專利名稱：用于制備抗腫瘤抗體的tm4sf3蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于制備抗腫瘤抗體的TM4SF3蛋白及其應(yīng)用。具體的本發(fā)明涉及用于制備抗腫瘤抗體的TM4SF3蛋白及其編碼核苷酸序列；涉及抗TM4SF3蛋白的抗體及其制備方法、在生產(chǎn)治療各種相關(guān)腫瘤的各種生物制劑中的用途；另外還涉及包括該抗體的藥物組合物及其在體內(nèi)抑制腫瘤的用途，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。
背景技術(shù)：
腫瘤是人類最常見的疾病之一，其死亡率在世界和我國的各種疾病中分別排在第二位和第三位，嚴(yán)重影響著人類的健康。在我國隨著社會(huì)的發(fā)展，腫瘤的發(fā)病率還在逐年上升。我國目前有癌癥患者約450萬人，死亡率在30%以上，而且每年新增的患者人數(shù)高達(dá)200萬人以上。有效地醫(yī)治癌癥已是科學(xué)研究中的當(dāng)務(wù)之急。臨床治療癌癥的方法主要是手術(shù)切除和放、化療，但是，放、化療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，給人體正常細(xì)胞也帶來了嚴(yán)重的損傷。前治療惡性腫瘤的手術(shù)，放療，化療三大常規(guī)治療手段并沒有明顯的降低腫瘤的死亡率，其5年生存率僅達(dá)10-30%，因此全世界各國均在始終不懈的探索，力圖尋找出更有效的治療手段。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，人們開始嘗試采用生物方法針對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的不同層面進(jìn)行治療并且已經(jīng)取得了令人欣喜的效果，腫瘤的生物靶向治療必將成為最有前景和最活躍的領(lǐng)域。癌癥的靶向治療很重要，"靶向"是癌癥治療中必須遵守的原則，高效、準(zhǔn)確地命中癌癥這個(gè)"耙"，實(shí)現(xiàn)有的放矢是癌癥治療的關(guān)鍵所在。因此，找到高效、特異的靶點(diǎn)是腫瘤生物靶向治療的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的載體，臨床上使用的各種藥物中有80%是針對(duì)蛋白質(zhì)的。當(dāng)前，尋找腫瘤粑向治療的耙點(diǎn)的研究主要集中在各種在腫瘤中異常表達(dá)的蛋白上。 一般認(rèn)為這種白蛋須具有以下一些特性1)在腫瘤組織中特異表達(dá)。即該蛋白在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織；或該
4蛋白在腫瘤中的細(xì)胞學(xué)定位明顯異于正常組織，而這一異常定位使得相關(guān)藥物能較容易到達(dá)。2)該蛋白在腫瘤細(xì)胞中具有功能，藥物與蛋白作用后能明顯抑制腫瘤的臨床進(jìn)展，而對(duì)正常的組織沒有明顯的毒副作用。3)目前，在各種生物治療手段中，最成功的是抗體類藥物，由于抗體本身的特性，要求抗體靶向的靶點(diǎn)必須是膜蛋白。近年來，
治療腫瘤的抗體藥物的研究開發(fā)取得了突破性進(jìn)展。Rituxan是1997年第一個(gè)獲FDA批準(zhǔn)上市的抗腫瘤抗體藥物，用于治療B細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤。Herceptin于1998年獲批準(zhǔn)，主要用于HER-2/neu陽性的乳腺癌。Mylotarg (2000)用于治療急性復(fù)發(fā)性髓性白血病。近年來，先后獲批準(zhǔn)用于治療腫瘤的抗體藥物還有Campath-lH、 Zevalin、Bexxer、 Erbitux和Avastin等。目前，為數(shù)眾多的治療腫瘤的抗體藥物正在進(jìn)行臨床前與臨床研究。
目前，已經(jīng)公開報(bào)道的抗體內(nèi)藥物針對(duì)的腫瘤治療靶點(diǎn)主要有以下一些。它們或者參與了腫瘤的生長過程，或者在腫瘤的轉(zhuǎn)、耐藥性的誘導(dǎo)的過程中發(fā)揮作用。已經(jīng)上市的抗體類藥物的靶點(diǎn)包括CD20,用于治療B細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤；Her2-neo，用于治療乳腺癌和肺癌等；CD33，用于治療急性復(fù)發(fā)性髓性白血病；CD52， B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞性白血??；EGRFR，用于治療晚期直、結(jié)腸癌；VEGF，用于治療治療晚期結(jié)、直腸癌；CD25，用于治療白血??；C017-1A，用于治療結(jié)腸癌等。其他的抗體類藥物的靶點(diǎn)還包括CEA、 CD22、 GD2、EGFR、 IGN-101、 EGF、 1D10、 CD6、 CDlla、 huJ591、 ACA-125等。(Grillo-Lopez AJ.抗CD20的單抗白血病的治療的策略和結(jié)果?？