專利名稱：純化的免疫球蛋白融合蛋白及其純化方法
純化的免疫球蛋白融合蛋白及其純化方法
背景技術(shù)：
鑒于日益接受生物制品(biologies)作為批準(zhǔn)的療法，這些種類的藥物的詳細(xì)表征是重要的。不可預(yù)見的產(chǎn)物分解或雜質(zhì)的存在可危害治療效果及患者安全。生物制品生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)的實例可包括產(chǎn)物的聚集體。在藥物組合物中，聚集體是不期望的，因為它們可為免疫原性的并給體內(nèi)使用帶來安全顧慮。由于中和在患者產(chǎn)生的抗體，聚集體還可降低產(chǎn)物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。此外，還可能在生產(chǎn)過程中制造失活蛋白。失活蛋白可能是在生產(chǎn)過程中不正確折疊引起的。例如，美國專利申請2002/0039580 (Browning等人)描述了當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時淋巴毒素β受體免疫球蛋白(LTiiR-Ig)融合蛋白的兩種形式，活性和失活形式。美國專利申請2002/0039580還教導(dǎo)了在Ig融合蛋白生產(chǎn)過程中通過降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度，可以降低制品中失活分子的百分比。此公布描述了 LTiiR-Ig的僅一種失活形式，其沒有結(jié)合配體的能力。在生物制品生產(chǎn)中，這些產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)可帶來純化的挑戰(zhàn)。這些雜質(zhì)往往難以鑒定，因為它們往往具有與感興趣的治療蛋白的活性形式相當(dāng)?shù)奶卣?，并因此可能很難檢測。 此外，即使當(dāng)鑒定了這些雜質(zhì)時，從藥物產(chǎn)品中分離雜質(zhì)可能是很困難的。因此，不僅對鑒定可能會出現(xiàn)在生物制品生產(chǎn)和純化過程中的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)，而且對鑒定雜質(zhì)后去除雜質(zhì)的方法仍然存在需要。發(fā)明概述本發(fā)明解決了從在哺乳動物細(xì)胞如CHO細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)生物制品的過程產(chǎn)生的雜質(zhì)中純化基于抗體的生物制品例如LT-β -R-Ig融合蛋白的問題，使得由此產(chǎn)生的組合物無論是在蛋白質(zhì)大量生產(chǎn)還是純度方面都適合于藥物用途。如本文描述，LT-β-R-Ig融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生LT-β-R-Ig的兩種失活形式和LT-β -R-Ig聚集體。這些雜質(zhì)必須從生物活性、單體形式的LT-β -R-Ig中分離以提供足夠的純度供患者使用。LT-i3-R-Ig的失活形式對純化方法提出了獨特的挑戰(zhàn)。例如，本文描述的LT-β-R-Ig的兩種失活形式與融合蛋白的活性、單體形式十分相似， 例如，在大小和電荷方面。此外，當(dāng)擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)LT-β-R-Ig以增加產(chǎn)量時(如生產(chǎn)治療劑所需的)，將產(chǎn)生高水平的聚集的LT-β -R-Ig。因此，為了以足夠的濃度和為臨床用途所需的純度生產(chǎn)活性、單體LT-β-R-Ig融合蛋白，需要最大限度地減少聚集、最大限度地減少蛋白質(zhì)失活形式的存在和最大限度地降低LT-β-R-Ig融合蛋白損失的方法。本發(fā)明提供了這一復(fù)雜問題的解決方法。更具體地，本發(fā)明提供了在基于抗體的生物制品即免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的純化過程能去除多種產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的高分辨率疏水作用色譜(HIC)方法。本發(fā)明提供了從 Ig融合蛋白的失活形式中純化Ig融合蛋白如淋巴毒素β受體免疫球蛋白(LTiiR-Ig)的活性形式的方法。本發(fā)明另外的方面包括純化的Ig融合蛋白組合物(例如，具有其他蛋白、 折疊不當(dāng)?shù)牟痪哂型耆锘钚缘淖凅w和蛋白質(zhì)聚集體的最小污染量，其往往由蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)引起)。本發(fā)明還提供了純化蛋白質(zhì)混合物的方法，所述蛋白質(zhì)混合物例如，來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的起始原料(例如，來自生物反應(yīng)器培養(yǎng)的大量原料)，其具有多于30%的雜質(zhì)，如失活形式的蛋白和/或蛋白質(zhì)聚集體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化具有多于50%雜質(zhì)例如約35%聚集蛋白和約19%失活蛋白的起始蛋白混合物的方法。本發(fā)明包括分離生物活性淋巴毒素-β受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白與生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，包括將包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的混合物荷載到丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂上，并將所述樹脂與包含鹽梯度例如1. 6Μ至0. OM NaCl的溶液接觸以獲得包含生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液和包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。在一個實施方案中，包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第二洗脫液是通過用1.5Μ NaCl洗液沖洗HIC 樹脂獲得的。在一個實施方案中，鹽濃度是不連續(xù)梯度或連續(xù)梯度。在一個實施方案中，鹽梯度包含0. 6Μ至0. OM Na2S04。在一個實施方案中，鹽梯度是從0. 4至0. 5Na2S04的反向梯度，接著是不連續(xù)梯度和柱反萃(column strip)。在一個實施方案中，序貫Na2SO4不連續(xù)梯度首先用于去除失活-1 (沖洗組分中)，其次是活性單體LT-β -R-Ig (洗脫組分)，其次是失活-2(反萃組分)。在一個實施方案中，丁基HIC樹脂具有600至750A的孔徑。在一個實施方案中，HIC樹脂具有約8g蛋白質(zhì)/L樹脂的荷載量。在一個實施方案中，在Na2SO4 存在時HIC樹脂具有約20g蛋白質(zhì)/L樹脂的荷載量。在一個實施方案中，包含生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液包含少于2%的生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液包含少于的生物失活 LT-β-R-Ig融合蛋白。本發(fā)明提供了分離非聚集、生物活性淋巴毒素-β受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig) 融合蛋白與聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，包括將包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig 融合蛋白和聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白的混合物荷載到苯基疏水作用色譜(HIC)樹脂上， 其中樹脂具有介于約10_20g蛋白質(zhì)/L樹脂之間的荷載量和約四至31cm的床高，并將樹脂與溶液以約50至150cm/hr (厘米/小時)的流速接觸以獲得包含生物非聚集、生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液和包含聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。在一個實施方案中，將樹脂與溶液以約lOOcm/hr的流速接觸。在一個實施方案中，包含非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第一洗脫液包含少于2 %的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，包含非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液包含少于的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。本發(fā)明還提供了分離生物活性淋巴毒素-β受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白與生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟在允許生物活性LT-i3-R-Ig融合蛋白結(jié)合丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將包含生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白和生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到所述丁基樹脂上； 將丁基HIC樹脂與包含鹽梯度例如連續(xù)鹽梯度或不連續(xù)鹽梯度的溶液接觸，以獲得富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；在允許生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合第二 HIC樹脂的條件下將步驟ii)的第一洗脫液荷載到第二 HIC樹脂上；并將第二 HIC 樹脂與溶液接觸以獲得進(jìn)一步富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，從而分離生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，丁基HIC樹脂包含羥基化的甲基丙烯酸酯聚合物化學(xué)骨架。在一個實施方案中，丁基HIC樹脂具有600至750A的孔徑。在一個實施方案中，第一洗脫液包含少于2%的失活LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。在一個實施方案中，第一洗脫液包含少于1 %的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。在一個實施方案中，第二洗脫液包含少于2%的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。 在一個實施方案中，第二洗脫液包含少于1 %的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。本發(fā)明提供了用混合模式樹脂分離生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白與生物失活 LT- β -R-Ig融合蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在允許生物活性LT- β -R-Ig 融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和生物失活 LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到混合模式樹脂上。該方法還包括用溶液從混合模式樹脂上洗脫生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液，然后在允許生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將第一洗脫液荷載到HIC樹脂上；最后用溶液洗脫生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。在一個實施方案中，將混合模式樹脂與用于清除LT-β -R-Ig的失活-1形式和部分清除LT-β -R-Ig的聚集形式的洗脫前沖洗步驟接觸。此方法分離生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與生物失活LT-β -R-Ig 融合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供使用混合模式樹脂分離非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白與聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟在允許生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到混合模式樹脂上，其中混合物中多于約30%或約30%的LT-β-R-Ig融合蛋白是聚集的；用溶液從步驟i)的混合模式樹脂上洗脫生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得富集存在生物活性 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；在允許生物活性Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC) 樹脂的條件下將步驟ii)的第一洗脫液荷載到HIC樹脂上；并用溶液洗脫步驟iii)的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。在一個實施方案中，將混合模式樹脂與用于清除LT-β -R-Ig的失活-1形式和部分清除LT-β -R-Ig的聚集形式的洗脫前沖洗步驟接觸。使用此方法，可分離非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，混合模式樹脂的特征是具有離子相互作用能力和疏水相互作用能力二者。在另一實施方案中，將混合物在約5.0的ρΗ荷載到混合模式樹脂上。在又另一實施方案中，在步驟(i)之前(第一洗脫步驟之前)，用具有約7.0至7. 2的ρΗ的緩沖液例如Bis Tris或檸檬酸鈉沖洗已荷載的混合模式樹脂。在一個實施方案中，HIC樹脂是苯基樹脂，如，但不限于，苯基瓊脂糖。在一個實施方案中，用硫酸銨從苯基樹脂上洗脫生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中， 硫酸銨的濃度在 0. 3 至 0. 5Μ 范圍內(nèi)，包括 0. 31,0. 32,0. 33,0. 34,0. 35,0. 36,0. 37,0. 38、 0. 39,0. 4,0. 41,0. 42,0. 43,0. 44,0. 45,0. 46,0. 47,0. 48 和 0. 49Μ。在一個實施方案中，流速是50至150cm/hr。在一個實施方案中，流速是lOOcm/hr。在另一個實施方案中，流速是130 至 170cm/hr。本發(fā)明包括從包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β -R-Ig 融合蛋白的混合物中去除存在的至少97%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟在允許非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將混合物荷載到混合模式樹脂上；用溶液從步驟i)的混合模式樹脂上洗脫非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得富集存在非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；在允許非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將步驟ii)的第一洗脫液荷載到HIC樹脂上；并用溶液洗脫非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集存在非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。此方法可用于從包含非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，第一洗脫液包含少于25%的聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白。在另一個實施方案中，第一洗脫液包含少于20 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在又另一實施方案中，第一洗脫液包含少于15 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在又另一實施方案中， 第一洗脫液包含約10 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，第二洗脫液包含少于2 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在另一實施方案中，第二洗脫液包含少于1 % 的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。本文描述的純化方法可用于組合物，其產(chǎn)生方式以最大限度地減少LT-β-R-Ig 的不需要的形式或由基于細(xì)胞的生產(chǎn)所產(chǎn)生的其他雜質(zhì)的存在，或用于包括促進(jìn)純化的試劑的組合物。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括首先將混合物與重組蛋白 A(rProtein Α)接觸。在一個實施方案中，與重組蛋白A接觸的混合物是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液是從在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞獲得的。在一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)上清液包含非離子表面活性劑，如，但不限于，Triton X-100。在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括在將混合物荷載到混合模式樹脂之前將混合物與陰離子交換膜吸附器(adsorber)接觸。在一個實施方案中，在病毒滅活步驟(例如低PH病毒滅活)之后將混合物與陰離子交換膜吸附器接觸。