專利名稱：用于增強抗腫瘤抗體療法的方法
用于增強抗腫瘤抗體療法的方法
背景技術(shù)：
在過去四分之一世紀(jì)中，單克隆抗體技術(shù)是最著名的科學(xué)進(jìn)步之一。這種研究的快速轉(zhuǎn)化延長了上千癌癥患者的生存。第一個被批準(zhǔn)的單克隆抗體是利妥昔單抗，它是一種抗⑶20的鼠-人嵌合性IgGl抗體，已經(jīng)成為患有B細(xì)胞淋巴瘤患者的醫(yī)護標(biāo)準(zhǔn)?？笻ER2(曲妥珠單抗)和抗EGF受體(西妥昔單抗)的單克隆抗體也相似地分別改變了患有乳癌、結(jié)直腸癌和頭頸癌的被選患者的自然病程。盡管單克隆抗體的有前景的活性，患有難治的或晚期癌癥的患者中的反應(yīng)率并未達(dá)到最理想，典型地在25%以下。增強單克隆抗體的 活性的努力集中在細(xì)胞毒性化療的各種組合上。這在很大程度上忽略并可能部分拮抗單克隆抗體借此發(fā)揮功能的免疫機制。獲得性免疫細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞的監(jiān)測和消除。在固有細(xì)胞中是自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)構(gòu)成了固有免疫系統(tǒng)的主要組成成分。在腫瘤和感染病毒的細(xì)胞的排除中NK細(xì)胞發(fā)揮主要作用。這種細(xì)胞通過釋放小的蛋白質(zhì)細(xì)胞質(zhì)顆粒(稱為穿孔素和顆粒酶)，其通過凋亡引起靶細(xì)胞死亡來進(jìn)行殺傷。自然殺傷細(xì)胞的活性受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)，并需要激活信號。例如，通過抗體激活Fe受體允許NK細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)去裂解細(xì)胞。經(jīng)激活，NK細(xì)胞釋放包含顆粒酶和穿孔素的顆粒。穿孔素在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成孔，顆粒酶和相關(guān)分子穿過該孔可以進(jìn)入，從而誘導(dǎo)凋亡。ADCC是針對腫瘤的單克隆抗體療法發(fā)揮作用的一個主要機制。然而，常規(guī)的細(xì)胞毒性化療引起骨髓抑制，減少了 NK細(xì)胞群，從而降低ADCC的療效。相比之下，具有加強的NK細(xì)胞功能的療法可能會提供改善單克隆抗體的活性而不增加非癌細(xì)胞毒性的能力。臨床上這是顯著的，因為由于較大的年齡、晚期的疾病或事先的療法而增加的癌癥患者群體不是常規(guī)細(xì)胞毒性化療的候選者。本發(fā)明解決了這個問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤作用的方法。在本發(fā)明的方法中，通過順序施用針對一種或多種腫瘤抗原的抗體以及抗一種或多種NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)的共刺激分子的激動抗體，來尤其加強ADCC的功能，其反過來又增強靶細(xì)胞的殺傷。對診斷患有腫瘤的個體首先施用針對腫瘤的抗體。經(jīng)過一段時間后,NK細(xì)胞上調(diào)可誘導(dǎo)的共刺激分子(比如CD137、0X40、GITR、CD30或IC0S)的表達(dá)，所述NK細(xì)胞是對于ADCC關(guān)鍵的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞。隨后，施用靶向NK細(xì)胞上誘導(dǎo)的共刺激分子的第二抗體(包括但不限于抗-CD137、抗-0X40、抗-GITR、抗-CD30或抗-IC0S)。在一些實施方式中，施用針對腫瘤的抗體之后評價上述共刺激分子的表達(dá)，以確定第二劑給藥的最佳時間?；蛘?，憑經(jīng)驗確定定時時間段，并且普遍適用。顯示所述劑的組合及其順序施用，來提供一種在單獨的單劑施用中觀察不到的腫瘤特異性、治療協(xié)同作用的水平。該方法特異性增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤功能。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體在NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激分子，該方法允許特異性刺激ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷中涉及的NK細(xì)胞，而省去其它NK細(xì)胞，從而限制了潛在的非特異性副作用。在本發(fā)明的一些實施方式中，可誘導(dǎo)共刺激分子是⑶137。在這種方法中，對診斷患有腫瘤的個體首先施用腫瘤選擇性的抗體。經(jīng)過一段足以上調(diào)CD137在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)的時間后，施用第二劑，而所述劑是CD137的激動劑。在一些實施方式中，在各施用步驟之前，確定在血細(xì)胞上的⑶137表達(dá)水平，其中表達(dá)的提高表明第二劑可以施用了。


圖1A-1C.與⑶20-陽性腫瘤B細(xì)胞孵育之后，利妥昔單抗誘導(dǎo)⑶137在人NK細(xì)胞上的上調(diào)。用淋巴瘤細(xì)胞系與曲妥珠單抗或利妥昔 單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自三個健康供體的外周血的⑶137在⑶3XD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(A)顯示用⑶20_淋巴瘤細(xì)胞系(0CI-Lyl9)或CD20-陽性淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos，DHL-4，Raji)細(xì)胞系培養(yǎng)的來自三個健康供體的⑶137+細(xì)胞在⑶3TD56+NK細(xì)胞中的百分比。(B)顯示在淋巴瘤細(xì)胞系(0CI_Lyl9、Ramos,DHL-4和Raji)上的⑶20表面表達(dá)。根據(jù)淋巴瘤細(xì)胞系的MFI相對于同種型的MFI中的IoglO-倍增加對直方圖進(jìn)行著色。(C)顯示用⑶20-陽性淋巴瘤細(xì)胞系、Ramos和利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，來自代表性的健康供體的CD137在NK細(xì)胞亞群003工056胃和⑶3XD56 上的表達(dá)。圖2A-2F.抗⑶137激動性mAb增加腫瘤細(xì)胞上利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性。用下列五種條件培養(yǎng)24小時之后僅培養(yǎng)基KD20-陽性淋巴瘤細(xì)胞系(Raji、Ramos或DHL-4);腫瘤和利妥昔單抗；腫瘤和抗CD137抗體；或腫瘤、利妥昔單抗和抗CD137激動抗體(A, Raji, *p = . 01 ；B, Ramos, *p = . 003, C, DHL-4, *p = . 002)，分析從健康供體外周血中分離并純化的NK細(xì)胞的通過CD107a動員的脫顆粒。在鉻釋放試驗中分析NK細(xì)胞對Raji、Ramos和DHL-4腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(D-F)。與鉻標(biāo)記的Raji、Ramos和DHL-4細(xì)胞孵育4小時前，純化預(yù)激活的NK細(xì)胞(如材料和方法中描述的)。(D-F)顯示通過鉻釋放在不同的效應(yīng)物(激活的NK細(xì)胞)靶(Raji)細(xì)胞比率下用下列條件培養(yǎng)的靶細(xì)胞的裂解百分比僅用培養(yǎng)基( )、抗CD137(A)、利妥昔單抗( )或利妥昔單抗和抗CD137( ■)抗體(D, Raji, *p = . 01 ；E, Ramos, *p = . 01, F, DHL-4, *p = . 009)。 圖3A-3D.抗⑶137激動mAb增強鼠抗⑶20mAb的體內(nèi)抗淋巴瘤活性。用5X106BL3750淋巴瘤腫瘤細(xì)胞對C57BL/6小鼠皮下接種至腹部上。A-B)腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照( )、在第3天接受抗CD20抗體(■)、在第4天接受抗⑶137抗體( )，或在第3天接受抗⑶20抗體和在第4天接受抗⑶137抗體(▲)。然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A，*p < 001)和總存活率(B，*p = 048)。C-D)顯示具有相同治療順序但是治療延遲至腫瘤接種后8天的腫瘤生長和存活。小鼠或者在第8天接受大鼠IgG對照( )、在第8天接受抗CD20抗體(■)、在第9天接受抗CD137抗體( )，或在第8天接受抗CD20抗體和在第9天接受抗CD137抗體(▲)。然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(C，*p < . 001)和總存活率(D，*p < . 001)。圖4A-4B.抗⑶20和抗⑶137mAbs的組合活性要求適當(dāng)?shù)膍Ab施用順序。用5X106BL3750淋巴瘤腫瘤細(xì)胞對C57BL/6小鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照( )、在第3天接受抗CD20mAb和在第4天接受抗CD137mAb (A),或在第3天接受抗CD20mAb和在第3天接受抗CD137mAb (■) 然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A，*p < . 001)和總存活率(B，*p = . 001)。圖5A-5D.通過抗⑶137激動mAb對抗⑶20mAb的抗淋巴瘤活性的增強取決于NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。