專利名稱：靶向破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白Siglec-15的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用作骨代謝異常的治療和/或預(yù)防劑的物質(zhì)、可用作骨代謝異常的 治療和/或預(yù)防劑的物質(zhì)的篩選方法、骨代謝異常的檢查方法以及骨代謝異常的治療和/ 或預(yù)防方法。
背景技術(shù)：
已知骨骼為通過重復(fù)形成和吸收，以進(jìn)行持續(xù)重建的動態(tài)性器官，以使其本身的 形態(tài)變化以及維持血鈣濃度。健康的骨骼維持由成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨形成和由破骨細(xì)胞進(jìn)行 的骨吸收的平衡關(guān)系，從而骨質(zhì)量保持恒定。然而，當(dāng)骨形成和骨吸收之間的平衡關(guān)系被 破壞時，則產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥等骨代謝異常(Endocrinological Review, (1992) 13，第66-80 頁，Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996)第 87-102 頁)。作為調(diào)節(jié)骨代謝的因子，報道了很多全身性激素以及局部性細(xì)胞因子，且這 些因子互相合作以形成和維持骨(Endocrinological Review, (1992) 13，第66-80頁， Endocrinological Review), (1996) 17，第308-332頁)。因老齡化導(dǎo)致的骨組織的變化， 骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病眾所周知，但是其發(fā)病機(jī)理包含各種因素，如性激素的分泌降低以及該 激素受體異常、骨局部細(xì)胞因子表達(dá)變動、老化基因的表達(dá)、破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化衰 退或功能不全，因此，難以理解為老齡化引起的單純的生理現(xiàn)象。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要分 為由于雌激素的分泌降低導(dǎo)致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老齡化導(dǎo)致的老年性骨質(zhì)疏松癥，為 了了解其發(fā)病機(jī)理和開發(fā)治療藥物，在骨形成和骨吸收的調(diào)節(jié)機(jī)制方面的進(jìn)一步基礎(chǔ)研究 很重要。破骨細(xì)胞是來自造血干細(xì)胞的多核細(xì)胞，通過在破骨細(xì)胞粘附的骨表面上釋放氯 離子和氫離子，破骨細(xì)胞使骨表面與破骨細(xì)胞之間的間隙成為酸性，并且還分泌作為酸性 蛋白酶等的組織蛋白酶K等(American Journal ofPhysiology, (1991)260，C1315-C1324)。 這引發(fā)磷酸鈣的降解、酸性蛋白酶的活化以及骨基質(zhì)蛋白質(zhì)的降解，導(dǎo)致骨吸收。業(yè)已發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞通過在骨表面的成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上 表達(dá)的RNAKL (NF-κ B配體的受體活化因子)的刺激，分化為破骨細(xì)胞(Proceedings of the National Academy of Science of the United States ofAmerica, (1998)95,第 3597-3602頁，Cell，(1998)93，第165-176頁，)。還發(fā)現(xiàn)RNAKL是成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞所 產(chǎn)生的膜蛋白，其表達(dá)受骨吸收因子的調(diào)節(jié)，以及RNAKL誘導(dǎo)由破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向多核 破骨細(xì)胞的分化等(Proceedings of the National Academy of Science of the United States ofAmerica, (1998)95,第3597-3602頁，Journal of Bone and Mineral Research, (1998)23，S222)。此外，還發(fā)現(xiàn)敲除RNAKL的小鼠產(chǎn)生典型的骨硬化病樣疾病，因此，證明 RNAKL是生理性破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子(Nature，(1999) 397，第315-323頁)。使用二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、雌二醇等激素制劑、SERMs (選 擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、PTH(甲狀旁腺激素)制劑和 鈣制劑等作為骨代謝疾病的治療以及縮短治療的持續(xù)時間的藥物。但是，這些制劑沒有始終表現(xiàn)滿意的治療效果，人們希望開發(fā)治療效果更高的藥物。免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上被如唾液酸等多種多糖高度覆蓋，所述多糖被各種多糖結(jié)合 蛋白識別。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Sialic-acid-bindingimmunoglobulin-lik e lectins，下面稱為“Siglecs”)為識別并結(jié)合唾液酸化的多糖的I型膜蛋白家族。人們 認(rèn)為Siglecs大多在免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，并識別類似地存在于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上 的唾液酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用以及細(xì)胞功能，并被認(rèn)為參與免疫應(yīng)答(Nature Reviews Immunology, (2007) 7，第255-266頁)。然而，也有很多生理功能尚不明了的Siglec分 子。最近報道了 Siglec-15(唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素15)為屬于Siglecs的分 子(Glycobiology，(2007) 17，第 838-846 頁)，其與被稱為 CD33L3 (CD33 分子樣 3)的分 子相同。該分子從魚類到人類的進(jìn)化高度保守，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在人脾以及淋巴結(jié)中，在樹突 細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中有強的表達(dá)。此外，使用唾液酸探針的結(jié)合測試的結(jié)果是，還發(fā)現(xiàn)人 Siglec-15 與 Neu5Ac α 2_6GalNAc 結(jié)合、小鼠 Siglec-15 除與 Neu5Ac α 2_6GalNAc 結(jié)合 外，還與 Neu5Aca 2-3Gal3 l-4Glc 結(jié)合(Glycobiology, (2007) 17，第 838-846 頁)。直 至最近，還未明了 Siglec-15的生理作用，但業(yè)已報道伴隨著破骨細(xì)胞的分化和成熟， Siglec-15表達(dá)增加，以及通過用RNA干擾使Siglec-15的表達(dá)下降，從而抑制破骨細(xì)胞的 分化(W02007/093042)。但是，還不明確抗Siglec-15抗體對破骨細(xì)胞分化的作用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供在各種形式的骨代謝異常中特異表達(dá)的基因，如骨質(zhì)疏 松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌的骨轉(zhuǎn)移等中可見的骨破壞；抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其活 性的物質(zhì)；用于篩選骨代謝異常的治療和/或預(yù)防劑的新方法；抑制破骨細(xì)胞的分化和成 熟及其活性的物質(zhì)；以及骨代謝異常的治療和/或預(yù)防劑。解決問題的手段為了找到具有骨代謝異常的治療和/或預(yù)防效果的物質(zhì)，本發(fā)明人以闡明破骨 細(xì)胞的分化、成熟和活化機(jī)制為目標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨著破骨細(xì)胞的分化、成熟， Siglec-15基因的表達(dá)增加，還發(fā)現(xiàn)通過與Siglec-15特異性結(jié)合的抗體，抑制破骨細(xì)胞的 分化，從而完成本發(fā)明。S卩，本發(fā)明包括以下發(fā)明。(1)抗體或該抗體的功能性片段，其特異性地識別包含以下的(a)至(i)中任一項 記載的氨基酸序列的一個或多個多肽，并抑制破骨細(xì)胞的形成和/或由破骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨 吸收(a)序列表中SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列；(b)由序列表中的SEQ ID NO :22表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328 位構(gòu)成的氨基酸序列；(c)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第260 位構(gòu)成的氨基酸序列；(d)由序列表中的SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第260 位的構(gòu)成的氨基酸序列；
(e)序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列；(f)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第341 位構(gòu)成的氨基酸序列；(g)由序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；(h)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；(i)包括(a)至(h)中所述的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加的氨基酸序列。(2)抗體或該抗體的功能性片段，其特異性地識別包含以下的(j)至 (η)中任一項記載的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的一個或多個多肽，并抑制破骨細(xì)胞的 形成和/或由破骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨吸收(j) SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；(k)SEQ ID NO 3表示的核苷酸序列；(I)SEQ ID NO 19表示的核苷酸序列；(m) SEQ ID NO 43表示的核苷酸序列；(η)具有與包含與(j)至(m)中記載的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸 在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸的核苷酸序列。(3)抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合過程的如(1)或(2)所述的抗體或該抗體的功能性 片段。(4)抑制由TNF α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的如(1)至(3)中任一項所述的抗體或該 抗體的功能性片段。(5)在30 μ g/ml或以下的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成的如(1)至(4)中任一項 所述的抗體或該抗體的功能性片段。(6)在3 μ g/ml或以下的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成的如(5)所述的抗體或該 抗體的功能性片段。(7)在1 μ g/ml或以下的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成的如(6)所述的抗體或該 抗體的功能性片段。(8)在63ng/ml至1 μ g/ml的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成的如(7)所述的抗體 或該抗體的功能性片段。(9)抑制破骨細(xì)胞性的骨吸收的如(1)至(4)中任一項所述的抗體或該抗體的功 能性片段。(10)在3 μ g/ml或以下的濃度下抑制體外的破骨細(xì)胞性的骨吸收的如(9)所述的 抗體或該抗體的功能性片段。(11)在0. 3μ g/ml至3 μ g/ml的濃度下抑制體外的破骨細(xì)胞性的骨吸收的如 (10)所述的抗體或該抗體的功能性片段。(12)由包括以下的步驟1)和2)的方法得到的如(1)至(11)中任一項所述的抗 體或該抗體功能性片段1)制備抗體的步驟，所述抗體特異性識別以下(a)至(i)中任一項所記載的氨基 酸序列的任意一個或多個序列
(a)序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列；(b)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328 位構(gòu)成的氨基酸序列；(c)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第260 位構(gòu)成的氨基酸序列；(d)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第260 位構(gòu)成的氨基酸序列；(e)序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列；(f)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第341 位構(gòu)成的氨基酸序列；(g)由序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；(h)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；(i)包含(a)至(h)中記載的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加的氨基酸序列。2)篩選抗體的步驟，所述抗體顯示破骨細(xì)胞形成抑制活性和/或骨吸收抑制活性。(13)由包括以下的步驟1)和2)的方法得到的如(1)至(11)中任一項所述的抗 體或該抗體功能性片段1)制備抗體的步驟，所述抗體特異性識別以下(j)至(η)中任一項所記載的核苷 酸序列編碼的一個或多個多肽(j) SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；(k)SEQ ID NO 3表示的核苷酸序列；(I)SEQ ID NO 19表示的核苷酸序列；(m) SEQ ID NO 43表示的核苷酸序列；以及(η)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸與包含與(j)至(m)中記載的核苷酸序 列互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交；以及2)篩選抗體的步驟，所述抗 體顯示破骨細(xì)胞形成抑制活性和/或骨吸收抑制活性。(14)如(1)至(13)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為單克隆抗體。(15)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其具有與雜交瘤 #32A1 (FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體相同的表位特異性。(16)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其與雜交瘤 #32A1 (FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體競爭。(17)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所述抗體為雜交瘤 #32A1 (FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體。(18)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其具有與雜交瘤 #4IBl (FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體相同的表位特異性。
(19)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其與雜交瘤 #4IBl (FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體競爭。(20)如(14)所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所述抗體為雜交瘤 #4IBl (FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體。(21)如(1)至(20)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為嵌合抗體。(22)如(1)至(21)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為人源化的。(23)如(1)至(16)、(18)、或(19)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段， 其特征在于，所述抗體為人抗體。(24)如(1)至(23)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為IgG抗體。(25)選自Fab、F(ab，)2、Fab，以及Fv的如(1)至(24)中所述的抗體的功能性片段。(26)如(1)至(16)、(18)和(19)中任一項所述的抗體，其特征在于，其為scFv。(27)藥物組合物，其特征在于，其含有如(1)至(26)中所述的抗體或該抗體的功 能性片段的至少一種。(28)如(27)中所述的藥物組合物，其特征在于，其為骨代謝異常的治療和/或預(yù) 防劑。(29)治療和/或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，其特征在于，其包含如(1)至 (26)中所述的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種，以及選自二膦酸鹽、活性維生素D3、 降鈣素及其衍生物、如雌二醇的激素制劑、SERMs (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、 維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF 受體制劑、抗TNFa抗體或該抗體的功能性片段、抗PTHrP(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗 體或該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能性片段、抗 RANKL抗體或該抗體的功能性片段以及OCIF(破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子)的至少一種。(30)如(28)或(29)中所述的藥物組合物，其中所述骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤以及癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破 壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎導(dǎo)致的牙齒缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨 佩吉特病、腎病性骨營養(yǎng)不良、以及成骨不全。(31)如(28)中所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。(32)如(29)中所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏 松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治療用藥劑而導(dǎo)致的繼發(fā)性骨 質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。(33)骨代謝異常的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，給予如(1)至(26)中所述 的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種。(34)骨代謝異常的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，同時或連續(xù)給予如(1)至 (26)所述的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種，以及選自二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、如雌二醇的激素制劑、SERMs (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維 生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF受 體制劑、抗TNF α抗體或該抗體的功能性片段、抗PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或 該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能性片段、抗RANKL 抗體或該抗體的功能性片段以及OCIF(破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子)的至少一種。(35)如(33)或(34)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，所述骨代謝異常為 骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。(36)如(35)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后 骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治療用藥劑而導(dǎo)致的繼 發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。(37)雜交瘤 #32A1 (FERM ΒΡ-10999)。(38)雜交瘤 #41B1 (FERM BP-11000)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可得到用于骨代謝異常的治療藥物和/或預(yù)防劑，其中骨代謝異常 的作用機(jī)制為抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其活性。