鼓[瘤治療經(jīng)驗(yàn)綜述，2002;2:323-329; (Grillo-Lopez AJ. AntiCD20 mAbs:modifying therapeutic strategies and outcomes in the treatment oflymphoma patients, Expert Rev Anticancer Ther. 2002;2:323-329 )StadtmauerEA,使用Mylotarg聯(lián)合化療的方法治療急性髓性白血病，臨床淋巴瘤，2002;2 suppl 1:S24-S28,( Stadtmauer EA, Trials withgemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) combined with chemotherapyregimens in acute myeloid leukemia, Clin Lymphoma, 2002;2 suppl1 :S24-S28,) Pangalis GA, Dimopoulou MN， Angelopoulou MK等，應(yīng)用Campath-1H (抗CD52)單抗治療淋巴細(xì)胞增生疾病，抗腫瘤醫(yī)學(xué)，
52001;18:99-107， (Pangalis GA， Dimopoulou顧，Angelopoulou MK， etal.Campath-lH (anti-CD52) monoclonal antibody therapy inlymphoproliferative disorders, Med Oncol, 2001;18:99-107) ，Leonard JP，Link BK,使用HLL2 (epratuzumab， 一種抗CD22單抗)和人1D10(apolizumab)治療非何杰金氏淋巴瘤，抗腫瘤研究，2002;29(1 suppl2):81-86， (Leonard JP， Link BK, Immunotherapy of non-Hodgkin'slymphoma with hLL2 (epratuzumab, an anti-CD22 monoclonal antibody)and HulDIO (apolizumab), Semin Oncol.2002;29(1 suppl 2):81-86)Slamon DJ, Clark GM, Wong 等人乳腺癌的復(fù)發(fā)與預(yù)后與HER-2/neu癌基因擴(kuò)增的相關(guān)性，科學(xué),1987;235:177-182，(Slamon DJ,Clark GM, Wong SG， et al， Human breast cancer: correlation of relapse andsurvival with amplification of the HER-2/neu oncogene, Science,1987;235:177-182) Mendelsohn J, Baselga J. EGF受體家族作為腫瘤耙向治療的耙點(diǎn)，癌基因，2000;19:6550-6565， (The EGF receptor familyas targets for cancer therapy, Oncogene, 2000;19:6550-6565) Rosen LS,
應(yīng)用血管生成抑制因子的臨床經(jīng)驗(yàn)聚焦血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，腫瘤
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盡管已經(jīng)有了幾十種針對(duì)不同的蛋白耙點(diǎn)的抗腫瘤單抗藥物，對(duì)臨床的需要來說仍然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，仍然需要發(fā)展更多的抗體類抗腫瘤藥物。這主要是由于腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素，多基因突變的過程，僅僅一兩種針對(duì)各別信號(hào)通路的抗體并不能阻止腫瘤的進(jìn)展，而
6只能延緩這一過程；另外不同的腫瘤有不同的發(fā)病機(jī)理，需要有不同 的治療藥物。
本發(fā)明人的研究表明TM4SF3位于腫瘤的細(xì)胞膜上，并且參與了腫 瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程，因此該蛋白具有作為抗腫瘤藥物靶標(biāo)的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
基于在治療腫瘤領(lǐng)域中目前的需要，為了發(fā)展能夠更好用于研發(fā) 和制備治療腫瘤的藥物，本發(fā)明一方面公開了具有氨基酸序列如SEQ IDNO:l、 2、 3或4所示的TM4SF3蛋白或其片段，該TM4SF3位于 人腫瘤細(xì)胞膜上，并能夠作為制備抗腫瘤藥物的人腫瘤細(xì)胞抗原；另 外本發(fā)明提供的TM4SF3蛋白或其片段作為靶標(biāo)可以用于篩選多種抗 腫瘤藥物。
另一方面，本發(fā)明提供了以TM4SF3蛋白或其片段作為抗原而制 備的抗體及其衍生物。所述的抗體衍生物優(yōu)選是核素偶聯(lián)抗體、1311標(biāo) 記抗體或納米磁性顆粒偶聯(lián)抗體。所述的抗體及其衍生物可以用于制 備用于治療腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的藥物。