(A)對來自腫瘤接種后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血細(xì)胞亞群的 CD 137 在 CD3IL I+NK 細(xì)胞(NK)、F4/80+ 巨噬細(xì)胞(Mcp)和 CD3+CD8+T 細(xì)胞(CD8)和⑶3+CD4+T細(xì)胞(⑶4)上的表達(dá)進(jìn)行分析，其中小鼠在第3天用IgG對照或抗⑶20抗體進(jìn)行治療(n =每組3只小鼠，*p = . 001)。(B)對來自腫瘤接種后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的⑶137在⑶3-NK1. I+NK細(xì)胞(NK)、F4/80+巨噬細(xì)胞(Mtp)和⑶3+CD8+T細(xì)胞(CD8)和⑶3+⑶4+T細(xì)胞(CD4)上的表達(dá)進(jìn)行分析，其中小鼠在第3天用IgG對照或抗⑶20抗體進(jìn)行治療(n =每組3只小鼠Zp = . 012,NS =不顯著)。(C-D)用5X106BL3750淋巴瘤腫瘤細(xì)胞接種C57BL/6小鼠。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照( )、在第_1、0、5、10、15、20和25天接 受抗-脫唾液酸基-GMl且在第3天接受抗CD20抗體以及在第4天接受抗CD137抗體(■)、在第_2、0、4、8、12、16、20和24天接受氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(L.)且在第3天接受抗CD20抗體和在第4天接受抗CD137抗體(▼)，在第-1、0、5、10、15、20和25天接受抗⑶8mAb且在第3天接受抗⑶20抗體和在第4天接受抗⑶137抗體( )，或在第3天接受抗⑶20抗體和在第4天接受抗⑶137抗體(A)0然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(C，*p = 002)和總存活率(D，*p < 001)。圖6A-6C.在播散性人淋巴瘤異種移植模型中，抗⑶137激動mAb增強利妥昔單抗的體內(nèi)抗淋巴瘤活性。用3X IO6熒光素酶標(biāo)記的Raji淋巴瘤腫瘤細(xì)胞通過眼后竇靜脈接種SCID小鼠。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照( )、在第3天接受利妥昔單抗(■)、在第4天接受抗CD137抗體( )，或在第3天接受利妥昔單抗和在第4天接受抗⑶137抗體(A)。每周連續(xù)治療，總共4周。代表治療后第10、第20和第30天的小鼠的熒光素酶成像顯示于(A)中。然后監(jiān)測小鼠(每組5只)的定量生物發(fā)光(B，*p = 001)和總存活率(C，*p = 013)。圖7A-7C.利妥昔單抗包被的、自體淋巴瘤細(xì)胞誘導(dǎo)來自患有B細(xì)胞惡性腫瘤的人類患者的NK細(xì)胞上的CD137上調(diào)。僅用培養(yǎng)基、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自患有B細(xì)胞惡性腫瘤的人類患者的外周血和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的CD137在⑶3XD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)(A和B)。(A)顯示對于患有邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)帶有70% CTC的患者，⑶16和⑶137在⑶3TD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(B)顯示在患有濾泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、MZL、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)和⑶20陽性急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的25名患者的人群中⑶137+在^31056+沖(細(xì)胞中的百分比。(C)顯示用利妥昔單抗培養(yǎng)24小時之后，來自患有FL( )、CLL(_)、MZL(e)、DLBCL (' )和⑶20陽性ALL ( )的患者樣本的外周血CTC百分比和⑶137在⑶3TD56+NK細(xì)胞表面的表達(dá)之間的相關(guān)性，R2 = 0. 87，p < . 001。圖8A-8C.預(yù)激活后在NK細(xì)胞上的CD137誘導(dǎo)和時序表達(dá)(Temporalexpression)。用培養(yǎng)基、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、淋巴瘤細(xì)胞系(Raji、Ramos、DHL-4或0CI-Lyl9)和利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析從健康供體中純化的NK細(xì)胞的⑶137表達(dá)(A)。用Raji細(xì)胞系和利妥昔單抗培養(yǎng)0、4、16、24、48和72小時后，分析從健康供體中純化的NK細(xì)胞的CD137表達(dá)(B)。對于顯示于圖8C中的實驗，將來自代表性健康供體的外周血單核細(xì)胞用Raji、Ramos或DHL-4和利妥昔單抗孵育24小時。然后在進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗之前分析預(yù)激活的NK細(xì)胞的CD137表達(dá)(C)。圖9A-9B.抗⑶137激動mAb增加細(xì)胞因子的釋放和利妥昔單抗介導(dǎo)的預(yù)激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為了評價NK細(xì)胞干擾素-Y分泌，從健康PBMC中分離純化的NK細(xì)胞，并與利妥昔單抗(lOiig/mL)和福照的(5000拉德)淋巴瘤腫瘤細(xì)胞(Raji)以I : I的比例共同培養(yǎng)24小時。24小時后，NK細(xì)胞經(jīng)分離并用于純度評估(如通過⑶3TD56+流式細(xì)胞術(shù)確定的> 90%純度)(A-B)。預(yù)激活的純化的NK細(xì)胞然后僅在培養(yǎng)基中、或單獨用抗0)13711^13(81^-663513，101^/1^)、單獨用利妥昔單抗(10 y g/mL)或利妥昔單抗加上抗⑶137mAb (均為10 u g/mL)培養(yǎng)4小時，收獲上清并通過ELISA分析干擾素-、(A，*p= 027)。NK細(xì)胞對Raji腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性在鉻釋放試驗中進(jìn)行分析，在有或沒有在先的NK細(xì)胞預(yù)激活的情況下(B)。預(yù)激活的和未預(yù)激活的純化的NK細(xì)胞與鉻標(biāo)記的Raji孵育4小時。通過鉻釋放在不同的效應(yīng)物(連續(xù)的線表示預(yù)激 活的NK細(xì)胞，虛線表示未預(yù)激活的NK細(xì)胞)靶(Raji)細(xì)胞比率下用下列條件培養(yǎng)的靶細(xì)胞的裂解百分比僅用培養(yǎng)基( )、抗⑶137 ( ▲)、利妥昔單抗( )或利妥昔單抗和抗⑶137 ( ■)抗體fp = . 024)。圖10.抗⑶137激動mAb增加利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞脫顆粒。僅用培養(yǎng)基、⑶20-陽性淋巴瘤細(xì)胞系(Raji、Ramos或DHL-4)、腫瘤和利妥昔單抗、腫瘤和抗⑶137抗體、或腫瘤、利妥昔單抗、和抗CD137激動抗體培養(yǎng)24小時之后，分析從健康供體外周血分離并純化的NK細(xì)胞的⑶107a動員的脫顆粒。用Ramos培養(yǎng)后NK細(xì)胞上⑶107a表達(dá)的代表性流式細(xì)胞圖。圖IIA-11C.用HER2-陽性腫瘤細(xì)胞孵育之后，曲妥珠單抗誘導(dǎo)⑶137在人類NK細(xì)胞上的上調(diào)。用乳癌細(xì)胞系和IgG對照、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自三名健康供體的外周血的⑶137在⑶3TD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(A)顯示用HER2+乳癌細(xì)胞系(BT474M1)培養(yǎng)24小時后，來自代表性健康供體的⑶69+和⑶137+在⑶3TD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(B)顯示HER2在乳癌細(xì)胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3和HER18)上的表面表達(dá)。根據(jù)乳癌細(xì)胞系的MFI相對于同種型的MFI中的IoglO-倍增加對直方圖進(jìn)行著色。