在一個實施方案中，在將混合物與重組蛋白A(I^roteinA)接觸之后將混合物與陰離子交換膜吸附器接觸。本發(fā)明還提供了制備大致上富集生物活性、單體形式LT-β -R-Ig融合蛋白的純化的組合物的方法。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于50%的聚集體。在一個實施方案中，純化的組合物包含減少量的LT-β-R-Ig聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于40%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于30%的聚集體。 在另一實施方案中，純化的組合物包含少于20%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于10%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于7. 5%的聚集體。 在另一實施方案中，純化的組合物包含少于5%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于3%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于2%的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含不可檢測的量的聚集體。在另一實施方案中，純化的組合物包含減少量的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于20%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于10%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于7. 5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于4%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于3%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在另一實施方案中，純化的組合物包含不可檢測的量的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在又另一實施方案中，純化的組合物包含少于6%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活 1形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活1形式。在另一實施方案中，純化的組合物包含少于4%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活1形式。 在另一實施方案中，純化的組合物包含少于3%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在另一實施方案中，純化的組合物包含不可檢測的量的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在另一實施方案中，本發(fā)明的純化的組合物包含比存在于起始組合物中的水平減少的一種或多種聚集體形式、失活-1、和/或失活_2。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于7. 5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于7. 5%的 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于7. 5%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于5 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活_2)、和少于5 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于 3%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于3%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于3%的聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于2%的聚集的LT- β -R-Ig 融合蛋白。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些產(chǎn)物的污染水平可能不相等和以上所列的例子僅是說明性的。例如，在一個實施方案中，純化的組合物包含少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于10 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于20%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于5%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于 5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于10%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于2%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活_2)、和少于 10%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，純化的組合物包含少于5%的 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟從包含用編碼LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液；將細(xì)胞培養(yǎng)上清液與重組蛋白A(rfr0tein Α)接觸以獲得LT-β -R-Ig融合蛋白混合物；在約5. 0 的ΡΗ，使得LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將ii)的LT-β -R-Ig融合蛋白混合物荷載到混合模式樹脂上；用具有約7. 0至7. 2的ρΗ的緩沖液沖洗混合模式樹脂；將混合模式樹脂與溶液接觸以獲得富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；在允許LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將第一洗脫液荷載到HIC樹脂上；并將步驟vi)的HIC樹脂與溶液接觸以獲得進(jìn)一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。在一個實施方案中，此方法產(chǎn)生一種組合物，其中第二洗脫液包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于1 %的 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的濃度是至少300mg/L。在一個實施方案中，混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的濃度是至少800mg/L。在一個實施方案中， 混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的濃度是至少1350mg/L。在一個實施方案中，混合物的體積是至少5000L。在一個實施方案中，混合物的體積是至少10000L。在一個實施方案中，混合物的體積是至少15000L。本發(fā)明包括包含生物活性淋巴毒素-β -受體免疫球蛋白(LT-β -R-Ig)融合蛋白的組合物，其大致上無聚集體。在一個實施方案中，少于6 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是生物失活的，和少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白是聚集的。例如，在一個實施方案中，少于5% 的LT-β -R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一個實施方案中，少于3%的LT-β -R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一個實施方案中，少于的LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一個實施方案中，少于0.5%的LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含少于2%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的組合物。在一個實施方案中，少于 1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是聚集的。在一個實施方案中，少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是生物失活的，和少于的LT-β-R-Ig融合蛋白是聚集的。在一個實施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白包含IgGl同種型的Ig恒定區(qū)。在一個實施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白包含SEQ ID NO :1中所列的LT-β-R的胞外域。在一個實施方案中，本發(fā)明的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白是單體。本發(fā)明的生物活性LT- β -R-Ig 融合蛋白能結(jié)合到LTi3和能阻斷細(xì)胞中由LT β R結(jié)合到LT β所誘導(dǎo)的生物活性。在一個實施方案中，這可通過在標(biāo)準(zhǔn)體外IL-8抑制測定中LT- β -R-Ig抑制IL-8的產(chǎn)生和/或阻斷IL-8的釋放的能力來測量。例如，在一個實施方案中，將表達(dá)LT β R的細(xì)胞與LTa 1 β 2 和LT- β -R-Ig接觸，并測量LT- β -R-Ig抑制細(xì)胞釋放IL-8的能力(與適當(dāng)?shù)膶φ眨纾?結(jié)合分子不存在時相比)。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的組合物和藥學(xué)上可接受的運載體(carrier)的藥物組合物。本發(fā)明還包括包含至少97%的生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的組合物(即，缺乏失活-1、失活_2，或兩者)。本發(fā)明進(jìn)一步包括包含單體LT-β -R-Ig融合蛋白的組合物 (即，大致上(substantially)缺乏聚集體)。用本文描述的本發(fā)明方法可獲得此組合物。本發(fā)明還提供了治療自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病或多發(fā)性硬化癥的方法，包括給需要其的受試者施用藥物組合物。附圖簡述

圖1提供了循環(huán)-1-1方法的概述。圖2顯示了循環(huán)-1-1的HIC-I 丁基樹脂步驟的結(jié)果，包括LT β R-Ig融合蛋白的失活形式1和2的洗脫條件。圖3描述了使用HPLC的方法中間體(process intermediates)的概述。圖4圖解描述了丁基-650M LTi3 R-Ig純化(循環(huán)1_1)的洗脫組分中活性和失活-2的百分比。以1.65M NaCl的荷載和沖洗濃度純化LT β R-Ig。柱被荷載一式兩份的 8mg/mL樹脂。用0. 7M NaCl實施洗脫，依次收集洗脫組分(條形圖顯示了來自每一組分的數(shù)據(jù)，非累加)和測量LT β R-Ig的形式。圖5提供了循環(huán)-1-2方法的概述。圖6描述了循環(huán)1-2的不連續(xù)沖洗和梯度沖洗策略。圖7提供總結(jié)了循環(huán)-1的三種分離方法即蛋白A、HIC_1 (丁基)和HIC-2 (苯基) 后雜質(zhì)分辨率提高的表格。圖8描述了通過HIC_2(苯基)步驟清除聚集體，包括荷載、床高和流速的影響。圖 8A描述了苯基步驟后荷載對聚集體和活性LTiiR-Ig融合蛋白百分比的影響。圖8B描述了在循環(huán)-2HIC(苯基)步驟的開發(fā)中，床高和速度對活性LTiiR-Ig(活性單體)產(chǎn)率百分比的影響。圖9提供了循環(huán)-2方法的概述。圖10提供了 LT β R-Ig融合蛋白的圖解。圖IlA和圖IlB描述了混合模式柱的操作條件。圖12圖解描述了循環(huán)-2的第3柱的色譜條件。圖13提供描述在15000生產(chǎn)中修改的下游方法的主要性能特征的表格。發(fā)明詳述為了可充分理解本文描述的本發(fā)明，下面闡述詳細(xì)描述。I.定義可在本文互換使用的術(shù)語“活性”或“生物活性”是指能夠結(jié)合到其同源結(jié)合伴侶物(例如，對于受體，結(jié)合到配體)和阻斷細(xì)胞相關(guān)LTiiR與LT的結(jié)合的生物效應(yīng)的蛋白質(zhì)形式。生物活性的定義不包括對蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)或免疫反應(yīng)。生物活性可根據(jù)被表征蛋白質(zhì)的類型來確定。例如，為受體(或其可溶性形式)的蛋白質(zhì)，如果其可結(jié)合到其各自的配體則可顯示為生物活性的。可選擇地，蛋白質(zhì)可被蛋白質(zhì)的活性形式特異性的抗體結(jié)合。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)的生物效應(yīng)可以使用基于細(xì)胞的測定來測量。這種測定是本領(lǐng)域所熟知的(例如，LT β R活性可以使用標(biāo)準(zhǔn)IL-8抑制測定來確定)。
術(shù)語“失活”或“生物失活”是指不能結(jié)合到其同源結(jié)合伴侶物上，因此，不能改變系統(tǒng)中的生物反應(yīng)或其結(jié)合親和力不足以導(dǎo)致生物反應(yīng)的蛋白質(zhì)。例如，在一個實施方案中，就受體或其可溶形式來說，受體的失活形式不能結(jié)合到配體，從而不能介導(dǎo)活性形式的生物活性。在另一實施方案中，受體的失活形式可結(jié)合到配體，例如，以降低的親和力，但是不導(dǎo)致適當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)，或(當(dāng)是可溶形式時)不充分阻斷通過受體的基于細(xì)胞的形式和其配體結(jié)合而轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物信號。如本文使用的短語“活性單體”是指非聚集的和包含通過二硫鍵連接的 LT-β-R-Ig的兩條鏈的生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白。在圖11中提供了活性單體的一個實例。因此，單體是非聚集的雙鏈Fc融合蛋白。術(shù)語“聚集體”是指錯誤折疊、剛性蛋白質(zhì)群組或高分子量物質(zhì)(包括蛋白質(zhì)的多聚體)。在一個實施方案中，聚集體是指LT- β -R-Ig單體的多聚體形式，其包含多于兩條鏈的Fc融合蛋白，例如，二聚體或更高階的多聚體形式(四聚體、八聚體)。聚集體可以是生物活性的或失活的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文可互換使用，是指各種長度的氨基酸序列，以其中性(不帶電)形式或作為鹽，及未修飾或由糖基化修飾、側(cè)鏈氧化修飾或磷酸化修飾。在某些實施方案中，氨基酸序列是全長天然蛋白質(zhì)。在其他實施方案中，氨基酸序列是全長蛋白的較小的片段。在其他實施方案中，氨基酸序列編碼嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白分子的至少一部分和第二、非-免疫球蛋白分子的至少第二一部分。在一個實施方案中， 非免疫球蛋白分子包含分子的生物活性部分，例如配體的受體結(jié)合部分或受體的配體結(jié)合部分，例如TNF受體或其片段。術(shù)語“融合蛋白，，是指包含通過其各自肽主鏈由共價鍵連接的兩種或多種蛋白質(zhì)或其片段的分子，更優(yōu)選地通過編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸分子的遺傳表達(dá)來產(chǎn)生。在優(yōu)選實施方案中，融合蛋白包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“淋巴毒素-β-受體”或“LTi3R”是指結(jié)合到由淋巴毒素α和β鏈的三聚復(fù)合體組成的表面淋巴毒素(LT) (Crowe等人，1994)及配體LIGHT(與淋巴毒素同源，顯示誘導(dǎo)型表達(dá)，及與單純皰疹病毒糖蛋白D競爭T淋巴細(xì)胞表達(dá)的受體HVEM)的受體TNF家族的成員。LT-β-R牽涉在外周免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟免疫系統(tǒng)中淋巴結(jié)和脾中事件的調(diào)節(jié)中(Ware 等人，1995 ；Mackay 等人，1997 ；Rennert 等人，1996 ；Rennert 等人，1997 ；Chaplin 和 Fu，1998)。在一個實施方案中，LT β R-免疫球蛋白(LTiiR-Ig)融合蛋白包含LT β R的胞外域的配體-結(jié)合部分和IgG恒定區(qū)，例如，Ig的Fc部分。LT β R-Ig融合蛋白可阻斷表面LT 配體和LT β R之間的信號，并影響濾泡樹突狀細(xì)胞的功能狀態(tài)(Mackay和Browning 1998)。 此阻斷可進(jìn)而導(dǎo)致嚙齒動物模型中自身免疫性疾病減少(Mackay等人，1998，于1995年7 月21日提交的美國專利申請序列號08/505，606和1996年10月沈日提交的美國專利申請序列號60/029, 060)。LT β R的序列在SEQ ID NO 1中提供人類LT β R 序列(PUBMED ΑΑΗ26262 和 P36Ml)1 MLLPffATSAP GLAffGPLVLG LFGLLAASQP QAVPPYASEN QTCRDQEKEY YEPQHRICCS61 RCPPGTYVSA KCSRIRDTVC ATCAENSYNE HWNYLTICQL CRPCDPVMGL EEIAPCTSKR121 KTQCRCQPGM FCAAffALECT HCELLSDCPP GTEAELKDEV GKGNNHCVPC KAGHFQNTSS