再一方面，本發(fā)明提供了通過TM4SF3蛋白或其片段作為耙標(biāo)篩 選得到的具有抗腫瘤活性的組分。該組分優(yōu)選是抗體、多肽、小分子 化合物。
第四方面，本發(fā)明提供了抑制TM4SF3蛋白或其片段活性的組分 在制備治療哺乳動(dòng)物包括人的腫瘤發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。 所述組分優(yōu)選是抗體、多肽、小分子化合物；所述的腫瘤優(yōu)選是食管 癌或其他陽性表達(dá)TM4SF3蛋白的腫瘤。
第五方面，本發(fā)明提供了一種包括由TM4SF3蛋白制備的抗體及 其衍生物或者由TM4SF3蛋白篩選得到的抗腫瘤的組分的藥物組合物， 以及所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移的藥物中 的用途。所述的腫瘤優(yōu)選是食管癌或其他陽性表達(dá)TM4SF3蛋白的腫 瘤。
本發(fā)明的有益效果在于以本發(fā)明提供的TM4SF3蛋白及其片段 作為抗原，制備得到的抗體具有良好的抗腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的作 用；以本發(fā)明的提供的TM4SF3蛋白及其片段可以作為抗腫瘤免疫導(dǎo)向治療的靶位，篩選得到潛在的或具有良好抗腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 的藥物組分，并進(jìn)而獲得具有抗腫瘤活性的藥物組合物。


圖1顯示W(wǎng)estern Bloting檢測TM4SF3在食管癌(T)及其配對(duì)正 常組織(N)中表達(dá)情況，P-肌動(dòng)蛋白確保恒定上樣量的內(nèi)參。結(jié)果 表明TM4SF3蛋白在食管癌組織高頻表達(dá)上調(diào)。
圖2顯示抗TM4SF3抗體對(duì)食管癌肺轉(zhuǎn)移的作用，結(jié)果表明抗 TM4SF3抗體治療組中，癌細(xì)胞基本沒有轉(zhuǎn)移，而在用PBS處理的對(duì) 照組中和正常鼠IgG治療組中，癌細(xì)胞存在明顯的肺轉(zhuǎn)移。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的蛋白。所 述的蛋白是人腫瘤細(xì)胞抗原。所述的蛋白是通過宿主細(xì)胞表達(dá)而獲得。 所述的蛋白，作為抗原位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，其具有免疫原性。其 特征在于該抗原部分多肽序列位于腫瘤細(xì)胞膜外。
本發(fā)明還提供一種以具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的蛋 白制得的抗體或其他針對(duì)該蛋白的藥物的方法。該抗體是抗腫瘤抗體。 該抗體可以是兔、羊、馬、鼠源的多克隆抗體或單克隆抗體。根據(jù)業(yè) 界公知的方法，以蛋白TM4SF3作為靶位還可以篩選多種抗腫瘤藥物， 如抗體、多肽、小分子等藥物。
本發(fā)明還提供含有如SEQ ID NO:l所述的氨基酸序列的蛋白或者 融合蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種由所述的抗體衍生而來的抗體衍生物，該 衍生物為核素-抗體偶聯(lián)物、化學(xué)藥物-抗體偶聯(lián)物、毒素-抗體偶聯(lián)物、 前體藥物酶-抗體偶聯(lián)物、納米顆粒-抗體偶聯(lián)物。
本發(fā)明還提供所述的抗體在制備治療腫瘤及抑制腫瘤生長、復(fù)發(fā)、 轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明再提供一種藥物組合物，其特征在于包括本發(fā)明的抗體或 者本發(fā)明的抗體衍生物的腫瘤化療藥物。
換言之，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種新的人腫瘤細(xì)胞抗原及其多肽序列，所述抗原多肽具有以下氨基酸殘基序列
(SEQ ID NO:l)。
包含該抗原的蛋白TM4SF3在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜表達(dá)，抑制該抗 原的功能就能夠抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移。因此，該抗原可 作為抗人腫瘤免疫導(dǎo)向治療的靶位。根據(jù)業(yè)界公知的方法，以蛋白 TM4SF3作為靶位還可以篩選多種抗腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的藥物，如 抗體、多肽、小分子等藥物。
本發(fā)明還涉及一種編碼如上述抗原的氨基酸殘基序列的DNA序 列以及以該DNA序列為耙設(shè)計(jì)生產(chǎn)各種核酸藥物的方法。根據(jù)業(yè)界公 知的方法，可以設(shè)計(jì)出針對(duì)該DNA序列的小RNA藥物及以病毒載體 為載體的其他核酸藥物。
在本發(fā)明中，所述的抗原是指包含上述氨基酸殘基序列的任何蛋 白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)；編碼該抗原的DNA是指任何根據(jù)公認(rèn)的三聯(lián)密碼 子翻譯后編碼含有上述氨基酸殘基序列。