(C)顯示用可變表達(dá)的HER2乳癌細(xì)胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3、HER18)培養(yǎng)24小時后，來自三個健康供體的⑶137在NK細(xì)胞⑶3TD56+上的表達(dá)。圖12A-12C.如通過細(xì)胞活力測定的，抗⑶137激動mAb增加曲妥珠單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。預(yù)激活的NK細(xì)胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小時之前進(jìn)行純化。(A-C)顯示用NK細(xì)胞、腫瘤、僅培養(yǎng)基、抗CD137、曲妥珠單抗、或曲妥珠單抗和抗CD137抗體培養(yǎng)之后，通過膜聯(lián)蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶細(xì)胞的百分比(A，MCF7細(xì)胞系，B，BT474M1 腫瘤系 *p = 03 ；C, HER18，**p < 01)。圖13.如通過鉻釋放測定的，抗⑶137激動mAb增加曲妥珠單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在鉻釋放試驗中分析NK細(xì)胞對BT474M1腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。預(yù)激活的NK細(xì)胞在用鉻標(biāo)記的BT474M1孵育4小時之前進(jìn)行純化。顯示的是通過鉻釋放在不同的效應(yīng)物(激活的NK細(xì)胞)靶(BT474M1)細(xì)胞比率下用下列條件培養(yǎng)的靶細(xì)胞的裂解百分比僅用培養(yǎng)基( )、抗CD137(V)、利妥昔單抗(▲)、或利妥昔單抗和抗CD137(_)抗體(P = 006)。圖14A-14B.抗⑶137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內(nèi)抗乳癌活性。皮下注射0. 72mg/60天釋放的P雌二醇丸之后I天，用5X 106BT474M1乳房腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。(A-B)腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照(籲)、在第3天接受曲妥珠單抗抗體(■)，在第4天接受抗CD137抗體( )，或在第3天接受曲妥珠單抗和第4天接受抗CD137抗體(▲)，每周重復(fù)各治療，共三周。然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A，*p < 001)和總存活率(B，**p = 003)。圖15A-15C.抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內(nèi)抗乳癌活性，同時保留了HER2特異性。皮下注射0. 72mg/60天釋放的P雌二醇丸之后I天，用5X 106MCF7乳房腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠在左側(cè)腹皮下接種，以及用5X 106HER18乳房腫瘤細(xì)胞在右側(cè)腹皮下接種。A-C)腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠單抗，或在第3天接受曲妥珠單抗和在第4天接受抗⑶137抗體，每周重復(fù)各治療，共三周。A)腫瘤模型。B)然后監(jiān)測代表性的小鼠(每組10只中的3只)的腫瘤生長 。C)治療組的腫瘤生長，腫瘤類型包括用曲妥珠單抗治療的小鼠左側(cè)腹的MCF7 (〇)和右側(cè)腹的HER18 ( □ □)，以及用曲妥珠單抗和抗CD137mAb治療的小鼠左側(cè)腹的MCF7 ( )和右側(cè)腹的HER18 ( ■ ) (*p < 001)。圖16.抗CD137激動mAb增強曲妥珠單抗體內(nèi)抗HER2+原發(fā)性乳房腫瘤的抗乳癌活性。200cGy全身輻射(TBI)后24小時，用I X 106HER2+原發(fā)性乳房腫瘤細(xì)胞通過乳房內(nèi)注射來接種SCID小鼠。在第40天，將小鼠隨機編入四組(每組5只小鼠)中的一組，包括在第40天治療的IgG對照( )、在第40天曲妥珠單抗治療(■)、在第41天抗⑶137mAb治療( )，或在第40天曲妥珠單抗且在第41天抗CD137mAb治療(▲)。在各組中每周重復(fù)治療，共三次治療。然后監(jiān)測小鼠的腫瘤生長Cp = . 016)。圖17A-17B.用EGFR-陽性腫瘤細(xì)胞孵育之后，西妥昔單抗誘導(dǎo)CD137在人類NK細(xì)胞上的上調(diào)。用頭頸癌細(xì)胞系和僅培養(yǎng)基、利妥昔單抗或西妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自三名健康供體的外周血的⑶137在⑶3TD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(A)顯示EGFR在頭頸癌細(xì)胞系(103、SCC4、PCU SCC6)上的表面表達(dá)。根據(jù)乳癌細(xì)胞系的MFI相對于同種型的MFI中的IoglO-倍增加對直方圖進(jìn)行著色。(B)顯示用可變表達(dá)的EGFR頭頸癌細(xì)胞系(SCC6、PC1和SCC4)培養(yǎng)24小時后，來自三個健康供體的⑶137在NK細(xì)胞⑶3TD56+上的表達(dá)。圖18A-18C.如通過細(xì)胞活力測定的，抗⑶137激動mAb增加西妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。預(yù)激活的NK細(xì)胞在用SCC6、PCl和SCC4孵育24小時之前進(jìn)行純化。(A-C)顯示用僅腫瘤、或腫瘤和NK細(xì)胞和培養(yǎng)基、西妥昔單抗、抗CD137、西妥昔單抗和抗CD137抗體培養(yǎng)之后，通過膜聯(lián)蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶細(xì)胞的百分比(A，SCC6, *p = . 002 ；B, PCI, **p = . Oil ；C, SCC4, ***p = . 001)。圖19.如通過鉻釋放測定的，抗⑶137激動mAb增加西妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在鉻釋放試驗中分析NK細(xì)胞對SCC6腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。新鮮的且預(yù)激活的NK細(xì)胞在用鉻標(biāo)記的SCC6細(xì)胞孵育5小時之前進(jìn)行純化。顯示的是通過鉻釋放在不同的效應(yīng)物(新鮮的NK細(xì)胞)靶(SCC6)細(xì)胞比率下用下列條件培養(yǎng)的靶細(xì)胞的裂解百分比僅用培養(yǎng)基( )、抗CD137 ( ▼)、西妥昔單抗(▲)、或西妥昔單抗和抗⑶137 ( ■)抗體Cp = . 003)，或者預(yù)激活的NK細(xì)胞作為效應(yīng)物和SCC6靶，且西妥昔單抗和抗⑶137( )抗體培養(yǎng)的靶細(xì)胞的裂解百分比( = . 002)。圖20.抗⑶137激動mAb增強西妥昔單抗的體內(nèi)抗頭頸癌活性。用3X 106SCC6頭頸腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第21天接受大鼠IgG對照( )、在第21天接受西妥昔單抗(■)、在第22天接受抗CD137抗體( )、或在第21天接受西妥昔單抗和在第22天接受抗CD137抗體(▲)，每周重復(fù)各治療，共三次治療。然后監(jiān)測小鼠(每組10只)的腫瘤生長(A，*p < . 001)。圖21A-21B—對患有頭頸癌的患者輸注西妥昔之后，循環(huán)NK細(xì)胞上調(diào)⑶137。分析來自患有頭頸癌的患者的新鮮外周血的⑶137在⑶3TD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。(A)顯示0期，生物標(biāo)志物，實驗方案(NCT01114256)。(B)顯示西妥昔單抗輸注之前和之后，新鮮外周血⑶3TD56+NK細(xì)胞中⑶137+細(xì)胞的百分比。
具體實施方式

提供了方法用于增強針對腫瘤抗原的單克隆抗體的抗腫瘤作用。在本發(fā)明的方法中，通過順序施用抗體的組合來加強ADCC功能并增強靶細(xì)胞殺傷。顯示相對于單一劑的施用，劑的組合和順序施用提供協(xié)同作用。針對腫瘤的抗體的施用上調(diào)可誘導(dǎo)的共刺激分子如CD137、0X40、GITR、CD30或ICOS在NK細(xì)胞上的表達(dá)，NK細(xì)胞是對ADCC關(guān)鍵的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞。隨后，施用靶向誘導(dǎo)的共刺激分子的第二激動抗體(包括但不限于抗-CD137、抗-0X40、抗-GITR、抗-⑶30或抗-IC0S)。在一些實施方式中，評價施用針對腫瘤的抗體之后上述共刺激分子的表達(dá)，以確定第二劑給藥的最佳時間?；蛘?，憑經(jīng)驗確定定時時間段，并且普遍適用。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體已經(jīng)在NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激分子，該方法允許特異性刺激ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷中涉及的NK細(xì)胞，而省去其它NK細(xì)胞，從而限制了潛在的非特異性副作用。進(jìn)一步說明本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不限于如此描述的具體實施方式
，正因為如此，當(dāng)然有變化。還應(yīng)理解本文所使用的術(shù)語僅出于描述具體實施方式