181 PSARCQPHTR CENQGLVEAA PGTAQSDTTC KNPLEPLPPE MSGTMLMLAV LLPLAFFLLL241 ATVFSCIffKS HPSLCRKLGS LLKRRPQGEG PNPVAGSffEP PKAHPYFPDL VQPLLPISGD301 VSPVSTGLPA APVLEAGVPQ QQSPLDLTRE PQLEPGEQSQ VAHGTNGIHV TGGSMTITGN361 IYIYNGPVLG GPPGP⑶LPA TPEPPYPIPE E⑶PGPPGLS TPHQEDGKAff HLAETEHCGA421 TPSNRGPRNQ FITHD(SEQID NO 1)在一個實施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白可包括人類LT-β-R-Ig胞外域的全部或片段(例如，其可包括人類LT- β -R的殘基40-200,35-200,40-210 ；35-220,32-225或 28-225) 0在一些實施方案中，LT-β-R融合蛋白包括LT-β-R分子的胞外域如SEQ ID NO: 1的殘基32-225所示?？砂ㄔ诒景l(fā)明的方法和組合物中的LTiiR-Ig融合蛋白的實例如下面(SEQ ID NO 2)所列MLLPWATSAPGLAWGPLVLGLFGLLAA AVPPYASENQTCRDQEKEYYEPQHRICCSRCPPGTYVSAK CSRIRDTVCATCAENSYNEHWNYLTICQLCRPCDPVMGLEEIAPCTSKRKTQCRCQPGMFCAAffALECTHCELLSDC PPGTEAELKDEVGKGNNHCVPCKAGHFQNTSSPSARCQPHTRCENQGLVEAAPGTAQSDTTCKNPLEPLPPEMSGTM V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN
WYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(斜體的氨基酸表示信號序列；帶下劃線的氨基酸表示來源于LT-β-R的胞外域的序列；黑體的氨基酸表示IgG Fc序列。連接LT-β-R序列和IgG-Fc序列的纈氨酸是人工的，及非來源于LT- β -R或IgG-Fc序列。帶下劃線的序列是LT- β -R胞外域的實質(zhì)部分， 并相應(yīng)于SEQ ID NO :1的氨基酸32至225)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物中所使用的LT-β-R融合蛋白包括SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列而無信號序列。“表面LT配體”是指可特異性地結(jié)合到LT β R的表面LT復(fù)合物或其衍生物。如本文使用的術(shù)語“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“配體結(jié)合部分”是指天然受體(例如， 細(xì)胞表面受體)或其保留至少定性配體結(jié)合能力的區(qū)域或衍生物，優(yōu)選地保留相應(yīng)天然受體的生物活性。術(shù)語“免疫球蛋白融合蛋白”是指多肽的功能部分(通常包含細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的胞外域)與免疫球蛋白恒定區(qū)的一個或多個部分例如CHI、CH2或CH3域或其組合的融合體。在一個實施方案中，多肽是受體TNF家族的成員。Ig分子的部分可來源于各種免疫球蛋白同種型的任一種，包括，例如，IgGU IgG2、IgM、IgA等。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物中使用的蛋白質(zhì)是免疫球蛋白融合蛋白。例如，融合蛋白可包含受體或其配體結(jié)合部分，和二聚化結(jié)構(gòu)域，例如Fc結(jié)構(gòu)域。通用術(shù)語“免疫球蛋白”包含5個不同類的可生化區(qū)分的抗體。明顯地抗體的所有5類都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，下面的討論將一般地針對免疫球蛋白分子的IgG類。短語“受體TNF家族”是指無論是天然細(xì)胞膜結(jié)合還是分泌(如就骨保護(hù)素而言) 的受體，其具有典型的TNF家族半胱氨酸橋接模式，或結(jié)合到配體TNF家族的確定成員的任何受體(例如，Banner等人1993)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及由本文討論的方法獲得的TNF家族受體-Ig融合體、及包含它們的藥物制劑。如本文使用的術(shù)語“大約”和“約”是關(guān)于通常包括落入該數(shù)字的任一方向10%范圍內(nèi)的數(shù)字(多于或少于該數(shù)字)，除非另外指明或上下文中另有證明(除了此數(shù)字超過可能值100% )。II.分離不同形式的失活和/或聚集的^融合蛋白本發(fā)明涉及通過分離蛋白質(zhì)的活性形式與失活形式和/或分離蛋白質(zhì)的活性形式與聚集體，產(chǎn)生純化的活性形式的免疫球蛋白(Ig)融合蛋白包括LTiiR-Ig融合蛋白的能力。盡管已知Ig融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可產(chǎn)生多種形式的失活I(lǐng)g融合蛋白，污染程度和充分純化融合蛋白的方法是未知的。更具體地，本領(lǐng)域教導(dǎo)了 LTiiR-Ig 融合蛋白以兩種形式在猴cos細(xì)胞或中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)。教導(dǎo)了一種形式以高親和力與配體結(jié)合，“活性”形式，而教導(dǎo)了另一種“失活”形式不結(jié)合配體(美國專利申請 20020039580)。然而認(rèn)識到，以前未知實際上LT β R-Ig融合蛋白有兩種不同的失活形式 (失活-ι和失活- ，因此，以前沒有開發(fā)最大限度地減少制品中這些失活形式的兩者(失活-1和失活-2)存在的方法。例如，如下面實施例所描述，哺乳動物表達(dá)LT β R-Ig融合蛋白產(chǎn)生活性LT β R-Ig融合蛋白混合物，該混合物包含LT β R-Ig融合蛋白的第一失活形式 (本文稱為“失活-1”，其可被看作圖3荷載HIC-I的HIC-HPLC圖中主峰之前的第一個肩)， 和LT β R-Ig融合蛋白的第二失活形式(本文稱為“失活_2”，其可被看作圖3荷載HIC-I 的HIC-HPLC圖中主峰之后的肩)，以及LT β R-Ig的聚集形式。本發(fā)明涉及從失活的多種形式和/或Ig融合蛋白及蛋白質(zhì)聚集體中分離所需的 LT^R-Ig的活性、單體形式。本發(fā)明的方法依賴于不同類型的色譜的組合，例如，疏水作用色譜(HIC)，以有效減少混合物中失活形式(包括兩種形式)和/或聚集Ig融合蛋白百分比。本發(fā)明提供了分離含有生物活性免疫球蛋白(Ig)融合蛋白、失活I(lǐng)g融合蛋白和聚集體的混合物的方法。在一個方面，通過包含混合模式樹脂的第一步驟，接著通過苯基 HIC步驟實現(xiàn)分離。本發(fā)明方法中第一步驟包括在允許生物活性Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將混合物與混合模式樹脂接觸。應(yīng)該注意的是，有利于混合模式樹脂結(jié)合活性Ig融合蛋白的條件可能也有利于雜質(zhì)結(jié)合。因此，沖洗條件和洗脫條件可用于分離雜質(zhì)與生物活性Ig融合蛋白。例如，為了純化活性LT-i3-R-Ig，將蛋白質(zhì)混合物荷載到混合模式樹脂后，某些洗脫前沖洗條件和洗脫條件可用于分離活性LT-β -R-Ig與失活1。在下面實施例中提供了此沖洗/洗脫條件的實例。然后從第一混合模式樹脂步驟洗脫生物活性 Ig融合蛋白，從而獲得洗脫液。純化方法的第二步驟包括在允許生物活性Ig融合蛋白結(jié)合HIC樹脂的條件下將第一步驟的洗脫液與疏水作用色譜(HIC)樹脂接觸。然后洗脫活性Ig融合蛋白。由此產(chǎn)生的溶液包括已從Ig融合蛋白的兩種失活形式和蛋白質(zhì)聚集體中分離的生物活性Ig融合蛋白。在優(yōu)選實施方案中，HIC樹脂是苯基樹脂，例如苯基瓊脂糖。關(guān)于用苯基步驟純化LT- β -R-Ig融合蛋白，如在下面實施例中更詳細(xì)地描述，產(chǎn)物(活性LT- β -R-Ig融合蛋白)、聚集體、失活-2都在荷載后結(jié)合到苯基柱，但使用適當(dāng)?shù)臎_洗/洗脫條件則分離。洗脫條件可導(dǎo)致聚集體和失活-2優(yōu)先地保留在柱上，而LT- β -R-Ig產(chǎn)物洗脫成純化形式。
分離活性Ig融合蛋白與失活形式和/或聚集體的一種方法包括在允許生物活性 Ig融合蛋白結(jié)合丁基樹脂的條件下將包含生物活性Ig融合蛋白和生物失活I(lǐng)g融合蛋白的混合物與丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂接觸。應(yīng)該注意的是，有利于丁基樹脂結(jié)合活性 Ig融合蛋白的條件可能也有利于雜質(zhì)結(jié)合。因此，沖洗條件和洗脫條件可用于分離雜質(zhì)與生物活性Ig融合蛋白。例如，為了純化活性LT-i3-R-Ig，將蛋白質(zhì)混合物荷載到丁基樹脂后，某些洗脫前沖洗條件和洗脫條件可用于分離活性LT-β -R-Ig與失活形式。失活-1可通過降低NaCl濃度沖洗掉?；钚訪T- β -R-Ig和聚集體可通過進(jìn)一步降低NaCl濃度洗脫， 而失活-2仍結(jié)合在柱上直到用水(無NaCl)才脫落。在下面實施例中提供了此沖洗/洗脫條件的實例。洗脫生物活性Ig融合蛋白后，隨后將洗脫液與第二 HIC樹脂接觸，使得生物活性 Ig融合蛋白結(jié)合第二 HIC樹脂。洗脫生物活性Ig融合蛋白后，由此產(chǎn)生的溶液包括從失活形式和/或聚集體中分離的生物活性Ig融合蛋白。在一個實施方案中，丁基HIC樹脂包含羥基化的甲基丙烯酸酯骨架?？蛇x擇地，使用苯基HIC步驟的組合可實現(xiàn)本發(fā)明的純化方法。關(guān)于LT-β -R-Ig 融合蛋白，生物活性LT-β-R-Ig、失活形式(例如失活-1和失活-2)和聚集體各自結(jié)合到苯基樹脂。因此，使用合適的沖洗和洗脫緩沖液的組合可純化活性LT- β -R-Ig。本發(fā)明的一個重要方面是從蛋白質(zhì)的兩種失活形式及蛋白質(zhì)聚集體中純化生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白。這些雜質(zhì)從LT-β -R-Ig融合蛋白生產(chǎn)中產(chǎn)生，特別是在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生，但可根據(jù)本文描述的純化步驟減少。本發(fā)明提供了分離包含生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白、失活LTi3 R-Ig融合蛋白和聚集體的混合物的方法。在一個方面，通過包含混合模式樹脂的第一步驟，接著苯基HIC步驟實現(xiàn)分離。方法中的第一步驟包括在允許生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將混合物與混合模式樹脂接觸。應(yīng)該注意的是，有利于混合模式樹脂結(jié)合活性 Ig融合蛋白的條件可能也有利于雜質(zhì)結(jié)合。因此，沖洗條件和洗脫條件可用于分離雜質(zhì)與生物活性Ig融合蛋白。然后從第一混合模式樹脂步驟洗脫生物活性LT β R-Ig融合蛋白，從而獲得洗脫液。在一個實施方案中，來自混合模式樹脂的洗脫液具有顯著減少的量的 LT β R-Ig融合蛋白的失活-1形式，即第一洗脫液包含少于2%、少于或少于0.5%的 LT β R-Ig融合蛋白的失活1形式。此外，取決于色譜條件，聚集體可能從荷載中的觀％減少到洗脫液中的8%。純化方法的第二步驟包括在允許生物活性LTiiR-Ig融合蛋白(其可能還包括雜質(zhì))結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下，將第一步驟的洗脫液與HIC樹脂接觸。然后洗脫活性LT β R-Ig融合蛋白，使得LT β R-Ig融合蛋白的失活-2形式和蛋白質(zhì)聚集體都顯著減少。在一個實施方案中，來自HIC樹脂的洗脫液具有顯著減少的量的 LTi3 R-Ig融合蛋白的失活-2形式，即第一洗脫液包含少于2%、少于或少于0. 5%的 LT β R-Ig融合蛋白的失活2形式。由此產(chǎn)生的溶液包含已從LT β R-Ig融合蛋白的兩種失活形式和蛋白質(zhì)聚集體中分離的生物活性LTiiR-Ig融合蛋白。在優(yōu)選實施方案中，HIC樹脂是苯基樹脂，例如苯基瓊脂糖。分離活性Ig融合蛋白與失活形式和/或聚集體的另一方法包括在允許生物活性 Ig融合蛋白結(jié)合丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將包含生物活性Ig融合蛋白和生物失活I(lǐng)g融合蛋白的混合物與丁基樹脂接觸。然后洗脫生物活性Ig融合蛋白并收集第一洗脫液。隨后將洗脫液與第二HIC樹脂接觸，使得生物活性Ig融合蛋白結(jié)合第二 HIC樹脂。 洗脫生物活性Ig融合蛋白后，由此產(chǎn)生的溶液包含從失活形式和/或聚集體中分離的生物活性Ig融合蛋白。在一個實施方案中，丁基HIC樹脂包含羥基化的甲基丙烯酸酯骨架。還具有特征是從包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白質(zhì)聚集體的混合物中去除至少97%的蛋白質(zhì)聚集體的方法。該方法基于上面色譜步驟的組合，例如，HIC苯基或混合模式/HIC苯基。在一個實施方案中，該方法包括在允許生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合苯基HIC或混合模式樹脂的條件下將混合物與苯基HIC樹脂或混合模式樹脂接觸， 隨后從苯基HIC或混合模式樹脂中洗脫生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以獲得第一洗脫液。 第一洗脫液具有減少量的蛋白質(zhì)聚集體，包括少于25%的蛋白質(zhì)聚集體、少于20%的蛋白質(zhì)聚集體、少于15%的蛋白質(zhì)聚集體或約10%的蛋白質(zhì)聚集體。在一個實施方案中，第一 HIC步驟后，在允許生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合HIC樹脂的條件下可將洗脫液與第二樹脂例如苯基HIC接觸。洗脫生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得包括少于2%的蛋白質(zhì)聚集體或少于的蛋白質(zhì)聚集體的第二洗脫液。該方法導(dǎo)致至少97%的蛋白質(zhì)聚集體從包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白聚集體的初始混合物中去除。本文描述的方法的特別優(yōu)勢是當(dāng)50%的起始原料包含不需要的失活和聚集物質(zhì)時，各種方法可用于純化產(chǎn)物，例如LT- β -R-Ig融合蛋白。在一個實施方案中，混合模式樹脂(例如Capto MMC)步驟能夠?qū)⒕奂w從減少至8%，循環(huán)-2苯基柱能夠?qū)⒕奂w從24%減少至< 1.0%。本發(fā)明的另一方面是制備包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的組合物的方法。 如本文以上闡述，在一個說明性實施方案中，組合物包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2蛋白)、和少于的蛋白質(zhì)聚集體。該方法基于提供失活I(lǐng)g融合蛋白和蛋白質(zhì)聚集體的去除的色譜步驟的某些組合。該方法包括從包含用編碼LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA 轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液。表達(dá)后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液與重組蛋白A(rfr0tein Α)接觸以獲得LT-i3-R_Ig融合蛋白混合物。在允許活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合樹脂的條件下將LT-β -R-Ig融合蛋白混合物與疏水作用色譜 (HIC)樹脂接觸。洗脫活性LT-i3-R-Ig融合蛋白后，在允許活性LT-i3-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將洗脫液與第二 HIC樹脂接觸。在一個實施方案中，洗脫活性LT- β -R-Ig融合蛋白后，洗脫液含有少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2蛋白)、和少于的蛋白質(zhì)聚集體。在一個實施方案中，該發(fā)明涉及包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式 (失活-2蛋白)、和少于的蛋白質(zhì)聚集體的組合物。在一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)的LT-β-R-Ig融合蛋白的基于苯基的純化包括不連續(xù)洗脫，從而柱上荷載IM硫酸銨并以0. 44Μ洗脫。LTBR-Ig的聚集體和失活_2形式比產(chǎn)物洗脫得“晚”些。在一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)的LT-β-R-Ig融合蛋白的基于丁基的純化包括，通過不連續(xù)降低NaCl濃度，在荷載柱后沖洗失活-ILT-β -R-Ig融合蛋白。然后，為了丁基洗脫，NaCl濃度進(jìn)一步不連續(xù)降低，導(dǎo)致產(chǎn)物(和聚集體)洗脫而失活-2不被洗脫。最終通過降低NaCl鹽濃度至0將失活-2從丁基柱上剝離。LT-β -R-Ig融合蛋白的活性和失活形式可根據(jù)本領(lǐng)域已知的大量參數(shù)的任一種確定，包括結(jié)合到LT配體。在一個實施方案中，可測量結(jié)合相互作用的親和力。在另一實施方案中，在本領(lǐng)域已知的測量LT- β -R分子引起生物反應(yīng)的能力的體外測定諸如IL-8抑制測定可用于從生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白中區(qū)分生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白。例如，在一個實施方案中，IL-8釋放測定基于IL-8分泌，在可溶性重組人類淋巴毒素α 1 β 2結(jié)合到Α375細(xì)胞(人類黑素瘤細(xì)胞系)上的細(xì)胞表面淋巴毒素β受體后可觀察到IL-8分泌。IL-8釋放測定測量結(jié)合分子(例如LT-β -R-Ig)通過結(jié)合到可溶淋巴毒素α 1β 2，阻止其結(jié)合到淋巴毒素β受體而阻斷此IL-8分泌的能力。然后用ELISA測定測量分泌到培養(yǎng)基上清液的IL-8。