圖1為表示人巨細(xì)胞瘤組織中的RANK、RANKL、組織蛋白酶K以及TRAP基因表達(dá) 特征分析的曲線。圖2為表示人巨細(xì)胞瘤組織中的Siglec-15基因表達(dá)特征分析的曲線。圖3為表示誘導(dǎo)從RAW264. 7或小鼠骨髓細(xì)胞到破骨細(xì)胞的分化時的Siglec-15 基因的表達(dá)量的變化的圖。圖4為表示伴隨RAW264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化的組織蛋白酶K以及TRAP基因表 達(dá)的圖。圖5為表示伴隨RAW264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化的Siglec-15基因表達(dá)的圖。圖6為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和使用抗6His_HRP抗體的免疫印跡法檢測293F 細(xì)胞的小鼠Siglec-15-His的表達(dá)隨培養(yǎng)時間變動的結(jié)果。圖7為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和使用抗人IgG Fc-HRP抗體的免疫印跡法檢測 293F細(xì)胞的小鼠Siglec-15-Fc的表達(dá)隨培養(yǎng)時間變動的結(jié)果。圖8為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評估用HisTrap HP柱色譜和Resource Q柱色譜純化的小鼠Siglec-15-His純度的結(jié)果。圖9為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和使用抗V5-HRP抗體的免疫印跡法檢測用 HisTrap HP柱色譜和Resource Q柱色譜純化的小鼠Siglec-15-His行為的結(jié)果。圖10為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評估用HiTrap蛋白A柱色譜純化的 小鼠Siglec-15-Fc純度的結(jié)果。圖11顯示通過SDS-聚丙烯酰胺電泳以及使用抗小鼠Siglec-15多克隆抗體 和抗兔IgG-HRP抗體的免疫印跡法確認(rèn)純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體不只結(jié)合 Siglec-15-Fc 還結(jié)合 Siglec-15-His 的結(jié)果。圖12顯示用其上固定有小鼠Siglec-15-Fc的親和柱純化抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的色譜圖。圖13顯示用SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評估用小鼠Siglec-15-Fc固定其上 的親和柱色譜純化的小鼠Siglec-15-Fc純度的結(jié)果。圖14顯示用Superose 6凝膠過濾柱純化抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的色譜 圖。圖15顯示測試添加親和純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓非貼壁 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果(N = 3)。圖16顯示基于TRAP酶活性測試添加凝膠過濾純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗 體對小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果(N = 3)。圖17顯示基于TRAP酶活性測試由于添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的小鼠骨 髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的抑制被抗原中和的結(jié)果(N = 3)。圖18顯示基于TRAP酶活性測試添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓非 貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用TNF α刺激)的影響的結(jié)果(N = 3)。圖19顯示用于通過TRAP染色評估添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓 非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用TNFa刺激)的影響的顯微照片(N = 3)。圖20顯示用TRAP酶活性表示通過添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制從小鼠 骨髓細(xì)胞到破骨細(xì)胞的分化(用活性維生素D3刺激)的圖。圖21為通過TRAP染色表示的通過添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制從小鼠 骨髓細(xì)胞到巨大破骨細(xì)胞形成(用活性維生素D3刺激)的顯微照片。圖22為通過TRAP染色表示的通過添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制從小鼠 骨髓細(xì)胞到巨大破骨細(xì)胞形成(用人RANKL刺激)的顯微照片。圖23顯示通過TRAP染色表示通過添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制從 RAW264. 7細(xì)胞到巨大破骨細(xì)胞形成(用人RANKL刺激)以及通過可溶型Siglec-15解除該 抑制作用的顯微照片。圖24顯示用ELISA法測試大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對其上固定有小鼠 Siglec-15-Fc的平板的結(jié)合的結(jié)果。符號( )表示#1A1抗體；符號(■)表示#3A1抗 體；符號(▲)表示#8A1抗體；符號(X)表示#24A1抗體；符號(·)表示#32A1抗體；符 號(〇)表示#34A1抗體；符號⑴表示#39A1抗體；符號㈠表示#40A1抗體；符號(一) 表示#41B1抗體；符號( )表示#61A1抗體；符號(口)表示對照IgG。圖25顯示測試添加抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#3A1、#8A1或#32A1)對小鼠 骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果。此外，圖中大鼠對照IgG 為圖25和26共有的陰性對照。圖26顯示測試添加抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#34A1、#39A1或#40A1)對小 鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果。此外，圖中大鼠對照 IgG為圖25和26共有的陰性對照。此外，圖中兔抗小鼠Siglec-15多克隆抗體No. 3為圖 25和26共有的陽性對照。圖27為表示誘導(dǎo)正常人破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化時的組織蛋白酶K、TRAP以 及Siglec-15基因的表達(dá)變化的圖。圖28為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測用HisTrap HP柱色譜和ResourceQ柱色譜純化的人Siglec-15-His純度的結(jié)果。圖29為通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測用蛋白A柱色譜純化的人Siglec-15-Fc 純度的結(jié)果。圖30為用其上固定有人Siglec-15-Fc的親和柱純化的抗人Siglec-15多克隆抗 體的色譜圖。圖31為通過TRAP染色表示的通過添加抗人Siglec-15多克隆抗體抑制從正常人 破骨前體細(xì)胞到巨大破骨細(xì)胞形成的顯微照片。圖32為通過用倒置顯微鏡計數(shù)具有5個或以上核的TRAP陽性細(xì)胞評估添加抗人 Siglec-15多克隆抗體對從正常人破骨前體細(xì)胞形成多核破骨細(xì)胞的影響的結(jié)果。圖33顯示用ELISA法測試大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對其上固定有人 Siglec-15-Fc的平板的結(jié)合的結(jié)果。符號( )表示#1A1抗體；符號(■)表示#3A1抗 體；符號(▲)表示#8A1抗體；符號(X)表示#24A1抗體；符號(·)表示#32A1抗體；符 號(〇)表示#34A1抗體；符號⑴表示#39A1抗體；符號㈠表示#40A1抗體；符號(一) 表示#41B1抗體；符號( )表示#61A1抗體；符號(口)表示對照IgG。圖34為通過TRAP染色表示的通過添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體抑制從 正常人破骨前體細(xì)胞到巨大破骨細(xì)胞形成的顯微照片。圖35為通過TRAP染色表示的添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗 體)對抑制從正常人破骨前體細(xì)胞形成巨大破骨細(xì)胞的顯微照片。圖36為表示通過添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)抑制正常 人破骨細(xì)胞的骨吸收活性的圖(N = 6)。
具體實施例方式在本說明書中，術(shù)語“基因”不僅包括DNA，還包括mRNA、cDNA以及cRNA。在本說明書中，術(shù)語“多核苷酸”用于與核酸相同的含義，并且還包括DNA、RNA、探 針、寡核苷酸、以及引物。在本說明書中，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”無區(qū)別使用。在本說明書中，術(shù)語“RNA組分”是指包含RNA的組分。在本說明書中，術(shù)語“細(xì)胞”也包括動物個體內(nèi)的細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞。在本說明書中，術(shù)語“Siglec-15”用于與Siglec-15蛋白相同的含義。在本說明書中，術(shù)語“破骨細(xì)胞形成”用于與“破骨細(xì)胞分化”或“破骨細(xì)胞成熟” 相同的含義。本說明書中的術(shù)語“抗體功能性片段”是指具有與抗原結(jié)合的活性并包括Fab、 F(ab' )2、scFv等的抗體部分片段。另外，抗體功能性片段還包括Fab’，其為在還原條件下 處理F(ab’)2得到的抗體的可變區(qū)的單價片段。但是，只要該片段具有與抗原的結(jié)合親和 力，該術(shù)語就不受限于這些分子。此外，這些功能性片段不僅包括用適當(dāng)?shù)拿柑幚砜贵w蛋白 的全長分子得到的片段，還包括使用基因工程地改變的抗體基因在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中產(chǎn)生 的蛋白。在本說明書中，術(shù)語“表位”是指特定的抗Siglec-15抗體結(jié)合的Siglec-15的部 分肽。前述Siglec-15的部分肽的表位，可通過免疫測定法等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法確定?；蛘?，例如，可通過以下的方法進(jìn)行。制備Siglec-15的各種部分結(jié)構(gòu)。在制備部分 結(jié)構(gòu)時，可使用公知的寡肽合成技術(shù)。例如，從Siglec-15的C末端或N末端順次縮短得到 的具有適當(dāng)?shù)目s短長度的一系列多肽是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因重組技術(shù)制備的。 其后，檢測這些多肽的抗體的反應(yīng)性，并粗略確定識別部位。進(jìn)一步合成更短的肽并檢測 與這些肽的反應(yīng)性，通過這些可確定表位。若二級抗Siglec-15抗體與初級抗Siglec-15 抗體結(jié)合的部分肽結(jié)合，可判定初級抗體與二級抗體具有共有的表位。此外，通過證實抗 Siglec-15的二級抗體與抗Siglec-15的初級抗體競爭與Siglec-15的結(jié)合(即二級抗體 抑制Siglec-15和初級抗體的結(jié)合)，能夠確定初級抗體和二級抗體具有相同的表位，即使 該表位的特異序列還沒有得到確定。此外，當(dāng)初級抗體和二級抗體結(jié)合共有表位，且初級抗 體具有抗原中和活性等特殊效應(yīng)時，可期待二級抗體也具有相同的活性。本發(fā)明中所用術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是指在可通過該條件鑒定的條件下進(jìn)行 雜交在市售的雜交溶液ExpressHyb雜交溶液(Clontech公司制備)中，在68°C下進(jìn)行雜 交，或者使用其上固定有DNA的濾器，在0. 7-1. OM NaCl存在下，在68°C進(jìn)行雜交，然后在用 0. 1-2X的SSC溶液(IX的SSC溶液由150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉組成)在68°C下洗滌，或 在與其同等的條件下雜交。1. Siglec-15本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Siglec-15基因在巨細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)。另外本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)， 在來自單核細(xì)胞的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時，Siglec-15基因表達(dá)量增加。本發(fā)明中所使用的Siglec-15可從人、非人哺乳動物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、 豬、綿羊、?；蚝?或雞的單核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞直接純化使用，或者制備上述細(xì)胞的細(xì)胞膜 組分使用。此外，Siglec-15還可以體外合成，或者通過遺傳工程使其在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生獲 得。具體來說，遺傳工程中，將Siglec-15cDNA整合到可表達(dá)Siglec-15cDNA的載體中，然 后在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液中合成Siglec-15，或者通過使其 它原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以表達(dá)Siglec-15，由此可得到該蛋白。人Siglec-15的cDNA核苷酸序列以登錄號NM_213602登錄在GenBank中，并表示 為序列表的SEQ ID NO :1，其氨基酸序列以序列表的SEQ ID NO :2表示。小鼠Siglec-15 的cDNA核苷酸序列以登錄號XM_884636登錄在GenBank中，并表示為序列表的SEQ ID NO 3，其氨基酸序列以序列表的SEQID N0:4表示。去除信號序列的成熟的人Siglec-15相當(dāng) 于由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328位構(gòu)成的氨基酸序列。 另外，去除信號序列的小鼠Siglec-15相當(dāng)于由SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸 殘基第21位至第341位構(gòu)成的氨基酸序列。另外，Siglec-15有時被稱為⑶33抗原樣3、 ⑶33分子樣3、⑶33樣3或⑶33L3，這些都表示相同的分子。Siglec-15的cDNA例如可通過被稱為PCR的方法獲得，其中使用以表達(dá) Siglec-15cDNA的cDNA文庫為模板，以及特異性擴(kuò)增Siglec-15的cDNA的引物進(jìn)行聚合酶 鏈反應(yīng)(以下稱為 “PCR”) (Saiki，R. K.，等·，Science, (1988)239,487-49)。此外，下述的多核苷酸也包含在Siglec-15的cDNA中，所述多核苷酸與由與選自 序列表的SEQ ID N0:1和3的至少一種表示的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷 酸在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質(zhì)。此外，下述多核 苷酸也包含在Siglec-15的cDNA中，所述多核苷酸是由人或小鼠Siglec-15基因座轉(zhuǎn)錄的剪接變體或與其在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼與Siglec-15具有同等生物活性的蛋白的多核 苷酸。此外，下述蛋白也包含在Siglec-15中，所述蛋白由在選自序列表的SEQ IDNO 2 和4表示的氨基酸序列的至少一種氨基酸序列中，或從這些序列中去除信號序列的氨基酸 序列中，包含一個或多個氨基酸取代、缺失、或添加，且具有與Siglec-15同等的生物活性 的氨基酸序列構(gòu)成。此外，下述蛋白也包含在Siglec-15中，所述蛋白由人或Siglec-15基 因座轉(zhuǎn)錄的剪接變體編碼的氨基酸序列，或其中包含一個或多個氨基酸序列取代、缺失、或 添加，且具有與Siglec-15同等的生物活性的氨基酸序列構(gòu)成。2.骨代謝異常的檢測對人各種骨組織測試樣品組中的Siglec-15基因表達(dá)量的分析顯示SigleC-15 基因在巨細(xì)胞瘤(Giant cell tumor ；GCT)中表達(dá)量顯著增加，其中所述巨細(xì)胞瘤是破骨細(xì) 胞樣多核巨細(xì)胞大量出現(xiàn)的骨腫瘤，其臨床特征是產(chǎn)生骨溶解性的骨破壞(Bullough等.， Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, ppl7.6-17. 8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992))。另外還發(fā)現(xiàn)，在來自單核細(xì)胞的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時Siglec-15基因表達(dá)量 增加。因此，可認(rèn)為Siglec-15參與GCT之類的骨吸收增加的人的病理學(xué)。S卩，通過測 定Siglec-15基因和/或Siglec-15在各細(xì)胞和/或各組織中的表達(dá)量，可以判定伴隨 Siglec-15的過量表達(dá)的骨代謝異常的狀態(tài)。本說明書中，骨代謝異常的實例包括但不限于 骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治 療用藥劑而導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥)、伴隨類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤以及癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、 牙周炎導(dǎo)致的牙齒缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特骨病、腎 病性骨營養(yǎng)不良、以及成骨不全。在本發(fā)明中，用于檢測Siglec-15基因和/或Siglec-15表達(dá)量的對象的“測試 樣品”是指由受試者或臨床樣品得到的骨髓、骨、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臟、口腔、咽、 唇、舌、牙齦、鼻咽、食道、胃、小腸、大腸、結(jié)腸、肝臟、膽囊、胰臟、鼻、肺、軟組織、皮膚、乳房、 子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結(jié)、肌肉、脂肪組織等的組織，或血液、體液或排泄物等的樣品， 本發(fā)明中更優(yōu)選血液或骨髓。3.抑制向破骨細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩選方法。本發(fā)明的一個實施方案可例示通過測定Siglec-15基因和/或Siglec-15的表達(dá) 量，篩選抑制向破骨細(xì)胞分化的物質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一實施方案可例示通過鑒定抑制Siglec-15的誘導(dǎo)向成熟破骨細(xì)胞 分化的活性的物質(zhì)，篩選對骨代謝異常具有治療效果和/或預(yù)防效果的物質(zhì)的方法?！笆茉囄镔|(zhì)”是指通過本發(fā)明的篩選方法用于檢測具有破骨細(xì)胞分化抑制活性的 物質(zhì)。受試物質(zhì)的實例包括化合物、微生物的代謝產(chǎn)物、植物或動物組織的提取物、它們的 衍生物，以及它們的混合物。另外，設(shè)計成使Siglec-15的表達(dá)量降低的核酸或其衍生物 (如反義寡核苷酸、核酶、dsRNA、或siRNA)也可作為受試物質(zhì)使用。受試物質(zhì)的給予劑量以 及濃度可適當(dāng)設(shè)定，或者通過例如制成稀釋系列等，可設(shè)定多種給予劑量。受試物質(zhì)也可以以固體、液體等適當(dāng)狀態(tài)給予，還可以溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液或添加穩(wěn)定劑等。在使用培養(yǎng)細(xì) 胞進(jìn)行篩選的方法中，受試物質(zhì)可以添加到培養(yǎng)基中，細(xì)胞在其中培養(yǎng)。在添加到培養(yǎng)基中 的情況下，受試物質(zhì)可以在培養(yǎng)開始時添加，也可以在培養(yǎng)中途添加，另外，添加次數(shù)也不 限于一次。在受試物質(zhì)存在下進(jìn)行培養(yǎng)的期間也可適當(dāng)設(shè)定，然而，優(yōu)選30分鐘-2周，更優(yōu) 選30分鐘-72小時。將受試物質(zhì)給予哺乳動物個體時，根據(jù)受試物質(zhì)的物物理性質(zhì)等適當(dāng) 決定給予途徑，給予途徑包括口服給予、靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、經(jīng)皮給予、皮下注射等。另 外，可選擇從給予受試物質(zhì)后到獲得測試樣品的適合時間。本發(fā)明的篩選方法中使用的培養(yǎng)細(xì)胞可以是正常的細(xì)胞，也可以是顯示異常生長 的確定的細(xì)胞系或細(xì)胞，如癌細(xì)胞，只要是表達(dá)Siglec-15的哺乳動物細(xì)胞即可。其實例包 括但不限于正常人破骨前體細(xì)胞(Normal Human NaturalOsteoclast Precursor Cells、可 由三光純藥有限公司購得，產(chǎn)品目錄號2T-110)、來自小鼠單核細(xì)胞的細(xì)胞RAW264. 7(ATCC Cat. No. TIB-71)、RAW264細(xì)胞(ECACC Cat. No. 85062803)、以及來自小鼠骨髓的原代培養(yǎng)細(xì) 胞等。作為培養(yǎng)細(xì)胞的動物種，優(yōu)選人、小鼠或其它哺乳動物(豚鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、牛、 猴等)、以及雞等，但并不限于這些。另外，作為培養(yǎng)細(xì)胞，更優(yōu)選使用過量表達(dá)Siglec-15 的哺乳動物細(xì)胞，例如，可例示RAW264. 7細(xì)胞、RAW264細(xì)胞、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、C0S7細(xì)胞 等，其通過將Siglec-15基因與其啟動子區(qū)一起導(dǎo)入以過量表達(dá)Siglec-15而改造。本發(fā)明的篩選方法也包括不使用培養(yǎng)細(xì)胞而將受試物質(zhì)給予哺乳動物個體后，檢 測由該動物個體摘除的器官或組織細(xì)胞中Siglec-15基因的表達(dá)的方法。用于檢測基因表 達(dá)的器官或組織只要表達(dá)Siglec-15即可，然而，優(yōu)選骨代謝異常相關(guān)組織，更優(yōu)選骨組織 和骨髓。作為哺乳動物物種，可以使用非人哺乳動物，優(yōu)選小鼠、大鼠或倉鼠，更優(yōu)選小鼠或 大鼠。此外，作為顯示骨代謝異常的動物模型，可以使用卵巢摘除動物，精巢摘除動物，將腫 瘤細(xì)胞移植到皮下、皮內(nèi)、左心室、骨髓、靜脈或腹腔等中的攜帶癌癥的動物，坐骨神經(jīng)切除 動物，佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型，膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎動物模型，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)性骨質(zhì)疏松癥 動物模型，促老化小鼠(SAMP6 小鼠、Matsushita 等.，Am. J. Pathol. 125，276-283 (1986))， 甲狀腺/甲狀旁腺摘除動物，持續(xù)注入甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)的動物，破骨細(xì)胞發(fā) 生抑制因子(OCIF)敲除小鼠(Mizuno 等·，Biochem. Biophys. Res. Commun.，(1998)247， 610-615)，給予可溶性RANKL的動物等。還可以使用牙周病導(dǎo)致牙齒缺失的動物模型以及 經(jīng)改造過量表達(dá)Siglec-15的動物。此外，將經(jīng)篩選選擇的受試物質(zhì)給予上述動物模型，測 定可由測定骨組織中成熟破骨細(xì)胞數(shù)、骨密度、骨強度或骨形態(tài)取得的各參數(shù)；血中和尿中 骨代謝參數(shù)(CTx、NTx等)；或血鈣水平等因骨代謝異常而引起變動的參數(shù)，由此可以評價 該受試物質(zhì)對于骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果。本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)細(xì)胞可以在任何條件下培養(yǎng)，只要所述條件能使培養(yǎng) 的細(xì)胞在未添加受試物質(zhì)的情況下表達(dá)Siglec-15即可。例如，已知對該培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng) 條件，當(dāng)在該條件下該細(xì)胞表達(dá)Siglec-15時，該細(xì)胞即可在該條件下培養(yǎng)。另外，在檢測 由哺乳動物個體摘除的器官或組織中的Siglec-15的表達(dá)時，該動物的飼養(yǎng)條件可為任何 條件，只要該條件能使該動物在未添加受試物質(zhì)的情況下表達(dá)Siglec-15的條件即可。另外，為檢測受試物質(zhì)對Siglec-15的表達(dá)的影響，有測定Siglec-15基因的表達(dá) 量的方法以及測定Siglec-15基因的翻譯產(chǎn)物即Siglec-15的表達(dá)量的方法?？梢哉J(rèn)為， 抑制Siglec-15基因和/或Siglec-15的表達(dá)的受試物質(zhì)是對骨代謝異常，優(yōu)選骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞具有治療效果和/或預(yù)防效果的物 質(zhì)。關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞中的Siglec-15基因的表達(dá)量的測定或Siglec-15的表達(dá)量的測 定，可使用以下方法進(jìn)行=Northern分析、定量PCR法、ELISA法等。另外，使用哺乳動物培 養(yǎng)細(xì)胞時，可根據(jù)需要，將受試物質(zhì)與適當(dāng)量的RANKL、TNF-a ,M-CSF或活性維生素D3等一 起添加在培養(yǎng)基中，在不添加受試物質(zhì)的對照中也以適當(dāng)量添加RANKL、TNF-α、M-CSF或 活性維生素D3等。此外，構(gòu)建測定對Siglec-15的內(nèi)源性配體的結(jié)合量的實驗系統(tǒng)，評價是否由于 添加受試物質(zhì)而抑制該內(nèi)源性配體向Siglec-15結(jié)合，籍此可篩選抑制向破骨細(xì)胞分化的 物質(zhì)。在下面的(1)至(3)中說明各篩選方法。(1)使用Siglec-15基因的方法本發(fā)明的篩選方法例如有使用來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞的方法和使用哺乳動物 個體的方法，以下分別介紹。(a)使用來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞的方法(i)包括以下步驟a)至C)的方法a)由來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA的步驟，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞在添加有受 試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b)檢測a)得到的總RNA和從未添加受試物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞得到 的總RNA之間的Siglec-15基因表達(dá)量的差異的步驟；c)通過分析b)所述的基因表達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì)對于骨代謝異常的治療 和/或預(yù)防效果的步驟。(ii)包括以下步驟a)至d)的方法a)由來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA的步驟，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞在添加有受 試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b)由來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA的步驟，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞在未添加受 試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；c)分別測定上述a)得到的總RNA和b)得到的總RNA中的Siglec-15基因表達(dá)量 的步驟；以及d)通過分析上述c)測定的上述a)得到的總RNA和b)得到的總RNA間的基因表 達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì)對于骨代謝異常的治療和/或預(yù)防效果的步驟。(b)使用哺乳動物個體的方法(i)包括以下步驟a)至C)的方法a)從給予了受試物質(zhì)的哺乳動物個體中采集測試樣品，由該樣品提取總RNA的步 驟；b)檢測來自a)的總RNA和從由未給予受試物質(zhì)的動物個體采集的樣品得到的總 RNA之間的Siglec-15基因表達(dá)量的差異的步驟；c)通過分析b)所述的基因表達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì)對于骨代謝異常的治療 和/或預(yù)防效果的步驟。