的目的，并無意進(jìn)行限制，因為本發(fā)明的范圍將只受到附加權(quán)利要求的限制。當(dāng)提供值的范圍時，應(yīng)理解除非另有指明，否則該范圍的上限和下限之間的和任何其它規(guī)定的各居中值或所規(guī)定范圍中的居中值至下限單位的十分之一涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。受限于規(guī)定范圍內(nèi)任何明確排除的限制，這些更小范圍的上限和下限可獨立地包含在更小的范圍內(nèi)，并也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。當(dāng)規(guī)定的范圍包括一個或兩個限制時，排除一個或兩個包括的限制的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)?？砂凑者壿嬌峡尚械乃鶖⑹鍪录娜魏雾樞蛞约八鶖⑹龅氖录樞騺韺嵤┍疚臄⑹龅姆椒?。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明的實踐或測試中，優(yōu)選現(xiàn)描述的方法和材料。本文提及的所有出版物納入本文作為參考，結(jié)合所引用的出版物來公開和描述方法和/或材料。必須指出，如本文和附加權(quán)利要求中所用，除非另有指明，否則單數(shù)形式“一”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。應(yīng)進(jìn)一步注意的是，這樣起草權(quán)利要求來排除任何可選的要素。正因如此，這種表述結(jié)合權(quán)利要求要素的敘述作為這種排除性術(shù)語如“僅”、“只”等的使用、或者作為“負(fù)”限制的使用的前提基礎(chǔ)。本文討論的出版物僅因為其在本申請?zhí)峤蝗罩肮_而提供。本文任何情況不能解釋為承認(rèn)本發(fā)明憑借在先的發(fā)明無權(quán)先于這種出版物。此外，提供的出版日期可能不同于實際的出版日期，這可能需要單獨證實。定義可誘導(dǎo)的共刺激分子。如本文所用，可誘導(dǎo)的共刺激分子是一種表達(dá)在免疫細(xì)胞(包括但不限于自然殺傷(NK)細(xì)胞)上的多肽，其表達(dá)在NK細(xì)胞激活期間被誘導(dǎo)或顯著上調(diào)。共刺激分子的激活增強效應(yīng)細(xì)胞的功能，例如增加由激活的NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC。這種可誘導(dǎo)的共刺激分子包括但不限于^137、(《 40、6幾1 、^30、10)5等，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這種分子的激動劑，包括結(jié)合并激活共刺激分子的抗體，是本發(fā)明方法所關(guān)注的。許多這種共刺激分子是腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)的成員。TNFR相關(guān)分子沒有任何已知的酶活性，并且依賴于細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的募集來激活下游信號通路。CD137。CD137，也可以稱為Ly63、ILA或4-1BB，是一種腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員。該受體家族的成員及其結(jié)構(gòu)上相關(guān)的配體是各種生理過程重要的調(diào)節(jié)子并在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。⑶137由激活的NK細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表達(dá)?；蚓幋a255個氨基酸的蛋白質(zhì)，其具有胞外域中的3個富含半胱氨酸的基序(該受體家族的特征)、跨膜區(qū)、以及含有潛在磷酸化位點的短N-端胞質(zhì)部分。原代細(xì)胞中的表達(dá)是嚴(yán)格激活依賴性的。該受體的配體是TNFSF9。報道人⑶137僅結(jié)合其配體。激動劑包括天然配體(TNFSF9)、適配體(見 McNamara 等人(2008) J. Clin. Invest. 118 :376-386)和抗體。CD134。0X40(CD134)及其結(jié)合伙伴0X40L (CD252)，是腫瘤壞死因子受體/腫瘤壞死因子超家族的成員，并表達(dá)于激活的T細(xì)胞以及一些其它淋巴和非淋巴細(xì)胞上。0X40和0X40L調(diào)節(jié)來自T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體信號傳導(dǎo)。GITR0糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)的(GITR)蛋白質(zhì)屬于腫瘤壞死因子受體/腫瘤壞死因子超家族，并刺激獲得性和固有免疫。它表達(dá)于幾種細(xì)胞和組織(包括T和自然殺傷(NK)細(xì)胞)中，并由其配體GITRL(主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上)激活。GITR/GITRL系統(tǒng)參與自身免疫/炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，并通過包括NK-細(xì)胞-共激活的機制加強對感染和腫瘤的反應(yīng)。CD30?？缒な荏wCD30 (TNFRSF8)及其配體CD30L (CD153，TNFSF8)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員，并顯示在激活的免疫細(xì)胞亞群中的限制表達(dá)。⑶30是一種TNF受體超家族的I型跨膜糖蛋白。⑶30的配體是⑶30L (⑶153)。⑶30對⑶30L的結(jié)合介導(dǎo)多效性作用，包括細(xì)胞增殖、激活、分化和凋亡的細(xì)胞死亡。可誘導(dǎo)的共刺激分子(ICOS)。ICOS是⑶28家族的成員。ICOS表達(dá)可能是可容易檢測到是靜止的，但激活后上調(diào)。ICOS和ICOS-L似乎是單配的一對。ICOS共刺激增強效應(yīng)物功能。“可誘導(dǎo)的共刺激分子激動劑”包括如上所述的天然配體、適配體、特異于激活受體的可誘導(dǎo)的共刺激分子的抗體、以及選擇性結(jié)合可誘導(dǎo)的共刺激分子的抗體的衍生物、變體和生物活性片段。“變體”多肽是指如下定義的具有與天然序列多肽100%以下序列一致性的一種生物活性多肽。該變體包括其中在天然序列的N-或C-端或在天然序列中添加有一個或多個氨基酸殘基的多肽；刪除約I至40個氨基酸殘基、以及任選被一個或多個氨基酸殘基取代的多肽；以及上述多肽的衍生物，其中氨基酸殘基被共價修飾從而獲得的產(chǎn)物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物活性變體將具有與天然序列多肽至少約90 %，優(yōu)選至少約95%，更優(yōu)選至少約99%氨基酸序列一致性的氨基酸序列。變體多肽可被天然地或非天然地糖基化，即多肽具有不同于在相應(yīng)天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的糖基化模式的糖基化模式。受關(guān)注的是特異于可誘導(dǎo)的共刺激分子的配體或抗體的片段，尤其是生物活性片段和/或?qū)?yīng)著功能域的片段。受關(guān)注片段通常長度上至少約IOaa至至少約15aa，通常在長度至少約50aa，但通常長度將不會超過200aa，其中片段將具有與其所源自的多肽一致的連續(xù)氨基酸延伸。“長度上至少20aa”的 片段例如意圖包括來自例如⑶137特異性抗體或來自TNFSF9的20個或更多連續(xù)的氨基酸。在本文中，“約”包括特定引用的值、或者多或少幾個(5、4、3、2或I)氨基酸的值。本文所述的蛋白質(zhì)變體由本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸編碼。遺傳密碼可用于選擇適當(dāng)?shù)拿艽a子來構(gòu)建相應(yīng)的變體。通過已知的方法，多核苷酸可用于生產(chǎn)多肽，且這些多肽可用于生產(chǎn)抗體?！叭诤稀倍嚯氖且环N包括融合至或結(jié)合至異源多肽的多肽或其部分(例如，一個或多個域)的多肽。在一些實施方式中，可誘導(dǎo)的共刺激分子激動劑是一種抗體。術(shù)語“抗體”或“抗體部分(moiety) ”意圖包括含有具有適合和識別表位的特定形狀的含任何多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，其中一個或多個非共價結(jié)合相互作用穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)和表位間的復(fù)合物。本發(fā)明利用的抗體可能是多克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體，因為它們可通過細(xì)胞培養(yǎng)或重組地進(jìn)行復(fù)制，并可經(jīng)過修飾來降低它們的抗原性。通過標(biāo)準(zhǔn)操作，通過用抗原組合物注射生產(chǎn)動物可產(chǎn)生多克隆抗體。見例如Harlow 和 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988。當(dāng)利用整個蛋白質(zhì)、或蛋白質(zhì)的較大段時，通過用蛋白質(zhì)和合適的佐劑(如，弗氏、弗氏完全的、水包油乳液等)免疫生產(chǎn)動物可產(chǎn)生抗體。當(dāng)利用較小的肽時，用較大的分子綴合肽來制備免疫刺激綴合物是有利的。用于這種目的的商業(yè)上可獲得的常用綴合蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(BSA)和鎖孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)。為了產(chǎn)生針對特定表位的抗體，可利用源自全序列的肽?；蛘?，為了產(chǎn)生針對蛋白質(zhì)靶的相對短的肽部分的抗體，如果多肽結(jié)合到載體蛋白質(zhì)(比如卵清蛋白、BSA或者KLH)上可引起優(yōu)異的免疫應(yīng)答?；蛘?，對于單克隆抗體,通過分離刺激的免疫細(xì)胞(比如來自接種動物脾的那些)可形成雜交瘤。這些細(xì)胞然后融合至永生細(xì)胞，如在細(xì)胞培養(yǎng)中能夠無限復(fù)制的骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而產(chǎn)生永生的、分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。此外，通過遺傳工程可產(chǎn)生抗體或抗原結(jié)合片段。當(dāng)向人類施用時產(chǎn)生較少免疫應(yīng)答的人源化、嵌合或異種人類抗體優(yōu)選用于本發(fā)明。除了整個免疫球蛋白(或它們的重組對應(yīng)物)以外,包括表位結(jié)合位點的免疫球蛋白片段(如，F(xiàn)ab'、F(ab' )2、或其它片段)可用作本發(fā)明的抗體部分。該抗體片段可通過蓖麻毒蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、或其它蛋白酶切割產(chǎn)生自整個的免疫球蛋白?？