靶向vegfr-2和dll4的雙靶向抗體及包含它的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新形式的雙靶向抗體，其中DLL4的拮抗劑結(jié)合到靶向VEGFR-2的 抗體的末端以額外靶向人DLL4,編碼該抗體的DNA，包括它的重組表達載體，轉(zhuǎn)化了該重組 表達載體的宿主細胞，使用該宿主細胞生產(chǎn)雙靶向抗體的方法，包括該雙靶向抗體的藥物 組合物，以及測量該雙靶向抗體的DLL4拮抗劑功效的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管生成是內(nèi)皮細胞通過生長、分裂、迀移等從現(xiàn)有的血管生成新 血管的機制，其在正常生長過程中起重要作用包括傷口愈合或女性月經(jīng)周期 (Risau，Nature, 386:671，1997)，而且，已知異常過度血管在疾病，如腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，年齡 相關(guān)性黃斑變性（ARMD)，糖尿病性視網(wǎng)膜病，銀肩病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，慢性炎癥中至關(guān)重 要的作用（Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000)。
[0003] 假設(shè)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性的，因此，Dr. J.Folkman在1971年 提出了關(guān)注于抗血管生成的治療可能是用于治療實體瘤的新治療劑。此后，對于涉 及抑制過多的血管生成機制的技術(shù)的研宄吸引了眾多研宄者的關(guān)注（Ferrara and Kerbel, Nature, 435:967, 2005)。血管生成的進展方面是通過血管生成誘導(dǎo)劑和血管生成 抑制劑的綜合平衡來確定的，并且由復(fù)雜的多步驟順序過程影響進展。詳細地說，由腫瘤或 受傷組織分泌的各種血管生成誘導(dǎo)劑（包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF))被結(jié)合到相應(yīng)的現(xiàn) 有外周血管內(nèi)皮細胞的相應(yīng)受體以活化血管內(nèi)皮細胞，從而增加血管內(nèi)皮細胞的通透性， 以及分泌蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)，其分解基底膜和細胞外基質(zhì)周圍的血管內(nèi)皮細 胞，使得血管內(nèi)皮細胞從現(xiàn)有的毛細血管逸出和朝向分泌血管生成誘導(dǎo)劑的組織迀移/增 生。迀移和增殖的血管內(nèi)皮細胞形成血管內(nèi)管結(jié)構(gòu)，最后，引入作為血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)支 撐的周細胞以實現(xiàn)穩(wěn)定且成熟的血管形成。
[0004] 如上所述，已發(fā)現(xiàn)VEGF和結(jié)合至VEGF的VEGF受體（VEGFR)的信號途徑受抑制， 最終抑制血管生成，從而獲得對各種疾病的治療效果，如年齡相關(guān)的黃斑變性，糖尿病性視 網(wǎng)膜病，牛皮癬，類風濕關(guān)節(jié)炎和慢性炎癥，包括腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，因此，一直在進行能夠抑 制VEGF活性的各種藥物的開發(fā)。
[0005] 具體地，在1989年由來自Genentech的N. Ferrara博士組通過蛋白質(zhì)分離、純 化和 cDNA 克隆形成 VEGF(Leung et al.，Science, 246:1306, 1989)。迄今已知也被稱作 VEGF-A 的 VEGF 具有四種同種型（VEGF121、VEGF165、VEGF189 和 VEGF206)，并且據(jù)報道， 在這四種同種型中，VEGF 165在除了胎盤外的所有人體組織中是最豐富的（Tisher et al.，J. Biol. Chem.，266:11947, 1991)。已知 VEGF 以顯著高的親和力結(jié)合受體 VEGFR-1 和VEGFR-2/KDR ;然而，VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過VEGFR-2轉(zhuǎn)移以誘導(dǎo)與血管生成相關(guān) 的機制，例如血管內(nèi)皮細胞的增殖、迀移等。由于上述原因，VEGF和VEGFR-2成為用于抑 制VEGF誘導(dǎo)的血管生成機制的主要靶標，并且若干論文是針對于VEGF和VEGFR-2 (Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008 ；Youssoufian et al.,Clin.Cancer Res. , 13:5544s, 2007)〇
