌夏Ｊ轿綄游鍪墙陙戆l(fā)展起來的新型層析技術(shù)，功能配基同時含有 疏水基團和離子交換基團，可以通過靜電相吸來強化吸附或靜電排斥來協(xié)助解 吸，配基密度通常比較高，吸附容量大，具有典型的耐鹽吸附特性，特別適合 于大規(guī)模的分離純化。本發(fā)明將混合模式吸附層析與鹽析分離相結(jié)合，用混合 模式吸附劑直接處理鹽析沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、 抗體選擇行和耐鹽吸附的特性，建立起一個同時從禽畜血液中提取纖維蛋白原和免疫球蛋白的經(jīng)濟高效方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法。包括如下步驟-1) 制備血漿配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮畜禽血液與抗凝劑按照9: 1 的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，除去紅細 胞，得到血槳，置于-20 -40。C冰箱中備用；2) 無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原向步驟1)得到的新鮮血漿中加入飽和無機鹽溶液，使其飽和度達到16 22 %,室溫下靜置30分鐘，待沉淀完全，用離心機以4000 5000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液；3) 混合模式吸附層析分離免疫球蛋白調(diào)節(jié)步驟2)得到的免疫球蛋白粗品溶液的pH至7 8，使其與平衡緩沖液 的pH相同，用0.2^濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中， 平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；4) 脫鹽和干燥將步驟3)得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。 所述的畜禽血液為新鮮的豬血、牛血、雞血、鴨血或鵝血。無機鹽為硫酸 銨或硫酸鈉?；旌夏Ｊ轿絼镸EPHypercel或以4-巰乙基吡啶為功能配基的 層析介質(zhì)。平衡緩沖液為檸檬酸鈉緩沖液，pH值為7.0 8.0。洗脫液為擰檬酸 鈉緩沖液，pH為3.5 4.5。本發(fā)明針對畜禽血液資源的綜合利用，將鹽析分離與混合模式吸附層析相 結(jié)合，用于纖維蛋白原和免疫球蛋白的分離純化。用混合模式吸附劑直接處理 鹽析沉淀分離纖維蛋白原后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量提 高過程的處理量、抗體的高選擇性提高分離的效率、耐鹽吸附的特性簡化分離 步驟，得到一個經(jīng)濟高效的提取纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法。本發(fā)明的優(yōu) 點在于1)同時提取纖維蛋白原和免疫球蛋白；2)工藝簡單，易于放大，成 本較低廉；3)過程處理量大，分離效率高；4)所得免疫球蛋白的純度較高。


附圖是本發(fā)明MEPHypercd混合模式吸附層析分離豬血漿免疫球蛋白的電泳譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法。 將新鮮抗凝血離心去除紅細胞，得到血漿后，用飽和無機鹽沉淀得到其纖維蛋 白原，將上清液通過混合模式吸附層析柱進行分離，得到免疫球蛋白。通過本
發(fā)明分離得到的免疫球蛋白純度約70%。
從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法包括如下步驟
1) 制備血漿
配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新畜禽鮮血液與抗凝劑按照9: 1
的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，除去紅細 胞，得到血漿，置于-20 -40。C冰箱中備用。
2) 無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原
向步驟1)得到的新鮮血槳中加入飽和無機鹽溶液，使其飽和度達到16 22 % ，室溫下靜置30分鐘，待沉淀完全，用離心機以4000 5000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液。
3) 混合模式吸附層析分離免疫球蛋白
調(diào)節(jié)步驟2)得到的免疫球蛋白粗品溶液的pH至7 8，使其與平衡緩沖液 的pH相同，用0.2拜濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中， 平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；平衡 緩沖液和洗脫液均為檸檬酸鈉緩沖液，pH值分別為7.0 8.0和3.5 4.5。
4) 脫鹽和干燥
將步驟3)得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述 實施例1
取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入1.9ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到16%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心10分鐘，得到濕沉淀0.22g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液10.8ml，備用。上清液用0.2拜濾膜過濾，取lml作為進樣樣品。層析 柱(內(nèi)徑lcm)中填充約5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度為68.2%。
實施例2
取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000rpm轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.0ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到17%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心15分鐘，得到濕沉淀0.27g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液llml，備用。上清液用0.2pm濾膜過濾，取2ml作為進樣樣品。層析柱 (內(nèi)徑lcm)中填充約5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度 為71.4%。 實施例3