衫弥亟M免疫球蛋白技術(shù)設(shè)計“片段”或最小的免疫球蛋白。例如，可通過將可變輕鏈區(qū)經(jīng)過肽接頭(如，不形成a螺旋或P片層基序的聚甘氨酸或其它序列)連接至可變重鏈區(qū)產(chǎn)生用于本發(fā)明的“ Fv ”免疫球蛋白?！霸鰪娦省笔侵?，與用單一劑(如特異于腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體)所觀察到的凋亡水平相比，ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的增加。協(xié)同的，是指劑的組合提供比單一劑高的效果，這種效果可以高于所組合的各劑的添加的效果。針對腫瘤的抗體。一些抗體目前正在臨床中用于癌癥治療，而其它的正處于臨床開發(fā)的不同階段。本發(fā)明方法的受關(guān)注抗體通過ADCC發(fā)揮作用，并典型地對腫瘤細(xì)胞有選擇性，盡管如此本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到一些臨床上有用的抗體實際上作用于非腫瘤細(xì)胞如 CD20。有許多抗原和相應(yīng)的單 克隆抗體用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤。一種流行的靶抗原是CD20，其發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞惡性腫瘤上。利妥昔單抗是一種針對CD20抗原的嵌合的未綴合的單克隆抗體。CD20在B細(xì)胞激活、增殖和分化中有重要功能作用。單克隆抗體阿侖單抗靶向⑶52抗原，阿侖單抗表明對慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療。⑶22為一些抗體所靶向并且最近已證實與毒素組合在化療耐受性毛細(xì)胞白血病中的療效。兩個新的靶向CD20的單克隆抗體，托西莫單抗和替伊莫單抗，已提交給食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)。這些抗體與放射性同位素綴合。本發(fā)明方法中有用的單克隆抗體包括但不限于依決洛單抗和曲妥珠單抗(赫賽汀)，已用于實體瘤。依決洛單抗靶向見于結(jié)腸癌和直腸癌的17-1A抗原，并已在歐洲批準(zhǔn)用于這些適應(yīng)癥。其抗腫瘤作用是通過ADCC、CDC和抗獨特型網(wǎng)絡(luò)的誘導(dǎo)所介導(dǎo)的。曲妥珠單抗祀向HER-2/neu抗原。該抗原見于25%至35%的乳癌。曲妥珠單抗被認(rèn)為以各種方式發(fā)揮作用下調(diào)ffiR-2受體表達(dá)、抑制過度表達(dá)HER-2蛋白質(zhì)的人腫瘤細(xì)胞的增殖、增強免疫更新(immune recruitment)和抗過度表達(dá)HER-2蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞的ADCC、以及下調(diào)血管生成因子。阿侖單抗(Campath)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血??；結(jié)腸癌和肺癌；發(fā)現(xiàn)吉妥單抗(Mylotarg)用于治療急性骨髓性白血??；發(fā)現(xiàn)替伊莫單抗(Zevalin)用于治療非霍奇金氏淋巴瘤；發(fā)現(xiàn)帕尼單抗(Vectibix)用于治療結(jié)腸癌。在本發(fā)明方法中使用西妥昔單抗(Erbitux)也是受關(guān)注的。抗體結(jié)合至EGF受體(EGFR)，并已用于治療實體瘤，包括結(jié)腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)。術(shù)語“生物樣本”包括多種獲自生物體的樣本類型，并且可用于診斷或監(jiān)測試驗。該術(shù)語包括生物來源的血液和其它液體樣本、固體組織樣本，如活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或由此衍生的細(xì)胞及其后代。該術(shù)語包括獲取之后以任何方式操作過的樣本，比如用試劑處理、溶解或某些成分的富集。該術(shù)語包括臨床樣本，還包括細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物體液和組織樣本。術(shù)語“癌癥”、“贅生物”、“腫瘤”和“癌”本文互換使用是指這樣的細(xì)胞，其表現(xiàn)相對自主的生長細(xì)胞，從而它們表現(xiàn)出一種異常的生長表型，特征在于細(xì)胞增殖控制的顯著喪失。在一般情況下，本申請中檢測或治療的受關(guān)注的細(xì)胞包括癌前的(例如，良性)、惡性的、轉(zhuǎn)移前的、轉(zhuǎn)移的和非轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。特別受關(guān)注的是癌細(xì)胞的檢測。如“正常細(xì)胞”的情況中所用的術(shù)語“正?！笔侵肝崔D(zhuǎn)化表型的細(xì)胞或表現(xiàn)出被檢查組織類型的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。“癌癥表型” 一般是指癌細(xì)胞特有的任何各種生物現(xiàn)象，這些現(xiàn)象可以隨著癌癥類型而不同。癌癥表型通常通過例如在細(xì)胞生長或增殖(如，不受控制的生長或增殖)、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞運動、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、或轉(zhuǎn)移等方面的異常來確定。受關(guān)注癌癥包括但不限于包括白血病的造血性癌癥、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病；肉瘤；黑色素瘤、腺瘤、實體組織癌、口腔、咽喉、喉和肺的鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥如子宮頸癌、膀胱癌和腎細(xì)胞癌、頭頸癌、胃腸道癌和神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、良性病變?nèi)缛轭^狀瘤等。短語“實體瘤”如本文所用是指通常不包含囊腫或液體區(qū)域的組織的異常團塊。實體瘤可能是良性或惡性的。不同類型的實體瘤根據(jù)形成它們的細(xì)胞類型而命名。實體瘤的實例是肉瘤、癌、淋巴瘤等。針對特定的癌癥表位或表位組合的單克隆抗體允許靶向和/或耗盡表達(dá)標(biāo)志物的癌細(xì)胞群。使用單克隆抗體的各種技術(shù)可用于篩選表達(dá)標(biāo)志物的細(xì)胞群，并包括使用抗體包被的磁珠的磁分離、用附著到固體基質(zhì)(即板)上的抗體“篩選”和流式細(xì)胞術(shù)(見，例如，美國專利5, 985, 660 ;Morrison等人，Cell, 96 :737-49 (1999))。這些技術(shù)允許在活檢樣本的免疫組織化學(xué)中；在檢測從癌細(xì)胞脫落入 血液和其它生物體液中的標(biāo)志物的存在中等用于篩選特定的細(xì)胞群。本文所用術(shù)語“治療”、“治”、“處理”等通常是指獲得希望的藥物和/或生理作用。該作用在完全或部分防止疾病或其癥狀方面可以是預(yù)防性的，和/或在部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或可由疾病引起的不利作用方面可以是治療性的。如本文所用“治療”覆蓋哺乳動物中(尤其是人)任何疾病的治療，并包括(a)在對疾病或癥狀易感的但是尚未診斷患有疾病或癥狀的對象中，防上上疾病或癥狀的發(fā)生；(b)抑制疾病的癥狀，即停滯其發(fā)展；或(C)減輕疾病的癥狀，即引起疾病或癥狀的消退。術(shù)語“受體”、“個體”、“對象”、“宿主”和“患者”本文互換使用，并且是指需要診斷、治療或療法的任何哺乳動物對象，特別是人類。“治療靶”是指由腫瘤細(xì)胞和/或非腫瘤(免疫)細(xì)胞表達(dá)的分子，其可以被靶向來誘導(dǎo)或增強抗腫瘤活性。方法提供增強由針對腫瘤細(xì)胞的抗體的施用所誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效率的方法。向患者施用有效劑量的針對腫瘤的第一抗體，其誘導(dǎo)可誘導(dǎo)的共刺激分子如⑶137、0X40、GITR、⑶30或ICOS在NK細(xì)胞上的上調(diào)，NK細(xì)胞是對于ADCC關(guān)鍵的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞。隨后，向所述個體施用有效劑量的抗這些分子之一的第二激動抗體，這些分子包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30或IC0S，其中第二抗體足以增強第一抗體所靶向的腫瘤細(xì)胞的ADCC殺傷。因為第二抗體靶向已通過針對腫瘤的抗體在NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激分子，該方法允許特異性刺激ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷中涉及的NK細(xì)胞，而省去其它NK細(xì)胞，從而限制了潛在的非特異性副作用。在一些實施方式中，在患者樣本(通?；颊叩难簶颖净蚱浼?xì)胞部分)中確定由針對腫瘤的抗體誘導(dǎo)的共刺激分子(包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30、或ICO)的水平。作為基線，可以在施用針對腫瘤的抗體之前，確定樣本中共刺激分子的水平，和可以在施用針對腫瘤的抗體之后確定表達(dá)的提聞。在本發(fā)明的一些實施方式中，向患者施用有效劑量的腫瘤選擇性抗體，隨后經(jīng)過足夠的時間使得CD137在免疫系統(tǒng)細(xì)胞(尤其是NK細(xì)胞)上的表達(dá)上調(diào)。