本發(fā)明所述的抗原是通過使用TM4SF3蛋白的多克隆抗體作免疫 組織化學(xué)和免疫細(xì)胞熒光時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜上。 ' 本發(fā)明另外還涉及一種制備抗腫瘤的抗體的方法。
根據(jù)本發(fā)明提供的新的抗腫瘤抗原，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 方法和技術(shù)很容易獲得其相應(yīng)的單克隆抗體及衍生物。采用該抗原免 疫小鼠，在檢測鼠血清中相應(yīng)的特異抗體的含量后，處死動(dòng)物獲得脾 細(xì)胞，經(jīng)過與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，再經(jīng)抗原特異性試驗(yàn)篩選， 即可獲得鼠單克隆抗體。將鼠單克隆抗體的可變區(qū)基因克隆，并與相 應(yīng)的人恒定區(qū)正確連接后，再次克隆入真核表達(dá)載體并導(dǎo)入真核細(xì)胞 表達(dá)，即可獲得人-鼠嵌合抗體。采用該抗原篩選人噬菌體抗體庫，或 采用人外周血單核細(xì)胞嵌合小鼠技術(shù)，可獲得相應(yīng)的全人抗體。
本發(fā)明還提供了所述的抗體或衍生物在制備的藥物或含有該抗體 的藥物組合在治療人腫瘤中的應(yīng)用。
該腫瘤抗原的相應(yīng)抗體或其衍生物可以用來免疫導(dǎo)向治療腫瘤。 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的原理可以推斷任何人類腫瘤，只要在此類 腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)該蛋白，即該腫瘤抗原存在于腫瘤細(xì)胞膜上，就可 以使用該腫瘤抗原的相應(yīng)抗體或其衍生物進(jìn)行免疫導(dǎo)向治療。該抗體
9或其衍生物可以直接通過各種方式注入患者的體內(nèi)，與位于腫瘤細(xì)胞 表面的抗原，抑制腫瘤的生長。標(biāo)記有核素或化療藥物的抗體可以將 核素或化學(xué)藥物帶到肺癌組織局部，從而減少核素或化療藥物的毒性， 大大增加它們殺傷肺癌細(xì)胞的作用。納米磁性顆粒偶聯(lián)的抗體將納米 磁性顆粒濃聚于肺癌病灶局部，高頻交變磁場的作用下發(fā)熱，殺傷周 圍的癌細(xì)胞，起到治療癌癥的目的。將該抗原相應(yīng)抗體與效應(yīng)分子融 合，如毒素PE40，可以將效應(yīng)分子濃聚于癌病灶，使效應(yīng)分子最大程 度地發(fā)揮作用，起到治療人腫瘤的作用。
總之，利用本發(fā)明提供的前述人腫瘤抗原相應(yīng)抗體，就可以方便地 生產(chǎn)目前已知的各種衍生物用于腫瘤的治療。
下面將參照附圖結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明所涉及的發(fā)明主題以 及應(yīng)用本發(fā)明中的新腫瘤抗原、其相應(yīng)抗體以及各種衍生物來實(shí)施腫 瘤的治療等具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例
實(shí)施例l:新的人腫瘤抗原的制備
按照本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，以TM4SF3基因的cDNA序列作為模板， 采用引物5'-ATAGATATCGACAAGCCTGTAACGAA-3，(正向引物， 含有 EcoRV 酶切位點(diǎn)和 Xhol 酶切位點(diǎn))和 5'-GATCTCGAGGTTCCCGATCTGG-3，(反向引物含有XhoI酶切位點(diǎn))， 通過PCR技術(shù)克隆TM4SF3基因的cDNA編碼序列。對(duì)克隆得到的 PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證為正確的TM4SF3基因的cDNA序列后，按照本 領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)將該序列構(gòu)建在表達(dá)載體PET-30b中，獲得重組載體 PET-30b- M4SF3。然后將所述的重組載體PET-30b-TM4SF轉(zhuǎn)化原核細(xì) 胞，獲得相應(yīng)的重組原核細(xì)胞，并在適合該重組載體表達(dá)的條件下使 得TM4SF3基因表達(dá)從而獲得TM4SF3蛋白。
表達(dá)得到的TM4SF3蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO: 1。
另一方面，可以將TM4SF3基因的cDNA全長序列克隆到其他含 有特定序列的載體上，從而形成TM4SF3蛋白的衍生物。本發(fā)明所指 的TM4SF3蛋白的衍生物是指通過對(duì)TM4SF3蛋白取代、缺失或添加
10變TM4SF3蛋白功能的蛋白衍生物，即不改 變本發(fā)明公開的TM4SF3蛋白的用于制備抗腫瘤抗體的功能。所述的
衍生物可以是(1)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被保守或非保守的氨基酸 殘基取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；