稀釋結(jié)合分子至適當(dāng)?shù)臐舛炔⑴c可溶性重組人類淋巴毒素α 1 β 2 (170ng/ml)在室溫在96-孔微孔板上孵育1小時。通過確定IL-8釋放的最大量的滴定實驗優(yōu)化淋巴毒素α1β2的濃度。然后向每孔加入2萬Α375細(xì)胞，將微孔板在 37°C、5%C02條件下孵育17小時。在孵育期結(jié)束時，將微孔板離心和收集上清液。用標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA測定檢測上清液的IL-8濃度。將IL-8濃度對抗體濃度繪圖，從數(shù)據(jù)的4-參數(shù)曲線擬合確定IC50。通常，如果抑制百分比在對照參考的75% -135%之間，則認(rèn)為LT-β-R-Ig融合蛋白在IL-8抑制測定中是活性的。可選擇地，可使用對活性形式或失活形式特異的抗體來確定LT-β -R-Ig融合蛋白的活性和失活形式。對LT-β -R-Ig融合蛋白的活性或功能形式特異的抗體(不能結(jié)合失活形式的抗體)的實例包括AGHl (由雜交瘤AG. Hl. 5.1產(chǎn)生；ATCC登錄號HB11796)和BDA8(產(chǎn)生小鼠抗-人類LT-^-R mAb BDA8的雜交瘤細(xì)胞系(BD.A8.AB9)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在1995年1月12日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) (Rockville, Md.)，指定ATCC登錄號是HB11798)，其每一個在美國專利申請 20020197254、美國專利申請20020039580和美國專利第7，001, 598號中描述，其每一個在此通過引用并入。此外，可根據(jù)本文描述的色譜步驟通過它們的洗脫性質(zhì)表征活性和失活蛋白。例如，使用丁基HIC柱，在1.55M NaCl的第一沖洗中將LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-1形式洗脫。用0. 7Μ NaCl作為洗脫緩沖液將LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白質(zhì)聚集體從柱上洗脫，用純水的反萃沖洗將LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式洗脫。如下述的實施例更詳細(xì)描述，用硫酸鈉代替氯化鈉的不連續(xù)梯度可實現(xiàn)類似的純化。應(yīng)該注意的是，使用大規(guī)模生產(chǎn)過程可實施上述的方法。例如，本文描述的方法可用于從具有至少5000L、至少10000L、至少15000L、15000L或大于15000L的體積的混合物中有效分離雜質(zhì)。此外，可調(diào)整某些柱參數(shù)以最大限度地回收蛋白。在一個實施方案中，方法的第二 HIC步驟包括具有25-35厘米之間、四至30cm、或約30厘米的柱高的柱。應(yīng)該理解的是，使用本文描述的方法獲得的組合物也涵蓋于本發(fā)明中。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含生物活性Ig融合蛋白例如LT-β-R-Ig融合蛋白的組合物，其中少于10%的Ig融合蛋白是生物失活的。在另一實施方案中，少于5%的Ig融合蛋白是生物失活的；少于的Ig融合蛋白是生物失活的；或少于0.5%的Ig融合蛋白是生物失活的。還描述了包含聚集體水平減少的組合物，包括包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和少于2%的蛋白聚集體的組合物。
HL餼譜技術(shù)本發(fā)明的分離方法可對多肽未純化群體(例如，培養(yǎng)上清液或從原核包涵體中分離的Ig融合蛋白的制品)實施。獲得此培養(yǎng)上清液的方法在下面IV部分更詳細(xì)地描述。 可選擇地，本分離方法可用于一種或多種初始選擇或純化步驟后獲得的多肽混合物，例如， 從親和基質(zhì)例如蛋白A洗脫包含失活和活性形式的制品后。在優(yōu)選實施方案中，本文描述的色譜步驟可應(yīng)用于已通過其他蛋白質(zhì)純化方案部分純化的混合物。如本文使用的術(shù)語“部分純化”包括一種蛋白制品，其中按重量計感興趣的Ig融合蛋白以至少5%的濃度存在、按重量計更優(yōu)選地至少10%和最優(yōu)選地至少 45%。初始或后續(xù)純化的步驟可用于去除，例如，免疫球蛋白聚集體、錯誤折疊物質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白、來自前面的色譜步驟的殘留物質(zhì)(如蛋白A，當(dāng)使用時)。因此，本文描述的具體色譜步驟的應(yīng)用還可在整體純化方案的上下文中理解?？捎糜诩兓盎蛑蟮牡湫偷募兓襟E包括親和色譜(例如，由蛋白A共價結(jié)合到受控孔玻璃組成的PROSEP- A (BioProcessing Ltd.，U. K)、或蛋白 A SEPHAROSE FastFlow(Pharmacia)或 T0Y0PEARL 650M蛋白A(TosoHaas))。蛋白A優(yōu)選用于人類γ1、γ2或Y 4重鏈，蛋白G優(yōu)選用于小鼠同種型。Bakerbond ABXtm樹脂可用于如果分子包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況。可用于本發(fā)明的方法中的色譜的一個實例是混合模式色譜。優(yōu)選的混合模式樹脂是具有在30mS/cm多于45mg BSA/ml介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力和為多模式弱陽離子交換劑的一種混合模式樹脂?？梢允褂玫幕旌夏Ｊ綐渲膶嵗荂apto MMC (GE Healthcare)?？梢允褂玫纳V的實例是疏水作用色譜或HIC。如本文使用的術(shù)語“HIC”是指使用柱和Ig融合蛋白之間的疏水相互作用以分離蛋白質(zhì)的失活形式和其他污染物如聚集體與再折疊產(chǎn)物即生物活性Ig融合蛋白的疏水作用色譜。疏水作用色譜最早是在觀察到蛋白質(zhì)可保留在包含碳?xì)浠衔镩g隔臂但缺乏親和配體的親和凝膠上之后發(fā)展起來的。從HIC支持物上洗脫可通過改變?nèi)軇?、pH、離子強(qiáng)度，或通過添加離液劑或有機(jī)改性劑如乙二醇或丙二醇來實現(xiàn)?？稍诶缑绹鴮＠?3，917，527號和美國專利第4，000, 098號中找到疏水作用色譜的一般原則的描述。在高效液相色譜(HPLC)范圍內(nèi)的HIC已經(jīng)用于在單步驟方案中，從完整的抗體分子分離缺乏重鏈部分的抗體片段(例如 F(ab' )2) (Morimoto, K.等人，L Biochem. Biophys. Meth. 24 107(1992))。離子交換色譜也可以用于本發(fā)明的方法中。在這方面，各種陰離子或陽離子取代基可連接到基質(zhì)以形成色譜的陰離子或陽離子支持物。陰離子交換取代基包括二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(Q)基團(tuán)。陽離子交換取代基包括羧甲基(CM)、 磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)和磺酸基(S)。纖維素離子交換樹脂如DE23、DE32、 DE52、CM-23、CM-32 和 CM-52 可從 U. K, Kent, Maidstone 的 Whatman Ltd.得到。還已知基于SEPHADEX 和低交聯(lián)的離子交換物。例如DEAE-、QAE-、CM-、和SP-SEPHADEX 和 DEAE-、Q-、CM-和 S- SEPHAROSE 禾口SEPHAROSE Fast Flow 都可從 Pharmacia AB得到。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物如T0Y0PEARL DEAE-650S 或 M 禾口 T0Y0PEARLCM-650S 或 M 可從 Toso Haas Co.，Philadelphia, Pa 得到。疏水相互作用在高離子強(qiáng)度時最強(qiáng)，因此，鹽沉淀或離子交換方案后方便地實施此種形式的分離。高鹽濃度對蛋白質(zhì)吸附到HIC柱有利，但是取決于蛋白質(zhì)和所選特定HIC配體的性質(zhì)，實際濃度可在很寬的范圍內(nèi)變化。各種離子可劃分到所謂的soluphobic系列，取決于它們是否增強(qiáng)疏水相互作用(鹽析效應(yīng))或破壞水的結(jié)構(gòu)(離液效應(yīng))和導(dǎo)致疏水相互作用弱化。陽離子按鹽析效應(yīng)增加排列為Ba++ < Ca++ < Mg++ < Li+ < Cs+ < Na+ < K+ < Rb+ < NH4+,而陰離子可按離液效應(yīng)增加排列為PO一 < SO4- < CH3COOO- < CF < Br— < NO3-< ClO4-< I-< SCN—。HIC色譜可用于結(jié)合和洗脫模式?？蛇x擇地，HIC可用于流通模式。通常，Na、K或NH4的硫酸鹽有效增強(qiáng)HIC中配體-蛋白質(zhì)相互作用。鹽可根據(jù)如下列給出的影響相互作用強(qiáng)度的關(guān)系來配制(NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN。通常，約0. 75和約2M之間的硫酸銨或約1和4M之間的NaCl的鹽濃度是有用的。在一個實施方案中，0.3至0.6M Na2SO4用于結(jié)合LT β R-Ig融合蛋白到HIC。從HIC的 N. B洗脫還可在低于本文所述的鹽濃度例如少于0. 3Na2S04實現(xiàn)。在一個實施方案中，0. 0 至0. 5M硫酸銨用于洗脫蛋白質(zhì)產(chǎn)物，包括但不限于0. 3至0. 5M硫酸銨。可加入的另外的純化方案包括但不必限于進(jìn)一步離子交換色譜、尺寸排阻色譜、 病毒滅活、濃縮和冷凍干燥、羥磷灰石色譜、凝膠電泳、透析、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠色譜、肝素SEQHAR0SE 色譜、色譜聚焦、PEG沉淀或硫酸銨沉淀。見于本發(fā)明的實施方案中的另外的純化步驟包括陽離子交換膜過濾(例如，用Q 膜吸附器純化蛋白質(zhì)制品)。在一些實施方案中，用Q膜吸附器純化蛋白質(zhì)在PH 6.2以上和高電導(dǎo)率的溶液中實施。如本文使用的“高電導(dǎo)率”是指約50mS/cm或更高的電導(dǎo)率。若干色譜支持物可在柱制備中使用，最廣泛使用的是瓊脂糖、二氧化硅和有機(jī)聚合物或共聚樹脂。疏水作用材料是疏水性配體(例如，烷基或芳基)偶合的基礎(chǔ)基質(zhì)(例如，親水性碳水化合物(如交聯(lián)瓊脂糖)或合成的共聚物材料)。在一個實施方案中，HIC材料包含苯基取代的瓊脂糖樹脂。典型的HIC材料包括具有低或高取代的苯基SEPHAR0SE ， FAST FLOW(GE Healthcare ；Pharmacia LKB Biotechnology, AB，瑞典)；苯基 SEPHAR0SE 高性能柱；苯基或丁基-SEPHAROSE CL-4B，丁基-SEPHAROSE FF，辛基 SEPHAROSE FF 和苯基-SEPHAROSE FF (Pharmacia LKBBiotechnology ABJi^ 典)；FractogelTM EMD 丙基或 FRACT0GEL EMC 苯基柱(E.Merck，德國)；MACR0PREP 甲基或 MACR0-PREP 叔丁基支持物(Bio-Rad，加利福尼亞)；WP HI-丙基(C3) 柱(J.T.Baker， 新澤西)。典型的HIC材料還可從以下獲得日本東京的Tosoh公司，產(chǎn)品名稱T0Y0PEARL 醚 650、苯基 650、丁基 650 (EMD Merck)、丁基 600 (EMDMerck)、醚-5PW-HR 或苯基-5PW-HR ； 以色列雷霍沃特的Miles-Yeda，產(chǎn)品名烷基-瓊脂糖，其中烷基包括從2_10個碳原子；和新澤西菲利普斯堡的J.T.Baker，商品名Bakerbond WP-HI-丙基。用傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)制備所需的HIC柱也是可能的(參見例如，Er-el.Z.等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 49 383(1972)或 Ulbrich，V.等人 Coll. Czech. Chem. Commum. 9 1466 (1964))。特定凝膠的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。通常蛋白質(zhì)和配體的相互作用力隨著烷基配體的鏈長的增加而增加，但具有約4至約8碳原子的配體適合于大多數(shù)分離。苯基與戊基具有大約相同的疏水性，雖然由于Pi-Pi軌道與蛋白質(zhì)上的芳香基相互作用的可能性而選擇性不同。選擇性還可受支撐樹脂的化學(xué)性質(zhì)影響。配體密度是一個重要的參數(shù)，因為其不僅影響相互作用的強(qiáng)度和特異性還影響柱容量。市場上可得到的苯基或辛基苯基凝膠的配體密度是大約40皮摩爾/ml凝膠床的級別。凝膠容量是所考慮的特定蛋白以及PH、溫度和鹽的類型和濃度的函數(shù)，但通常可預(yù)計落入3-20mg/ml凝膠的范圍。通常，溫度降低使得與色譜材料的相互作用降低。然而，由提高溫度產(chǎn)生的任何益處也必須與這種增加對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性可能具有的不良反應(yīng)相權(quán)衡。在一個實施方案中，Ig融合蛋白可同步洗脫。在同步洗脫中，開始時，所有的化合物開始在柱中遷移。然而，每種遷移的速率不同，導(dǎo)致較快或較慢的洗脫率。在另一實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可結(jié)合到柱上并洗脫，例如，使用分階洗脫或梯度洗脫。無論是分階洗脫還是梯度形式的洗脫可以各種方式完成(a)通過改變鹽濃度， (b)通過改變?nèi)軇┑臉O性或(c)加入洗滌劑。通過降低鹽的濃度，吸附的蛋白質(zhì)按照疏水性增加的順序洗脫。極性的變化可受添加溶劑如乙二醇或丙二醇或(異)丙醇的影響，從而降低了疏水作用的強(qiáng)度。洗滌劑可起蛋白質(zhì)的置換劑的作用，可主要用在膜蛋白質(zhì)純化方面。在進(jìn)行分離時，多肽混合物可與色譜材料接觸例如，使用分批純化技術(shù)或使用柱。 純化之前可能期望去除任何離液劑或非常疏水的物質(zhì)，例如將混合物通過預(yù)層析柱。例如，對于分批純化，將色譜材料在所需的起始緩沖液中制備或平衡。獲得材料的漿液。將多肽溶液與漿液接觸以吸附至少一種要分離的多肽到色譜材料。將包含不結(jié)合到色譜材料的多肽的溶液從漿液中分離，例如，通過允許漿液沉淀和去除上清。漿液可經(jīng)受一個或多個沖洗步驟。如果需要的話，漿液可與較低導(dǎo)電率的溶液接觸以解吸附已結(jié)合到HIC 材料的多肽。為了洗脫結(jié)合的多肽，鹽濃度可降低。在一個實施方案中，色譜材料可裝在柱中。包含要分離的多肽的混合物可施加到柱，允許至少一種要分離的多肽吸附到柱上。不吸附到柱上的多肽穿過柱并可被收集。為了洗脫結(jié)合的多肽，鹽濃度可降低，例如以逐步方式或使用包括連續(xù)或不連續(xù)鹽梯度的鹽梯度通過差別解吸附實現(xiàn)結(jié)合物質(zhì)的分離。本文進(jìn)一步描述已被鑒定為有效分離Ig融合蛋白的失活形式和/或蛋白質(zhì)聚集體的特定色譜組合。IV. Ig融合蛋白的表達(dá)本發(fā)明的方法用于純化首先使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的Ig 融合蛋白的混合物。簡單地說，通常將編碼Ig融合蛋白的核酸插入表達(dá)載體以引入可用于生產(chǎn)所需量多肽的宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)而根據(jù)本文描述的方法為純化提供Ig融合蛋白。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”是指根據(jù)本發(fā)明用作在細(xì)胞中引入和表達(dá)所需基因的媒介的載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，這些載體可很容易地從由質(zhì)粒、噬菌體、病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒組成的組中選擇。通常，與本發(fā)明兼容的載體包含篩選標(biāo)記、方便所需基因克隆的適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c和在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中進(jìn)入和/或復(fù)制的能力。對于此發(fā)明，可使用許多表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，一類載體使用來自動物病毒如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或M0MLV)或 SV40病毒的DNA元件。其他載體涉及使用多順反子系統(tǒng)，帶有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點。此外， 已整合DNA到其染色體的細(xì)胞可通過導(dǎo)入一種或多種允許篩選轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的標(biāo)記進(jìn)行篩選。標(biāo)記可以為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原營養(yǎng)、抗殺生物劑抗性(例如抗生素)或?qū)χ亟饘偃玢~的抗性。選擇標(biāo)記基因可直接連接到要表達(dá)的DNA序列，或通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入同一細(xì)胞。mRNA的優(yōu)化合成還可需要另外的元件。這些元件可包括信號序列、剪接信號、及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子和終止信號。在特別優(yōu)選的實施方案中，克隆的可變區(qū)基因與如上面討論合成的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(優(yōu)選地人類)一起插入到表達(dá)載體。優(yōu)選地，這使用IDEC有限公司的稱為NE0SPLA的專有表達(dá)載體來實現(xiàn)(美國專利第6，159，730號)。這種載體包含巨細(xì)胞病毒啟動子/增強(qiáng)子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40復(fù)制起點、牛生長激素多聚腺苷酸序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。