該足夠的時間通常是至少約12小時，更通常至少約18小時，通常至少約24小時，并可能至少約2天，至少約3天，并且不超過約5天，通常不超過約4天。⑶137上調(diào)之后，向所述個體施用有效劑量的CD137激動劑，其中激動劑足以增強由第一抗體所靶向的腫瘤細(xì)胞的ADCC殺傷。在一些實施方案中，在患者樣本(通?；颊叩难簶颖净蚱浼?xì)胞部分)中確定⑶137的水平。作為基線，可以在施用腫瘤選擇性抗體之前，確定樣本品中CD137的水平，和可以在施用腫瘤選擇性抗體之后確定表達(dá)的提高。⑶137在NK細(xì)胞上的表達(dá)希望的增加是至少約I. 5倍，至少約2倍或更高。當(dāng)在整體血細(xì)胞中測量吋，由于污染的非反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，表達(dá)增加可能較低。“降低癌細(xì)胞的生長”包括但不僅限于，減少癌細(xì)胞的増殖和提高腫瘤細(xì)胞的凋亡。利用任何已知的試驗，包括但不限于摻加[3H]-胸苷；計數(shù)一段時間的細(xì)胞數(shù)目；檢測和/或測量與相關(guān)癌癥有關(guān)的標(biāo)志物等，可以容易地確定是否已實現(xiàn)癌細(xì)胞生長的減少。利用任何已知的癌癥診斷試驗，包括但 不限于活體檢查、對比射線照相研究、CAT掃描和在個體血液中檢測與癌癥相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，可以評價一種物質(zhì)或特定量的該物質(zhì)在治療癌癥中是否有效?？梢匀砘蚓植?，通常是全身施用物質(zhì)。制劑通過將具有所需純度程度的抗體與任選的生理可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，為了保存可作為凍干制劑或水溶液的形式來制備包括用于本發(fā)明方法中的ー種或多種抗體的治療制劑(Remington, s Pharmaceutical Sciences第 16版，Osol,A. Ed. (1980))。以與良好醫(yī)療操作一致的方式配制、制劑和施用抗體組合物。在這方面考慮的因素包括正在接受治療的特定癌癥、個體患者的臨床狀況、劑的遞送位點、施用方法、施用計劃和醫(yī)療操作者已知的其他因素。待施用的抗體“治療有效量”將受到這種考慮的控制。治療劑量可能是至少約O. 01μ g/kg體重，至少約O. 05 μ g/kg體重；至少約O. I μ g/kg體重,至少約O. 5 μ g/kg體重,至少約I μ g/kg體重,至少約2. 5 μ g/kg體重,至少約5 μ g/kg體重,并且不超過約100 μ g/kg體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這些準(zhǔn)則將根據(jù)如在使用抗體片段中，或在使用抗體綴合物中活性劑的分子量進(jìn)行調(diào)整。劑量還可能根據(jù)施用途徑變化。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度時對于受體是無毒的，并包括緩沖劑比如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸等；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸 ，防腐劑(比如氯化十八烷基ニ甲基芐基銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基苯甲酸酯類比如甲基或丙基苯甲酸酯；鄰苯ニ酚；間苯ニ酚；環(huán)己醇；3_戊醇；間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物比如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、ニ糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑比如EDTA ;糖比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的反離子比如鈉；金屬復(fù)合物(如，鋅蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN. TM. ,PLUR0NICS. TM.或聚こニ醇(PEG)。待用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這很容易通過穿過無菌過濾膜的過濾實現(xiàn)。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，提供了含有用于治療上述疾病的材料的制造的物品。制造的物品包括容器和標(biāo)簽。合適的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。容器盛放對治療病癥有用的組合物，并且可具有無菌入口(例如，容器可能是靜脈溶液袋或具有皮下注射針可穿刺的塞的小瓶)。組合物中的活性劑是ー種或多種上述抗體。容器上的或結(jié)合的標(biāo)簽表明組合物用于治療所選擇的條件。制造的物品可還包括第二容器，其包含藥學(xué)上可接受的緩沖液比如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏液和右旋糖溶液。它可還包括其它材料，從商業(yè)和用戶的角度來看所需的其它緩沖劑、稀釋齊IJ、過濾器、針、注射器和帶有使用說明的包裝內(nèi)冊。適用于本發(fā)明方法的抗體和激動劑可作為試劑盒的形式提供，例如存在于含有一個或多個含有活性成分的單位劑型的包裝或分裝裝置中。該包裝或裝置可例如包括金屬或塑料箔，比如吸塑包裝。包裝或分裝裝置可附有施用說明。也可制備包括可以配制于兼容的藥物載體中的用于本發(fā)明方法的劑的組合物，將其置于適當(dāng)?shù)娜萜髦幸约百N上用于治療指示的病癥的標(biāo)簽。標(biāo)簽上指示的適用條件可包括癌癥的治療。試劑盒還包括適于測量NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)的共刺激分子的表達(dá)的單元，如包括特異性結(jié)合可誘導(dǎo)的共刺激分子的可檢測的帶標(biāo)記的試劑，和表達(dá)參照物以 及本領(lǐng)域已知的等。實驗十年前治療癌癥的范例限于常規(guī)細(xì)胞毒性的化療，假設(shè)迅速増殖的腫瘤細(xì)胞對劑(比如細(xì)胞周期抑制劑或DNA損傷劑)的敏感性増加。隨著食品和藥物管理局對利妥昔單抗的批準(zhǔn)，這種范例在1997年改變了，利妥昔單抗是首個治療性單克隆抗體并靶向表面標(biāo)志物CD20用于非霍奇金淋巴瘤的治療。單克隆抗體比常規(guī)細(xì)胞毒性的化療具有獨特的優(yōu)勢，即良好的耐受性，且較小的系統(tǒng)性毒性，對腫瘤的選擇性和最小的脫靶效應(yīng)，以及靶向未經(jīng)歷頻繁有絲分裂的緩慢増殖的細(xì)胞的能力。利妥昔單抗的批準(zhǔn)之后，在1998年批準(zhǔn)了曲妥珠單抗用于HER2+乳癌，它是ー種抗HER2(人類表皮生長因子受體2)的人源化IgGl抗體。在2004年批準(zhǔn)了西妥昔單抗用于結(jié)直腸癌，它是ー種靶向EGFR(表皮生長因子受體)的嵌合的IgGl抗體。在2006年，西妥昔單抗還被批準(zhǔn)用于治療頭頸癌。正如最近HER2+胃癌和食管癌的鑒定所證明的，癌癥療法現(xiàn)在的重點是發(fā)現(xiàn)新的或當(dāng)前的抗體可以靶向的新型的和已知的靶。與常規(guī)化療相比，單克隆抗體證明最小的直接的細(xì)胞毒性。盡管證據(jù)支持多種抗體功能的機制，抗腫瘤活性的主要機制是通過抗體依賴性細(xì)胞細(xì)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。通過ADCC發(fā)生的細(xì)胞毒性是由帶有Fe受體的自然殺傷(NK)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞介導(dǎo)的，F(xiàn)e受體結(jié)合抗體靶向的腫瘤細(xì)胞。結(jié)合至抗體的NK細(xì)胞Fe受體激活NK細(xì)胞，導(dǎo)致釋放觸發(fā)抗體靶向的腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒。提高的NK細(xì)胞的功能加強了 ADCC并產(chǎn)生改進(jìn)的抗腫瘤活性。識別抗體包被的腫瘤細(xì)胞后，本發(fā)明鑒定在NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激分子，NK細(xì)胞是對于ADCC關(guān)鍵的固有效應(yīng)細(xì)胞。被針對腫瘤的抗體上調(diào)之后，這些共刺激分子(包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30、或IC0S)可以隨后用激動抗體靶向來增強這些效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC。鑒于越來越多的針對腫瘤的靶特異性抗體，這對于單克隆抗體所直接靶向的任何癌癥類型都具有治療意義。增強NK細(xì)胞功能的激動抗體的臨床益處僅受到腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的靶和靶特異性抗體的數(shù)目的限制。鑒于利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗在過去十年的影響，發(fā)現(xiàn)靶和抗體的努力似乎仍然是活躍的研究領(lǐng)域。盡管激動性NK細(xì)胞抗體的應(yīng)用將擴展到非霍奇金淋巴瘤、乳癌、結(jié)直腸癌和頭頸癌以外，這四種仍然證明了臨床益處的大小。抗體包被的腫瘤細(xì)胞觸發(fā)NK細(xì)胞的激活，NK細(xì)胞的殺傷活性然后可以通過抗CD 137的第二激活抗體被刺激。激動性抗CD137抗體的加入是增強任何抗腫瘤抗體的治療作用的通用方法。