(2) 是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)所取代；
(3) 是屬于成熟多肽與其他化合物融合，或者與其他諸如前導(dǎo)序列、 分泌序列、用于純化此序列的序列等構(gòu)成融合多肽。例如將TM4SF3 基因的cDNA全長序列克隆到含有GST標(biāo)簽的載體上，例如PGEX-3X 載體，從而獲得GST-TM4SF3融合蛋白，即在該蛋白的N端加上了G ST的序列，但這并不改變TM4SF3蛋白的性質(zhì)。還可以將本蛋白的 c DNA序列克隆到含有其他表達(dá)標(biāo)簽的載體，如含有H i s標(biāo)簽的 PET載體等中，已構(gòu)成TM4SF3蛋白的其他衍生物。
另外，也可以將TM4SF3蛋白中的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明要求保護(hù)的TM4SF3 蛋白功能的關(guān)鍵序列(胞外區(qū)序列，如SEQIDNo.2和SEQIDNo.5) 單獨(dú)表達(dá)或連接到含有標(biāo)簽的載體中構(gòu)成融合蛋白，而不表達(dá)該蛋白 全序列，這也構(gòu)成本發(fā)明要求保護(hù)的TM4SF3蛋白的一類衍生物。如 將本蛋白胞外端氨基酸序列(SEQIDNo.2)對(duì)應(yīng)的c DNA序列克隆 到含有GS T標(biāo)簽的載體中，然后進(jìn)行表達(dá)，則獲得GST與TM4SF3 胞外區(qū)序列肽段的融合蛋白。例如，還可以合成本蛋白中的關(guān)鍵肽段，
(SEQIDNO: 4)，然后在一端或兩端添加半胱氨酸后偶聯(lián)于匙孔血藍(lán) 蛋白(KLH)上，用于動(dòng)物免疫制備抗體或其他小分子靶向藥物， 這也屬于本發(fā)明的蛋白衍生物的一類。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解， TM4SF3蛋白的衍生物并不限于上述內(nèi)容，還包括對(duì)TM4SF3蛋白的 其他修飾和改變。
實(shí)施例2: TM4SF3在食管癌組織高表達(dá)
通過Westen檢測，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TM4SF3蛋白在食管癌組織中高 頻表達(dá)上調(diào)。
Westen檢測14對(duì)食管癌(T)及其配對(duì)的癌旁正常食管上皮組織 標(biāo)本(N)中TM4SF3蛋白的表達(dá)情況。提取每例組織總蛋白，用
iiSDS-PAGE電泳和Westen檢測對(duì)獲得的各個(gè)組織的總蛋白進(jìn)行檢測。 SDS-PAGE電泳上樣的每例組織樣品的總蛋白為50ug。 Westen檢測結(jié) 果表明所有14對(duì)食管癌及其配對(duì)的癌旁正常食管上皮組織中有11例 食管癌組織中的TM4SF3表達(dá)上調(diào)，上調(diào)率達(dá)到78.6% (圖1)。因此， TM4SF3蛋白是特異的人腫瘤抗原，可用于進(jìn)一步的制備抗腫瘤抗體的 研制中。
實(shí)施例3:新的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體的制備
采用實(shí)施例1得到的200嗎人腫瘤抗原(TM4SF3蛋白)或其片段， 等體積混合完全福氏佐劑共200ul，采用皮下免疫的方式免疫新西蘭家 兔，2周后采用200pg抗原蛋白或其片段混合不完全福氏佐劑皮下加強(qiáng) 免疫，1周后采用完全弗氏佐劑乳化50-60mg卡介苗蛋白雙側(cè)腳掌注 射，1周后采用200(ag抗原蛋白或其片段等體積混合不完全福氏佐劑共 200ul兩側(cè)胭窩淋巴結(jié)內(nèi)注射，10天后采血使用常規(guī)方法測效價(jià)，發(fā) 現(xiàn)血清的效價(jià)>1:108，處死動(dòng)物，收集兔血清，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法，例如采用抗原親和純化法從兔血清中純化抗TM4SF3或其 片段的抗體。
實(shí)施例4:新的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體衍生物的制備
(一)核素-抗體偶聯(lián)物
(1) ^Re標(biāo)記新的人腫瘤抗原相應(yīng)鼠單抗
SnCl2直接還原法標(biāo)記實(shí)施例3獲得的抗體，立即快速薄層層析 (ITLC)測定抗體的標(biāo)記效率及放化純度。標(biāo)記后，ITLC實(shí)驗(yàn)表明188Re-抗體標(biāo)記率為91%，放化純度大于94。/。。"SRe-抗體比活為347MBq/mg。 ELISA測得^Re-抗體免疫活性為66%。標(biāo)記抗體的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 表明，抗體在37。C孵育24hr，無論是在生理鹽水還是人血清白蛋白中， 放射性脫落都小于5%，示其在體外穩(wěn)定。
(2) 1311標(biāo)記新的人腫瘤抗原相應(yīng)鼠單抗