[0006] 例如，阿瓦斯?。ㄘ惙慰梗珿enentech)是一種革El向VEGF-A的人源化抗 體（Ferrara et al.，Biochem.Biophy. Res. Comm. ,333:328, 2005)，分別在 2004 年獲 得美國FDA批準用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療，在2006年批準用于非小細胞肺癌，和在 2008年批準用于Her-2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌，并且被批準用于治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤 (GBM)和腎癌。目前，對各種實體瘤的臨床試驗正在進行中，以擴大適應(yīng)癥。此外，同 一家公司開發(fā)的Lucentis，是通過從阿瓦斯汀僅切割Fab片段所制備的抗體（Eter et al，Biodrgus，20:167, 2006)，在為了抑制作為老年性黃斑變性的主要樣態(tài)的黃斑周圍的過 度血管生成而被注入視網(wǎng)膜時，Lucentis具有良好透氣性，它作為治療劑用于濕性年齡相 關(guān)的黃斑變性（濕ARMD)，已于2006年獲得美國FDA批準。
[0007] 作為另一種革E向VEGF的用于治療的抗體，有Regeneron公司生產(chǎn)的 VEGF-trap (Holash et al.，PNAS, 99:11393, 2002)。VEGF-trap 是 VEGFR-1 的第二免疫球蛋 白結(jié)構(gòu)域和VEGFR-2的第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域融合到人Fc的可溶性誘餌受體，其尚未得到 美國FDA批準，但已經(jīng)進行到轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性肺癌、結(jié)直腸癌、激素難治性前列腺癌 等的三期階段。
[0008] 同時，靶向VEGFR-2(它是VEGF受體）的抗血管生成的抗體的例子，包括 由 Imclone 公司生產(chǎn)的 IMC-1121B(EP 1916001A2)，由 UCB 公司生產(chǎn)的 CDP-791(PCT/ GB02/04619)，由本發(fā)明人開發(fā)并已進入臨床試驗的Tanibirumab(TTAC-OOOl) (W02008/153237)等等。
[0009] MC-1121B是選自人Fab文庫的單克隆抗體，其已經(jīng)進行到轉(zhuǎn)移性乳腺癌的三期 階段，并在2010年進入胃癌的三期階段。由UCB生產(chǎn)的⑶P-791是人源化抗體，其以PEG 化的Di-Fab形式已經(jīng)進行到非小細胞肺癌的二期階段。由于該抗體不具有Fc，因此可能無 法預(yù)期抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性或補體依賴性細胞毒性。
[0010] 最后，由本發(fā)明人開發(fā)的Tanibirumab (TTAC-0001)是選自全長人單鏈抗體庫 的單克隆抗體，并且是唯一的與小鼠和大鼠來源的flk-l(VEGFR-2同源物）具有反應(yīng)性 而同時靶向VEGFR-2的抗體，這是與Imclone生產(chǎn)的MC-1121B重要區(qū)別的特征之一 (W02008/153237)。具體地，通過Tanibirumab抑制跨物種的交叉反應(yīng)性可能使研宄進入到 動物疾病模型，以進行對特定癌癥分期的抗癌劑的未來發(fā)展，這使得相關(guān)研宄更容易。
[0011] 如上所述，針對于VEGF和VEGFR-2的研宄在過去的五年急劇發(fā)展，通過市場和臨 床研宄開發(fā)出許多治療劑。
[0012] 與此同時，通過VEGF/VEGFR-2信號分化成Tip細胞的細胞強烈表達DLL4并結(jié)合 到存在于周圍細胞中的Notchl受體，Notchl信號途徑被激活的細胞分化成柄Cellls以形 成正常的血管管結(jié)構(gòu)，這證明了 DLL4/Notch 1信號傳導(dǎo)途徑是對VEGF/VEGFR-2路徑和血管 生成最重要的機制之一（Dufraine et al.，Oncogene, 27:5132 ~5137, 2008)。
[0013] 迄今已知DLL4是Notch受體的配體之一，在哺乳動物中有四種Notch受體（Notch 1 至 4)和 5 種 Notch 配體（Jagged-1、Jagged-2、DLL1、DLL3 和 DLL4)。Notch 信號傳導(dǎo)途 徑被一個細胞的Notch配體結(jié)合至其它細胞的Notch受體發(fā)起，并且僅由不同細胞之間的 直接相互作用所必然激活（Bray SJ，Nat Rev Mol Cell Biol.，7(9) :678, 2006)。
[0014] 當Notch配體結(jié)合于Notch受體時，ADAM金屬蛋白酶首先被激活，裂解Notch受 體的細胞膜外近側(cè)的位點，然后Y分泌酶復(fù)合物被激活，裂解所述Notch受體的細胞膜內(nèi) 側(cè)的位點，使得Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)被分離并迀移到細胞核中。NICD結(jié)合到RBPJ/ CSL轉(zhuǎn)錄因子以誘導(dǎo)Notch靶基因的表達，如包括Hes和Hey的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白。 Notch信號傳導(dǎo)途徑根據(jù)相應(yīng)細胞的情況確定增殖/分化/凋亡，并對維持正常干細胞和癌 干細胞起著重要作用。
[0015] 基本上，所有Notch受體都能夠被結(jié)合到所有Notch配體；然而，在相應(yīng)的細 胞的微環(huán)境中，各種結(jié)合的組合受到選擇性控制。例如，在胎兒發(fā)育過程期間，DLL4在 血管生成內(nèi)皮細胞上強烈表達，并結(jié)合在外周內(nèi)皮細胞中表達的Notchl和Notch4 ;然 而，01^4-此化111結(jié)合以獨特的方式是最重要的（￥&1111，￥&8(3〇611，2011)并且