(ii)包括以下步驟a)至d)的方法a)從給予了受試物質(zhì)的哺乳動物個體中采集測試樣品，由該樣品提取總RNA的步 驟；b)從未給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體中采集測試樣品，由該樣品提取總RNA的步 驟；c)分別測定上述步驟a)得到的總RNA和上述步驟b)得到的總RNA中的 Siglec-15基因表達(dá)量的步驟，以及d)通過分析C)所述的基因表達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì)對于骨代謝異常的治療 和/或預(yù)防效果的步驟。(2)使用 Siglec-15 的方法關(guān)于利用測定Siglec-15表達(dá)量進(jìn)行篩選的方法，使用哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞的方法 和使用動物個體的方法，各包含以下步驟。(a)使用來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞的方法(i)包括以下步驟a)和b)的方法a)測定來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞中的Siglec-15表達(dá)量的步驟，其中所述培養(yǎng)細(xì) 胞在添加有受試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以及b)通過分析a)中測定的蛋白質(zhì)的表達(dá)量和在未添加受試物質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的 來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞中該蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效 果和/或預(yù)防效果的步驟。(ii)包括以下步驟a)至C)的方法a)測定來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞中的Siglec-15表達(dá)量的步驟，其中所述培養(yǎng)細(xì) 胞在添加有受試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b)測定來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞中的上述a)所述的蛋白表達(dá)量的步驟，其中所 述培養(yǎng)細(xì)胞在未添加受試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以及c)通過檢測由上述a)測定的蛋白表達(dá)量和由上述b)測定的該蛋白表達(dá)量之間的 差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果的步驟。(iii)包括以下步驟a)至C)的方法a)在添加有受試物質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來自哺乳動物的細(xì)胞，固定由該培養(yǎng)細(xì)胞得 到的總蛋白的步驟；b)對上述固定蛋白中的Siglec-15蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定的步驟；c)通過分析上述b)中檢測的Siglec-15的表達(dá)量和從在未添加受試物質(zhì)的培養(yǎng) 基上培養(yǎng)的來自哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞得到的總蛋白中該蛋白表達(dá)量的差異，判定受試物質(zhì) 對骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果的步驟。(iv)包括以下步驟a)至e)的方法a)在添加有受試物質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來自哺乳動物的細(xì)胞，固定由該培養(yǎng)細(xì)胞得 到的總蛋白的步驟；b)在未添加受試物質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來自哺乳動物的細(xì)胞，固定由該培養(yǎng)細(xì)胞得 到的總蛋白的步驟；c)使用與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的抗體或配體，對上述步驟a)所述的固定蛋白中Siglec-15蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測定的步驟；d)使用與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的抗體或配體，對上述步驟b)所述的固定蛋 白中Siglec-15蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測定的步驟；e)通過分析由上述步驟C)測定的蛋白表達(dá)量和由上述步驟d)測定的蛋白表達(dá)量 之間的差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果的步驟。(b)使用哺乳動物個體的方法(i)包括以下步驟a)和b)的方法a)從已給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體采集測試樣品，測定受試樣品的Siglec-15 表達(dá)量的步驟；b)通過分析上述步驟a)中測定的Siglec-15的表達(dá)量和由未給予受試物質(zhì)的哺 乳動物個體采集的樣品中該蛋白表達(dá)量之間的差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效 果和/或預(yù)防效果的步驟。(ii)包括以下步驟a)至C)的方法a)使用與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的抗體或配體，對由已給予受試物質(zhì)的哺乳 動物個體采集的測試樣品中的該蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定的步驟；b)測定由未給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體采集的測試樣品中該蛋白表達(dá)量的步 驟；以及c)通過分析由a)測定的Siglec-15表達(dá)量和由b)測定的該蛋白表達(dá)量的差異， 判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果的步驟。(iii)包括以下步驟a)至C)的方法a)從已給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體采集測試樣品，將該樣品中的總蛋白進(jìn)行固 定的步驟；b)對上述固定蛋白中的Siglec-15蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定的步驟；以及c)通過上述b)中檢測的Siglec-15的表達(dá)量和由未給予受試物質(zhì)的哺乳動物個 體采集的測試樣品中該蛋白表達(dá)量之間的差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療和/或 預(yù)防效果的步驟。(iv)包括以下步驟a)至e)的方法a)從已給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體采集測試樣品，將該樣品中的總蛋白進(jìn)行固 定的步驟；b)從未給予受試物質(zhì)的哺乳動物個體采集測試樣品，將該樣品中的總蛋白進(jìn)行固 定的步驟；c)使用與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的抗體或配體，對上述步驟a)所述的固定蛋 白中Siglec-15的表達(dá)量進(jìn)行檢測的步驟；d)使用與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的抗體或配體，對上述b)所述的固定蛋白中 Siglec-15的表達(dá)量進(jìn)行檢測的步驟；以及e)通過分析由上述C)檢測的該蛋白表達(dá)量和由上述d)檢測的該蛋白表達(dá)量之間 的差異，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療效果和/或預(yù)防效果的步驟。(3)使用內(nèi)源性配體的篩選方法通過觀察是否由于添加受試物質(zhì)而抑制內(nèi)源性配體與Siglec-15的結(jié)合，也可進(jìn)行抑制向破骨細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩選。作為Siglec-15的內(nèi)源性配體的唾液酸化多糖的 實例包含與人和小鼠Siglec-15結(jié)合的Neu5Ac α 2_6GalNAc以及與小鼠Siglec-15結(jié)合 的Neu5ACa2-3Gali3 l_4Glc，然而，Siglec-15的內(nèi)源性配體不受限于這些多糖，只要具有 對Siglec-15的結(jié)合親和力即可?；跍y試與Siglec-15的結(jié)合的目的，這些內(nèi)源性配體 可用適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽、放射性同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記。例如，生物素化聚丙烯酰胺，其已結(jié)合有 如Neu5Ac a 2-6GalNAc的唾液酸化寡糖，可作為與Siglec-15結(jié)合的探針用于篩選。作為 結(jié)合內(nèi)源性配體的Siglec-15，可使用Siglec-15表達(dá)細(xì)胞或從該細(xì)胞制備的膜組分。另 外，也可從Siglec-15表達(dá)細(xì)胞分離、然后純化Siglec-15用于篩選。作為Siglec-15表 達(dá)細(xì)胞，可使用任何表達(dá)Siglec-15的培養(yǎng)細(xì)胞系、在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞中通過基因工程使 Siglec-15基因短暫或持續(xù)表達(dá)的細(xì)胞、或從活體內(nèi)得到的表達(dá)Siglec-15的細(xì)胞中任一 種。使用這樣的內(nèi)源性配體的篩選方法可通過下述步驟進(jìn)行。(i)包括以下步驟a)和b)的方法a)向Siglec-15表達(dá)細(xì)胞中添加Siglec-15的內(nèi)源性配體和受試物質(zhì)的步驟；以 及b)通過比較添加和未添加受試物質(zhì)時內(nèi)源性配體與Siglec-15表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合 量，判定受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療和/或預(yù)防效果的步驟。(ii)包括以下步驟a)至C)的方法a)制備Siglec-15表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞膜組分的步驟；b)向該細(xì)胞膜組分中添加Siglec-15的內(nèi)源性配體和受試物質(zhì)的步驟；以及c)通過比較添加和未添加受試物質(zhì)時內(nèi)源性配體與該細(xì)胞膜組分的結(jié)合量，判定 受試物質(zhì)對骨代謝異常的治療和/或預(yù)防效果的步驟。(iii)包括以下a)至C)步驟的方法a)制備 Siglec-15 的步驟；b)向a)中的Siglec-15中添加Siglec-15的內(nèi)源性配體和受試物質(zhì)的步驟；以 及c)通過比較添加和未添加受試物質(zhì)時內(nèi)源性配體與Siglec-15的結(jié)合量，判定受 試物質(zhì)對骨代謝異常的治療和/或預(yù)防效果的步驟。當(dāng)通過遺傳工程使適當(dāng)?shù)募?xì)胞表達(dá)Siglec-15，且將得到的Siglec-15純化供篩 選時，待篩選的Siglec-15可選自由以下的(a)至(i)中表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(a)序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列；(b)由序列表的SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328位 構(gòu)成的氨基酸序列；(c)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第260 位構(gòu)成的氨基酸序列；(d)由序列表中的SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第260 位構(gòu)成的氨基酸序列；(e)序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列；(f)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第341 位構(gòu)成的氨基酸序列；
(g)由序列表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；(h)由序列表中的SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第258 位構(gòu)成的氨基酸序列；以及(i)包括(a)至(h)中所述的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加的氨基酸序列。待篩選的Siglec-15也可選自由以下的(j)至(η)表示的核苷酸序列編碼的氨基 酸序列構(gòu)成的多肽(j) SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；(k)SEQ ID NO 3表示的核苷酸序列；(I)SEQ ID NO 19表示的核苷酸序列；(m)SEQ ID NO 43表示的核苷酸序列；(η)具有與由與(j)至(m)中記載的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷 酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸的核苷酸序列。此外，通過將適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽與任意這些多肽連接的多肽，或與不同的可溶性蛋白質(zhì) 融合的多肽也可用作篩選目標(biāo)。另外，由序列表中的SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的氨 基酸殘基第1位至第20位構(gòu)成的多肽相當(dāng)于人Siglec-15的信號肽，而由其氨基酸殘基 第21位至第260位構(gòu)成的多肽相當(dāng)于人Siglec-15的成熟蛋白的胞外域。另外，由序列 表中的SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第20位構(gòu)成的多肽相當(dāng)于 小鼠Siglec-15的信號肽，而由其氨基酸殘基第21位至第258位構(gòu)成的多肽相當(dāng)于小鼠 Siglec-15的成熟蛋白的胞外域。另外，SEQ ID NO 43表示的核苷酸序列編碼人Siglec-15 的胞外域，所述人Siglec-15由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列編碼，而SEQ IDNO 19表示 的核苷酸序列編碼小鼠Siglec-15的胞外域，所述小鼠Siglec-15由SEQ ID NO 3表示的 核苷酸序列編碼。對于用(1)至(3)中的任一篩選方法篩選的抑制向破骨細(xì)胞分化的物質(zhì)的 候選物質(zhì)，可以以如實施例17、19以及20所示的破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶 (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase =TRAP)活性的抑制為指標(biāo)進(jìn)行二次評價。此外， 也可以以實施例19、21、22和35表示的TRAP陽性多核破骨細(xì)胞形成的抑制，即破骨細(xì)胞的 細(xì)胞融合的抑制為指標(biāo)進(jìn)行二次評價。(4)其它方法對哺乳動物個體給予受試物以引起過量表達(dá)Siglec-15和不給予受試物質(zhì)的情 況，測定隨時間變化的骨代謝異常的發(fā)病率、骨代謝異常的程度、和/或存活率等。給予受 試物質(zhì)的哺乳動物中，骨代謝異常發(fā)病率顯著降低、骨代謝異常的程度顯著減輕、和/或存 活率增高為約10%以上，優(yōu)選為約30%以上，更優(yōu)選為約50%以上，此時可以選擇受試物 質(zhì)作為對骨代謝異常具有治療和/或預(yù)防效果的化合物。4.抗Siglec-15抗體的制備本發(fā)明的抗Siglec-15的抗體可通過以下方法獲得根據(jù)常規(guī)的方法，用選自 Siglec-15或Siglec-15的氨基酸序列的任意的多肽來免疫動物，并采集和純化活體內(nèi)產(chǎn) 生的抗體。作為抗原的Siglec-15的生物種不限于人，也可以用從小鼠、大鼠等人以外的動物得到的Siglec-15來免疫動物。在這種情況下，通過測試與得到的異源Siglec-15結(jié)合 的抗體與人Siglec-15之間的交叉反應(yīng)性，能夠選擇可適用于人的疾病的抗體。另夕卜，可根據(jù)公知的方法(例如，Kohlerand Milstein，Nature (1975) 256， 第 495-497 頁；Kennet, R. ed. , Monoclonal Antibody, 第 365-367 頁，PrenumPress, N. Y. (1980))，通過使產(chǎn)生Siglec-15抗體的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來建立雜交 瘤，以得到單克隆抗體。另外，作為抗原的Siglec-15可通過以下方法得到通過遺傳工程，使宿主細(xì)胞產(chǎn) 生 Siglec-15 基因。具體而言，所述遺傳工程可如下進(jìn)行制備可以表達(dá)Siglec-15基因的載體，將得 到的載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因，然后純化表達(dá)的Siglec-15。下面具體說明獲得 Siglec-15抗體的方法。(1)抗原的制備作為用于制備抗Siglec-15抗體的抗原的實例包括Siglec-15，或由Siglec-15的 至少6個連續(xù)氨基酸殘基組成的部分氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或者在其上附加有給定的氨 基酸序列或載體而得到的衍生物。此外，對于“3.向破骨細(xì)胞的分化抑制物質(zhì)的篩選方法” 部分中，作為篩選目標(biāo)例示的Siglec-15也可以作為用來制備抗Siglec-15抗體的抗原。Siglec-15可從人的腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中直接純化后使用。此外，Siglec-15還 可以體外合成，或者通過遺傳工程使其在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生獲得。具體而言，在遺傳工程中，將SigleC-15CDNA整合到可表達(dá)Siglec-15的載體中， 然后Siglec-15在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液中合成，或者通過 使其它原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以表達(dá)Siglec-15，由此可得到抗原。另外，還可通過使作為膜蛋白的Siglec-15的胞外域與抗體的恒定區(qū)連接得到的 融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗?載體系中表達(dá)，可以以分泌蛋白得到抗原。Siglec-15的cDNA例如可通過如下方法獲得例如，被稱為PCR的方法，其中使用 以表達(dá)Siglec-15cDNA的cDNA文庫為模板，以及特異性擴(kuò)增Siglec-15的cDNA的引物進(jìn) 行聚合酶鏈反應(yīng)(以下稱為“PCR”)(參照Saiki，R.K.，等.Science (1988) 239，第487-489 頁)。多肽的體外合成系統(tǒng)，例如可舉出羅氏診斷產(chǎn)品公司制備的快速翻譯系統(tǒng)(RTS)， 但不受其限制。原核細(xì)胞宿主的實例包括大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草桿菌 (Bacillussubtilis)等。為了在這些宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化靶基因，可以用含有來自與所述宿主 相容的的種的復(fù)制子(即復(fù)制起點)以及調(diào)控序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。另外，所述 載體優(yōu)選具有可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有表型選擇性的序列。真核細(xì)胞的宿主細(xì)胞的實例包含脊椎動物、昆蟲和酵母，脊椎動物經(jīng)常使用例如 猿細(xì)胞 COS 細(xì)胞(Gluzman, Y. Cell (1981) 23，第 175-182 頁、ATCCCRL-1650)、小鼠成纖維 細(xì)胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞、ATCC CCL-61)的二氫 葉酸還原酶缺失細(xì)胞株(Urlaub，G.和 Chasin，L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77，第 4126-4220頁)等，但不受其限制。如上所述得到的轉(zhuǎn)化體可根據(jù)常規(guī)的方法培養(yǎng)，病通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生目標(biāo)多肽。該培養(yǎng)使用的適合培養(yǎng)基可根據(jù)所采用的宿主細(xì)胞從常用的各種培養(yǎng)基選擇。如 果使用大腸桿菌，則可以使用根據(jù)需要在其中添加氨芐青霉素等抗生素或IPMG的LB培養(yǎng)基。通過上述培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外生產(chǎn)的重組蛋白可利用該蛋白的物理 性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)，通過各種公知的分離操作方法進(jìn)行分離和純化。該方法的具體實例包括，通過常規(guī)的蛋白質(zhì)沉淀劑進(jìn)行的處理、超濾、如分子篩層 析(凝膠過濾)、吸附色譜、離子交換色譜和親和層析等各種液相色譜、透析法、以及它們的