氯胺T法標(biāo)記抗體，立即快速薄層層析(ITLC)測定抗體的標(biāo)記效率 及放化純度。標(biāo)記后，ITLC實(shí)驗(yàn)表明1311-抗體標(biāo)記率為91%，放化純度大于93%。 '311 -抗體比活為77MBq/mg， ELISA測得1311 -抗體免疫 活性64.3%。
(二)納米磁性顆粒-抗體偶聯(lián)物
以純水將直徑約20-50nm的鐵氧化物磁性顆粒超聲分散，形成膠體 狀。按0.2g納米磁性顆粒加入16mg抗體的比例加入溶于純水的抗體， 迅速攪拌混合，5min后加入終濃度為1%的BSA，離心并采用1%的 BSA洗滌后備用。
實(shí)施例5:采用實(shí)施例3得到的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體抑制腫瘤的生
長(以食管癌為例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，測量并計(jì)算腫瘤體積后，按腫瘤體積 隨機(jī)分為3組，每組8只。第一組為PBS對(duì)照組，每只腹腔注射 200|ilPBS;第二組為正常鼠IgG對(duì)照組，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三組為新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組，每只腹腔注射實(shí)施例得 到的0.2mg腫瘤抗原相應(yīng)抗體。每兩天給藥一次，治療后10次后，處 死動(dòng)物，分離腫瘤，稱取腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組瘤重 量一治療組瘤重量)/對(duì)照組瘤重量X100。/。。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。
結(jié)果顯示PBS組瘤重1.24士0.47g，正常鼠IgG對(duì)照組1.13士0.37g， 新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組0.66士0.25g，新腫瘤抗原相應(yīng)抗體的抑瘤 率為47.2%， P值小于O.Ol。這些結(jié)果顯示新腫瘤抗原相應(yīng)抗體在免疫 導(dǎo)向治療食管癌癌中有重要的應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例6:采用實(shí)施例3得到的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體抑制腫瘤的轉(zhuǎn)
移(以食管癌為例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，測量并計(jì)算腫瘤體積后，按腫瘤體積 隨機(jī)分為3組，每組8只。第一組為PBS對(duì)照組，每只腹腔注射 200)alPBS;第二組為正常鼠IgG對(duì)照組，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三組為新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組，每只腹腔注射實(shí)施例1得 到的0.2mg腫瘤抗原相應(yīng)抗體。治療的第一個(gè)月每星期給藥兩次，一 個(gè)月后每五天給藥一次，治療后50天后次后，處死動(dòng)物，解剖動(dòng)物
13觀察個(gè)臟器腫瘤轉(zhuǎn)移情況。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。
結(jié)果顯示PBS組8只小鼠有7只有明顯肺轉(zhuǎn)移，正常鼠IgG對(duì)照組 8只小鼠有6只有明顯肺轉(zhuǎn)移，新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組8只小鼠有 1只有明顯肺轉(zhuǎn)移，新腫瘤抗原相應(yīng)抗體的能明顯抑制食管癌的肺轉(zhuǎn) 移，P值小于0.01 (圖2)。這些結(jié)果顯示新腫瘤抗原相應(yīng)抗體在免疫 導(dǎo)向治療食管癌轉(zhuǎn)移中有重要的應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例7:采用新的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體衍生物體內(nèi)靶向并抑制腫 瘤(以食管癌為例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，測量并計(jì)算腫瘤體積后，按腫瘤體積 隨機(jī)分為3組，每組8只。第一組為PBS對(duì)照組，每只腹腔注射 200filPBS;第二組為正常鼠IgG對(duì)照組，每只腹腔注射9.2MBq(200pl) "il-正常鼠IgG;第三組為偶聯(lián)1311的新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組，每 只腹腔注射9.2MBq(200|il) 1311-抗體。治療后10天，處死動(dòng)物，分離 腫瘤，稱取腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組瘤重量—治療組瘤 重量)/對(duì)照組瘤重量X 100%。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。