取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000卬m轉(zhuǎn)速離心15分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.2ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到18%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以5000rpm離心10分鐘，得到濕沉淀0.30g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液10.8ml，備用。上清液用0.2拜濾膜過濾，取2ml作為進樣樣品。層析 柱(內(nèi)徑lcm)中填充約5ml以4-巰乙基吡啶為功能配基的層析介質(zhì)，平衡緩 沖液為40mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH8.0)，洗脫液為20mM的擰檬酸鈉緩沖液 (pH4.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫 球蛋白的純度為77.4%。 實施例4
取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.4ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到19%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心20分鐘，得到濕沉淀0.48g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液11.4ml，備用。上清液用0.2pm濾膜過濾，取5ml作為進樣樣品。層析 柱(內(nèi)徑lcm)中填充約5mlMEPHypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH8.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度 為69.2%。 實施例5取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000rpm轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.5ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到20%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心20分鐘，得到濕沉淀0.45g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液11.5ml，備用。上清液用0.2^m濾膜過濾，取2ml作為進樣樣品。層析 柱(內(nèi)徑lcm)中填充約5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度 為68.4%。 實施例6
取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000rpm轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.8ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到22%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心20分鐘，得到濕沉淀0.65g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液10.9ml，備用。上清液用0.2^im濾膜過濾，取2ml作為進樣樣品。層析 柱(內(nèi)徑lcm)中填充約5ml MEPHypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度 為70.5%。
權(quán)利要求
1.一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟1)制備血漿配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮畜禽血液與抗凝劑按照9∶1的比例混合均勻，用離心機以2500～3000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，除去紅細胞，得到血漿，置于-20～-40℃冰箱中備用；2)無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原將飽和無機鹽溶液加入到步驟1)得到的新鮮血漿中，使無機鹽的飽和度達到16～22％，室溫下靜置30分鐘，待沉淀完全，用離心機以4000～5000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液；3)混合模式吸附層析分離免疫球蛋白調(diào)節(jié)步驟2)得到的免疫球蛋白粗品溶液的pH至7～8，使免疫球蛋白粗品溶液與平衡緩沖液的pH相同，用0.2μm濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；4)脫鹽和干燥將步驟3)得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從畜禽血液中分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法，其特征在于所述的畜禽血液為新鮮的豬血、牛血、雞血、鴨血或鵝血。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從畜禽血液中分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法，其特征在于所述的無機鹽為硫酸銨或硫酸鈉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從畜禽血液中分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法，其特征在于所述的混合模式吸附劑為MEPHypercd或以4-巰乙基吡啶 為功能配基的層析介質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從畜禽血液中分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法，其特征在于所述的平衡緩沖液為檸檬酸鈉緩沖液，pH值為7.0 8.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從畜禽血液中分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法，其特征在于所述的洗脫緩沖液為擰檬酸鈉緩沖液，pH值為3.5 4.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法。具體步驟如下1)制備血漿，取新鮮血液，離心，除去紅細胞，得到血漿。2)無機鹽沉淀，向血漿中加入無機鹽達到一定濃度，產(chǎn)生沉淀后離心分離，沉淀即纖維蛋白原，取上清液后續(xù)分離。3)柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。4)脫鹽和干燥，將收集液脫鹽后，冷凍干燥，得到純度約70％的免疫球蛋白。本發(fā)明所開發(fā)方法的特色在于設(shè)計了一條新的分離工藝，可以同時從畜禽血液中分離出纖維蛋白原和免疫球蛋白，方法的關(guān)鍵在于從沉淀分離纖維蛋白原的上清液中直接提取免疫球蛋白，具有操作步驟簡單，分離純化因子高的優(yōu)點。
文檔編號C07K14/435GK101402671SQ20081012187
公開日2009年4月8日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者姚善涇, 莊甜甜, 林東強 申請人:浙江大學(xué)