組合等。另外，可以通過將由6個組氨酸殘基與上述待表達(dá)的重組蛋白連接，該蛋白可用 鎳親和柱高效純化。或者，可以通過將IgG的Fc區(qū)與待表達(dá)的重組蛋白連接，該蛋白可用 蛋白A柱高效純化。通過將上述方法組合，可以高產(chǎn)率、高純度容易地大量制備目標(biāo)多肽。(2)抗Siglec-15單克隆抗體的制備與Siglec-15特異性結(jié)合的抗體的例子包括與Siglec-15特異性結(jié)合的單克隆抗 體，該抗體的獲得方法如下所述。制備單克隆抗體一般需要下述操作步驟(a)純化作為抗原使用的生物聚合物；(b)通過向動物注射該抗原免疫該動物，然后采集血液，測定其抗體滴度，并確定 脾摘除時間，以制備抗體產(chǎn)生細(xì)胞；(c)制備骨髓瘤細(xì)胞(以下稱為“骨髓瘤”)；(d)將抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤融合；(e)篩選生成目標(biāo)抗體的雜交瘤群；(f)將雜交瘤分開成為單細(xì)胞克隆(克隆)(g)任選培養(yǎng)雜交瘤，或培育移植有雜交瘤的動物，以制備大量單克隆抗體；(h)檢測上述制備的單克隆抗體的生物活性及其結(jié)合特異性，或者鑒定其帶有標(biāo) 記試劑的特性等。以下，按照上述步驟對單克隆抗體的制備方法進(jìn)行詳述，但該體的制備方法并不 限于此，例如也可以使用脾細(xì)胞以外的抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤。(a)抗原的純化可以使用按照上述方法制備的Siglec-15或其部分肽作為抗原。另外，可以使用由表達(dá)Siglec-15的重組細(xì)胞制備的膜組分、或者使用表達(dá) Siglec-15的重組細(xì)胞本身、以及本領(lǐng)城技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行化學(xué)合成得到的本發(fā)明 的蛋白的部分肽作為抗原。(b)抗體生成細(xì)胞的制備將步驟(a)中所得的抗原、佐劑(如弗氏完全或不完全佐劑、或者硫酸鉀鋁)混 合，以所得到的混合物作為免疫原，對實驗動物進(jìn)行免疫。對于實驗動物，可無困難地使用 公知的雜交瘤制備方法中所使用的任何動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿 羊、牛、馬等。但是，從容易獲得與提取的抗體生成細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞的角度考慮，優(yōu)選以小鼠或大鼠作為被免疫動物。此外，對于實際使用的小鼠和大鼠的株沒有特別限制，小鼠例如可以使用A、AKR、 BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HTl、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、 SWR、WB、以及129等各系，而為大鼠時，例如可使用Wistar、Low、Lewis、Spraque Daweley, ACI、BN、Fischer 等。這些小鼠和大鼠例如可從日本CLEA、日本Charles River Laboratories等實驗動 物培育銷售商購得。其中，從與后述的骨髓瘤細(xì)胞的融合相容性考慮，特別優(yōu)選小鼠中的BALB/c株、 以及大鼠中的Wistar和Low系作為被免疫動物。另外，考慮到人和小鼠之間的抗原同源性，還優(yōu)選使用除去自身抗體、具有降低的 生物功能的小鼠，即自身免疫疾病小鼠。另外，這些小鼠或大鼠在免疫時的周齡優(yōu)選為5-12周齡，更優(yōu)選6-8周齡。為了 Siglec-15或其重組體免疫動物，例如可采用Weir，D. Μ.，Handbook ofExperimental Immunology Vol.I. II. III. , Blackwell ScientificPublications, Oxford(1987)、Kabat, E. A.和 Mayer, Μ. Μ. , ExperimentalImmunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigf ield，Illinois (1964)等中詳細(xì)記載的公知的方法。這些免疫方法中，本發(fā)明優(yōu)選的具體方法例如如下所述。S卩，首先，將作為抗原的膜蛋白組分或表達(dá)抗原的細(xì)胞皮內(nèi)或腹腔內(nèi)給予動物。但是，為提高免疫效率，優(yōu)選兩種給予途徑的組合，如果前半階段進(jìn)行皮內(nèi)給予， 則后半階段或者只在最后給藥時進(jìn)行腹腔內(nèi)給予，則可特別提高免疫效率。 給予抗原的方案根據(jù)被免疫動物的種類、個體差異等而不同。然而，通?？乖o予 次數(shù)優(yōu)選為3-6次、更優(yōu)選給予次數(shù)為3-4次，而給予間隔為2-6周，更優(yōu)選為2-4周。另外，抗原給予劑量根據(jù)動物的種類、個體差異等不同。然而，通常劑量設(shè)定為 0. 05-5mg,優(yōu)選 0. 1-0. 5mg 左右。加強免疫在上述給予抗原1-6周后、優(yōu)選2-4周后、更優(yōu)選2_3周后進(jìn)行。另外，進(jìn)行加強免疫時的抗原給予劑量根據(jù)動物的種類或大小等而不同。然而，為 小鼠時，劑量通常為0. 05-5mg，優(yōu)選0. 1-0. 5mg，更優(yōu)選0. 1-0. 2mg左右。上述加強免疫1-10天后、優(yōu)選2-5天后、更優(yōu)選2_3天后，從被免疫動物中無菌摘 取含有抗體生成細(xì)胞的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。此時，測定抗體滴度，以抗體滴度足夠升高的動物作為抗體生成細(xì)胞供給源，這樣 后續(xù)的操作更有效率。這里所采用的抗體滴度的測定方法包括，例如RIA法或ELISA法，但不受這些方法 的限制。例如，如果使用ELISA法，則本發(fā)明中抗體滴度的測定可根據(jù)如下所述步驟進(jìn)行。首先，將純化或部分純化的抗原吸附于ELISA用96孔板等固相表面，再將未吸附 抗原的固相表面用與抗原無關(guān)的蛋白例如牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)包被。洗滌該 表面，然后使該表面與作為初級抗體的系列稀釋的樣品(例如小鼠血清)接觸，使樣品中所 含的抗體與上述抗原結(jié)合。再加入作為二級抗體的酶標(biāo)抗小鼠抗體，使之與小鼠抗體結(jié)合，洗滌后加入該酶的底物，通過底物降解等誘導(dǎo)而顯色，可測定由顯色產(chǎn)生的吸光度的變化等，并計算抗體滴度?？赏ㄟ^公知的方法從上述脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞中分離抗體生成細(xì)胞(例如，Kohler 等.，Nature (1975) 256，第 495 頁；Kohler 等.，Eur. J. Immnol. (1977) 6，第 511 頁；Milstein 等·，Nature (1977)，266，第 550 頁，；Walsh, Nature, (1977) 266，第 495 頁)。例如，為脾細(xì)胞時，可采用將脾勻漿以得到細(xì)胞，用不銹鋼網(wǎng)過濾細(xì)胞，然后使細(xì) 胞懸浮于Eagle基本培養(yǎng)基(MEM)，從而分離抗體生成細(xì)胞的常規(guī)方法。(c)骨髓瘤細(xì)胞(以下稱為“骨髓瘤”)的制備對于細(xì)胞融合所使用的骨髓瘤細(xì)胞沒有特別限制，可從公知的細(xì)胞系中選擇適合 的細(xì)胞。但是，基于從融合細(xì)胞中選擇雜交瘤時的便利性角度考慮，優(yōu)選使用其選擇步驟已 經(jīng)得到確立的HGPRT (次黃嘌呤(hipoxanthin)-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)缺失細(xì)胞株。更具體而言，HGPRT缺失細(xì)胞株的實例包括來自小鼠的X63_Ag8 (X63)、 NSl-ANS/1 (NSl)、P3X63-Ag8. Ul (P3U1)、X63-Ag8. 653 (X63. 653)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、 MPC11-45. 6TG1. 7(45. 6TG)、FO、S149/5XX0 禾口 BU. 1 等，來自大鼠的 210. RSY3. Ag. 1. 2. 3 (Y3)等，以及來自人的 U266AR(SK0-007)、GM1500 · GTG-A12 (GM1500)、UC729-6、 LICR-L0ff-HMy2 (HMy2)和 8226AR/NIP4-1 (NP41)等。這些HGPRT 缺失細(xì)胞株例如可由 American Type Culture Collection(ATCC)等獲得。這些細(xì)胞株可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基例如8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基[RPMI-1640培養(yǎng)基中 加入谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、以及胎牛血清(以下稱為“FCS”)，在所得培養(yǎng)基中 再加入8-氮雜鳥嘌呤得到的培養(yǎng)基]、Iscove' s改性Dulbecco' s培養(yǎng)基(Iscove’ s Modified Dulbecco' s Medium ；以下稱為 “ IMDM，，)、或者 Dulbecco ‘ s 改性 Eagle 培養(yǎng)基 (Dulbecco' s Modified Eagle Medium ；以下稱為“DMEM”)中繼代培養(yǎng)。在這種情況下， 可以在細(xì)胞融合之前3-4日在正常培養(yǎng)基[例如含有10% FCS的ASF104培養(yǎng)基(味之素 (株)制造)]中繼代培養(yǎng)，以在融合當(dāng)天得到不少于2 X IO7的細(xì)胞。(d)細(xì)胞融合抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合可按照公知的方法(Weir，D. Μ.，Handbookof Experimental Immunology Vol. I. II. III. , BlackwelIScientific Publications, Oxford (1987)、Kabat, E. A.禾口 Mayer, Μ. Μ. , Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas PublisherSpigf ield，Illinois (1964)等)，在不使細(xì)胞存活率過度降低的條件下 適當(dāng)實施。所述方法的實例包括在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中將抗體生成細(xì)胞和骨髓 瘤細(xì)胞混合的化學(xué)方法；利用電刺激的物理方法。這些方法中，上述化學(xué)方法的具體例子如下所述。S卩，使用聚乙二醇作為高濃度聚合物溶液時，在分子量為1500-6000、優(yōu)選 2000-4000的聚乙二醇溶液中、在30-40°C、優(yōu)選35_38°C的溫度下，使抗體生成細(xì)胞和骨髓 瘤細(xì)胞混合1-10分鐘，優(yōu)選5-8分鐘。(e)雜交瘤群的選擇由上述細(xì)胞融合得到的雜交瘤的選擇方法沒有特別限制，通常，可以采用HAT(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)選擇法(Kohler 等·，Nature (1975) 256，p. 495 ；Milstein 等·， Nature(1977)266, p. 550)。該方法對于使用在氨基蝶呤存在下無法存活的HGPRT缺失細(xì)胞株的骨髓瘤細(xì)胞 獲得雜交瘤的情形有效。即，通過將未融合細(xì)胞和雜交瘤在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，僅選擇性地容許對氨基蝶 呤具有抗性的雜交瘤存活并增殖。(f)分開成為單細(xì)胞克隆(克隆化)雜交瘤的克隆方法例如可使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、或有限稀釋法等公 知的方法(例如參照 Barbara，B. M.禾口 Stanley，Μ· S. =Selected Methods inCellular Immunology, W. H. Freeman 和 Company, San Francisco (1980))。這些方法中，特別優(yōu)選有限 稀釋法。該方法中，向微孔板上接種來自胎大鼠的成纖維細(xì)胞株或如正常小鼠脾細(xì)胞、胸 腺細(xì)胞、腹水細(xì)胞等的飼養(yǎng)細(xì)胞。另一方面，預(yù)先將雜交瘤在培養(yǎng)基中稀釋以得到細(xì)胞密度為0. 2-0. 5個/0. 2ml, 每孔中各加入0. Iml該稀釋的雜交瘤懸浮液，以預(yù)定的時間間隔(例如每3天)將約1/3 的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)兩周左右，由此可使雜交瘤克隆增殖。使已確認(rèn)了抗體滴度的孔中的雜交瘤經(jīng)受克隆化，例如將有限稀釋法克隆重復(fù) 2-4次。將已確認(rèn)具有穩(wěn)定抗體滴度的雜交瘤選作抗Siglec-15單克隆抗體生成雜交瘤細(xì) 胞株。這樣克隆的雜交瘤細(xì)胞株的例子包括雜交瘤#32A1和雜交瘤#41B1。雜交瘤#32A1 和雜交瘤#41B1于2008年8月28日保藏在日本國獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利 生物保藏中心(所在地郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東1條1門1中央第6)。 雜交瘤#32A1以抗Siglec-15雜交瘤#32A1的名稱及保藏號FERM BP-10999保藏，以及雜 交瘤#41B1以抗Siglec-15雜交瘤#41B1的名稱及保藏號FERM BP-11000保藏。另外，本 說明書中，雜交瘤#32A1產(chǎn)生的抗體以“#32A1抗體”，或簡單的“#32A1”表示；雜交瘤#41B1 產(chǎn)生的抗體以“#41B1抗體”，或簡單的#41B1”表示。另外，對于本說明書的實施例中取得 的除#32A1抗體和#41B1抗體以外的抗體，也用同樣的方法以抗體名表示。(g)通過雜交瘤的培養(yǎng)制備單克隆抗體對于上述選擇的雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)，可以有效獲得單克隆抗體，但優(yōu)選在培養(yǎng)之前 對生成目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤進(jìn)行篩選。該篩選可采用已知的方法。本發(fā)明的抗體滴度的測定例如可通過上述(b)項說明的ELISA法進(jìn)行。由上述方法得到的雜交瘤可以在液氮中或者-80°C或以下的冷凍箱中以冷凍狀態(tài)保存。對于完成克隆后的雜交瘤，將培養(yǎng)基由HT培養(yǎng)基換為正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。大量培養(yǎng)可以通過使用大型培養(yǎng)瓶的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或者通過旋動培養(yǎng)進(jìn)行。從該大量培養(yǎng)得到的上清液中，通過使用如凝膠過濾等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方 法進(jìn)行純化，可得到與本發(fā)明的蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體。另外，向與雜交瘤同株小鼠(例如上述的BALB/c)或者Nu/Nu小鼠的腹腔內(nèi)注射雜交瘤，使該雜交瘤增殖，由此可以獲得含有大量本發(fā)明的單克隆抗體的腹水。腹腔內(nèi)給予雜交瘤時，如果事先(3-7天前)給予如2，6，10，14-四甲基十五碳烷 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(降植烷)等的礦物油，則可得到更大量的腹水。例如，預(yù)先向與雜交瘤同株的小鼠腹腔內(nèi)注射免疫抑制劑，使T細(xì)胞失活。20天 后，使IO6-IO7個雜交瘤克隆細(xì)胞懸浮于不含血清的培養(yǎng)基中(0.5ml)，然后向小鼠腹腔內(nèi) 注射該懸浮液，通常在腹部膨脹、充滿腹水時由該小鼠采集腹水。通過該方法，可得到比培養(yǎng)液中的單克隆抗體約高100倍以上濃度的單克隆抗 體。由上述方法得到的單克隆抗體例如可通過Weir，D.M. =Handbook ofExperimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford(1978)中記載
的方法純化。即所述方法的實例包括硫酸胺鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法、親和層析法寸。簡便的純化方法可以利用市售的單克隆抗體純化試劑盒(例如，MAbTrapGII試劑 盒；Pharmacia，Inc.制造)等。上述所得單克隆抗體對于Siglec-15具有高抗原特異性。(h)單克隆抗體的測定上述所得單克隆抗體的同種型和亞類的確定可如下進(jìn)行。首先，鑒定法的實例包括奧脫洛尼(Ouchterlony)法、ELISA法以及RIA法。奧脫洛尼法簡便，但是單克隆抗體濃度低時需要進(jìn)行濃縮操作。另一方面，使用ELISA法或RIA法時，可使培養(yǎng)上清液與吸附有抗原的固相進(jìn)行直 接反應(yīng)，再通過使用各種免疫球蛋白同種型和亞類所對應(yīng)的抗體作為二級抗體，可以鑒定 單克隆抗體的同種型和亞類。此外，更簡便的方法可利用市售的用于鑒定的試劑盒(例如，小鼠分型試劑盒； Bio-Rad Laboratories 制造)等。此外，蛋白的定量可通過福林勞里法、以及基于280nm處的吸光度[1. 4(0D280)= 免疫球蛋白lmg/ml]計算的方法進(jìn)行。(3)其他抗體本發(fā)明的抗體不僅包括上述抗Siglec-15的單克隆抗體，而且包括以降低對人的 異種抗原性等為目的人工改造的重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。這些 抗體可使用已知的方法制備。作為嵌合抗體，可例示抗體可變區(qū)和恒定區(qū)來自不同的種的抗體，例如使來自 小鼠的抗體的可變區(qū)與來自人的恒定區(qū)結(jié)合的嵌合抗體(參照Proc. Nat 1. Acad. Sci. U. S. Α.，81，6851-6855，(1984))。作為人源化抗體，可例示只將互補決定區(qū)(CDR ；complementaritydetermining region)整合到來自人的抗體中的抗體(參照Nature (1986) 321，第522-525頁)，以及通 過CDR移植法，將一部分構(gòu)架的氨基酸殘基和CDR序列移植到人抗體得到的抗體(國際公 開小冊子W090/07861)。此外，本發(fā)明的抗體包括人抗體。抗Siglec-15人抗體是指只具有來自人染色體的抗體的基因序列的人抗體。抗Siglec-15人抗體可通過使用人抗體生成小鼠的方法獲 得(參照 Tomizuka, K.等·，Nature Genetics (1997) 16，第 133-143 頁；Kuroiwa, Y.等·， Nuc. Acids Res. (1998)26，第 3447-3448 頁；Yoshida, H.等·，AnimalCell Technology Basic 禾口 Applied Aspects vol. 10,第 69—73 頁(Kitagawa, Y. , Matuda, Τ.禾口 Iijima, S.編輯)，Kluwer AcademicPub 1 ishers, 1999 ；Tomizuka, K.等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97，第722-727頁等)，該人抗體生成小鼠具有含人抗體的H鏈和L鏈的基因的人 染色體片段。這樣的轉(zhuǎn)基因動物，可通過如下具體制備已破壞非人哺乳動物的內(nèi)源性免疫球 蛋白重鏈和輕鏈的基因座，取代的是借由酵母人工染色體(YAC)載體等導(dǎo)入人免疫球蛋白 重鏈和輕鏈的基因座的遺傳改造動物通過制備基因敲除動物和轉(zhuǎn)基因動物并使其交配制 備。此外，根據(jù)遺傳工程技術(shù)，通過分別編碼這樣的人抗體的重鏈和輕鏈的cDNA，優(yōu)選 包含該cDNA的載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，培養(yǎng)生成重組人單克隆抗體的轉(zhuǎn)化體，由此該抗體也可
由培養(yǎng)上清液獲得。這里，宿主例如可以使用真核細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以 及骨髓瘤細(xì)胞。另外，還已知獲得由人抗體文庫篩選的來自噬菌體展示的人抗體的方法 (參 照 fformstone, I. M.等，Investigafive Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), M 2301-2308 M ；Carmen, S. ^ . , Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002),1 (2), 第 189-203 頁；Siriwardena, D.等·， Opthalmology (2002) 109 (3)，第 427-431 頁等)。例如，可使用使人抗體可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面表達(dá)，并選擇與 抗原結(jié)合的噬菌體的噬菌體展示法(Nature Biotechnology (2005)，23，(9)，第1105-1116 頁)。通過分析基于與抗原結(jié)合選擇的噬菌體基因，可確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的 可變區(qū)的DNA序列。若已明確與抗原結(jié)合的scFvDNA序列，可通過制備具有該序列的表達(dá)載體，并將 該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦惺蛊浔磉_(dá)，而獲得人抗體(W092/01047，W092/20791，W093/06213， W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388、Annu. Rev. Immunol (1994) 12，第 433-455 頁、NatureBiotechnology (2005) 23(9)，第 1105-1116 頁)?？贵w基因一旦分離，然后將該基因?qū)氲竭m當(dāng)?shù)乃拗髦兄苽淇贵w時，可使用適當(dāng) 的宿主和表達(dá)載體的組合。將真核細(xì)胞用作宿主時，可使用動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真核微生物細(xì)胞。作為動物細(xì)胞，可例示(1)哺乳類細(xì)胞，例如猿細(xì)胞的COS細(xì)胞(Gluzman， Y. Cell (1981) 23，第 175-182 頁、ATCC CRL-1650)、小鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞、ATCCCCL-61)的二氫葉酸還原酶缺失細(xì)胞株 (Urlaub, G.和 Chasin，L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1980) 77，第 4126-4220 頁)。當(dāng)使用原核細(xì)胞時，例如可例示大腸桿菌和枯草桿菌。通過轉(zhuǎn)化，向這些細(xì)胞中導(dǎo)入目標(biāo)抗體基因，并體外培養(yǎng)這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，由此可得到該抗體。本發(fā)明的抗體同種型沒有限制，其實例包括IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、 IgA (IgAl、IgA2)、IgD和IgE，且其優(yōu)選實例包括IgG和IgM。此外本發(fā)明的抗體可以是具有抗體的抗原結(jié)合部位的抗體功能性片段或其修飾 的片段。通過將該抗體用如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等的蛋白酶處理，或根據(jù)遺傳工程技術(shù) 修飾該抗體基因，并使該修飾的基因在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，可得到該抗體的片段。在這 些抗體片段中，保持抗體全長分子功能的全部或部分的片段，可稱為該抗體的功能性片段。 一般而言，抗體功能可例示抗原結(jié)合活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗 體依賴性細(xì)胞毒活性、補體依賴性細(xì)胞毒活性以及補體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒活性。本發(fā)明 中抗體功能性片段保持的功能優(yōu)選抑制破骨細(xì)胞形成的活性，更優(yōu)選抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞 融合過程的活性。所述抗體片段的實例包括Fab、F(ab' )2、Fv、或以適當(dāng)?shù)慕宇^連接重鏈和輕鏈Fv 的單鏈Fv(SCFV)、雙抗體、線狀抗體、以及由抗體片段組成的多特異性抗體等。另外，抗體片 段還包括作為在還原條件下處理F(ab’ ) 2抗體的可變區(qū)的單價片段的Fab’。此外，本發(fā)明的抗體可以是具有對至少兩種不同抗原的特異性的多特異性抗體。通常，這樣的分子結(jié)合兩個抗原(即，雙特異性抗體)，但本發(fā)明中的“多特異性抗 體”包含對兩種或兩種以上(例如，3種)抗原具有特異性的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多特異性抗體，所述多特異性抗體由全長抗體，或這樣的抗 體的片段(例如，F(xiàn)(ab' )2雙特異性抗體)構(gòu)成。該雙特異性抗體可通過連接兩種抗體的 重鏈和輕鏈(HL對)來制備，也可以通過使生成不同單克隆抗體的雜交瘤融合，以制備生成 雙特異性抗體的融合細(xì)胞來制備(Millstein等·，Nature (1983) 305，第537-539頁)。本發(fā)明的抗體可以是單鏈抗體(也稱為scFv)。該單鏈抗體可通過以多肽接 頭連接抗體的重鏈V區(qū)和輕鏈V區(qū)獲得(Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg禾口Moore編，Springer Verlag, NewYork,第 269-315 頁(1994)、 Nature Biotechnology (2005)，23，第1126-1136頁)。此外，也可將通過多肽接頭連接兩種 scFv制備的BiscFv片段作為雙特異性抗體使用。制備單鏈抗體的方法在本領(lǐng)域中公知(例如，參照美國專利第4，946，778號、美國 專利第5，260，203號、美國專利第5，091，513號、美國專利第5，455，030號等)。這種scFv 中，重鏈V區(qū)和輕鏈V區(qū)通過不產(chǎn)生綴合體的接頭、優(yōu)選多肽接頭連接(Huston，J. S.等.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)，85，第 5879-5883 頁)。scFv 中重鏈 V 區(qū)和輕鏈 V 區(qū)可 來自同一抗體，也可來自不同抗體。作為用于連接V區(qū)的多肽接頭，例如可以使用由12-19 殘基構(gòu)成的給定單鏈肽。編碼scFv的DNA可如下獲得使用編碼全部或所需氨基酸序列的部分DNA序列為 模板，所述全部或所需氨基酸序列的DNA選自編碼上述抗體的重鏈或重鏈V區(qū)的DNA以及 編碼其輕鏈或輕鏈V區(qū)的DNA，并使用限定其兩端的引物對，通過PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，接著，進(jìn) 一步進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增結(jié)合了編碼多肽接頭部分的DNA和限定其兩端的引物對，從而將 其兩端分別連接重鏈和輕鏈。此外，編碼scFv的DNA —經(jīng)制備，可根據(jù)常規(guī)方法獲得包含該DNA的表達(dá)載體以 及由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主。另外，通過使用該獲得的宿主，可根據(jù)常規(guī)方法獲得scFv。