結(jié)果PBS瘤重1.16士0.35g，人IgG對(duì)照組1.12土0.41g，標(biāo)記抗體 治療組0.41士0.15g，標(biāo)記抗體的抑瘤率為64.6%， P值小于O.Ol。這 些結(jié)果顯示新腫瘤抗原相應(yīng)抗體(實(shí)施例3的多克隆抗體)偶聯(lián)核素 在免疫導(dǎo)向治療食管癌中有重要的應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例8:采用實(shí)施例2得到的人腫瘤抗原相應(yīng)抗體抑制腫瘤的生
長(以結(jié)腸癌為例)
取荷人結(jié)腸癌裸小鼠24只，測量并計(jì)算腫瘤體積后，按腫瘤體積 隨機(jī)分為3組，每組8只。第一組為PBS對(duì)照組，每只腹腔注射 200 1PBS;第二組為正常鼠IgG對(duì)照組，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三組為新腫瘤抗原相應(yīng)抗體治療組，每只腹腔注射實(shí)施例1得 到的0.2mg腫瘤抗原相應(yīng)抗體。每兩天給藥一次，治療后10次后，處 死動(dòng)物，分離腫瘤，稱取腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組瘤重 量一治療組瘤重量)/對(duì)照組瘤重量X 100%。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果PBS組瘤重1.45士0.37g，正常鼠IgG對(duì)照組1.53士0.39g，新腫瘤
14抗原相應(yīng)抗體治療組0.73士0.21g，新腫瘤抗原相應(yīng)抗體的抑瘤率為
49.7%， P值小于O.Ol。這些結(jié)果顯示新腫瘤抗原相應(yīng)抗體在免疫導(dǎo)向 治療結(jié)腸癌中有重要的應(yīng)用價(jià)值。序列表
<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所
< 120>用于制備抗腫瘤抗體的TM4SF3蛋A及其應(yīng)用
<160> 5
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gly Val Ser Ala Cys lie Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn 1 5 10 15
Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly lie Leu lie Leu Ala Leu Ala lie Trp 20 25 30
Val Arg Val Ser Asn Asp Ser Gin Ala lie Phe Gly Ser Glu Asp Val 35 40 45
Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp lie Leu lie Ala Val Gly Ala 50 . 55 60
lie He Met lie Leu Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala lie Lys Glu 65 70 75 80
Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe He Gly Leu Leu Leu lie Leu 85 90 95
Leu Leu Gin Val Ala Thr Gly lie Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys 100 105 110
Ser Asp Arg lie Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu 115 120 125
Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gin Phe Gin Glu Ala lie lie Val 130 135 140
Phe Gin Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp 145 150 155 160
Trp Gly Asn Asn Phe Gin His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp165 170 175
Lys Gin Arg Pro Cys Gin Ser Tyr Asn Gly Lys Gin Val Tyr Lys Glu 180 185 190
Thr Cys lie Ser Phe lie Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu lie lie 195 200 205
Val lie Gly lie Ser Phe Gly Leu Ala Val lie Glu lie Leu Gly Leu 210 215 220
Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gin lie Gly Asn Lys 225 230 235