在美國專利號第5，736，137和5，658，570號中還教導(dǎo)了載體系統(tǒng)，其每一個在此通過引用以其整體并入。這種系統(tǒng)提供了高表達(dá)水平，例如>30pg/細(xì)胞/天。其他典型的載體系統(tǒng)還在例如美國專利第6，413，777號中公開。在其他優(yōu)選實施方案中，Ig融合蛋白可使用多順反子構(gòu)建體表達(dá)，如于2001年11 月16日提交的共同待決的美國臨時申請?zhí)?0/331，481中所公開的，在此以其整體并入。在這些新的表達(dá)系統(tǒng)中，感興趣的多種基因產(chǎn)品如抗體的重鏈和輕鏈可從單個多順反子構(gòu)建體產(chǎn)生。這些系統(tǒng)有利地使用內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(IREQ以在真核宿主細(xì)胞中提供相對高水平的本發(fā)明的多肽。也并入在此的美國專利第6，193，980號中公開了兼容的IRES序列。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，這種表達(dá)系統(tǒng)可用于有效地產(chǎn)生本申請中公開的全部范圍的多肽。更通常地，制備了編碼Ig融合蛋白的載體或DNA序列后，表達(dá)載體可以導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。也就是說，宿主細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)實現(xiàn)。這些技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、用包膜DNA進(jìn)行細(xì)胞融合、顯微注射和用完整病毒感染。參見Ridgway， A. A. G"Mammalian Expression Vectors (哺乳動物表達(dá)載體)”第 24. 2 章，第 470-472 頁， Vectors (載體),Rodriguez 禾口 Denhardt 編著(Butterworths, Boston, Mass. 1988)。最優(yōu)選地，通過電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適合于輕鏈和重鏈產(chǎn)生的條件下生長，并測定重鏈和/或輕鏈蛋白合成。典型的測定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、或熒光激活細(xì)胞分選分析(FACS)、免疫組織化學(xué)及類似測定。如本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”應(yīng)是廣義上的使用，是指將DNA導(dǎo)入受者宿主細(xì)胞，改變基因型并因而導(dǎo)致受者細(xì)胞中發(fā)生變化。本著同樣的精神，“宿主細(xì)胞”是指已使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的編碼至少一個外源基因的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。為了描述從重組宿主中分離抗體的方法，除非另有明確說明，否則可互換地使用術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)”以表示抗體來源。換言之，從“細(xì)胞”中回收多肽可意味著從沉降的完整細(xì)胞或從包括培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞系最優(yōu)選地是哺乳動物來源；認(rèn)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員具有優(yōu)先地確定最適合所需基因產(chǎn)物在其中表達(dá)的特定宿主細(xì)胞系的能力。典型的宿主細(xì)胞系包括但不限于DG44和DUXB 11(中國倉鼠卵巢系，DHFR缺陷)、HELA (人類宮頸癌)、CVI (猴腎臟系)、C0S(以SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)、BALBC/3T3 (小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉鼠腎臟系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、 P3. times. 63-Ag3. 653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI (人類淋巴細(xì)胞)和四3(人類腎臟)。特別優(yōu)選的是CHO細(xì)胞。宿主細(xì)胞系通?？蓮纳虡I(yè)服務(wù)、美國組織培養(yǎng)物保藏中心或從出版的文獻(xiàn)得到。體外生產(chǎn)允許擴(kuò)大規(guī)模以生產(chǎn)大量所需的多肽。在組織培養(yǎng)條件下哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為本領(lǐng)域已知的，包括均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中， 或固定或截留的細(xì)胞培養(yǎng)，例如在空心纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷管殼上。編碼本發(fā)明多肽的基因還可由非-哺乳動物細(xì)胞如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞表達(dá)。 在這方面要認(rèn)識到，各種單細(xì)胞非-哺乳動物微生物如細(xì)菌也可以被轉(zhuǎn)化，即能夠在培養(yǎng)或發(fā)酵中生長的那些細(xì)菌。容易轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科的成員如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)菌株；芽胞桿菌科(Bacillaceae)的成員如枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)；月市炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)禾口、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) 0還應(yīng)進(jìn)一步理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時多肽通常成為包涵體的一部分。多肽必須被分離、純化和然后組裝成功能分子。除了原核生物，還可使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的面包酵母(baker' s yeast)是真核微生物中最常用的，雖然許多其他菌株通?？傻玫健τ谠诮湍钢斜磉_(dá)，常用例如質(zhì)粒YRp7 (Minchcomb等人，Nature, 282 =39(1979)； Kingsman 等人，Gene, 7 :141(1979) ；Tschemper 等人，Gene, 10 :157(1980))。這種質(zhì)粒中已包含為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株提供篩選標(biāo)記的TRPl基因，例如 ATCCNo. 44076 或 PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 :12(1977))。作為酵母宿主細(xì)胞基因組的特征的trpl損傷的存在從而為通過在缺乏色氨酸的情況下生長而檢測轉(zhuǎn)化提供了有效的環(huán)
^Mi ο在一個實施方案中，利用在低培養(yǎng)溫度即低于常規(guī)的37°C或在和32°C之間培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞使本發(fā)明的Ig融合蛋白表達(dá)。Ig融合蛋白特別是TNF受體-Ig融合蛋白的低溫培養(yǎng)降低失活融合蛋白的整體百分比。美國專利申請20020039580 (Browning等人)描述了在低溫培養(yǎng)Ig融合蛋白的方法，在此通過引用以其整體并入。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法使用的純化用的起始材料是表達(dá)重組Ig融合蛋白的CHO細(xì)胞的上清液。在一個實施方案中，CHO細(xì)胞在約至32°C的溫度培養(yǎng)。在一個實施方案中，純化的起始材料包含大約20-40%的聚集材料。在一個實施方案中，純化的起始材料包含大約30%的聚集材料。在一個可選擇的實施方案中，起始材料包含大約50% 或多于50%的聚集材料。使用本發(fā)明方法純化之前，包含待分離的多肽混合物的組合物優(yōu)選放置在酸性或大約中性PH的緩沖液中。這可以例如，通過添加濃縮緩沖液，再懸浮緩沖液中樣品，交換緩沖液(例如，使用透析或超濾)來進(jìn)行。可選擇地，樣品緩沖液的PH可簡單地調(diào)節(jié)到所需的范圍內(nèi)。V.免疫球蛋白融合蛋白本文描述的方法可用于Ig融合蛋白，其可能更容易具有例如由于多個二硫鍵的不適當(dāng)?shù)恼郫B。這種蛋白質(zhì)可能會更容易具有不完整或異常折疊，產(chǎn)生不同形式的失活蛋白，其在大小和特征上與活性蛋白十分相似，但盡管如此，其是失活的和治療用途所不需要的。
在一個方面，本發(fā)明的方法可用于純化具有復(fù)雜折疊的融合蛋白，如具有高數(shù)目的形成二硫鍵的半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，Ig融合蛋白組合了配體或受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體的胞外域(EOT))與至少一條重鏈結(jié)構(gòu)域和連接肽。在一個實施方案中，當(dāng)制備本發(fā)明的融合蛋白時，編碼配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或受體結(jié)構(gòu)域的核酸C-末端融合到編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列的N-末端的核酸。N-末端融合也是可能的。在一個實施方案中，融合蛋白包括CH2和 CH3結(jié)構(gòu)域。融合還可對恒定結(jié)構(gòu)域的Fc部分的C-末端，或緊接重鏈的CHl或輕鏈相應(yīng)區(qū)的N-末端進(jìn)行。在一個實施方案中，將配體或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列融合到免疫球蛋白分子的Fc 結(jié)構(gòu)域的N-末端。還可能將整條重鏈恒定區(qū)融合到配體或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列。在一個實施方案中，在融合中使用起始于鉸鏈區(qū)、木瓜蛋白酶裂解位點正上游的序列，其化學(xué)上定義IgG Fc(即，殘基216，把重鏈恒定區(qū)的第一個殘基看作114)，或其他免疫球蛋白的類似位點。進(jìn)行融合的確切位點不是關(guān)鍵；已熟知特定的位點，并可以選擇以優(yōu)化分子的生物活性、分泌或結(jié)合特征。本領(lǐng)域已知制備融合蛋白的方法。在一個實施方案中，包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白與Fc結(jié)構(gòu)域通過氨基酸連接子連接，所述連接子例如長度是1至5個氨基酸。在一個實施方案中，TNF受體和Fc結(jié)構(gòu)域通過單個氨基酸連接。在優(yōu)選實施方案中，本文描述的純化方法可用于分離TNF受體Ig融合蛋白。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及通過本文討論的方法獲得的TNF家族受體-Ig融合體，及包含它們的藥物制劑。TNF受體的實例是LT β R0其他實例包括HVEM。在一個方面，本發(fā)明的方法實現(xiàn)了純化的LTiiR-Ig融合蛋白組合物。在一個實施方案中，LT β R-Ig融合蛋白包含人類LT β R的胞外結(jié)構(gòu)域(無跨膜結(jié)構(gòu)域的形式)和免疫球蛋白Fc區(qū)(IgGlFc結(jié)構(gòu)域)。SEQ ID NO 1描述了人類LT β R的全長序列，包括胞外結(jié)構(gòu)域。圖10中提供了 LT-β-R-Ig融合的示意圖。其他融合蛋白也包括在本發(fā)明中。文獻(xiàn)中報道的典型的融合蛋白包括與以下的融合體Τ 細(xì)胞受體(Gascoigne 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :2936-2940 (1987))； CD4 (Capon 等人，Nature 337 :525-531 (1989) ；Traunecker 等人，Nature 339 68-70(1989) ；Zettmeissl 等人，DNA Cell Biol. USA 9:347-353(1990)；和 Byrn 等人.， Nature 344:667-670(1990)) ；L-選擇素(歸巢受體)(Watson 等人，J. Cell. Biol. 110 2221-2229(1990)；和 Watson 等人，Nature 349 :164-167(1991)) ；CD44 (Aruffo 等人， Cell 61 :1303-1313(1990)) ；CD^ 和 B7 (Linsley 等人，J. Exp. Med. 173 :721-730 (1991))； CTLA-4(Lisley 等 A, J. Exp. Med. 174 :561-569 (1991)) ；CD22 (Stamenkovic 等人， Cell66 :1133-1144(1991)) ;TNF 受體(Ashkenazi 等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10535-10539 (1991) ；Lesslauer 等人，Eur. J. Immunol. 27 :2883-2886 (1991)；和 Peppel 等人，J. Exp. Med. 174 1483-1489 (1991))；和 IgE 受體 a (Ridgway 和 Gorman，J. Cell. Biol. 第 115 卷，摘要號 1448(1991))。另外的典型的可包括在本融合蛋白中的配體和它們的受體包括以下細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子對淋巴細(xì)胞的增殖、分化和功能活化具有多效作用。各種細(xì)胞因子或其受體結(jié)合部分可用于本發(fā)明的融合蛋白中。典型的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13 和 IL-18)、集落刺激因子(CSF)(例如粒細(xì)胞CSF(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF))、腫瘤壞死因子(TNF) α和β、和干擾素如干擾素-α、β或γ (美國專利第4，925，793和4，929，554號)。細(xì)胞因子受體通常由配體-特異α鏈和共同的β鏈組成。典型的細(xì)胞因子受體包括以下物質(zhì)的受體GM-CSF、IL-3 (美國專利第5，639，605號)、 IL_4(美國專利第 5，599，905 號)、IL_5(美國專利第 5，453，491 號)、IFNy (EP0240975) 和受體 TNF 家族(例如，TNF α (例如 TNFR-I (EP 417，563)、TNFR_2 (EP 417，014)、淋巴毒素 β受體)。粘附蛋白粘附分子是允許細(xì)胞彼此相互作用的膜結(jié)合蛋白。各種粘附蛋白，包括白細(xì)胞歸巢受體和細(xì)胞粘附分子、其受體結(jié)合部分，可被并入本發(fā)明的融合蛋白。白細(xì)胞歸巢受體在炎癥期間在白細(xì)胞表面表達(dá)，包括整聯(lián)蛋白(例如VLA-1、2、3、4、5和6)，其介導(dǎo)對胞外基質(zhì)成分的結(jié)合，和β 2整聯(lián)蛋白(例如LFA-I、LPAM-I、CR3和CR4)，其結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞粘附分子(CAM)。典型的CAM包括ICAM-I、ICAM-2、VCAM-I和MAdCAM-I。其他CAM包括選擇蛋白家族的CAM，包括E-選擇蛋白、L-選擇蛋白和P-選擇蛋白。趨化因子刺激白細(xì)胞向感染部位遷移的趨化因子、趨化蛋白可以也并入本發(fā)明的融合蛋白中。典型的趨化因子包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、中性粒細(xì)胞趨化因子和RANTES(調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的因子)。生長因子和互長因子受體生長因子或其受體(或其受體結(jié)合或配體結(jié)合部分)可并入本發(fā)明的融合蛋白中。典型的生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和其亞型(美國專利第5，194，596號)； 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，包括aFGF和bFGF ；心房鈉利尿因子(ANF)；肝生長因子(HGF ； 美國專利第5，227，158和6，099，841號)；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或 NT-6)；或神經(jīng)生長因子如NGF-β，血小板-源生長因子(PDGF)(美國專利第4，889，919、 4，845，075、5，910，574 和 5，877，016 號)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β (W0 90/14359)；骨誘導(dǎo)因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-IKIGF-I和IGF-II ；美國專利第6，403，764和6，506，874號)；紅細(xì)胞生成素(EPO)； 干細(xì)胞因子(SCF)；血小板生成素(c-Mpl配體)，Wnt多肽(美國專利第6，159，462號)?？捎米鞅景l(fā)明的靶向受體結(jié)構(gòu)域的典型的生長因子受體包括EGF受體；VEGF受體(例如Fltl 或 Flkl/KDR)，PDGF 受體(W0 90/14425) ；HGF 受體(美國專利第 5，648，273 和 5，686，292 號)，和神經(jīng)營養(yǎng)受體包括低親和力受體(LNGFR)，也稱為ρ75·或ρ75，其結(jié)合NGF、BDNF 和ΝΤ-3，和為受體酪氨酸激酶的trk家族的成員的高親和力受體(例如trkA、trkB(EP 455，460)、trkC(EP522, 530))。