實施例INK細(xì)胞暴露于利妥昔單抗包被的⑶20+淋巴瘤后，發(fā)生增強的⑶137的NK細(xì)胞表達(dá)。用激動抗體靶向CD137來增強抗腫瘤的ADCC依賴于其在暴露于抗體包被的腫瘤細(xì)胞之后在NK細(xì)胞上増加的表面表達(dá)。因為第二抗體靶向通過針對腫瘤的抗體(利妥昔單杭、曲妥珠單抗)在NK細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激分子(CD137)，該方法允許特異性刺激ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞(淋巴瘤、乳癌)殺傷中涉及的NK細(xì)胞，而省去其它NK細(xì)胞，從而限制了潛在的非特異性副作用。我們從由于慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)和⑶20+急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)而具有循環(huán)CD20+腫瘤細(xì) 胞的患者中分離了外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養(yǎng)之后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析PBMC。用利妥昔單抗培養(yǎng)之后，⑶137+NK細(xì)胞百分比從基線處的1-2%增加至22-43%，同時⑶16(Fc受體)下調(diào)。這似乎是抗體依賴性的，因為用曲妥珠單抗培養(yǎng)后沒有發(fā)生激活。如圖1A-1C所示，用CD20陽性腫瘤B細(xì)胞孵育之后，利妥昔單抗誘導(dǎo)CD137在人NK細(xì)胞上的上調(diào)。用淋巴瘤細(xì)胞系和曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自三個健康供體的外周血的CD137在CD3_CD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)?？笴D137激動mAb增加利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，如圖2A-2F所示。用下列五種條件培養(yǎng)24小時之后僅培養(yǎng)基fD20-陽性淋巴瘤細(xì)胞系(Raji、Ramos或DHL-4);腫瘤和利妥昔單抗；腫瘤和抗CD137抗體；或腫瘤、利妥昔單抗和抗CD137激動抗體，分析從健康供體外周血中分離并純化的NK細(xì)胞的通過CD 107a動員的脫顆粒。如圖3A-3D中所示，也有抗⑶137激動mAb的抗淋巴瘤活性的增強。如圖4A-4B所示，抗⑶20和抗⑶137mAb組合活性需要適當(dāng)?shù)膍Ab施用順序，并依賴于NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。圖5A- 中顯示，對來自腫瘤接種后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血細(xì)胞亞群的CD137在CD3-NK1. I+NK細(xì)胞(NK)、F4/80+巨噬細(xì)胞(Mcp)、CD3+CD8+T細(xì)胞(⑶8)和⑶3+⑶4+T細(xì)胞(⑶4)上的表達(dá)進(jìn)行分析，其中小鼠在第3天用IgG對照或抗CD20抗體進(jìn)行治療；對來自腫瘤接種后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的⑶137在⑶3 Κ1. I+NK細(xì)胞(NK)、F4/80+巨噬細(xì)胞(Μφ )、⑶3+⑶8+T細(xì)胞(⑶8)和⑶3+CD4+T細(xì)胞(⑶4)上的表達(dá)進(jìn)行分析，其中小鼠在第3天用IgG對照或抗⑶20抗體進(jìn)行治療。通過用利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗在異種移植無胸腺的裸鼠模型中測試⑶137Ab的活性，驗證了在同系小鼠模型中觀察到的抗⑶20Ab和抗⑶137Ab療法的協(xié)同作用是有效的。這種模型之前用于利妥昔單抗、曲妥珠單抗和西妥昔單抗的臨床前測試。在淋巴瘤模型中，Balb/c裸nu/nu小鼠在第O天接種3X IO6轉(zhuǎn)染有螢火蟲熒光素酶的Raji細(xì)胞，并在第3天用利妥昔單抗治療(10 μ g/g體重，IP)，隨后在第4天用150 μ g大鼠抗小鼠抗⑶137Ab IP治療。在第3天利妥昔單抗治療前收集血液、在第4天抗⑶137Ab IP治療前收集血液、以及在第5天收集血液，分析⑶137、⑶69和⑶16的NK細(xì)胞的表達(dá)。在第3天Ab療法之前，IP熒光素注射(200 μ L)后進(jìn)行生物發(fā)光成像，每周重復(fù)。用利妥昔單抗的⑶137的效果顯示于播散性人類淋巴瘤異種移植模型中，如圖6A-6C所示。利妥昔單抗包被的自體淋巴瘤細(xì)胞誘導(dǎo)⑶137在來自患有B細(xì)胞惡性腫瘤的人類患者的NK細(xì)胞上的上調(diào)，如圖7A-7C中所示。僅用培養(yǎng)基、曲妥珠單抗或利妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自患有B細(xì)胞惡性腫瘤的人類患者的外周血和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的⑶137在⑶3-⑶56+NK細(xì)胞上的表達(dá)。圖8A-8C中預(yù)激活后分析NK細(xì)胞上⑶137的誘導(dǎo)和時序表達(dá)的動力學(xué)。用抗⑶20Ab或抗⑶137Ab單ー療法降低約50%的腫瘤生長。然而，所有用抗⑶20Ab治療的小鼠在60天之前死亡，而僅50%用抗⑶137Ab治療的小鼠腫瘤接種后生存100天。在第3天用抗⑶20Ab治療隨后在第4天用抗⑶137Ab治療導(dǎo)致腫瘤完全消退并且90%的小鼠存活100天。為了確定所觀察到的協(xié)同作用是否依賴于NK細(xì)胞功能，在第-1、O天和此后每5天直至第20 天用抗-脫唾液酸基-GMl耗盡NK細(xì)胞，在這一點上觀察到清晰的治療組的分離。用抗-脫唾液酸基-GMl耗盡NK細(xì)胞取消了組合療法的好處。抗CD137激動mAb増加細(xì)胞因子的釋放和利妥昔單抗介導(dǎo)的預(yù)激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，如圖9A-9B所示。為了評價NK細(xì)胞干擾素Y分泌，從健康PBMC中分離純化的NK細(xì)胞，并與利妥昔單抗(10μ g/mL)和輻照的(5000拉德)淋巴瘤腫瘤細(xì)胞(Raji)以I : I的比例共同培養(yǎng)24小吋。24小時后，NK細(xì)胞經(jīng)分離并用于純度評估。預(yù)激活的純化的NK細(xì)胞然后僅在培養(yǎng)基中、或単獨用抗CD137mAb、単獨用利妥昔單抗或利妥昔單抗加上抗CD137mAb培養(yǎng)4小吋，收獲上清并通過ELISA分析干擾素-Y。NK細(xì)胞對Raji腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性在鉻釋放試驗中進(jìn)行分析，在有或沒有在先的NK細(xì)胞預(yù)激活的情況下。抗CD137激動mAb還增加利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞脫顆粒，顯示于圖10中。實施例2NK細(xì)胞暴露于曲妥珠單抗包被的HER2+乳癌后，發(fā)生增加的⑶137的NK細(xì)胞表達(dá)。然后，我們確定它們在暴露于曲妥珠單抗包被的乳癌之后，是否⑶137在NK細(xì)胞上的表達(dá)同樣地増加。我們從健康供體的血液中分離NK細(xì)胞并將它們連同曲妥珠單抗或利妥昔單抗一起加入到乳癌細(xì)胞系中保持24小時，所述乳癌細(xì)胞系包括MCF7(非表達(dá)HER2的乳癌細(xì)胞系)和SKBR3 (過度表達(dá)HER2的乳癌細(xì)胞系)。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞的⑶137表達(dá)，如圖11所示。用如上所述針對乳癌細(xì)胞系的西妥昔單抗(10 μ g/mL)、利妥昔單抗(10 μ g/mL)或曲妥珠單抗(lOyg/mL)包被的適當(dāng)腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)之后確定CD137的NK細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)行⑶3和⑶56的流式細(xì)胞術(shù)來評價NK細(xì)胞分離物的純度。包括⑶69、⑶107和CD16的其它激活標(biāo)志物包括在流式細(xì)胞術(shù)的面板中。結(jié)腸癌細(xì)胞系包括HCT-8 (EGFR+)和SW620 (EGFR)，以及鱗狀的頭頸癌細(xì)胞系包括TE3 (EGFR+HER20和TE4 (EGFITHER2+)。如圖12A-12C所示，如通過細(xì)胞活力測定的，抗⑶137激動mAb增加曲妥珠單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。預(yù)激活的NK細(xì)胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小時之前進(jìn)行純化，并評價凋亡。還通過鉻釋放試驗確定激活的NK細(xì)胞經(jīng)抗體和腫瘤細(xì)胞刺激之后的功能能力。為了研究抗HER2+乳癌的活性，從正常血液中分離的NK細(xì)胞通過與SKBR3 (HER2+)和曲妥珠單抗共培養(yǎng)而激活。通過流式細(xì)胞術(shù)測試這些暴露的NK細(xì)胞的CD137和CD69的表達(dá)以評價其激活。激活的NK細(xì)胞按照12. 5 1、25 1、50 I和100 I的比例連同曲妥珠單抗(10μ g/mL)、抗 CD137Ab(10y g/mL)、或曲妥珠單抗 + 抗 CD137Ab (均為 10 μ g/mL) —起加入到鉻標(biāo)記的SKBR3靶細(xì)胞中。用HCT-8 (EGFR+)細(xì)胞系和西妥昔單抗進(jìn)行相似的激活和殺傷試驗來研究抗EGFR+結(jié)腸癌的體外功能活性、用TE3 (EGFR+HER2_)細(xì)胞系和西妥昔單抗進(jìn)來研究EGFR+頭頸癌的體外功能活性。