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這些抗體片段可通過以上述相同的方法獲得基因并表達(dá)該基因，由宿主產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體，可以使其增量以提高對抗原的親和性。待增量的抗體可以是一種 抗體，也可以是識別相同抗原的多種表位的多種抗體。作為增量抗體的方法，可例示IgG CH3結(jié)構(gòu)域與兩個scFv分子結(jié)合，與鏈霉抗生素蛋白結(jié)合，螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋基序?qū)氲?。本發(fā)明的抗體可以是為氨基酸序列不同的多種抗Siglec-15抗體的混合物的多 克隆抗體。作為該多克隆抗體的一個例子，可例示具有不同CDR的多種抗體的混合物。作 為這樣的多克隆抗體，可使用培養(yǎng)產(chǎn)生不同抗體的細(xì)胞混合物，并由所得到的培養(yǎng)物純化 的抗體(參照W02004/061104號)。作為修飾的抗體，也可使用與任意如聚乙二醇(PEG)的各種類型的分子結(jié)合的抗 體。此外，本發(fā)明的抗體可以是這些抗體和其它藥劑形成綴合體的形式(免疫綴合 物)。作為這樣的抗體的例子包括該抗體與放射性物質(zhì)或具有藥理作用的化合物綴合的那 些(Nature Biotechnology (2005) 23，第 1137-1146 頁)?？梢詫⑺每贵w純化至均一?？贵w的分離和純化可使用常規(guī)的蛋白的分離和純化 方法進(jìn)行。例如，可適當(dāng)選擇并組合使用色譜柱、濾器、超濾、鹽析、透析、制備的聚丙烯 酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等，進(jìn)行抗體的分離和純化(Strategies forprotein Purification and Charcterization :A Laboratoy Course Manual, DanielR. Marshak 等·編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ；Antibodies :A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, ColdSpring Harbor Laboratory (1988)), O=Li^Tj^ ^· 受這些方法的限制。色譜法的實例包括親和層析法、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾色譜法、 反相色譜法、和吸附色譜法。 這些色譜法可使用液相色譜法進(jìn)行，如HPLC或FPLC。作為用于親和層析法的柱子，可例示蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作為使用蛋白A柱的柱子，可例示Hyper D、P0R0S, Sepharose F. F. (Pharmacia)等。另外，通過使用其上固定有抗原的載體，利用該抗體對抗原的結(jié)合特性也可純化 抗體。5.含有Siglec-15抗體的藥物從由上述“4.抗Siglec-15抗體的制備”一項中所述的方法中得到的抗Siglec-15 抗體中，可獲得中和Siglec-15的生物活性的抗體。這些中和Siglec-15的生物活性的抗 體可抑制生物體內(nèi)的Siglec-15生物活性，即，抑制破骨細(xì)胞的分化和/或成熟，因此可作 為藥物，用作由破骨細(xì)胞的分化和/或成熟異常引起的骨代謝異常的治療和/或預(yù)防劑。 骨代謝異?？梢允侨魏我怨堑膬袅魇?骨質(zhì)減少或骨質(zhì)溶解)為特征的病癥。一般地，用 抗Siglec-15抗體的治療和/或預(yù)防適用于需要抑制骨吸收的情況?？捎每筍iglec-15抗 體治療和/或預(yù)防的骨代謝異常的實例包括骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì) 疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治療用藥劑而導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥)、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤以及癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎導(dǎo)致的牙齒缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨 溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特骨病、腎病性骨營養(yǎng)不良、以及成骨不全等，然而，骨 代謝異常不受這些的限制，只要其是伴隨破骨細(xì)胞性的骨的凈流失的疾病即可。作為上述 藥物使用的抗Siglec-15抗體的例子包括從#32A1抗體或#41B1抗體由4. (3) “其他抗體” 中所述的方法制備的嵌合抗體和人源化抗體。此外，具有與#32A1抗體或#41B1抗體相同 表位的嵌合抗體、人源化抗體以及人抗體也可作為藥物使用。某種抗Siglec-15抗體具有 與32A1抗體或#41B1抗體相同表位，可通過觀察這些抗體是否與相同的Siglec-15的特定 部分肽結(jié)合確認(rèn)。此外，若某種抗Siglec-15抗體與#32A1抗體或#41B1抗體競爭性結(jié)合 Siglec-15，則也可判定這些抗體具有相同的表位?？筍iglec-15抗體中和Siglec-15的生物活性的體外活性可通過例如抑制過量表 達(dá)Siglec-15的細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的活性來測定。例如，以各種濃度向來自小鼠單核細(xì) 胞的細(xì)胞系的RAW264. 7細(xì)胞或RAW264細(xì)胞中添加抗Siglec-15抗體，可測定通過RANKL 和TNF-α的刺激抑制向破骨細(xì)胞分化的活性。此外，以各種濃度向來自骨髓的原代培養(yǎng)細(xì) 胞中添加抗Siglec-15抗體，可測定通過RANKL、TNF-α或活性維生素D3的刺激抑制向破 骨細(xì)胞分化的活性。此外，以各種濃度向正常人破骨前體細(xì)胞(可購自三光純藥產(chǎn)品目錄 號2Τ-110)中添加抗Siglec-15抗體，可測定通過RANKL和M-CSF的刺激抑制向破骨細(xì)胞 分化的活性。這樣的對破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)可以通過以實施例17、19、20和26所示的 破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性的抑制為指標(biāo)進(jìn)行測定。此外，也可以通過以 實施例19、21、22和35所示的TRAP陽性多核破骨細(xì)胞形成的抑制，即破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合 的抑制為指標(biāo)測定對破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。在上述破骨細(xì)胞分化的試驗系統(tǒng)中，本發(fā) 明的抗體在30 μ g/ml或以下的濃度下顯示對細(xì)胞融合的抑制效應(yīng)，一些抗體甚至在3 μ g/ ml或以下，或1 μ g/ml或以下的濃度下也顯示抑制效應(yīng)。此外，在試驗在更低濃度下的效 應(yīng)時，觀察到多個抗體甚至在63ng/ml至1 μ g/ml的濃度范圍下對破骨細(xì)胞分化的抑制效 果。此外，在使用來自股骨和/或脛骨的細(xì)胞進(jìn)行的陷窩測定實驗(Takada等.，Bone and Mineral, (1992) 17，347-359)中，通過以各種濃度向來自股骨和/或脛骨的細(xì)胞中添加抗 Siglec-15抗體，并觀察象牙質(zhì)切片上的陷窩形成，可測定抑制破骨細(xì)胞的骨吸收的體外活 性。作為測定抑制破骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨破壞的體外活性的系統(tǒng)，如實施例37所示，也可使用 涂層有綴合銪的人膠原的平板。上述破骨細(xì)胞所致的骨吸收的試驗系統(tǒng)中，本發(fā)明的抗體 在3 μ g/ml或以下的濃度下，即在從0. 3 μ g/ml至3 μ g/ml的濃度范圍下抑制骨吸收。利用 實驗動物進(jìn)行的抗Siglec-15抗體對骨代謝異常的體內(nèi)治療或預(yù)防效應(yīng)可通過如下確認(rèn) 例如，對骨質(zhì)疏松模型動物或過量表達(dá)Siglec-15的轉(zhuǎn)基因動物給予抗Siglec-15抗體，并 測定破骨細(xì)胞的變化。上述所得的中和Siglec-15的生物活性的抗體可用作藥物、特別是用作治療或預(yù) 防骨代謝異常的的藥物組合物，所述骨代謝異常如骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨 破壞、伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞，或者用于上述疾病的免疫學(xué)診斷的抗體。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療中，伴隨該疾病的發(fā)病的骨流失是主要的難題。業(yè) 已報道在伴隨RA的這種骨流失中，破骨細(xì)胞起主要作用。被認(rèn)為是RA中破骨細(xì)胞的誘導(dǎo) (分化和成熟)、活化、以及骨破壞的原因最重要的細(xì)胞因子為RANKL和TNF-α (Romas E 等·，Bone 30，第340-346，2002)。如本說明書的實施例19所示，作為RANKL的誘餌受體的0CIF/0PG可抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，但是不抑制TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。 另一方面，如本發(fā)明的抗Siglec-15抗體有效抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和TNF-α 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。因此，期望本發(fā)明的抗Siglec-15抗體可以比RANKL阻滯劑(OCIF/ 0PG、抗RANKL抗體等)更強力地抑制RA等中的TNF- α誘導(dǎo)的骨流失和骨破壞。作為一實例，對于骨代謝異常的治療或預(yù)防，抗Siglec-15抗體可以單獨給予，或 與至少一種骨相關(guān)疾病的治療劑一起給予。作為另一實例，抗Siglec-15抗體可以與治療 有效量的抗骨代謝異常治療劑一起給予?？膳c抗Siglec-15抗體一起給予的治療劑的實例 包括但不限于，二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、雌二醇等激素制劑、SERMs (選 擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激 素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF受體制劑、抗TNF α抗體或該抗體的功能性片段、抗 PTHrP(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受 體抗體或該抗體的功能性片段、抗RANKL抗體或該抗體的功能性片段以及0CIF。根據(jù)骨代 謝異常的狀態(tài)和希望治療和/或預(yù)防的程度，可以給予2、3或更多種藥物，這些藥物可以通 過封裝在同一制劑中一起給予。也可以將這些藥物與抗Siglec-15抗體通過封裝在同一制 劑中一起給予。此外，這些藥物也可以通過封裝為治療和/或預(yù)防用試劑盒的形式一起給 予。另外，還可以將這些藥物與抗Siglec-15抗體分別供給。在基因治療中給予時，可以將 蛋白性的骨疾病治療劑的基因和抗Siglec-15抗體的基因插入到相同或不同啟動子區(qū)的 下游，從而可導(dǎo)入至相同或不同的載體中。通過使骨疾病治療劑與抗Siglec-15抗體或其片段綴合，可以制備如 M. C. Garnet "Targeted drug conjugates :principles and progress，，，AdvancedDrug Delivery Reviews, (2001) 53，171-216中所述的靶式藥物綴合物。為達(dá)到該目的， 可使用除抗體分子外的任何抗體片段，只要其沒有完全失去對破骨細(xì)胞的識別能 力，其實例包括Fab、F(ab’)2、以及Fv。本發(fā)明中也可以以相同的方式使用該抗體 和該片段?？筍iglec-15抗體或該抗體的片段與骨疾病治療劑形成的綴合物可為， 如 M.C. Garnet “Targeted drug conjugates !principles andprogress”，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53，171-216、G.T.Hermanson “Bioconjugate Techniques，，Academic Press，California (1996)、Putnam 禾口 J. Kopecek "Polymer Conjugates with AnticancerActivity^Advances in Polymer Science(1995) 122，55-123 等中所述的各種形式的任意一種。即，可例示抗Siglec-15抗體和骨痰病治療劑彼此化學(xué) 性直接綴合或經(jīng)由寡肽等間隔區(qū)而綴合的綴合物形式、經(jīng)由適當(dāng)?shù)乃幬镙d體綴合的綴合物 形式。藥物載體的例子包括脂質(zhì)體和水溶性聚合物。通過這些藥物載體的綴合物形式的 更具體實例包括將抗體和骨痰病治療劑合并入脂質(zhì)體中，并將該脂質(zhì)體與抗體彼此綴合 的綴合物形式；以及骨疾病治療劑與水溶性聚合物(分子量1000-100000左右的化合物) 化學(xué)性直接或經(jīng)由寡肽等間隔區(qū)綴合，并將抗體與該水溶性聚合物綴合的綴合物形式。抗 體(或其片段)與骨疾病治療劑、或脂質(zhì)體以及水溶性聚合物等藥物載體的綴合可按照本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實施，如 G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques，，Academic Press, California(1996)、Putnam 禾口 J. Kopecek "Polymer Conj ugates withAnticancer Activity”Advances in Polymer Science (1995) 122，55-123 中所述的方法。骨疾病治療劑 在脂質(zhì)體中的合并可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實施，如D. D. Lasic"Liposomes =FromPhysics to Applications，，,Elsevier SciencePublishers B. V. ,Amsterdam(1993)中所述 的方法等。骨疾病治療劑與水溶性聚合物的合并可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實施， 如 D. Putnam 禾口 JKopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity"Advances in PolymerScience (1995) 122，55-123中所述的方法。除上述方法外，抗體(或其片段)與蛋 白性的骨疾病治療劑(或其片段)的綴合物還可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過遺傳 工程實施。本發(fā)明也提供含有治療和/或預(yù)防有效量的抗Siglec-15抗體和藥學(xué)上可接受的 稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供含有治療和/或預(yù)防有效量的抗Siglec-15抗體、治療和/或預(yù)防 有效量的至少一種骨疾病治療劑，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐 劑和/或佐劑的藥物組合物。骨疾病治療劑的實例包括但不限于二膦酸鹽、活性維生素d3、 降鈣素及其衍生物、如雌二醇的激素制劑、SERMs (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、 維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF 受體制劑、抗TNFa抗體或該抗體的功能性片段、抗PTHrP(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗 體或該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能性片段、抗 RANKL抗體或該抗體的功能性片段以及OCIF(破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中可接受的用于制劑中的物質(zhì)優(yōu)選在其給予量和給予 濃度時對給予藥物組合物的人沒有毒性。本發(fā)明的藥物組合物可包含能改變或維持pH、滲透壓、粘度、透明度、顏色、等張 性、顏色、無菌條件、穩(wěn)定性、溶解度、緩釋率、吸收率、以及滲透性的制劑用物質(zhì)。制劑用的 物質(zhì)的實例包括但不限于以下物質(zhì)如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨 酸的氨基酸類；抗菌劑；如抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉的抗氧化劑；如磷酸鹽、檸檬酸 鹽、硼酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽和Tris鹽酸(Tris-HCl)溶液的緩沖劑；如甘露醇和甘氨酸的 填充劑；如四乙酸乙二胺(EDTA)的螯合劑；如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-環(huán)糊精和羥丙 基_ β _環(huán)糊精的絡(luò)合劑；如葡萄糖、甘露糖和糊精的增量劑，如單糖類和二糖類的其它碳 水化合物；著色劑；香味劑；稀釋劑；乳化劑；如聚乙烯吡咯烷的親水聚合物；如低分子量 多肽，成鹽抗衡離子，苯扎氯銨、安息香酸鹽、水楊酸、硫汞撒、苯乙醇、羥苯甲酯、羥苯丙酯、 氯己定、山梨酸和過氧化氫的防腐劑；如甘油、丙二醇和聚乙二醇的溶劑；如甘露醇和山梨 醇的糖醇；混懸劑；如脫水山梨糖醇酯、包括聚山梨酯20和聚山梨酯80的聚山梨酯、三硝 基甲苯(triton)、氨丁三醇、卵磷脂和膽固醇的表面活性劑；如蔗糖和山梨醇的穩(wěn)定性強 化劑；如氯化鈉、氯化鉀和甘露醇和山梨醇的彈性增強劑；轉(zhuǎn)運劑；稀釋劑；賦形劑和/或 藥學(xué)上的佐劑。這些制劑用的物質(zhì)的添加量優(yōu)選添加抗Siglec-15抗體重量的0. 01-100 倍，特別優(yōu)選0. 1-10倍。制劑中合適的藥物組合物的優(yōu)選組成可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所 適用的疾病、適用的給予途徑等適當(dāng)確定。藥物組合物中的賦形劑和載體可以是液體也可以是固體的形式。適當(dāng)?shù)馁x形劑或 載體還可以是注射用水、生理鹽水、人工腦脊液或胃腸外給予中通常所使用的其它物質(zhì)。此 外，還可以將中性生理鹽水或含有血清白蛋白的生理鹽水作為載體使用。藥物組合物可以 含有pH7. 0-8. 5的Tris緩沖液或pH4. 0-5. 5的乙酸鹽緩沖液，并可補充山梨醇或其它化 合物。本發(fā)明的藥物組合物的實例包括含有抗Siglec-15抗體的藥物組合物、以及含有抗
33Siglec-15抗體和至少一種骨疾病治療劑的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物作為具有所 選擇的組成和所需的純度的藥劑，制成凍干品或液體形式。含有抗Siglec-15抗體的藥物 組合物以及含有抗Siglec-15抗體和至少一種骨代謝異常的治療劑的藥物組合物也可以 使用適當(dāng)?shù)馁x型劑(如蔗糖)形成凍干品。本發(fā)明的藥物組合物可以制成胃腸外給予，還可以制成經(jīng)口服的消化道吸收用 的形式。制劑的組成和濃度可根據(jù)給予方法確定。對于本發(fā)明的藥物組合物中所含的抗 Siglec-15抗體對Siglec-15的親和性較高，即，對Siglec-15的解離常數(shù)(Kd值)較低，則 該抗Siglec-15抗體可顯示其在較低劑量對人的藥效，因此基于該結(jié)果，還可以確定本發(fā) 明的藥物組合物對人的劑量。對于劑量，在對人給予人抗Siglec-15抗體時，該抗體可以約 0. l-100mg/kgU 180 天一次給予。本發(fā)明的藥物組合物的劑型的實例包括如下包括輸液的注射劑、栓劑、經(jīng)鼻劑、 舌下劑、經(jīng)皮吸收劑等。6.直接相互作用的物質(zhì)的探索本發(fā)明的另一實施方案包括為獲得抑制Siglec-15活性的物質(zhì)并基于Siglec-15 的構(gòu)型的藥物設(shè)計方法。所述方法已知有合理化藥物設(shè)計方法，并用于探索有效抑制或激 活酶活性或與配體、協(xié)同因子、或DNA結(jié)合的化合物。作為這樣的化合物的例子，市場上的 作為抗HIV藥物的蛋白酶抑制劑廣為人知。本發(fā)明的Siglec-15的三維結(jié)構(gòu)分析也可以利 用X射線晶體分析或核磁共振等通常廣為人知的方法。此外，為了探索抑制Siglec-15功 能的物質(zhì)，還可以進(jìn)行應(yīng)用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計(CADD)的設(shè)計。其例子已知有抑制AP-I 活性并有望作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的新型基因組新藥的低分子量化合物(國際專利申 請公開W099/58515號)等。通過所述方法，有可能得到抑制Siglec-15功能的物質(zhì)，其通 過與Siglec-15直接結(jié)合或者通過抑制Siglec-15與其它因子的相互作用。此外，另一實施方案涉及與本發(fā)明的Siglec-15聯(lián)合的多肽，即Siglec-15的伴侶 蛋白。即，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)Siglec-15活性的伴侶蛋白的篩選方法。該篩選方法的一個實施方案包含使受試蛋白樣品與Siglec-15接觸，并選擇與 Siglec-15結(jié)合的蛋白的步驟。該方法例如可例示使用純化的Siglec-15，親和純化與其結(jié) 合的蛋白的方法。該方法的具體的實例描述如下。以由6個組氨酸組成的序列作為親和標(biāo) 記物，使其與Siglec-15融合，以制備融合蛋白，將所得蛋白與細(xì)胞提取液(將細(xì)胞溶液裝 滿鎳_瓊脂糖柱后，取通過該柱的組分)在4°C下孵育12小時，然后向該混合物中另外添 加鎳_瓊脂糖載體，將該混合物在4°C下孵育1小時。用洗滌緩沖液充分洗滌鎳_瓊脂糖 載體，然后在混合物中添加IOOmM咪唑，由此使細(xì)胞提取液中的與Siglec-15特異性結(jié)合的 蛋白洗脫并純化，然后，純化的蛋白經(jīng)分析并確定其結(jié)構(gòu)。如上所述，可以純化與Siglec-15 直接結(jié)合的蛋白、以及與Siglec-15不具結(jié)合活性但與Siglec-15間接結(jié)合的蛋白，其中所 述間接結(jié)合通過與上述作為亞單元的與Siglec-15直接結(jié)合的蛋白形成復(fù)合物達(dá)到。作為 替代的方法，還可以有通過far-western免疫印跡法、或使用酵母或哺乳類動物細(xì)胞的雙 雜交系統(tǒng)法進(jìn)行的克隆，但并不限于這些方法。如果如此得到與Siglec-15直接或間接相互作用的伴侶蛋白的cDNA，則該cDNA可 以用于功能性篩選抑制Siglec-15與該伴侶蛋白的相互作用的物質(zhì)。具體而言，例如制備 Siglec-15與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白，并使其與用抗谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抗體包被的