激素本發(fā)明的融合蛋白中使用的典型的生長激素包括腎素、人類生長激素(HGH ；美國專利第5，834，598號)、N-甲硫氨酰人類生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子； 甲狀旁腺激素(PTH)；促甲狀腺激素(TSH)；甲狀腺素；胰島素原和胰島素(美國專利第5，157，021和6，576，608號)；卵泡刺激素(FSH)、降鈣素、促黃體生成素(LH)、瘦素、胰高血糖素；鈴蟾肽；生長激素；苗勒氏管抑制物；松弛素和松弛素原(prorelaxin)；促性腺激素相關(guān)肽；催乳素；胎盤催乳素；OB蛋白或苗勒氏管抑制物。凝血因子本發(fā)明的融合蛋白中使用的典型的凝血因子包括凝血因子(例如因子V、VII、 VIII、X、IX、XI、XII和XIII、血管性血友病因子)；組織因子(美國專利第5，346，991、 5，349，991,5, 726，147和6，596，84號)；凝血酶和凝血酶原；纖維蛋白和纖維蛋白原；纖溶酶和纖溶酶原；纖溶酶原激活物、如尿激酶或人類尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)。其他典型的融合蛋白教導(dǎo)于，例如，W00069913A1和W00040615A2?？砂ㄓ诒景l(fā)明融合蛋白中的另一典型的分子是IGSF9。融合蛋白可用本領(lǐng)域熟知的方法制備(參見例如美國專利第5，116，964和 5，225，538號)。通常，配體或配體結(jié)合伴侶物C-末端地融合到重鏈(或重鏈部分)的恒定區(qū)的N-末端，并代替可變區(qū)。融合之前優(yōu)選失活或缺失配體結(jié)合受體的任何跨膜區(qū)或脂質(zhì)或磷脂錨識別序列。編碼配體或配體結(jié)合伴侶物的DNA通過限制性內(nèi)切酶在編碼所需的 ORF片段的DNA的5，和3，末端處或附近裂解。隨后所得的DNA片段容易插入編碼重鏈恒定區(qū)的DNA。進(jìn)行融合的確切位點可憑經(jīng)驗選擇以優(yōu)化可溶性融合蛋白的分泌或結(jié)合特征。 然后將編碼融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以表達(dá)。VI.藥物組合物本發(fā)明的方法和組合物特別適合于用于藥物配制的Ig融合蛋白的純化，因為如果給治療中的受試者施用失活和/或蛋白質(zhì)聚集體可具有毒性效應(yīng)。例如，融合蛋白的失活形式和蛋白質(zhì)聚集體可能導(dǎo)致Ig融合蛋白的效力損失或增加免疫原性。因此，本發(fā)明提供了適合于治療用途的純化的生物蛋白的組合物。制備和給受試者施用使用本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的或容易確定的。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含純化的LT-β -R-Ig融合蛋白的藥物組合物。 可溶性LT-β-R-Ig可配制成藥物組合物，例如，用于給受試者施用以治療自身免疫性疾病，例如脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化癥。通常，藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的運載體。如本文使用，“藥學(xué)上可接受的運載體”包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑、及生理相容的類似物。該組合物可包括藥學(xué)上可接受的鹽，如酸加成鹽或堿加成鹽(參見例如 Berge 等人，J. Pharm. Sci. 66 :1_19，1977)?？扇苄訪T-β-R-Ig可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法配制。藥物配制是完善建立的技術(shù)，進(jìn)一步描述在，例如，Gennaro (編著)，Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓藥學(xué)理論與實踐)，第 20 版，Lippincott, Williams & amp ；Wilkins (2000) (ISBN :0683306472) ；Ansel 等人’ Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(藥物劑型與藥物遞送系統(tǒng))，第 7 版，Lippincott Williams & amp ；Wilkins 出版社(1999) (ISBN :0683305727)；和 Kibbe (編著)，Handbook of Pharmaceutical Excipients (藥用輔料手冊)American Pharmaceutical Association (美國制藥協(xié)會)，第 3 版，(2000) (ISBN :091733096X)中。在一個實施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可用輔料材料配制，如氯化鈉、磷酸氫二鈉七水合物、磷酸二氫鈉和穩(wěn)定劑。其可以例如合適濃度的緩沖溶液提供，并可在2-8°C貯藏。藥物組合物可能是各種形式。這些包括，例如，液體、半固體和固體劑型，如液體溶液(例如注射液和可輸注溶液)、分散液或懸浮液、片劑、丸劑、粉末劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式可取決于預(yù)期施用模式和治療應(yīng)用。通常情況下，本文描述的制劑的組合物為注射液或可輸注溶液形式。此組合物可通過腸胃外模式施用(例如靜脈、皮下、腹腔內(nèi)或肌肉注射)。本文使用的短語“腸胃外施用”和“施用腸胃外”表示腸內(nèi)和局部施用以外的施用模式，通常通過注射，包括但不限于靜脈、肌肉、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、包膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、腦硬膜夕卜、腦內(nèi)、顱內(nèi)、頸動脈內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸液。該組合物可配制成溶液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或適合于在高濃度穩(wěn)定儲存的其他有序結(jié)構(gòu)。無菌注射液可通過將所需量的本文描述的藥劑與根據(jù)需要的上述列舉的成分的一種或組合一起加入到合適的溶劑中而制備，接著是過濾滅菌。通常，分散劑是通過將本文所述的藥劑加入到包括基本分散介質(zhì)和所需的上述列舉的其他成分的無菌賦形劑中而制備。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況，優(yōu)選地制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生本文描述的藥劑加上來自其之前無菌-過濾的溶液的任何另外所需的成分的粉末。可維持溶液的適當(dāng)流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂，通過維持分散劑情況所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑。注射組合物的延長吸收可由包括在組合物中的延遲吸收的試劑所導(dǎo)致，例如單硬脂酸鹽和明膠。在某些實施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可與防止化合物快速釋放的運載體一起制備，如包括植入體和微囊遞送系統(tǒng)的控釋制劑?？墒褂蒙锟山到狻⑸锵嗳莸木酆衔?， 如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這類制劑的許多制備方法是特許的或普遍所知。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (緩釋和控釋藥物遞送系統(tǒng))，J. R. Robinson 編著，Marcel Dekker, Inc.，New York, 1978?？扇苄訪T-β -R-Ig可被修飾，例如用基團(tuán)提高其穩(wěn)定性和/或在循環(huán)例如血液、 血清或其他組織中的滯留時間，例如提高至少1.5、2、5、10或50倍?？稍u價修飾的藥劑以評估其是否可達(dá)到炎癥位點(例如損傷或硬化癥)如可發(fā)生在脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化癥(例如，通過使用標(biāo)記形式的藥劑)。例如，LT-β -R-Ig可與聚合物締合，例如，大致上非抗原性聚合物，如聚氧化烯烴或聚氧化乙烯。合適的聚合物的重量實質(zhì)地不同?？墒褂镁哂袛?shù)均分子量從約200至約 35，000道爾頓(或約1，000至約15，000，和2，000至約12，500)的聚合物。例如，可溶性LT-β -R-Ig可共軛到水溶性聚合物，例如親水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。這類聚合物的非限制性列表包括聚氧化烯烴均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，前提是保持嵌段共聚物的水溶性。其他有用的聚合物包括聚氧化烯烴如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(Pluronics)、聚甲基丙烯酸酯、卡波姆、和分支或不分枝的多糖。當(dāng)可溶性LT-β -R-Ig與第二種藥劑聯(lián)合使用時，兩種藥劑可分別配制或一起配制。例如各自的藥物組合物可在例如施用之前混合并一起施用，或可分別施用，例如在相同的時間或不同的時間?？扇苄訪T-β -R-Ig可通過各種方法給受試者例如人類受試者施用。對于許多應(yīng)用，施用的途徑是以下之一靜脈注射或輸液(IV)、皮下注射(Sc)、腹腔內(nèi)(IP)或肌內(nèi)注射。在一些情況下，施用可直接進(jìn)入CNS，例如鞘內(nèi)、腦室內(nèi)(ICV)、腦內(nèi)或顱內(nèi)。該藥劑可以固定劑量施用或以mg/kg劑量施用。也可以選擇劑量以減少或避免產(chǎn)生針對藥劑的抗體?？扇苄訪T- β -R-Ig的施用路徑和/或施用模式還可針對個別情況定制，例如通過確定受試者中硬化癥的位置、數(shù)量或大小，例如使用磁共振成像(MRI)掃描、正電子發(fā)射成像(PET)掃描、彌散加權(quán)成像(DW-I或DW-MRI)、擴(kuò)散張量成像、脊髓造影、磁化傳遞。脫髓鞘疾病的嚴(yán)重性或程度的還可由腰椎穿刺(例如，檢查腦脊液中白細(xì)胞的升高)、用作神經(jīng)功能量度的誘發(fā)電位測試，和/或與脫髓鞘疾病(例如多發(fā)性硬化癥)相關(guān)的任何其他標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)確定，例如，本文描述的任何評估標(biāo)準(zhǔn)。調(diào)整劑量方案以提供所需的反應(yīng)，例如，治療反應(yīng)或聯(lián)合療效。劑量方案將例如導(dǎo)致髓鞘再生增加。一般來說，可溶性LT-β-R-Ig的劑量任選地分別配制，或與合適劑量的第二治療劑一起配制，用于向受試者提供可溶性LT-β -R-Ig。合適的劑量和/或可溶性LT-β -R-Ig的劑量范圍包括足以導(dǎo)致受試者中髓鞘再生增加的量。合適的劑量可以是本文描述的任何劑量，并包括，例如，至少0. OOlmg的可溶性LT- β -R-Ig每kg受試者(例如人類患者)體重。所需的增加髓鞘再生的可溶性LT-β -R-Ig的劑量可取決于許多因素，包括，例如年齡、性別和待治療的受試者的體重。影響給受試者施用的劑量的其他因素包括，例如，脫髓鞘疾病的類型或嚴(yán)重程度。例如，與較輕形式的多發(fā)性硬化癥相比，急性爆發(fā)型多發(fā)性硬化癥的患者可能需要施用不同劑量的可溶性LT-i3-R_Ig。其他因素可包括，例如，同時或之前影響患者的其他疾病、患者的總體健康、患者的遺傳傾向、飲食、施用時間、排泄率、聯(lián)合用藥和向該患者施用的任何其它另外的療法。還應(yīng)理解，對任何特定患者的具體劑量和治療方案將取決于治療醫(yī)師的判斷?；钚猿煞值牧窟€取決于特別描述的化合物和組合物中另外的抗病毒劑的存在或不存在和性質(zhì)。本文使用的劑量單位形式或“固定劑量”是指適合作為單一劑量用于要被治療的受試者的物理離散單位；每一個單位包括與所需的藥物運載體聯(lián)合和任選地與其他藥劑聯(lián)合的計算為產(chǎn)生所需治療效果(例如，受試者中髓鞘再生增加)的預(yù)定量的活性化合物。藥物組合物可包括本文描述的治療有效量的可溶性LT-i3-R_Ig。這種有效量的確定可基于施用的藥劑的效果，或如果使用多于一種藥劑則基于藥劑與第二藥劑的聯(lián)合效應(yīng)。藥劑的治療有效量也可變化，根據(jù)以下因素如病狀、年齡、性別和個體體重、和化合物在個體中引起所需反應(yīng)的能力，例如至少一種疾病參數(shù)的改善，例如自身免疫性疾病例如脫髓鞘疾病例如多發(fā)性硬化癥的至少一種癥狀的改善。例如，治療有效量的可溶性 LT-β-R-Ig將增加髓鞘再生，還可減慢和/或改善脫髓鞘。治療有效量也是在其中治療有益作用超過組合物的任何有毒或有害作用的劑量。裝置和藥盒。包括可溶性LT-β-R-Ig的藥物組合物可用醫(yī)療裝置施用。裝置可設(shè)計成具有如便攜性、室溫貯藏和易用性特征以便其可在遠(yuǎn)離醫(yī)療設(shè)施和其他醫(yī)療設(shè)備的緊急情況下使用，例如由未經(jīng)訓(xùn)練的受試者或由在現(xiàn)場的急救人員使用。該裝置可包括，例如，一個或多個儲存包括可溶性LT-β-R-Ig的藥物制劑的外殼，并可以配置為遞送藥劑的一個或多個單位劑量。例如，藥物組合物的施用可用經(jīng)皮遞送裝置，如注射器，包括皮下注射器或多腔注射器。其他合適的遞送裝置包括支架、導(dǎo)管、經(jīng)皮貼片、顯微操作針和可植入控釋裝置。裝置(例如，注射器)可包括足夠引起髓鞘再生的劑量的干燥或液體形式的可溶性 LT-i3-R_Ig。裝置還可以是雙腔裝置，其中一個腔含有足夠?qū)е略黾邮茉囌咧兴枨试偕膯挝粍┝康睦鋬龈稍锏目扇苄訪T-β -R-Ig，第二個腔含有用于重構(gòu)冷凍干燥單位劑量的可溶性LT- β -R-Ig的液體(例如，緩沖液)。在其他實例中，藥物組合物可以用無針皮下注射裝置施用，如美國專利第 5，399，163,5, 383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 號中所描述的裝置。眾所周知的植入體和模塊在例如美國專利第4，487，603號中描述，其公開用于以控制的速率分配藥物的可植入式微型輸液泵；美國專利第4，486，194號，其公開了通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利第4，447，233號，其公開了以精確的輸注率遞送藥物的藥物輸液泵；美國專利第4，447，224號，其公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流速可植入式輸液器；美國專利第4，439，196號，其公開了具有多腔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利第4，475，196號，其公開了滲透藥物遞送系統(tǒng)。還已知許多其他裝置、植入體、遞送系統(tǒng)和模塊。可溶性LT-β-R-Ig可在藥盒中提供。在一個實施方案中，藥盒包括(a)含有包括一個或多個單位劑量可溶性LT-β-R-Ig的組合物的容器，和任選地(b)信息材料。可溶性LT-β-R-Ig的單位劑量足以在受試者中導(dǎo)致所需的結(jié)果，例如，受試者中疾病進(jìn)展放緩或改善。信息材料可以是描述性的、指導(dǎo)性的、營銷性的或與本文描述的方法和/或用于治療益處的藥劑的用途有關(guān)的其他材料。藥盒還可包括對髓鞘再生檢測(測定)有用的試劑和說明。對髓鞘再生測定的這種方法包括但不限于本文描述的任何檢測方法。在一個實施方案中，藥盒包括一種或多種另外的用于治療脫髓鞘疾病的藥劑，如一種或多種治療多發(fā)性硬化癥的藥劑。例如，藥盒包括第一容器，其含有包括可溶性LT-β -R-Ig 的組合物，和第二容器，其包括一種或多種另外的藥劑。藥盒的信息材料不限于其形式。在一個實施方案中，信息材料可包括關(guān)于化合物生產(chǎn)、化合物的分子量、濃度、失效日期、批次或生產(chǎn)場地的信息等。在一個實施方案中，信息材料涉及可溶性LT-β -R-Ig的施用方法，例如以合適的劑量、劑型或施用模式(例如本文描述的劑量、劑型或施用模式)向患有脫髓鞘疾病或有發(fā)展成脫髓鞘疾病的危險或正在經(jīng)歷與脫髓鞘疾病相關(guān)的發(fā)作的受試者施用。信息可以以各種格式提供，包括印刷文件、計算機(jī)可讀材料、顯像記錄、或錄音、或提供了實質(zhì)性材料的鏈接或地址的信息。除了藥劑之外，藥盒中的組合物還可包括其他成分，如溶劑或緩沖液、穩(wěn)定劑或防腐劑。該藥劑可以以任何形式提供，例如液體、干燥或冷凍干燥形式，優(yōu)選地基本純凈和/ 或無菌。當(dāng)藥劑以液體溶液提供時，液體溶液優(yōu)選地是水溶液。當(dāng)藥劑以干燥形式提供時， 通常通過加入合適的溶劑重構(gòu)。溶劑，例如無菌水或緩沖液，可任選地在藥盒中提供。藥盒可包括用于組合物或含有藥劑的組合物的一個或多個容器。在一些實施方案中，藥盒包含用于組合物和信息材料的單獨的容器、分隔器或腔室。例如，組合物可容納于瓶、管形瓶或注射器中，信息材料可容納于塑料套或小包中。在其他實施方案中，藥盒的單獨成分可容納于單個的、未分隔的容器內(nèi)。例如，該組合物容納于具有貼著標(biāo)簽形式的信息材料的瓶、管形瓶或注射器中。在一些實施方案中，藥盒包括多個(例如一包)單獨的容器， 每個包括藥劑的一個或多個單位劑量形式(例如，本文描述的劑量形式)。容器可包括聯(lián)合單位劑量，例如，包括可溶性LT- β -R-Ig和第二藥劑的單位，例如，以所需的比例。例如， 藥盒包括多個注射器、安瓿、鋁箔包、泡罩包裝或醫(yī)療裝置，例如，每個包括單個組合單位劑量。藥盒的容器可以是密閉、防水(例如，濕氣或蒸汽的變化不能滲透)和/或不透光的。藥盒任選地包括適合于施用該組合物的裝置，例如，注射器或其他適合的給藥裝置。提供的裝置可以預(yù)裝一種或兩種藥劑或可以是空的，但適合于裝載。VIII.治療方法使用根據(jù)本文描述的方法純化的活性LT-β-R-Ig融合蛋白制造的制劑，可用于治療用LT-β-R阻斷劑能治療的許多疾病。此類疾病的實例包括自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸道疾病，如克羅恩氏病，和神經(jīng)疾病，如多發(fā)性硬化癥。美國專利申請 20020197254和美國專利第7，255，854號描述了可用本文描述的組合物治療的疾病的其他實例，每個在此整體并入。在一個實施方案中，包含本發(fā)明純化的LT-β-R-Ig融合蛋白的藥物組合物用于治療脫髓鞘疾病。如本文使用的“脫髓鞘疾病”是與髓鞘(包圍和隔絕神經(jīng)纖維的脂肪鞘) 被破壞或從神經(jīng)去除相關(guān)的任何疾病。