如圖13中所示，如通過鉻釋放測定的，抗CD137激動mAb增加曲妥珠單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在同系小鼠淋巴瘤模型中已經(jīng)提供了支持性的證據(jù)，抗⑶137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內(nèi)抗乳癌活性。如圖14A-14B所示，皮下注射O. 72mg/60天釋放的β雌ニ醇丸之后I天，用5Χ106ΒΤ474Μ1乳房腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG對照、在第3天接受曲妥珠單抗抗體，在第4天接受抗CD 137抗體、或在第3天接受曲妥珠單抗且在第4天接受抗CD137抗體，每周重復(fù)各治療，共三周。然后監(jiān)測小鼠的腫瘤生長和 總存活率。如圖15A-15C所示，抗⑶137激動mAb增強曲妥珠單抗的體內(nèi)抗乳癌活性，同時保留了 HER2特異性。皮下注射O. 72mg/60天釋放的β雌ニ醇丸之后I天，用5Χ 106MCF7乳房腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠在左側(cè)腹皮下接種，以及用5X 106HER18乳房腫瘤細(xì)胞在右側(cè)腹皮下接種。腫瘤接種后，小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠單抗，或在第3天接受曲妥珠單抗和在第4天接受抗CD137抗體，每周重復(fù)各治療，共三周。然后監(jiān)測代表性的小鼠的腫瘤生長。如圖16所示，抗⑶137激動mAb增強曲妥珠單抗體內(nèi)抗HER2+原發(fā)性乳房腫瘤的抗乳癌活性。200cGy全身輻射(TBI)后24小時，用I X 106HER2+原發(fā)性乳房腫瘤細(xì)胞通過乳房內(nèi)注射來接種SCID小鼠。在第40天，將小鼠隨機編入四組中的ー組，包括在第40天治療的IgG對照、在第40天曲妥珠單抗治療、在第41天抗CD137mAb治療、或在第40天曲妥珠單抗且在第41天抗⑶137mAb治療。在各組中每周重復(fù)治療，共三次治療。然后監(jiān)測小鼠的腫瘤生長。實施例3如圖17A-17B所示，用EGFR-陽性腫瘤細(xì)胞孵育之后，西妥昔單抗誘導(dǎo)⑶137在人類NK細(xì)胞上的上調(diào)。用頭頸癌細(xì)胞系和僅培養(yǎng)基、利妥昔單抗或西妥昔單抗培養(yǎng)24小時后，分析來自三名健康供體的外周血的⑶137在⑶3てD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)，和顯示已增加的表達(dá)。如圖18A-18C所示，如通過細(xì)胞活力測定的，抗⑶137激動mAb增加西妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。預(yù)激活的NK細(xì)胞在用SCC6、PCl和SCC4孵育24小時之前進(jìn)行純化。用僅腫瘤、或腫瘤和NK細(xì)胞和培養(yǎng)基、西妥昔單抗、抗CD137、西妥昔單抗和抗CD137抗體培養(yǎng)之后，通過膜聯(lián)蛋白和7AAD活力染色確定凋亡靶細(xì)胞的百分比。如通過鉻釋放測定的，抗CD137激動mAb增加西妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。NK細(xì)胞對SCC6腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性在鉻釋放試驗中進(jìn)行測定。新鮮的且預(yù)激活的NK細(xì)胞在用鉻標(biāo)記的SCC6細(xì)胞孵育5小時之前進(jìn)行純化。圖19中顯示的是通過鉻釋放在不同的效應(yīng)物(新鮮的NK細(xì)胞)祀(SCC6)細(xì)胞比率下靶細(xì)胞的裂解百分比?？笴D137激動mAb增強西妥昔單抗的體內(nèi)抗頭頸癌活性。如圖20所示，用3X IO6SCCe頭頸腫瘤細(xì)胞對nu/nu裸鼠皮下接種至腹部上。腫瘤接種后，小鼠或者在第21天接受大鼠IgG對照、在第21天接受西妥昔單抗、在第22天接受抗CD137抗體、或在第21天接受西妥昔單抗且在第22天接受抗⑶137抗體，每周重復(fù)各治療，共三次治療。然后監(jiān)測小鼠的腫瘤生長。此外還顯示，對患有頭頸癌的患者輸注西妥昔之后，循環(huán)NK細(xì)胞上調(diào)⑶137 (圖21A-21B)。分析來自患有頭頸癌的患者的新鮮外周血的⑶137在⑶3てD56+NK細(xì)胞上的表達(dá)，和顯示所述表達(dá)被上調(diào)。當(dāng)NK細(xì)胞暴露于抗體包被的腫瘤細(xì)胞之后激活出現(xiàn)在NK細(xì)胞上的特異性靶(⑶137)、以及針對這些宿主細(xì)胞上的⑶137靶的第二抗體在多種腫瘤模型中具有協(xié)同抗腫瘤活性，這種表現(xiàn)是創(chuàng)新的且對于患者護理有高度的影響。激動性抗CD137抗體(例如BMS-663513)目前在多個大型制藥公司正處于早期階段的臨床試驗中以及臨床前開發(fā)中。在I期和II期臨床試驗中，約300名患者已經(jīng)用BMS抗體進(jìn)行了治療。已觀察到可忽略的單劑活性，反應(yīng)率低于10%。基于我們的體外數(shù)據(jù)，沒有共存的針對腫瘤的抗體(比如利妥昔單杭)時，沒有觀察到顯著的NK細(xì)胞功能的増加。然而，當(dāng)兩種抗體 組合時NK細(xì)胞的功能顯著增加。盡管在實體瘤中最小的單劑活性，因為有機會證明抗CD137組合抗體療法的臨床價值，所以本發(fā)明具有高度的重要性。以通過免疫調(diào)節(jié)的協(xié)同作用為基礎(chǔ)的療法是創(chuàng)新的，且成為轉(zhuǎn)變改善患有很多類型癌癥的患者生存的方法的范例。更廣泛地，除了⑶137以外，我們已經(jīng)觀察到ー些當(dāng)暴露于抗體包被的腫瘤細(xì)胞后在NK細(xì)胞上被上調(diào)的其它共刺激分子，如0X40和GITR。和CD137相似，預(yù)期用激動抗體靶向這些可誘導(dǎo)的共刺激分子來刺激并增強NK細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致増加的ADCC。
權(quán)利要求
1.一種治療癌癥的方法，該方法包括 向個體施用癌細(xì)胞抗原選擇性的第一抗體，經(jīng)過一段足以誘導(dǎo)或上調(diào)可誘導(dǎo)的共刺激分子在NK細(xì)胞上的表達(dá)的時間后； 以有效增強Nk細(xì)胞抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的劑量向所述個體施用所述可誘導(dǎo)的共刺激分子的激動劑； 其中所述患者的腫瘤細(xì)胞群減少。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述可誘導(dǎo)的共刺激分子是⑶137、0X40、GITR、⑶30和ICOS中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述激動劑是單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中第一抗體特異于⑶20、⑶19、⑶22、⑶52、Her2和表皮生長因子受體(ERFR)中的至少一種。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中方法在減少腫瘤細(xì)胞群方面提供協(xié)同作用。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，還包括在施用所述第一抗體之前以及施用所述激動劑之前，測量所述患者中所述可誘導(dǎo)的共刺激分子在NK細(xì)胞上的表達(dá)的步驟，其中所述激動劑在所述可誘導(dǎo)的共刺激分子在NK細(xì)胞上的表達(dá)增加之后施用。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述癌癥是實體瘤。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述實體瘤是乳癌。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述實體瘤是結(jié)腸癌。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述實體瘤是頭頸癌。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于CD20。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于her-2。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于表皮生長因子受體(ERFR)。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于CD52。
16.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于CD19。
17.如權(quán)利要求I所述的方法，其中癌細(xì)胞抗原選擇性抗體特異于CD22。
全文摘要
公開了一種增強用于針對殺傷腫瘤細(xì)胞的療法抗體導(dǎo)向的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)效率的方法。癌癥特異性細(xì)胞表面抗原被單克隆抗體結(jié)合，從而刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，其特征在于共刺激分子在T細(xì)胞上上調(diào)的細(xì)胞表面表達(dá)。通過隨后施用第二抗體來加強ADCC反應(yīng)，第二抗體是共刺激分子的激動劑。
文檔編號A61K39/395GK102753195SQ201080063243
公開日2012年10月24日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者羅奇·烏奧, 羅納德·萊維, 詹姆斯·托爾基亞, 阿拉什·阿什·阿里扎德, 霍爾布魯克·科爾特, 馬修·J·戈爾茨坦 申請人:小利蘭·斯坦福大學(xué)托管委員會