34微孔板結(jié)合，然后使生物素化的伴侶蛋白與該融合蛋白接觸，通過鏈霉抗生物素綴合的堿 性磷酸酶檢測該伴侶蛋白與該融合蛋白的結(jié)合。添加生物素化的伴侶蛋白時也添加受試物 質(zhì)，以選擇促進(jìn)或抑制該融合蛋白與該伴侶蛋白結(jié)合的物質(zhì)。通過該方法，可得到與該融合 蛋白直接作用的物質(zhì)或與該伴侶蛋白直接作用的物質(zhì)。當(dāng)該融合蛋白通過另一因子與該伴侶蛋白的間接結(jié)合時，例如，在含有該因子的 細(xì)胞提取液存在下，進(jìn)行上述測定。在這種情況下，也有可能選擇對該因子作用的物質(zhì)。此外，所得伴侶蛋白具有促進(jìn)Siglec-15功能的活性時，按照上述的應(yīng)用 Siglec-15基因的表達(dá)載體的實驗方法，可以進(jìn)行可用作骨代謝異常治療和/或預(yù)防藥劑、 例如骨質(zhì)疏松癥的治療和/或預(yù)防藥劑的候選物質(zhì)的篩選。此外，當(dāng)所得伴侶蛋白具有抑 制Siglec-15的功能的活性時，編碼上述抑制因子的多核苷酸可用于骨代謝異常的基因治 療。所述多核苷酸可通過如下方法獲得例如，對已鑒定的抑制因子的氨基酸序列進(jìn) 行分析，合成寡核苷酸探針，其中該寡核苷酸探針編碼該氨基酸序列，并進(jìn)行cDNA文庫或 基因組文庫的篩選。此外，當(dāng)具有抑制Siglec-15功能的活性的多肽為來自隨機(jī)合成的人 工肽文庫時，化學(xué)合成由編碼該肽的氨基酸序列的核苷酸序列構(gòu)成的DNA。在基因治療中，將編碼上述所得的抑制因子的基因整合到例如病毒載體中，使具 有所得重組病毒載體的病毒(已減毒處理)感染患者?；颊唧w內(nèi)產(chǎn)生抗骨破壞因子，并運 行具有抑制破骨細(xì)胞分化的功能，因此，可以實現(xiàn)治療和/或預(yù)防骨代謝異常。將基因治療劑導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法可以采用利用病毒載體的基因轉(zhuǎn)移方法、或非病 毒性的基因轉(zhuǎn)移方法。用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法的實例包括將編碼Siglec-15的抑制因子或其 突變體的DNA整合到DNA病毒或RNA病毒中的方法，以實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，所述DNA病毒或RNA 病毒反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、或辛 德比斯病毒。其中，特別優(yōu)選使用反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或牛痘病毒的方法。非病 毒性的基因轉(zhuǎn)移方法的實例包括將表達(dá)質(zhì)粒直接給予肌肉的方法(DNA疫苗法)、脂質(zhì)體 法、脂轉(zhuǎn)染法、微注射法、磷酸鈣法以及電穿孔法。具體而言，優(yōu)選DNA疫苗法和脂質(zhì)體法。此外，為了使基因治療劑實際作為藥物使用，還有將DNA直接導(dǎo)入體內(nèi)的體內(nèi) 法和由人體取出某種細(xì)胞，在體外將DNA導(dǎo)入該細(xì)胞，再將該細(xì)胞返回體內(nèi)的回體法(ex vivo)ο例如，通過體內(nèi)法給予該基因治療劑時，根據(jù)痰病、癥狀等，可通過靜脈或動脈、皮 下、皮內(nèi)、或肌內(nèi)等適當(dāng)?shù)慕o予途徑給予。另外，通過體內(nèi)法給予時，該基因治療劑通常配制 成注射劑，然而，也可以根據(jù)需要加入常用的載體。此外，制成脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(如 仙臺病毒_脂質(zhì)體)的形式時，可以配制成如混懸劑、冷凍劑、離心濃縮和冷凍劑等脂質(zhì)體 制劑。與序列表中的SEQ ID NO :1或3表示的核苷酸序列的全長序列或部分序列互補的 核苷酸序列，可用于所謂的反義治療。反義分子可以作為與選自序列表中的SEQ ID NO 1 和3表示的核苷酸序列的核苷酸序列的一部分互補、通常由15-30個核苷酸構(gòu)成的DNA使 用；或作為其穩(wěn)定的DNA衍生物，如其硫代磷酸酯、膦酸甲酯或嗎啉代衍生物；或穩(wěn)定的RNA 衍生物，如2’-0_烷基RNA使用。通過注射極小量該反義分子、通過將該分子形成脂質(zhì)體膠囊，或者利用具有反義序列的載體表達(dá)該分子等本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法，可將上 述反義分子導(dǎo)入到細(xì)胞中。上述反義療法用于治療由于序列表中的SEQ IDNO :1或3表示 的核苷酸序列所編碼的蛋白活性過度增加而引起的疾病。另外，還可例示使用雙鏈短RNA(SiRNA)的方法(“夕一 > 文· 7 > F ·〒”工口 、m y V (Genes and Developments) ”)，2001 年 1 月 15 日，第 15 卷，第 2 號，第 188-200 頁)。例如，制備Siglec-15基因的siRNA，并根據(jù)該文獻(xiàn)所述的方法導(dǎo)入細(xì)胞，由此可制備 伴隨Siglec-15的過量表達(dá)的骨代謝性疾病的治療劑。實施例以下，通過參考實施例更詳細(xì)說明本發(fā)明，然而，本發(fā)明不受這些實施例的限定。 此外，下述實施例中，如無特別說明，基因操作相關(guān)的各操作均按照“分子克隆(Molecular Cloning) ” (Sambrook, J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis, Τ.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年發(fā)行)中所述的方法進(jìn)行，或者在使用市售試劑或試劑盒時，按 照市售品所附的說明書使用。實施例1巨細(xì)胞瘤組織中人Siglec-15基因的表達(dá)巨細(xì)胞瘤(GCT)是組織學(xué)上出現(xiàn)大量破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞的骨腫瘤，且其特征 是臨床發(fā)現(xiàn)具有骨溶解性的骨破壞(Bullough等.，Atlas of OrthopedicPathology 2nd edition, 17. 6-17. 8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992))。使用 Gene Logic, Inc.的數(shù)據(jù)庫(Genesis 2006 Release 3. 0)，對具有與人 Siglec-15 基因部分重 復(fù)的核苷酸序列的 EST 探針(AffymetrixGeneChip HG-U133 探針 215856_at =Affymetrix, Inc.制備)在GCT組織中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。此外，對于對破骨細(xì)胞分化具有重要作用 的 RNAK (Affymetrix GeneChip HG-U 133 探針 207037_at，Affymetrix, Inc 制備)和 RNAKL (Affymetrix GeneChip HG-U133 探針 210643_at，Affymetrix，Inc.制備)、以及對 于作為破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的組織蛋白K(Affymetrix GeneChipHG_U133 probe 202450_ s_at, Affymetrix, Inc.制備)禾口 TRAP (AffymetrixGeneChip HG-U133 probe 204638_at, Affymetrix, Inc.制備)的EST探針，也以相同的方式進(jìn)行GCT組織中的表達(dá)譜分析。對13例正常骨組織、12例GCT組織、16例GCT以外的骨腫瘤組織進(jìn)行表達(dá)量比較， 其顯示，與正常組織相比，GCT組織中的RNAK和RNAKL的轉(zhuǎn)錄特異性增加(圖1_A)。另一 方面，被認(rèn)為不一定會引起骨吸收增加的GCT以外的骨腫瘤組織中，RNAK和RNAKL的轉(zhuǎn)錄比 在GCT中的低，由此表明GCT提供促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和活化的環(huán)境。另外，對組織蛋白酶K 和TRAP的基因表達(dá)量進(jìn)行比較，在GCT中這些基因以高水平轉(zhuǎn)錄(圖1-B)，表明出現(xiàn)大量 具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞。類似地，對于Siglec-15基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平比較，發(fā)現(xiàn)該基因 與RNAK、RNAKL、組織蛋白酶K和TRAP各基因相同，在GCT中以高水平特異性轉(zhuǎn)錄(圖2)。 由此表明Siglec-15與如GCT的骨吸收增加的人的病理學(xué)相關(guān)。實施例2從來自小鼠的成熟破骨細(xì)胞的總RNA的提取a)用含有10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基將來自小鼠單核細(xì)胞的細(xì)胞 RAW264. 7 (ATCC Cat. No. TIB-71)制備成4. 5X IO4細(xì)胞/ml，將所得到的細(xì)胞制劑接種于 75cm2的燒瓶，每燒瓶10ml，添加人RANKL (P^roTech公司制備)，得到終濃度為40ng/ml， 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)該細(xì)胞3天。另外，以相同的方式對未添加人RANKL的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)試劑所附的方法，使用總RNA提取用試劑(IS0GEN 日本基因公司制備)，由在各自條件下培養(yǎng)的RAW264. 7提取總RNA。在_80°C下保存收集的總RNA。b)在活性維生素D3存在下培養(yǎng)來自小鼠骨髓的原代培養(yǎng)細(xì)胞時，則出現(xiàn)大量 TRAP 陽性多核破骨細(xì)胞(Takahashi 等.，Endocrinology，(1988) 122，1373-1382)。在乙醚麻醉下用頸椎脫臼使8周齡雄性DDY小鼠安樂死，摘取股骨和脛骨。除去 軟組織，然后截斷股骨或脛骨兩端，用帶有25號注射針頭的注射筒向骨髓中注入包含10% 胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，并采集骨髓細(xì)胞。計數(shù)細(xì)胞數(shù)，然后在包含10%胎牛血清的 α-MEM培養(yǎng)基中制備成5Χ106細(xì)胞/ml，將所得到的細(xì)胞制劑以100μ 1/孔Χ60孔接種于 96孔板，添加活性維生素D3 (Sigma公司制備)以得到終濃度為2 X 10_8M，在CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)所述細(xì)胞8天。另外，一相同方式對未添加活性維生素D3的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此外，在第3 天和第6天實施培養(yǎng)基替換和活性維生素D3的添加。接著，根據(jù)試劑所附的方法，使用總RNA提取用試劑(IS0GEN 日本基因公司制 備)，由在各自條件下培養(yǎng)的細(xì)胞提取總RNA。在-80°C下保存收集的總RNA直至使用。實施例3小鼠Siglec-15開放閱讀框(ORF)序列的取得a)第一鏈 cDNA 合成向?qū)嵤├?的a)中制備的總RNA 1 μ g中力口入1 μ 1的IU/ μ 1 DNAseIU μ 1 IOXDNAseI緩沖液(Invitrogen, Inc.制備)，用H2O使終體積為10 μ 1，在室溫下使其反 應(yīng)15分鐘，然后添加1 μ 1 25mM EDTA，得到的混合物在65°C下加熱10分鐘。由該溶液 取8 μ 1的等分樣品，添加1 μ 1的50 μ M oligo (dT) 20引物和1 μ 1的IOmM dNTPs,得到的 混合物在65°C下加熱5分鐘，然后在冰中孵育。向該溶液中加入2μ 1的10XRT緩沖液 (Invitrogen, Inc.制備)、4μ 1 的 25mM MgCl2Jy 1 的 0. IM 二硫蘇糖醇、1 μ 1 RNAse 抑制 劑(RNAse0UT,40U/y 1, Invitrogen, Inc.制備)、1μ1 SuperscriptIII 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ 1>Invitrogen, Inc.制備)并使其總體積為20 μ 1。該混合物在50°C下反應(yīng)50分鐘，然 后在85°C下加熱5分鐘，冰中孵育一分鐘。之后將該混合物在-20°C下保存。b) PCR 反應(yīng)按照常規(guī)方法，合成具有以下序列的寡核苷酸5，-agaattccac cATGGAGGGG TCCCTCCAAC TC-3，(mSiglec-15-EcoRIkozak-F 序 列表中的SEQ ID NO 5)以及5，-cgccgctcga gTTATTTCTC ATGGTGAATG AC-3，(mSiglec-15-XhoI-R 序列表中 的 SEQ ID NO 6)其用作通過PCR法擴(kuò)增小鼠Siglec-15的ORF cDNA的引物。使用所述引物組合 和a)中制備的cDNA，以及高保真聚合酶(Invitrogen，Inc.制備)按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR。 熱循環(huán)儀條件設(shè)定如下在94°C下加熱2分鐘，然后重復(fù)“94°C下0. 5分鐘、55°C下0. 5分 鐘、68°C下1. 5分鐘”的溫度循環(huán)35次，然后在68°C下加熱5分鐘，并在4°C下孵育。c)向 pcDNA3. 1 (+)載體的克隆對b)中得到的PCR反應(yīng)液禾口 pcDNA3. 1 (+)載體(Invitrogen, Inc.制備)進(jìn)行限 制性酶處理(EcoRI、XhoI)，柱純化后，按照常規(guī)方法進(jìn)行連接酶反應(yīng)。用得到的載體向大 腸桿菌DH5 α -Tl轉(zhuǎn)化，并接種于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿。由上述所得大腸桿菌菌落，分 離出含有小鼠Siglec-15/pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
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用DNA測序儀分析插入所得質(zhì)粒中的ORF cDNA的總核苷酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其為 序列表中的SEQ ID N0:3表示的序列。所述核苷酸序列，與以“小鼠⑶33L3”(登錄號 XM_884636)登錄于NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測序列的ORF編碼區(qū)相同，此外，由該核 苷酸序列編碼的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO 4)與小鼠CD33L3的預(yù)測氨基酸序列
100%—致。實施例4伴隨小鼠破骨細(xì)胞分化的Siglec-15的mRNA表達(dá)(實時PCR分析)a)向?qū)嵤├?的a)或b)中制備的總RNA Wlyg中加入1 μ 1的IU/ μ 1 DNAseI, 1 μ 1的IOXDNAseI緩沖液(Invitrogen，Inc.制備)，用H2O至終體積為10 μ 1，在室溫下 使其反應(yīng)15分鐘，然后添加1 μ 1的25mM EDTA，所得到的混合物在65°C下加熱10分鐘。 由該溶液取8μ 1等分樣品，添加1μ的1 50 μ M oligo (dT) 2(1引物和1 μ 1的IOmM dNTPs, 將得到的混合物在65°C下加熱5分鐘，然后在冰中孵育。向該溶液中加入2 μ 1的10XRT 緩沖液(Invitrogen，Inc.制備)、4μ1 的 25mM MgCl2、2yl 的 0. IM 二硫蘇糖醇、1 μ 1 的 RNAse 抑制劑(RNAseOUT、40U/μ 1、Invitrogen, Inc.制備)、1 μ lSuperscriptIII 逆轉(zhuǎn)錄 酶(200υ/μ 1、Invitrogen, Inc.制備)并使其總體積為20 μ 1，使該混合物在50°C下反應(yīng) 50分鐘，然后在85°C下加熱5分鐘，在冰中孵育。使用如上所述制備的單鏈cDNA，用下面的引物和熒光標(biāo)記探針(TaqMan探針、應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司制備)的組合進(jìn)行實時PCR。實時PCR條件小鼠Siglec-15擴(kuò)增用引物5，-tcaggctcag gagtccaatt at_3，(TqM-mSiglec-15-F 序列表中的 SEQ IDNO 7)以及5，_ggtctagcct ggtactgtcc ttt_3，(TqM-mSiglec-15-R 序列表中的 SEQ IDNO 8)、小鼠Siglec-15 檢測用 TaqMan 探針5，-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3，(TqM-mSiglec-15-探針 序列表中的SEQ ID NO :9)、小鼠L32核糖體蛋白擴(kuò)增用引物5，-aagaagttca tcaggcacca gt_3，(TciM-mL32-F 序列表中的 SEQ ID NO 10)以及5，-cttgacattg tggaccagga ac_3，(TqM_mL32-R 序列表中的 SEQ ID NO 11)
小鼠L32核糖體蛋白檢測用TaqMan探針5，-Fam-aaacccagag gcaRgacaa cagggtgc_TAMRA_3，(TqM_mL32-探針序列表中 的 SEQ ID NO 12)使用實時PCR系統(tǒng)(ABI Prism 7700序列檢測器、(株)珀金埃爾默日本 應(yīng)用生 物系統(tǒng)事業(yè)部制)，在以下條件下進(jìn)行實時PCR分析。在反應(yīng)中使用TaqMan通用PCR主要 混合液(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制備)。首先，向各25pmol的引物、8ng的單鏈cDNA和IOpmol 的TaqMan探針中加入蒸餾水使終體積為25 μ 1，然后，加入25 μ 1 TaqMan通用PCR主要混 合液，由此制備50 μ 1的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在50°C加熱2分鐘，然后在95°C下加熱10分 鐘，重復(fù)“95°C下0. 25分鐘、60°C下1分鐘”的溫度循環(huán)40次，進(jìn)行實時PCR分析。此夕卜， 用L32核糖體蛋白的mRNA表達(dá)量校正小鼠Siglec-15的mRNA表達(dá)量。
其結(jié)果是，在向RAW264. 7中添加RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時，以及向來自小鼠骨髓的 原代培養(yǎng)細(xì)胞中添加活性維生素D3誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時，Siglec-15基因的表達(dá)量都顯著上升 (圖 3)。b)在包含10%胎牛血清的α -MEM培養(yǎng)基中將RAW264. 7制備成4. 5X IO4細(xì)胞/ ml，將得到的細(xì)胞制劑接種于75cm2的燒瓶，每燒瓶10ml，添加人RANKL(P印roTech公司制 備)使其終濃度為40ng/ml，在0)2培養(yǎng)箱中將該細(xì)胞培養(yǎng)0、1、2和3天。另外，以相同的 方式對未添加人RANKL的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)試劑所附的方法，使用總RNA提取用試劑(IS0GEN 日本基因公 司制備)，由在各自條件下培養(yǎng)的RAW264. 7提取總RNA。在_80°C下保存收集的總RNA。向如此收集的總RNA Iyg中加入1 μ 1的IU/μ 1 DNAseIU μ 1的IOXDNAseI緩 沖液(Invitrogen，Inc.制備)，用H2O使終體積為10 μ 1，在室溫下使其反應(yīng)15分鐘，然后 添加1 μ 1的25mM EDTA，將得到的混合物在65°C下加熱10分鐘。由該溶液取8 μ 1等分樣 品，添加1μ 1的50μΜ oligo(dT)2Q引物和1μ 1的IOmM dNTPs，將得到的混合物在65°C下 加熱5分鐘，然后在冰中孵育。向該溶液中加入2μ 1的10XRT緩沖液(Invitrogen，Inc. 制備)、4μ 1 的 25mM MgCl2、2y 1 的 0. IM二硫蘇糖醇、1 μ 1 的 RNAse 抑制劑(RNAseOUT、40U/ μ 1、Invitrogen, Inc. 備)、1μ 1 SuperscriptIII 逆轉(zhuǎn)錄Bl (200U/ μ 1、Invitrogen, Inc.制備)使其總體積為20 μ 1。使該混合物在50°C下反應(yīng)50分鐘，然后在85°C下加熱 5分鐘，然后在冰中孵育。使用如上所述制備的單鏈cDNA，用下面的引物和熒光標(biāo)記探針(TaqMan探針、應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司制備)的組合進(jìn)行實時PCR。實時PCR條件小鼠組織蛋白酶K擴(kuò)增用引物5' -ggcatctttc cagttttaca gc-3' (TqM-mcatK-F 序列表中的 SEQ ID NO 13)以及5，-gttgttctta ttccgagcca ag_3，(TqM-mcatK-R 序列表中的 SEQ ID NO 14) >小鼠組織蛋白酶K檢測用TaqMan探針5，-Fam-atgtgaacca tgcagtgttg gtggtggg_TAMRA_3，(TqM-mcatK-探針序列表 中的 SEQ ID NO :15)、小鼠TRAP擴(kuò)增用引物5，-gaacttcccc agcccttact ac_3，(TqM-mTRAP-F :序列表中的 SEQ ID NO 16)以及5，-aactgctttt tgagccagga c_3，(TciM-mTRAP-R 序列表中的 SEQ ID NO 17)小鼠TRAP檢測用TaqMan探針5，-Fam-ttgccagtca gcagcccaaa atgcct-TAMRA-3，(TqM-mTRAP-探針序列表中 的 SEQ ID NO :18)、小鼠Siglec-15擴(kuò)增用引物5，-tcaggctcag gagtccaatt at_3，(TqM-mSiglec-15-F 序列表中的 SEQ IDNO 7)以及5，_ggtctagcct ggtactgtcc ttt_3，(TqM-mSiglec-15-R 序列表中的 SEQ IDNO 8)、