<210> 2
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Lys Ser Lys Ser Asp Arg lie Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr 15 10 15
Lys Leu Leu Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gin Phe Gin Glu Ala 20 25 30 .
lie lie Val Phe Gin Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly 35 40 45
Ala Ala Asp Trp Gly Asn Asn Phe Gin His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala 50 55 60
Cys Leu Asp Lys Gin Arg Pro Cys Gin Ser Tyr Asn Gly Lys Gin Val 65 70 75 80
Tyr Lys Glu Thr Cys He Ser Phe lie Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn 85 90 95
<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223>
<400> 3
17<formula>formula see original document page 18</formula>
權(quán)利要求
1、TM4SF3蛋白或其片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、3或4所示。
2、 如權(quán)利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段在制備抗體中的用途。
3、 如權(quán)利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作為靶標(biāo)在篩選多種抗 腫瘤藥物中的用途。
4、 以權(quán)利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作為抗原而制備的抗體 及其衍生物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體及其衍生物，其中所述的抗體衍生物是 核素偶聯(lián)抗體、1311標(biāo)記抗體或納米磁性顆粒偶聯(lián)抗體。
6、 如權(quán)利要求4所述的抗體及其衍生物在制備用于治療腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn) 移的藥物中的用途。
7、 以權(quán)利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作為靶標(biāo)篩選得到的具 有抗腫瘤活性的組分。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組分，其是抗體、多肽、小分子化合物。
9、 如權(quán)利要求7所述的具有抗腫瘤活性的組分在制備治療哺乳動(dòng)物包 括人的腫瘤發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述組分是抗體、多肽、小分 子化合物。
11、 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的用途，其中所述的腫瘤是食管癌、結(jié) 腸癌或陽性表達(dá)TM4SF3蛋白的腫瘤。
12、 一種藥物組合物，其特征在于包括如權(quán)利要求4所述的抗體及其 衍生物或者包括如權(quán)利要求7所述的組分。
13、 如權(quán)利要求12所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的發(fā)生、生長或 轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的腫瘤是食管癌、結(jié)腸癌 或陽性表達(dá)TM4SF3蛋白的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于制備抗腫瘤抗體的TM4SF3蛋白及其應(yīng)用。具體的本發(fā)明涉及用于制備抗腫瘤抗體的TM4SF3蛋白及其編碼核苷酸序列；涉及抗TM4SF3蛋白的抗體及其制備方法、在生產(chǎn)治療各種相關(guān)腫瘤的各種生物制劑中的用途；另外還涉及包括該抗體的藥物組合物及其在體內(nèi)抑制腫瘤的用途，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。
文檔編號(hào)C07K16/30GK101497662SQ20081005702
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者冉宇靚, 楊治華, 海 胡 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所