脫髓鞘疾病包括，例如，多發(fā)性硬化癥(例如，復(fù)發(fā)/ 緩解型多發(fā)性硬化癥、繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化癥、進(jìn)展復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥、原發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化癥和急性爆發(fā)型多發(fā)性硬化癥)、腦橋中央髓鞘溶解癥、急性播散性腦脊髓炎、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、亞急性硬化全腦炎、感染后腦脊髓炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、 格林巴利綜合征、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、德維克病、巴洛同心性硬化癥和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良 (例如，異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克拉伯病、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、卡納萬病、L童共濟(jì)失調(diào)伴中樞髓鞘化不良、亞歷山大病或雷夫敘姆病)?；加忻撍枨始膊〉娜祟惢颊呖删哂忻撍枨始膊〉囊环N或多種癥狀，如，但不限于，視力損傷、麻木、四肢無力、震顫或痙攣、熱耐受不良、言語障礙、失禁、眩暈或本體感覺障礙(例如平衡、協(xié)調(diào)、肢體位置感)。對于本方法，具有脫髓鞘疾病的家族史(例如，對脫髓鞘疾病有遺傳傾向性)的人 (例如，人類患者)，或顯示上面所述的輕度或偶發(fā)癥狀的脫髓鞘疾病的人可視為有發(fā)展脫髓鞘疾病(例如，多發(fā)性硬化癥)的危險，可用如本文描述的藥物組合物治療。在一些實施方案中，可溶性LT-β -R-Ig可以足夠改善受試者病癥的量、頻率和/ 或時間給受試者施用。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于在受試者中誘導(dǎo)或促進(jìn)髓鞘再生。在一個實施方案中，給受試者施用可溶性LT-β -R-Ig —次。在其他實施方案中， 給受試者施用可溶性LT-β-R-Ig多于一次，例如每3-10天一次；至少兩次和不多于每 5-20天一次；至少兩次和不多于每觀-31天一次；每周；每兩周；每月；至少4周的整個療程中每周一次；至少6周的整個療程中每兩周一次；至少3個月的整個療程中每月一次；或至少6個月的整個療程中每月一次。在一些實施方案中，劑量確定的試驗中可溶性LT-β -R-Ig的合適的起始劑量(例如，足以誘導(dǎo)受試者中髓鞘再生的量)是0. OOlmg可溶性LT-β-R-Ig受試者每kg體重。在一些實施方案中，合適的劑量或起始劑量是取決于許多主觀的、患者-特定因素，如，但不限于性別、年齡、體重、身體健康程度，或本文所述的任何其他因素。在一些實施方案中，可溶性LT- β -R-Ig給受試者靜脈或腸胃外(例如，鞘內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)或口服)施用。在一些實施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可給受試者作為單一療法施用。在一些實施方案中，可溶性LT- β -R-Ig可與其他療法作為聯(lián)合治療施用，例如，用于自身免疫性疾病，例如，脫髓鞘性疾病(例如本文所述的任何脫髓鞘疾病(例如，多發(fā)性硬化癥))的其他療法。例如，聯(lián)合療法可包括向受試者(例如，人類患者)施用一種或多種對患有自身免疫性疾病例如脫髓鞘疾病或有發(fā)展危險的受試者提供治療益處的另外藥劑。在一些實施方案中，同時施用可溶性LT-β -R-Ig和一種或多種另外藥劑。在其他實施方案中，第一時間施用可溶性LT-β-R-Ig，第二時間施用一種或多種另外藥劑。在一些實施方案中，第一時間施用一種或多種另外藥劑，第二時間施用可溶性LT-β-R-Ig。可溶性 LT-i3-R-Ig可取代或增強(qiáng)先前或目前施用的治療。例如，用LT-β-R-Ig治療后，一種或多種另外藥劑的施用可停止或減少，例如，以低水平施用。在其他實施方案中，維持先前治療的施用。在一些實施方案中，維持先前治療直至LT- β -R-Ig水平達(dá)到足以提供治療益處的水平。兩種治療可聯(lián)合施用。在一個實施方案中，可監(jiān)測正在用本文描述的藥物組合物治療脫髓鞘疾病的受試者的髓鞘再生。如本文定義的監(jiān)測受試者(例如，人類患者)髓鞘再生是指評價受試者的改變，例如，指示髓鞘再生的一個或多個參數(shù)的改善，例如，可監(jiān)測脫髓鞘疾病的一種或多種癥狀的改善。此種癥狀包括本文描述的脫髓鞘疾病的任何癥狀。髓鞘再生還可由包括直接確定受試者中髓鞘狀態(tài)的方法監(jiān)測，例如，可使用磁共振成像(MRI)測量白質(zhì)質(zhì)量或用磁共振波譜(MRQ腦部掃描測量髓鞘纖維的厚度。在一些實施方案中，評估在施用，優(yōu)選地首次施用可溶性LT- β -R-Ig后至少1小時，例如，至少2、4、6、8、12、24或48小時，或至少 1天、2天、4天、10天、13天、20天或更久，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更久后進(jìn)行。受試者可在一個或多個下列周期中評估開始治療之前、治療期間、或經(jīng)過施用療法的一種或多種組成部分后。評價可包括對進(jìn)一步治療的需要的評估，例如，評價劑量、施用頻率或療程是否應(yīng)改變。其還可包括評估添加或刪除選定的治療方案的需要，例如添加或刪除本文描述的脫髓鞘疾病的任何療法。例如，如有需要時，持續(xù)施用可溶性LT-β-R-Ig 可與一種或多種另外的治療藥劑一起進(jìn)行。在優(yōu)選實施方案中，如果獲得預(yù)選的評價結(jié)果， 則采取另外的步驟，如，向受試者施用另一療法，或進(jìn)行另一評價或試驗。例如，可對患者進(jìn)行腰椎穿刺(例如，腰椎抽液)以獲得腦脊液樣本。然后測試腦脊液中以下的存在，例如，⑴異常蛋白如髓鞘質(zhì)的微小片段，( )淋巴細(xì)胞的濃度升高或特定類型，和/或(iii)免疫球蛋白(IgG)分子水平異常。對脫髓鞘疾病的定量試驗的另一實例是誘發(fā)電位測試，其測量神經(jīng)活性為神經(jīng)沖動從眼睛、耳朵或皮膚到達(dá)大腦需要的時間的函數(shù)。脫髓鞘疾病的評估還可通過評價出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性病變(例如，硬化癥)的大小和/或數(shù)量，用幾種成像方法的任何一種，所述成像方法包括但不限于，磁共振成像(MRI)掃描、正電子發(fā)射成像(PET)掃描、彌散加權(quán)成像(DW-I或DW-MRI)、擴(kuò)散張量成像、脊髓造影、磁化傳遞。還可使用多種半定量或定性評估患者的神經(jīng)心理(例如，各種能力如記憶、算術(shù)、注意力、判斷和推理的情況)或患者呈現(xiàn)的癥狀(臨床參數(shù))來診斷患者，所述癥狀包括，例如，本文描述的多發(fā)性硬化癥的任何癥狀。此外，脫髓鞘疾病的程度或進(jìn)展的檢測可通過測試患者尿液的髓鞘堿性蛋白類物質(zhì)(MBPLM)的升高水平，該物質(zhì)當(dāng)疾病進(jìn)展過程中發(fā)生軸索損傷時升高(參見，例如，Whitaker等人(1995) Arm. Neural. 38(4) 635-632)。對于色盲的某些測試也可有助于追蹤脫髓鞘疾病對眼睛的影響。上述的這些診斷方法也可用于評估受試者(如患者)用可溶性LT-β -R-Ig治療后增加的髓鞘再生。例如，髓鞘再生可與患者中存在的硬化癥的大小或數(shù)量的減少一致，通過本文描述的任何成像方法確定。此外，受試者中髓鞘再生可測量為信號從耳朵、眼睛或皮膚到大腦的傳輸速度的增加，通過誘發(fā)電位測試確定。在一些情況下，髓鞘再生可評價為白質(zhì)體積(例如，脊柱或大腦的神經(jīng)質(zhì)量)的增加。在一些情況下，受試者中髓鞘再生的程度或發(fā)生可通過直接測量受試者中髓鞘的厚度來評估，通過使用例如磁共振光譜掃描。本發(fā)明還包括本文描述的方法和組合物與可引起脫髓鞘病癥的療法或藥物聯(lián)合使用。例如，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗-TNF治療的副作用可導(dǎo)致一種類型的脫髓鞘病癥。因此，可溶性LT-β -R-Ig可與抗TNF療法聯(lián)合施用以阻止、改善或逆轉(zhuǎn)脫髓鞘的副作用和促進(jìn)髓鞘再生?？?TNF療法包括但不限于阿達(dá)木單抗(Humira)、依那西普(Enbrel)或英利昔單抗(Remicade)。在一些情況下，可溶性LT-β -R(例如，LT-β -R-Fc)用作二線治療。例如，對脫髓鞘疾病(例如，多發(fā)性硬化癥)的一種或多種治療確定無反應(yīng)的患者將停止接受該一種或多種治療，并將開始用可溶性LT- β -R-Ig治療。上述公開教導(dǎo)了本領(lǐng)域的技術(shù)人員本發(fā)明的各方面，包括怎樣制備和使用本發(fā)明。下面的實施例是為了提供本發(fā)明的進(jìn)一步的說明，而不是為了限制本發(fā)明。
實施例下面的實施例描述了從產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)中純化基于抗體的生物制品即LT-β -R-Ig 的方法。當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)時三種產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)與LT-i3-R-Ig共同表達(dá)。這些產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)對純化方法提出了挑戰(zhàn)。雜質(zhì)包括兩種單體但結(jié)構(gòu)不同的失活形式的LT-β-R-Ig(稱為“失活-1”和“失活-2”)和包括二聚體和較高分子量物質(zhì)的聚集體。Fc融合蛋白在CHO 細(xì)胞中表達(dá)后，雜質(zhì)對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的百分比的實例是約46%產(chǎn)物(活性、單體蛋白質(zhì))、約 35%聚集體、約13%失活-2和約6%失活-1。實施例1 能夠在基于抗體的生物制品純化過程中去除多種產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的高分辨率疏水作用色譜方法的開發(fā)(循環(huán)1)為了第一階段臨床生產(chǎn)，開發(fā)能夠從基于抗體的產(chǎn)物中去除兩種單體的但失活的產(chǎn)物-相關(guān)雜質(zhì)的HIC方法步驟。在隨后的開發(fā)過程中，設(shè)法改善容量和穩(wěn)健性同時維持色譜的分辨率。將描述開發(fā)研究，其中探討了可選擇的HIC樹脂和結(jié)合鹽，并通過實驗設(shè)計方法鑒定了對分離效率關(guān)鍵的參數(shù)。在同一方法的下游使用了具有不同分辨力的第二 HIC 步驟用于去除第三種產(chǎn)物-相關(guān)雜質(zhì)。將討論在建立適合于生產(chǎn)-規(guī)模臨床制備的穩(wěn)健方法時所面臨的問題和挑戰(zhàn)。下面的實施例描述了能夠從基于抗體的產(chǎn)物中去除產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)例如蛋白質(zhì)的兩種失活形式的疏水作用色譜(HIC)方法，其被開發(fā)用于臨床生產(chǎn)。下面的實施例描述了HIC 丁基和苯基樹脂、結(jié)合鹽和鑒定為對分離效力重要的參數(shù)?？傊?，下面的方法(稱為“循環(huán)1-1”和“循環(huán)1-2”)使用第一 HIC 丁基柱，例如丁基-650M樹脂(Tosoh Biosciences)，其次是第二 HIC苯基柱。HIC方法的聯(lián)合導(dǎo)致失活和聚集的分子減少。丁基-650M樹脂被確定在分離活性LT- β -R-Ig與其他形式即失活-1、失活-2和聚集形式中有效。循環(huán)1-1用于LT-β -R-Ig的2000L生產(chǎn)，而優(yōu)化循環(huán)1_2是為更高滴度的起始原料(例如800mg/mL)。循環(huán)1_1和循環(huán)1_2都包括第一丁基HIC分離和第二丁基HIC分離。材料與方法在此實施例中使用的樹脂包括iToyopearl 丁基-650M(Tosoh Bioscience)和苯基瓊脂糖6Fast Flow(Pharmacia)。丁基-650M色譜方法包括用包含20mM磷酸鈉、pH 7.5、 1. 65M NaCl的溶液的平衡步驟和沖洗步驟，和用包含20mM磷酸鈉、pH 7. 5,0. 7M NaCl的溶液的洗脫步驟。使用Pharmacia UV-I檢測器在^Onm吸光度(Aaxi)監(jiān)測柱流出物。Pharmacia生產(chǎn)的AKTA FPLC和Unicorn軟件3. 2. 6版本用于各種實驗。除特別注明外，進(jìn)行色譜的溫度范圍是1848°C。在特定情況下使用Torrey Pines Scientific HPLC柱制冷/制熱型號C030調(diào)節(jié)柱溫度。在一些實驗中使用Neslab水浴器型號RTE-211控制純化溶液的溫度。使用JMP 軟件(SAS Institute)版本3. 2. 6進(jìn)行統(tǒng)計分析，其用于實驗設(shè)計和結(jié)果分析。在本報告中LT-β -R-Ig蛋白濃度是基于1. 25的消光系數(shù)。1. 1 循環(huán) 1-1開發(fā)循環(huán)1-1以從哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的LT-β -R-Ig中去除雜質(zhì)。需要去除的雜質(zhì)包括LT- β -R-Ig蛋白的兩種不同的失活形式，即失活-1和失活-2形式及聚集體。圖1描述了循環(huán)1-1的方法的概述。首先使用分批補(bǔ)料方法在重組中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)LTBR-Ig。在循環(huán) 1-1中，滴度是 300mg/L，聚集體以 12%，失活-1以 5%和失活-2以 9%。表達(dá)后， 收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并離心。澄清的條件培養(yǎng)基用蛋白-A捕獲柱處理。由此產(chǎn)生的LT-β -R-Ig 混合物用丁基樹脂HIC柱(稱為HIC-1) ( 丁基-650Μ ；Tosoh Bioscience)處理，其中樹脂具有8g/L的容量。HIC-I步驟清除LT- β -R-Ig的失活形式1和失活形式2的混合物，并優(yōu)化了蛋白質(zhì)容量。較其他測試的樹脂由于若干原因選擇丁基-650Μ樹脂，包括下面的優(yōu)選特征1) 剛性甲基丙烯酸酯骨架；2) 40-90 μ m的孔徑；3)80-300cm/hr的運行速度；和4)可能的嚴(yán)格清洗條件，例如IN Na0H、50%甲醇。丁基樹脂能夠去除多于99%的LT-β-R-Ig失活形式。篩選大量的鹽以確定哪一種對從失活和聚集形式中分辨LT-β -R-Ig蛋白質(zhì)產(chǎn)物最有效。NaCl和Na2SO4兩者都被鑒定為可從LTBR-Ig產(chǎn)物中分辨雜質(zhì)。LTBR-Ig的失活-1 和失活-2形式分別從丁基樹脂中洗脫到洗液和反萃NaCl溶液中。丁基HIC-I步驟將洗脫組分中的失活-1和失活-2減少到< 1. 0%。圖3描述了對HIC-I后方法中間體的HPLC分析，包括從活性LT- β -R-Ig和聚集體中分辨LT- β -R-Ig的失活形式的HIC-HLPC，和從活性、單體LT- β -R-Ig融合蛋白中分辨聚集體的尺寸排阻HPLC (SE-HPLC)。圖2提供了 HIC-I 丁基步驟后結(jié)果的概述，其中LT-β -R-Ig的兩種失活形式與活性LT-β -R-Ig分離。如圖2中描述，用0. 7Μ NaCl從HIC-1 丁基樹脂中洗脫LT-β -R-Ig 產(chǎn)物。對HIC-I的終循環(huán)-1-1條件是在1.65Μ NaCl (所有都結(jié)合)結(jié)合，然后以1. 55Μ NaCl沖洗(失活-1從柱上沖洗掉)，然后以0. 7Μ NaCl洗脫(洗脫產(chǎn)物和聚集體)，然后以 OM NaCl反萃(失活-2從柱上顯現(xiàn))(也參見圖2)。然后用低ρΗ方法對來自HIC-I步驟的洗脫液滅活病毒，接著用苯基瓊脂糖(苯基瓊脂糖6高流速高分辨率)用第二 HIC色譜柱處理。第二 HIC步驟(苯基)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體的清除和洗脫液的優(yōu)化分辨。圖8Α描述了顯示由HIC-2(苯基)步驟清除聚集體的結(jié)果，包括荷載的影響。第二 HIC(HICj)步驟后，通過病毒清除過濾器(VF)和超濾/滲濾(UF/DF)進(jìn)一步處理洗脫液。1. 2 循環(huán) 1-2循環(huán)1-2是上述的循環(huán)1-1的修改版本，其中循環(huán)1-2具有增加容量的改進(jìn)能力 (起始原料中的蛋白質(zhì)滴度增加)。圖5提供了循環(huán)1-2的概述。如下所述，循環(huán)1-2中硫酸鈉(代替氯化鈉)用于增加丁基柱的容量從8至20g/L樹脂。為了提高容量特征和分辨LT-β-R-Ig的活性對失活(失活1和失活幻的能力而篩選不同的易溶鹽。滴度增加后進(jìn)行篩選以確定有效去除LT-β -R-Ig的失活和聚集形式的鹽和樹脂。表1描述了易溶鹽的篩選結(jié)果。表1 易溶鹽的篩選
權(quán)利要求
1.一種包含生物活性淋巴毒素-β-受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白的組合物，其中少于6%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的，且少于2%的所述LT-β-R-Ig 融合蛋白是聚集的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中少于5%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中少于的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中少于0.5%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，所述組合物包含少于2%的聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，所述組合物包含少于的聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的組合物，其中所述LT-i3-R-Ig融合蛋白包含IgGl 同種型的Ig恒定區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的組合物，其中所述LT-i3-R-Ig融合蛋白包含SEQID NO: 2所列的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的組合物，其中所述生物活性的LT-β-R-Ig融合蛋白在標(biāo)準(zhǔn)體外IL-8抑制測定中可抑制IL-8釋放。