小鼠Siglec-15 檢測用 TaqMan 探針5，-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3，(TqM-mSiglec-15-探針 序列表的SEQ ID NO 9)、小鼠L32核糖體蛋白擴(kuò)增用引物5，-aagaagttca tcaggcacca gt_3，(TciM-mL32-F 序列表中的 SEQ ID NO 10)以及5，-cttgacattg tggaccagga ac_3，(TqM_mL32-R 序列表中的 SEQ ID NO 11)小鼠L32核糖體蛋白檢測用TaqMan探針5，-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3，(TqM_mL32-探針序列表 中的 SEQ ID NO 12)使用實時PCR系統(tǒng)(ABI Prism 7700序列檢測器、(株)珀金埃爾默日本·應(yīng)用 生物系統(tǒng)事業(yè)部制)，在以下條件下進(jìn)行實時PCR分析。在反應(yīng)中使用TaqMan通用PCR主 要混合液(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制備)。首先向各25pmol的引物、8ng的單鏈cDNA和IOpmol 的TaqMan探針中加入蒸餾水使終體積為25 μ 1，然后加入25 μ 1的TaqMan通用PCR主要 混合液，由此制備50 μ 1的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在50°C加熱2分鐘，然后在95°C下加熱10 分鐘，重復(fù)“95°C下0. 25分鐘和60°C下1分鐘”的溫度循環(huán)40次，進(jìn)行實時PCR分析。此 夕卜，用L32核糖體蛋白的mRNA表達(dá)量校正各基因的mRNA表達(dá)量。其結(jié)果是，已知作為破骨細(xì)胞的標(biāo)記分子的組織蛋白酶K和TRAP基因表達(dá)量在 RANKL添加后第2-3天顯著上升(圖4-A、B)。類似地，Siglec-15基因表達(dá)量也在RANKL 添加后第2-3天顯著上升(圖5)。由此結(jié)果可知，伴隨破骨細(xì)胞分化的Siglec-15基因表 達(dá)上調(diào)，特別是Siglec-15基因在分化后期有強的表達(dá)。實施例5可溶性小鼠Siglec-15蛋白的表達(dá)構(gòu)建體的制備。編碼小鼠Siglec-15蛋白的胞外域的部分核酸序列為序列表中的SEQ IDNO :19， 氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N0:20。通過利用這樣的部分序列，可使動物細(xì)胞等的培 養(yǎng)上清液中產(chǎn)生可溶性小鼠Siglec-15蛋白。a)通過PCR的可溶性小鼠Siglec-15基因的擴(kuò)增按照常規(guī)方法，合成具有以下序列的寡核苷酸5’ -ggggacaagt ttgtacaaaaaagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3’(mSiglec-15-ECD-F 序列表中 的 SEQ ID NO 21)以及5，-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGCGGAAC-3， (mSi glec-15-ECD-R 序列表中的 SEQ ID NO 22)其用作通過PCR法擴(kuò)增小鼠Siglec-15的胞外結(jié)構(gòu)域cDNA的引物。此外，這些引 物設(shè)計為在mSiglec-15-ECD-F中添加attBl序列，以及在mSiglec-15-ECD-R中添加attB2 序列，作為擴(kuò)增引物以制備Gateway進(jìn)入克隆(entry clone)，。按照常規(guī)方法，使用所述引 物組合和作為模板的實施例3制備的小鼠Siglec-15/pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒進(jìn)行PCR。熱循環(huán) 儀條件設(shè)定如下在94°C下加熱5分鐘，然后重復(fù)“94°C下0. 5分鐘、55°C下0. 5分鐘以及 68°C下1. 5分鐘”的溫度循環(huán)15次，再在68°C下加熱5分鐘，然后在4°C下孵育。b)通過Gateway BP反應(yīng)的進(jìn)入克隆的制備
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采用以下方法制備進(jìn)入克隆，所述進(jìn)入克隆通過應(yīng)用λ噬菌體的部位特異性重 組系統(tǒng)的Gateway技術(shù)(Invitrogen，Inc.)，將小鼠Siglec-15胞外域的cDNA整合至克 隆中。首先，在兩端帶有a)中制備的attB序列的PCR產(chǎn)物和具有attP序列的供體載體 PDN0R221 (Invitrogen, Inc.制備)之間，使用BP克隆酶進(jìn)行BP反應(yīng)。通過使用該反應(yīng)液， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，對耐藥性克隆進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)插入片段的大小。然后，對已確認(rèn)具 有正確大小的插入片段的克隆實施插入片段總DNA序列的序列分析，結(jié)果得到與編碼小鼠 Siglec-15蛋白的胞外域的目標(biāo)核酸序列(序列表中的SEQ ID NO 19)完全相同的進(jìn)入克 隆。c)通過Gateway LR反應(yīng)的表達(dá)克隆的制備采用以下方法制備表達(dá)克隆，所述表達(dá)克隆通過應(yīng)用λ噬菌體的部位特異性重 組系統(tǒng)的Gateway技術(shù)(Invitrogen，Inc.)，將小鼠Siglec-15胞外域的cDNA整合至克 隆中。b)中制備的進(jìn)入克隆含有兩端具有attL序列的插入片段。在所述進(jìn)入克隆和具有 attR序列的兩種目標(biāo)載體之間，使用LR克隆酶進(jìn)行LR反應(yīng)。另外，作為目標(biāo)載體，使用兩 種目標(biāo)載體設(shè)計成在該插入片段的C端添加V5表位標(biāo)簽和6XHis標(biāo)簽的pDONM、和設(shè)計 成在插入片段的C端添加人Fc標(biāo)簽的phlgFc。通過使用由LR反應(yīng)得到的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH10B，對所得耐藥性克隆進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)插入片段大小。然后，對已確認(rèn)插入片 段正確大小的克隆進(jìn)行從插入片段側(cè)到載體側(cè)的兩端的序列分析。用于序列分析的引物序列5' -tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec_15_ECD_seq_upstm 序歹Ij表中白勺 SEQID NO 23)以及5，-cctcgcctgg tcgggtc-3，(mSiglec-15-ECD-seq-dnstm 序列表中的 SEQ IDNO 24) 序列分析的結(jié)果是，分別得到pDONM和phlgFc的兩種正確重組的表達(dá)克隆 (可溶性小鼠Siglec-15/pDONM和可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc)。通過將可溶性小鼠 Siglec-15/pDONM轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞等，具有序列表中的SEQ IDNO 25表示的堿基序列的 mDNA被轉(zhuǎn)錄，并被翻譯成具有序列表中的SEQ IDNO :26表示的氨基酸序列的蛋白(小鼠 Siglec-15-His)。通過將可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞等，具有序列表中 的SEQ ID NO :27表示的堿基序列的mDNA被轉(zhuǎn)錄，并被翻譯成具有序列表中的SEQ ID N0: 28表示的氨基酸序列的蛋白(小鼠Siglec-15-Fc)。實施例6用于可溶性小鼠Siglec-15蛋白制備的最適培養(yǎng)時間的檢測a)使用293-F細(xì)胞的蛋白表達(dá)分別以約100 μ g的量制備由實施例5得到的兩種表達(dá)質(zhì)粒(可溶性小 鼠Siglec-15/pDONM和可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc)。將制備的質(zhì)粒各50 μ g與 Opti-MEM(Invitrogen，Inc.制備)混合，濾器滅菌后，向其中添加64 μ 1作為轉(zhuǎn)染試劑的 293fectin(Invitrogen, Inc.製)，得到的混合物在室溫下孵育25分鐘。向在搖瓶中培養(yǎng) 的FreeStyle 293-F細(xì)胞(Invitrogen，Inc.制備)添加中每種如此得到的混合液，使得細(xì) 胞密度在FreeStyle 293細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen, Inc.制備)中達(dá)到1.0X IO6細(xì)胞 /mlX50ml。在8. 0% CO2濃度、37°C下使所述細(xì)胞經(jīng)受旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(125轉(zhuǎn)/分)96小時(4天)。以24小時間隔收集少量培養(yǎng)液(培養(yǎng)時間:0、24、48、72、96小時)，并離心制備培養(yǎng) 上清液。一般認(rèn)為在上述制備的培養(yǎng)上清液中分別表達(dá)在小鼠Siglec-15的胞外域C端已 添加V5表位標(biāo)簽和6XHis標(biāo)簽的蛋白(小鼠Siglec-15-His)和在小鼠Siglec-15的胞 外域C端已添加人Fc標(biāo)簽的蛋白(小鼠Siglec-15-Fc)。b)隨表達(dá)小鼠Siglec-15-His的293F細(xì)胞的培養(yǎng)時間變化的表達(dá)量的變化通過使用a)中制備的表達(dá)小鼠Siglec-15-His的293F細(xì)胞的培養(yǎng)液(培 養(yǎng)時間0、24、48、72、96小時)樣品和市售的含有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，重組人護(hù)骨素/ his (OPG-Fc-His) (R&D systems, Inc.制備)用還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺電泳和 Western免疫印跡法進(jìn)行表達(dá)量的分析。S卩，向用MicroconYM-10 (Millipore Co. ,Ltd.制 備)將各培養(yǎng)液濃縮20倍得到的5 μ 1樣品或5 μ IOPG-Fc-His溶液中加入等量的SDS-處 理液(包含ImM EDTA、2. 5%SDS、0. 1 %溴酚藍(lán)、和5% 2-巰基乙醇的IOmM Tris-HCl緩沖液 (ρΗ8. 0))，得到的混合物在95°C下加熱10分鐘。將0. 8 μ 1熱處理過的各樣品用于SDS-聚 丙烯酰胺電泳。電泳的凝膠使用8-25%聚丙烯酰胺梯度膠(Amersham Biosciences, Inc. 制備)，并且電泳用Phastsystem進(jìn)行(Amersham Biosciences, Inc.制備)。此外，分子量 標(biāo)記使用 ECL· Dua/Vue Western 免疫印記法標(biāo)記(AmershamBiosciences, Inc.制備)，。電 泳結(jié)束后，使用 PhastTransfer 半干轉(zhuǎn)移試劑盒(PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit) (Amersham Biosciences, Inc.制備)，和快速電泳系統(tǒng)(快速電泳系統(tǒng))將凝膠中的蛋白 轉(zhuǎn)印(印跡)到 PVDF 膜(Hybond-P,Amersham Biosciences, Inc.制備)上。將所述 PVDF 膜移入包含0. 1% Tween 20的IOml封閉劑(BlockAce，雪印乳業(yè)公司制備)中，在室溫下 緩慢振蕩1小時。向所述封閉溶液中加入5 μ IS-蛋白HRP溶液(ECL Dua/Vue免疫印記 法標(biāo)記，Amersham Biosciences, Inc.制備)和 2μ 1 抗 6His_HRP 抗體(PentaHis HRP 共 軛試劑盒，Qiagen, Inc.制備)，再將該膜在室溫下緩慢振蕩1小時。通過將其在50ml包 含0. 01% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中緩慢振蕩5分鐘，洗滌所述PVDF膜4 次。洗滌后，按照ECL檢測試劑盒(ECL Western免疫印記檢測試劑與分析系統(tǒng)，Amersham Biosciences, Inc.制備)所附的方法處理PVDF膜，使含有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)條帶顯色，使 用 ECLmini-camera(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))禾口艮口顯膠片(Polapan 3200B，寶 麗來公司生產(chǎn))檢測其顯色。結(jié)果如圖6所示。由此結(jié)果，產(chǎn)生最高濃度的分子量約35kDa 的蛋白(小鼠Siglec-15-His)并與抗6His_HRP抗體反應(yīng)的293F細(xì)胞的培養(yǎng)時間選擇96 小時。c)隨表達(dá)小鼠Siglec-15-Fc的293F細(xì)胞的培養(yǎng)時間變化的表達(dá)量的變化使用a)中制備的表達(dá)小鼠Siglec-15-Fc的293F細(xì)胞的培養(yǎng)液(培養(yǎng)時間0、 24、48、72、96小時)樣品和人IgG(Sigma公司生產(chǎn))，用非還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺 電泳和Western免疫印跡法進(jìn)行表達(dá)量的分析。即向5 μ 1各培養(yǎng)液樣品和5 μ 1人IgG 溶液中加入等量的SDS-處理液，得到的混合物在95°C下加熱10分鐘。使用0. 8μ 1熱處 理過的各試樣，以與前述b)中所述的方法相同的方法實施SDS-聚丙烯酰胺電泳、向PVDF 膜的轉(zhuǎn)印(印跡)、以及PVDF膜的封閉。向封閉過的PVDF膜加入5μ1 S-蛋白HRP溶液 (ECLDua/Vue Western 免疫印跡法標(biāo)記，Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))禾口 2 μ 1 抗人 IgG Fc-HRP抗體(抗人IgG (Fe特異性)過氧化氫酶綴合物，Sigma公司生產(chǎn))，再將溶液 中的膜在室溫下緩慢振蕩1小時。以與前述b)中所述相同的方法洗滌后，檢測含有Fc的蛋白的條帶的顯色。結(jié)果如圖7所示。由此結(jié)果，產(chǎn)生最高濃度的分子量約IlOkDa的蛋白 (小鼠Siglec-15-Fc)并與抗人Fc抗體反應(yīng)的293F細(xì)胞的培養(yǎng)時間選擇96小時。實施例7使用293-F細(xì)胞大量制備含可溶性小鼠Siglec-15蛋白培養(yǎng)液分別以約5mg的量制備由實施例5得到的兩種表達(dá)質(zhì)粒(可溶性小鼠Siglec-15/ pDONM和可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc)。另外，純化來自大量培養(yǎng)的大腸桿菌的質(zhì)粒時， 使用 Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (Invitrogen, Inc.生產(chǎn))。將 如此制備的質(zhì)粒與Opti-MEM(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))混合，濾器滅菌后，添加IOml作為轉(zhuǎn) 染試劑的293feCtin (Invitrogen，Inc.製)，得到的混合物在室溫下孵育20分鐘。向在錐 形燒瓶中培養(yǎng)的FreeStyle293-F細(xì)胞中(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))添加每種如此獲得的 混合液，以使在FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))中的細(xì)胞密度達(dá)到 1. IXlO6細(xì)胞/mlX5L(lL/燒瓶，5瓶)。在8.0% CO2濃度、37°C下96小時(4日)旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)(125轉(zhuǎn)/分)該細(xì)胞，然后收集該培養(yǎng)液，并離心以制備培養(yǎng)上清液。一般認(rèn)為上述制 備的培養(yǎng)上清液中，分別表達(dá)在小鼠Siglec-15的胞外域C端已添加V5表位標(biāo)簽和6 XHis 標(biāo)簽的蛋白(小鼠Siglec-15-His)和在小鼠Siglec-15的胞外域C端已添加人Fc標(biāo)簽的 蛋白(小鼠 Siglec-15-Fc)。實施例8小鼠Siglec-15-His的純化a) HisTrap HP 柱色譜向2L實施例7制備的表達(dá)小鼠Siglec-15-His的293F細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入225mL 的IOx緩沖液(500mM Tris, 1. 5M NaCl,200mM咪唑，ρΗ8· 0)，充分?jǐn)嚢璧玫降幕旌衔?，然?用Sterivex GV濾器(Millipore Co. , Ltd.生產(chǎn))過濾。將此培養(yǎng)液以流速2ml/min加 載至串聯(lián)的3根5mL HisTrap HP柱(AmershamBiosciences, Inc.生產(chǎn))，所述柱預(yù)先用熱 原去除劑PyroCLEAN(ALerCHEK公司生產(chǎn))處理，并且用注射用蒸餾水洗滌。使用60ml含 有300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8. 0)，在流速lml/min下洗滌該柱，然后使用 50ml 含有 300mM NaCl,500mM 咪唑的 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH8. 0)，在流速 lml/min 下洗 脫吸附于柱上的蛋白質(zhì)。洗脫液以每餾分Iml被分餾到預(yù)先加入10μ1的0% Tween 20的 Mini-sorp管(Nunc公司生產(chǎn))中。合并含有洗脫蛋白的餾分(餾分14-20)，將得到的約 20ml的溶液用離心膜濃縮器AmiconUltra-15 (Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))濃縮至2. 5ml， 將該濃縮液加載至預(yù)先用包含0.01% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水(T-PBS)平衡的 PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))，用T-PBS洗脫，由此得到3. 5ml溶劑置 換為T-PBS的樣品。b) Resource Q 柱色譜向3. 5ml用HisTrap HP柱色譜純化的TBS-P置換樣品中加入22. 5ml含有0. 1 % CHAPS的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)并將得到的混合物攪拌，然后將該混合物在4°C、 3，000r. p.m.下離心30分鐘，除去沉淀物。用Millex GV濾器(Millipore Co.，Ltd.生 產(chǎn))過濾得到的上清液，然后將濾出液以流速lml/min加載至用含有0. 1% CHAPS的50mM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 5)預(yù)先平衡的 Resource Q 6mL· 柱(Amersham Biosciences, Inc.生 產(chǎn))。然后使用該緩沖液在流速lml/min下洗滌柱，收集未吸附于柱上的蛋白餾分。用含 有0. CHAPS和IM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)在流速lml/min下洗脫吸附 于柱上的蛋白。用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co. ,Ltd.生產(chǎn))將26. 5ml
43未吸附于柱上的餾分濃縮為2. 0ml，然后將該濃縮液在4°C、3，OOOr. p. m.下離心10分鐘，并 除去沉淀物。在-80°C下冷凍保存離心后的上清液直至使用。重復(fù)實施兩次上述純化操作 (HisTrap HP柱色譜和Resource Q柱色譜)。c)純化的小鼠Siglec-15-His的檢測和純度分析使用上述純化操作(HisTrap HP柱色譜和Resource Q柱色譜)制備的樣品在還 原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色。S卩，向5 μ 1經(jīng)各純化步驟純化的各樣品加 入等量的SDS-處理液，得到的混合物在95°C下進(jìn)行10分鐘熱處理。將3μ 1熱處理過的 各樣品用于SDS-聚丙烯酰胺電泳。除使用彩虹分子量標(biāo)記(Amersham Biosciences, Inc. 生產(chǎn))作為分子量標(biāo)記之外，電泳操作用與前述實施例6的b)相同的方法實施。電泳結(jié)束 后，使用PhastGel銀試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和快速電泳系統(tǒng)進(jìn)行銀 染色，其結(jié)果如圖8所示。所述結(jié)果表示在未吸附于Resource Q柱的蛋白質(zhì)餾分中，分子 量約35kDa的蛋白(小鼠Siglec-15-His)被有效純化并濃縮。^jtffi ECL Dua/Vue Western ^^Epiafefeid (Amersham Biosciences, Inc. ^ 產(chǎn))作為分子量標(biāo)記以外，在相同的條件下進(jìn)行電泳。使用PhastTransf er半干轉(zhuǎn)移試劑盒 (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和快速電泳系統(tǒng)將電泳的凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜(Hybond-P、Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))上。將所述 PVDF 膜在含 0. 1 % Tween 20 的IOml封閉劑(BlockAce，雪印乳業(yè)公司制備)中在室溫下緩慢振蕩1小時。向所述封閉 劑溶液中加入 10 μ 1 S-蛋白 HRP (Amersham Biosciences, Inc.)禾口 10 μ 1 抗 V5-HRP 抗體 (抗Pk-TAG-HRP單克隆抗體，Acris抗體公司生產(chǎn))，再將在溶液中的膜在室溫下緩慢振蕩 1小時。通過將該PVDF膜在50ml含0. 01 % Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中緩 慢振蕩5分鐘，洗滌PVDF膜4次。洗滌后，按照ECL檢測試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))所附的方法處理該PVDF膜以使蛋白條帶顯色，并用ECL mini-camera (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和寶麗來膠片(Polapan 3200B,Polaroid, Inc.生產(chǎn))檢測蛋白 條帶的顯色。其結(jié)果如圖9所示。由該結(jié)果也可確認(rèn)，在未吸附于Resource Q柱的蛋白質(zhì) 餾分中，分子量約35kDa并與抗V5-HRP抗體反應(yīng)的蛋白(小鼠Siglec-15-His)被有效純 化和濃縮。d)純化的小鼠Siglec-15-His的蛋白純度的測定對于純化小鼠Siglec-15-His (未吸附于Resource Q柱的蛋白質(zhì)餾分)，使用牛血 清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測定蛋白 濃度。如表1所示，通過2次純化操作得到合計1. 66mg的純化小鼠Siglec-15-His蛋白。表1 實施例9小鼠Siglec-15-Fc的純化a) HiTrap蛋白A柱色譜用LSterivex GV 濾器(Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾 1. 8L 實施例 7 制備 的表達(dá)小鼠Siglec-15-Fc的293F細(xì)胞的培養(yǎng)液，然后將濾出液以流速5ml/min加載至 用 Dulbecco，s PBS(D_PBS、Invitrogen, Inc.制備)預(yù)先平衡的 HiTrap 蛋白 A 5mL 柱 (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))。在流速5ml/min下使用D-PBS洗滌柱，然后使用 50ml的0. IM檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)以流速5ml/min洗脫吸附于柱上的蛋白。洗脫液 以每餾分5ml被分餾到Mini-sorp管(Nunc公司生產(chǎn))中，然后立即加入IM Tris 1. 3ml 中和。將已檢測被洗脫的蛋白餾分(餾分1和2)合并后得到的溶液用離心膜濃縮器 Amicon Ultra-15 (MilliporeCo. , Ltd.生產(chǎn))濃縮為 2. 5ml，濃縮液加載至用含 0. 01 % Tween 20的大塚注射用生理鹽水(T0-SS，大塚制藥公司生產(chǎn))預(yù)先平衡的PD-10脫鹽柱 (AmershamBiosciences, Inc.生產(chǎn))，然后用TO-SS洗脫，由此得到溶劑置換為TO-SS的 3.5ml樣品。在-80°C下冷凍保存該樣品直至使用。使用2. 9L的293F細(xì)胞培養(yǎng)液，再重復(fù) 實施1次同樣的純化操作。b)純化的小鼠Siglec-15-Fc的檢測和純度分析使用通過上述純化制備的樣品，在還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染 色。S卩，向5μ 1各純化步驟純化的各樣品加入等量的SDS-處理液，得到的混合物在95°C 下加熱10分鐘。將用1/2濃度的SDS-處理液對熱處理過的各樣品稀釋至1/300或1/900 倍得到的0. 3μ 1樣品用于SDS-聚丙烯酰胺電泳。用與實施例8的c)中所述的小鼠 Siglec-15-His的純度測定方法相同的方式實施電泳和銀染色，其結(jié)果與少量預(yù)備純化條 件檢測的結(jié)果(應(yīng)用的培養(yǎng)液的ρΗ為8. 9或7. 0) 一起顯示在圖10中。其表示在由HiTrap 蛋白A柱洗脫的蛋白餾分中，分子量約55kDa的蛋白(小鼠Siglec-15-Fc)被有效純化并 濃縮。c)純化的小鼠Siglec-15-Fc的蛋白純度的測定對于純化小鼠Siglec-15-Fc (由PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾分)，使用牛血清白 蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測定蛋白濃 度。如表2所示，通過2次純化操作得到合計92mg的純化小鼠Siglec-15-Fc蛋白。表 2 實施例10兔抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的制備(兔的免疫)a)抗原的制備將實施例9制備的小鼠Siglec-15-Fc蛋白制備成100μ g/0. 5ml，用玻璃注射器在 其中添加等量佐劑，并制備乳液。另外，佐劑只在初次免疫時使用弗氏完全佐劑(FCA，Difco 公司生產(chǎn))，第二次及后續(xù)的免疫使用弗氏不完全佐劑(FICA，Difco公司生產(chǎn))。b)對兔的免疫3只兔(日本白色種雌性，體重3kg)用作免疫動物。另外，在免疫前采血，每只兔 得到Iml免疫前血清。使用27號注射針頭將a)中得到的乳液以Iml/兔注射到皮下和皮 內(nèi)。第一次免疫后每14天進(jìn)行一次免疫，合計8次。從第8次免疫開始7天后，采集全血， 每只兔得到76-79ml的抗血清。通過固定有抗原的ELISA法確認(rèn)免疫前血清中和抗血清中 的抗體滴度。其結(jié)果是3只兔的抗血清中抗體滴度均上升。在_20°C下保存該抗血清直至 使用。實施例11.抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的純化a) HiTrap蛋白A柱色譜向?qū)嵤├?0中制備的3組20ml兔抗血清中各加入20ml Dulbecco ‘ s PBS(D-PBS, Invitrogen, Inc.生產(chǎn))并混合，用 Sterivex GV濾器(Millipore Co. ,Ltd.生 產(chǎn))過濾得到的混合物后，將濾出液以2ml/min的流速加載至預(yù)先用D-PBS平衡的HiTrap 蛋白 A 5mL 柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))。用 37. 5mlD_PBS 以 2. 5ml/min 的流 速洗柱后，用50ml 0. IM檸檬酸鈉緩沖液(ρΗ3. 0)以2. 5ml/min的流速洗脫吸附在柱上的 蛋白。以每餾分2.5ml將洗脫液分餾在Mini-sorp管(NimC，InC.生產(chǎn))中，然后立即加入 0.65ml 的 IM Tris 進(jìn)行中和。用離心膜濃縮器 Amicon Ultra-15 (Millipore Co. ,Ltd.生 產(chǎn))將含有洗脫的蛋白的餾分約IOml (餾分2 5)濃縮至2. 5ml后，加載至用含有0. 01 % Tween 20的大塚注射用生理鹽水(TO-SS)平衡的PD-IO脫鹽柱(大塚制藥公司制備生產(chǎn)) 并用TO-SS洗脫，得到將溶劑置換為TO-SS的樣品3. 5ml。將如此制備的樣品在-80°C冷凍 保存直至使用。b)抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的檢測和純度測定用上述a)所述的純化操作中制備的樣品(第1、2、3三組)在還原條件下進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色。即在各純化步驟純化的5μ1各樣品中加入等量 的SDS-處理液(含有ImM EDTA.2. 5% SDS、0. 1 %溴酚藍(lán)以及5 % 2-巰基乙醇的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH8. 0))，并將得到的混合物在95°C下加熱10分鐘。用1/2濃度的SDS-處 理液將熱處理的各樣品稀釋至1/100、1/300及1/900倍，并將0. 3 μ 1稀釋后的樣品用于 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用與實施例8的c)中所述的小鼠Siglec-15-His純度測定 相同的方法進(jìn)行電泳和銀染色。結(jié)果顯示，從PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾分中，由分子量約 45kDa的重鏈和分子量約21kDa的輕鏈組成的IgG蛋白被有效地純化并濃縮。c)純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的蛋白濃度的測定