10.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-9任一項所述的組合物和藥學(xué)上可接受的運載體。
11.一種治療自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求 10所述的藥物組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是繼發(fā)、進(jìn)展型多發(fā)性硬化癥或復(fù)發(fā)、緩解型多發(fā)性硬化癥。
14.一種分離生物活性淋巴毒素-β-受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白與生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，所述方法包括將包含所述生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂上，并將所述樹脂與包含鹽梯度的溶液接觸以獲得包含所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液和包含所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鹽梯度是不連續(xù)梯度或連續(xù)梯度。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鹽梯度包含1.6Μ至0. OMNaCl。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脫液通過用1. 5Μ NaCl洗液沖洗所述HIC樹脂獲得。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鹽梯度包含0.6Μ至0. OMNa2SCV
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述不連續(xù)梯度包含從0.6Μ至0. OM范圍的增量的 Nei2SO4O
20.根據(jù)權(quán)利要求14-19任一項所述的方法，其中所述丁基HIC樹脂具有600至750A 的孔徑。
21.根據(jù)權(quán)利要求14-19任一項所述的方法，其中所述丁基HIC樹脂具有約8mg至約 20mg蛋白質(zhì)/L樹脂的荷載量。
22.根據(jù)權(quán)利要求14-19任一項所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脫液包含少于2%的生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求14-19任一項所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脫液包含少于1 %的生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白。
24.一種分離非聚集、生物活性淋巴毒素-β-受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白與聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，所述方法包括將包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到苯基疏水作用色譜(HIC)樹脂上，其中所述樹脂具有介于約10-20g蛋白質(zhì)/L樹脂之間的荷載量和約30至31cm的床高，并將所述樹脂與溶液以流速約50至150cm/hr接觸以獲得包含所述生物學(xué)非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液和包含所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中包含所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第一洗脫液包含少于2%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中包含所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第一洗脫液包含少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
27.一種分離生物活性淋巴毒素-β-受體免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白與生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟i)在允許所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合丁基疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將包含所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到所述丁基樹脂上； )將所述丁基HIC樹脂與包含鹽梯度的溶液接觸以獲得富集有所述生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；iii)在允許所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合第二HIC樹脂的條件下將步驟 )的所述第一洗脫液荷載到所述第二 HIC樹脂上；并iv)將所述第二HIC樹脂與溶液接觸以獲得進(jìn)一步富集有所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，從而分離所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中(ii)的所述鹽梯度是不連續(xù)梯度或連續(xù)梯度。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述丁基HIC樹脂包含羥基化甲基丙烯酸酯骨架。
30.根據(jù)權(quán)利要求27- 任一項所述的方法，其中所述丁基HIC樹脂具有600至750A 的孔徑。
31.根據(jù)權(quán)利要求27- 任一項所述的方法，其中所述第一洗脫液包含少于2%的失活 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。
32.根據(jù)權(quán)利要求27- 任一項所述的方法，其中所述第一洗脫液包含少于的失活 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。
33.根據(jù)權(quán)利要求27- 任一項所述的方法，其中所述第二洗脫液包含少于2%的失活 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。
34.根據(jù)權(quán)利要求27- 任一項所述的方法，其中所述第二洗脫液包含少于的失活 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。
35.根據(jù)權(quán)利要求14-34任一項所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的濃度是至少300mg/L。
36.根據(jù)權(quán)利要求14-34任一項所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的濃度是至少800mg/L。
37.根據(jù)權(quán)利要求14-34任一項所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的濃度是至少1350mg/L。
38.根據(jù)權(quán)利要求14-37任一項所述的方法，其中所述混合物的體積是至少5000L。
39.根據(jù)權(quán)利要求14-37任一項所述的方法，其中所述混合物的體積是至少10000L。
40.根據(jù)權(quán)利要求14-37任一項所述的方法，其中所述混合物的體積是至少15000L。
41.一種分離生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白與生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的方法， 該方法包括以下步驟i)在允許所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將包含所述生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到所述混合模式樹脂上； )用溶液將所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白從步驟i)的所述混合模式樹脂中洗脫以獲得富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；iii)在允許所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將步驟ii)的所述第一洗脫液荷載到所述HIC樹脂上；并iv)用溶液洗脫步驟iii)的所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，從而分離所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
42.一種分離非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白與聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟i)在允許所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷載到所述混合模式樹脂上，其中所述混合物中多于約30%或約30%的LT-β -R-Ig融合蛋白是聚集的； )用溶液從步驟i)的所述混合模式樹脂上洗脫所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；iii)在允許所述生物活性Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將步驟 )的所述第一洗脫液荷載到所述HIC樹脂上；并iv)用溶液洗脫步驟iii)的所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，從而分離所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白與所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的方法，其中所述混合模式樹脂的特征為具有離子相互作用能力和疏水相互作用能力。
44.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的方法，其中所述混合物在約5.0的ρΗ荷載到所述混合模式樹脂上。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中在步驟(ii)之前，用具有約7.0至7.2的ρΗ的緩沖液沖洗已荷載的混合模式樹脂。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述緩沖液是BisTris0
47.根據(jù)權(quán)利要求41-46任一項所述的方法，其中所述HIC樹脂是苯基樹脂。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述苯基樹脂是苯基kpharose。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述生物活性LT-β-R-Ig是用硫酸銨從所述苯基樹脂上洗脫。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述生物活性LT-β -R-Ig是用0. 3至0. 5Μ的硫酸銨從所述苯基樹脂上洗脫。
51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述苯基樹脂的流速是50至150cm/hr。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述流速是約lOOcm/hr。
53.一種從包含非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟i)在允許所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將所述混合物荷載到所述混合模式樹脂上； )用溶液從步驟i)的所述混合模式樹脂上洗脫所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得富集有所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；iii)在允許所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將步驟ii)的所述第一洗脫液荷載到所述HIC樹脂上；并iv)用溶液洗脫步驟iii)的所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以獲得進(jìn)一步富集有所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，從而從包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第一洗脫液包含少于25%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第一洗脫液包含少于20%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第一洗脫液包含少于15%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
57.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第一洗脫液包含約10%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二洗脫液包含少于2%的所述聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。
59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二洗脫液包含少于的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
60.根據(jù)權(quán)利要求53-59任一項所述的方法，還包括在步驟(i)之前，將所述混合物與重組蛋白A(rfr0tein Α)接觸。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中與所述重組蛋白A接觸的所述混合物是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液是從在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞獲得。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液包含非離子型表面活性劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述非離子型表面活性劑是TritonX-100。
65.一種制備包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的組合物的方法，其中所述組合物包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白，該方法包括以下步驟i)從包含用編碼所述LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液； )將所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液與重組蛋白A(rfrotein Α)接觸以獲得LT-β-R-Ig融合蛋白混合物；iii)在PH約5.0，在使得所述LT-β -R-Ig融合蛋白結(jié)合混合模式樹脂的條件下將步驟ii)的所述LT-β -R-Ig融合蛋白混合物荷載到所述混合模式樹脂上；iv)用具有約7.0至7. 2的pH的緩沖液沖洗所述混合模式樹脂；ν)將步驟iii)的所述混合模式樹脂與溶液接觸以獲得富集有所述生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脫液；vi)在允許所述LT-β-R-Ig融合蛋白結(jié)合疏水作用色譜(HIC)樹脂的條件下將步驟 iv)的所述第一洗脫液荷載到所述HIC樹脂上；并vii)將步驟vi)的所述HIC樹脂與溶液接觸以獲得進(jìn)一步富集有所述生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脫液，其中所述第二洗脫液包含少于1 %的所述LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于1 %的所述LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
66.一種組合物，所述組合物包含至少97%的由權(quán)利要求14-65所述的任一方法制備的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白。
67.一種治療受試者中自身免疫性疾病的方法，所述方法包括給受試者施用權(quán)利要求 67所述的組合物。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
69.根據(jù)權(quán)利要求53-65所述的方法，還包括在步驟(i)之前將所述混合物與陰離子交換膜吸附器接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的生產(chǎn)過程中分離雜質(zhì)的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法可去除的雜質(zhì)的實例包括Ig融合蛋白的失活形式和/或聚集體。
文檔編號C12N15/62GK102239177SQ200980115497
公開日2011年11月9日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者喬納森·羅梅羅, 戴維·埃文斯, 斯蒂芬·諾塔尼科拉, 沃納·梅爾, 理查德·麥克尼文, 賈斯廷·麥丘 申請人:比奧根艾迪克Ma公司