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對于純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體(從PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾分)，將 牛IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白測定試劑盒(BioRad Laboratories, Inc.)測定蛋白濃度。 如表3所示，第1 3組的每組的100 170mg的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體可被純化。表3 d)純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)性的檢測對上述a)項中制備的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體不僅與Fc標(biāo)簽結(jié)合而且與 Siglec-15蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)試驗。在5iU純化的小鼠Siglec-15-His樣 品(實施例8)和5 ill Siglec-15-Fc樣品(實施例9)中加入等量的SDS-處理液(添加 或不添加5% 2-巰基乙醇)，將得到的混合物在95°C下加熱10分鐘。將0. 3 yl熱處理的 各樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用與上述實施例6的b)所述的方法相同的方法 進(jìn)行電泳和向PVDF膜的轉(zhuǎn)印(印跡)。將該PVDF膜在8ml含0. 1 % Tween 20的封閉劑 (BlockAce，雪印乳液社制)中于室溫下緩慢振蕩1小時。向該封閉溶液中加入1.6 yl第 1組抗小鼠Siglec-15多克隆抗體(表3)，將溶液中的PVDF膜進(jìn)一步于室溫下緩慢振蕩1 小時。通過將該PVDF膜在50ml含0. 01 % Tween 20的PBS中緩慢振蕩5分鐘，洗滌4次。 將洗滌后的PDVF膜浸漬在8ml抗體稀釋劑ECL促進(jìn)封閉劑(ECL促進(jìn)免疫印跡檢測試劑盒， Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))中，并添力口抗兔 IgG-HRP (Amersham Biosciences, Inc. 生產(chǎn))使終濃度為1/200，000，再加入0.81115-蛋白服卩溶液(ECL Dua/Vue Western免疫 印跡標(biāo)記、AmershamBiosciences，Inc.生產(chǎn))，將該膜進(jìn)一步于室溫下緩慢振蕩1小時。通 過將該PVDF膜在50ml含0. 01 % Tween 20的PBS中緩慢振蕩5分鐘，洗滌4次。洗滌后， 按照ECL Advance Western免疫印跡檢測試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))所附 的說明書處理 PVDF 膜，用 ECL mini-camera (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和寶麗來 膠片(Polaroid film) (Polapan 3200B,Polaroid, Inc.生產(chǎn))檢測蛋白條帶的顯色。結(jié)果 如圖11所示。該結(jié)果顯示，純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體也與小鼠Siglec-15-His 結(jié)合，從而可以確認(rèn)，抗小鼠Siglec-15多克隆抗體不僅與Fc標(biāo)簽結(jié)合而且與Siglec-15 蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。重復(fù)進(jìn)行同樣的試驗，結(jié)果確認(rèn)第2組和第3組抗小鼠Siglec-15 多克隆抗體也與小鼠Siglec-15-His結(jié)合。實施例12.免疫前兔IgG的純化小鼠Siglec-15-Fc的免疫開始前，預(yù)先從在實施例10中使用的3只兔中采血
以制備免疫前的血清。將各0. 8ml該血清的等分樣品彼此混合后加入2. 4mlDulbeCC0’ s
PBS(D-PBS,Invitrogen, Inc.生產(chǎn))，用 Millex GV 濾器(Millipore Co. ,Ltd.生產(chǎn))過濾
得到的混合物。將該得到的血清樣品以lml/min的流速加載至預(yù)先用D-PBS平衡的HiTrap蛋白 A 5mL 柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))。用 50ml D-PBS 以 2. 5ml/min 的流速洗 柱后，用50ml 0. IM檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0)以2. 5ml/min的流速洗脫吸附在柱上的蛋白。 以每餾分2. 5ml將洗脫液分餾到Mini-sorp管(Nunc, Inc.生產(chǎn))中，然后立即加入0. 65ml IM Tris進(jìn)行中和該洗脫液。用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co. , Ltd.生 產(chǎn))將合并洗脫的蛋白餾分(餾分2 4)得到的溶液濃縮至2. 5ml后，加載至用含0.01% Tween 20的大塚注射用生理鹽水(TO-SS)平衡的PD-10脫鹽柱(AmershamBiosciences， Inc.生產(chǎn))并用TO-SS進(jìn)行洗脫，由此得到將溶劑置換為TO-SS的樣品3. 5ml。對于如此 純化的該免疫前兔IgG樣品，采用上述實施例8的c)所述的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 和銀染色，以確認(rèn)IgG蛋白被充分純化，然后測定蛋白濃度。將純化的該樣品在-80°C冷凍 保存直至使用。實施例13.將小鼠Siglec-15-Fc固相化的親和柱的制備用PD-10脫鹽柱將實施例9所述的0. 54ml的18. 5mg/ml純化小鼠Siglec-15-Fc 溶液(合計IOmg蛋白)的溶劑置換為偶聯(lián)緩沖液0. 2MNaHC03,0. 5M NaCl, ρΗ8· 3)后，用 離心膜濃縮器Amicon Ultra 4(Millipore Co. ,Ltd.生產(chǎn))將得到的溶液濃縮至lml。將 NHS-活化的HiTrap柱(lml、AmershamBiosciences，Inc.生產(chǎn))內(nèi)的異丙醇置換為ImM鹽 酸后，用注射器將Iml含有10mg/ml的小鼠Siglec-15-Fc的偶聯(lián)緩沖液注入柱中。室溫下 反應(yīng)30分鐘后，為了滅活過剩的活性基，按照Amersham Biosciences, Inc.的說明書，依次 注入6ml封閉緩沖液(含0. 5M NaCl的乙醇胺緩沖液、pH8. 3)、6ml洗滌緩沖液(含0. 5M NaCl的醋酸鈉緩沖液、pH4. 0)、6ml封閉緩沖液后，將柱室溫下放置30分鐘。然后，再次向 柱中依次注入洗滌緩沖液、封閉緩沖液、洗滌緩沖液各6ml，最后將柱內(nèi)的緩沖液置換為含 IM NaCl和0. 01% Tween 20的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)。將該柱在4°C保存直至使 用。實施例14.使用親和柱對抗小鼠Siglec-15多克隆抗體進(jìn)行的純化a)親和柱色譜向?qū)嵤├?1制備的第1、2、3組純化抗小鼠Siglec-15多克隆抗體各2ml中加入 8ml應(yīng)用緩沖液(含0. 15M NaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液、pH7. 2)后，得到的混合物以 0. 25ml/min的流速加載至預(yù)先用應(yīng)用緩沖液平衡的親和柱(實施例13)。用5ml應(yīng)用緩沖 液以流速0. 25ml/min洗柱后，首先用5ml含0. 5MNaCl的0. IM鹽酸甘氨酸緩沖液(ρΗ2· 7) 以流速0. 25ml/min對吸附在柱中的蛋白進(jìn)行洗脫，接著用5ml含0. 5M NaCl的0. IM檸檬 酸鈉緩沖液(PH2.0)以流速0.25ml/min對吸附在柱中的蛋白進(jìn)行洗脫。用親和柱對第3 組抗小鼠Siglec-15多克隆抗體進(jìn)行純化的色譜圖如圖12所示。以每餾分0. 5ml將洗脫 液分餾至Mini-sorp管(Nunc，Inc.生產(chǎn))中，然后立即在0. 5ml鹽酸甘氨酸緩沖液洗脫 的各餾分中加入16 μ 1 IM Tris，在0. 5ml檸檬酸鈉緩沖液洗脫的各餾分中加入150 μ IlM Tris中和洗脫液。大部分抗小鼠Siglec-15多克隆抗體被含有0. 5M NaCl的0. IM鹽酸甘 氨酸緩沖液(PH2. 7)洗脫出來。將合并用鹽酸甘氨酸緩沖液洗脫的經(jīng)檢測含有IgG蛋白的 各組餾分(餾分3 7)得到的約2. 5ml溶液，分別加載至用含0. 01% Tween 20的大塚注 射用生理鹽水(TO-SS)預(yù)先平衡的PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))并 用TO-SS進(jìn)行洗脫，由此得到溶劑置換為TO-SS的樣品3. 5ml。對于約2. 5ml用檸檬酸鈉緩 沖液洗脫的IgG蛋白餾分(餾分16 19)，將三組全部混合，得到的混合物用離心膜濃縮器AmiconUltra-4 (MiIlipore Co.，Ltd.生產(chǎn))濃縮至2. 5ml，然后將濃縮液加載至用TO-SS 平衡的PD-IO脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)并用T0-SS洗脫，由此得到溶 劑置換為TO-SS的樣品(檸檬酸鹽-E) 3. 5ml。將如此制備的樣品在-80°C冷凍保存直至使用。b)親和純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的蛋白濃度的測定對于純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體樣品(從PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾 分)，將牛IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白測定試劑盒BioRad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測定 蛋白濃度。將已測定蛋白濃度的樣品制備為抗體濃度為15或50 μ g/ml，采用與實施例11 的b)相同的方法進(jìn)行電泳和銀染色，其結(jié)果如圖13所示。結(jié)果顯示，從PD-IO柱洗脫的蛋 白餾分中，由分子量約45kDa的重鏈和分子量約21kDa的輕鏈組成的IgG蛋白被有效純化 濃縮。如表4所示，第1 3各組或作為檸檬酸鹽-E餾分，均可制備約2. 3 7. 4mg的親 和純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體。表 4 實施例15.使用凝膠過濾柱對親和純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體進(jìn)行的純 化a) Superose 6 柱色譜為了從實施例14制備的親和純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體中完全除去 內(nèi)毒素及低分子量的雜質(zhì)，用凝膠過濾柱進(jìn)一步純化。將第2、3組親和純化的抗小鼠 Siglec-15多克隆抗體各Iml加載至預(yù)先用熱原去除劑PyroCLEAN(ALerCHEK，Inc.生產(chǎn)) 處理并且用含 0. 01% Tween 20 的 Dulbecco，s PBS(D_PBS、Invitrogen, Inc.生產(chǎn))平衡 的 Superose 6HR 10/30 柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)，用含 0· 01 % Tween 20 的D-PBS以0.4ml/min的流速進(jìn)行洗脫。其色譜圖如圖14所示。以每餾分0. 5ml將洗脫 液分餾至Mini-sorp管(Nunc，Inc.生產(chǎn)制)中，得到凝膠過濾的抗小鼠Siglec-15多克隆 抗體樣品2. Oml (餾分28 31)。將如此制備的樣品在-80°C冷凍保存直至使用。b)用凝膠過濾柱對純化的兔IgG蛋白濃度進(jìn)行的測定對凝膠過濾純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體樣品(從Superose 6柱洗脫的 蛋白餾分)也進(jìn)行蛋白濃度測定。如表5所示，第2、3組分別可以制備2.25mg和3.34mg 的凝膠過濾純化的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體。表 5
49 實施例16.小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞的制備從5 8周齡的雄性ddY小鼠中取出股骨和脛骨，并除去軟組織。切除該股骨或 者脛骨的兩端，用帶有25號注射針的注射器注入D-PBS并推出骨髓細(xì)胞，收集在離心管中。 室溫下以IOOg離心5分鐘，去上清液后，收集細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中加入Iml溶血緩沖液 (紅細(xì)胞溶解緩沖液，Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))并混懸，得到的懸浮液室溫下放置5分鐘。加 入20ml D-PBS并于室溫下以IOOg離心5分鐘，去上清液后，向細(xì)胞沉淀加入IOml含有5ng/ ml M-CSF(R&DSystems, Inc.生產(chǎn))和 10%胎牛血清(FBS)的 MEM-α 培養(yǎng)基(Invitrogen, Inc.生產(chǎn))并混懸，通過細(xì)胞過濾器(cell strainer) (40 μ m尼龍、BD Falcon生產(chǎn))除去 凝集物。將得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至75cm2-T燒瓶(附著細(xì)胞用)中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。培 養(yǎng)過夜后，收集未附著在T-燒瓶上的細(xì)胞，作為小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞使用。實施例17.添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞 分化的影響(用RANKL刺激)利用實施例14、15中制備的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體，來研究小鼠骨髓非貼 壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響。將采用上述實施例16的方法制備的小鼠骨髓非貼壁細(xì) 胞用含有10% FBS和10ng/ml M-CSF (R&D Systems, Inc.生產(chǎn))的α-MEM培養(yǎng)基配制成 1. 5 X IO5細(xì)胞/ml，得到的細(xì)胞制劑以每孔200 μ 1鋪于96孔板，該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2天。除去96孔板中舊的培養(yǎng)液，添加100 μ 1含有10 % FBS的MEM- α培養(yǎng)基，該FBS添加 了終濃度分別為 20ng/ml 的人 RANKL (RANKL、P印rotech，Inc.生產(chǎn))和 10ng/ml 的 M-CSF。 在該細(xì)胞培養(yǎng)液中，以濃度30 1，000ng/ml添加實施例12、14和15制備的第3組親和純 化抗體、檸檬酸鹽E抗體、第2組凝膠過濾純化抗體、第3組凝膠過濾純化抗體、免疫前兔 IgG 以及市售的兔對照 IgG(非免疫兔 IgG CLRB00、CEDARLANE LABORATORIES Ltd.生產(chǎn))， 該細(xì)胞進(jìn)一步在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，按照以下操作測定形成的破骨細(xì)胞 對抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。吸除96孔板各孔的培養(yǎng)液，每孔加入50 μ 1含1 % Triton X-100的50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6. 1)，用振板搖床振蕩5分鐘使細(xì)胞裂解。向每 孔加入50 μ 1底物溶液(含有5mg/ml ρ-硝苯基硫酸鹽和0. 46%酒石酸鈉的50mM檸檬酸 鈉緩沖液(PH6.1))并將該板于室溫下培養(yǎng)5分鐘。培養(yǎng)后向96孔板的各孔中加入50 μ 1 IN氫氧化鈉溶液以停止酶反應(yīng)。酶反應(yīng)停止后測定各孔405nm處的吸光度作為TRAP活性 的指標(biāo)。結(jié)果如圖15、16所示。免疫前兔IgG以及市售的兔對照IgG未見對TRAP活性的 顯著抑制。另一方面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3組親和純化抗體在30ng/ml或以上，檸檬酸鹽E抗體在 約130ng/ml或以上對TRAP活性具有顯著的抑制作用(圖15)。也觀察到第3組凝膠過濾 純化抗體在30ng/ml或以上對TRAP活性具有顯著的抑制作用。并且發(fā)現(xiàn)第3組凝膠過濾
50純化抗體比第2組凝膠過濾純化抗體具有更強的抑制活性(圖16)。由于發(fā)現(xiàn)凝膠過濾純 化抗體也具有對破骨細(xì)胞形成的抑制活性，因此表明，觀察到的抗小鼠Siglec-15多克隆 抗體對破骨細(xì)胞形成的抑制活性，不是由于抗體樣品中所含的內(nèi)毒素或低分子量的雜質(zhì)所 致，而是歸因于抗體分子自身的作用。以上結(jié)果顯示，抗小鼠Siglec-15多克隆抗體具有較 強的抑制破骨細(xì)胞形成(破骨細(xì)胞的分化和成熟)的作用。實施例18.抗原對添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向 破骨細(xì)胞分化的中和(用RANKL刺激)通過在抗小鼠Siglec-15多克隆抗體中預(yù)先加入抗原形成免疫沉淀，確認(rèn)抗小 鼠Siglec-15多克隆抗體的作用取決于其與抗原的結(jié)合。向10yg/ml實施例14制備 的第3組親和純化抗體中以濃度10、30、100或300μ g/ml添加實施例8或9制備的小 鼠Siglec-15-His或Siglec-15-Fc，得到的混合物37°C下培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后混合物用 Chibitan離心5分鐘，并用Millex GV濾器(Millipore Co. ,Ltd.生產(chǎn))對得到的上清液 進(jìn)行過濾滅菌。將采用實施例16的方法制備的小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞以200 μ 1/孔鋪于96 孔板，該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。除去96孔板中舊的培養(yǎng)液，向每孔添加100 μ 1含有 10% FBS 的 MEM- α 培養(yǎng)基，該 FBS 添加了終濃度為 20ng/ml 的人 RANKL(RANKL、P印rotech， Inc.生產(chǎn))和lOng/ml的M-CSF。在該細(xì)胞培養(yǎng)液中，以1/200 (ν/ν)添加上述制備的各測 試樣品，并將細(xì)胞進(jìn)一步在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，用實施例17所述的方法 測定形成的破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。結(jié)果如圖17所示。無論是用 Siglec-15-His中和抗體，還是用Siglec-15-Fc中和抗體，抗體的作用均被中和而消失。該 結(jié)果證明，抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對破骨細(xì)胞形成的抑制作用是與Siglec-15蛋白 的結(jié)合以及阻斷其功能所致。實施例19.添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞 分化的影響(用TNF刺激)用抗小鼠Siglec-15多克隆抗體，研究TNF刺激對小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì) 胞分化的影響。將用實施例16的方法制備的小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞在包含10%胎牛血清 (FBS) U0ng/ml M-CSF 以及 2ng/ml TGF-β (R&D systems, Inc.生產(chǎn))的 α-MEM 培養(yǎng)基中 制成1. 5X IO5細(xì)胞/ml，再將得到的細(xì)胞溶液以每孔200 μ 1鋪于96孔板，并在CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)2天。除去96孔板中舊的培養(yǎng)液，向每孔添加100 μ 1含有10% FBS的MEM-α培 養(yǎng)基，該FBS中添加了終濃度為30ng/ml的人重組TNFa (R&D systems, Inc.生產(chǎn))、終濃 度為lOng/ml的M-CSF。向該細(xì)胞培養(yǎng)液中以濃度30 1，000ng/ml添加實施例12制備 的免疫前IgG或?qū)嵤├?5制備的第3組凝膠過濾純化抗小鼠Siglec-15抗體，將該細(xì)胞進(jìn) 一步在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。同時準(zhǔn)備培養(yǎng)的孔，在孔中以濃度3 lOOng/ml添加采用 專利W096/26217說明書記載的方法制備的人重組0CIF/0PG培養(yǎng)該細(xì)胞，。培養(yǎng)結(jié)束后，采 用實施例17所述的方法測定形成的破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。其結(jié)果 如圖18所示。免疫前IgG以及0CIF/0PG中未見對TRAP活性的顯著抑制。另一方面，發(fā)現(xiàn) 第3組凝膠過濾純化抗小鼠Siglec-15抗體在250ng/ml或以上的濃度抑制約50%的TRAP 活性。這些結(jié)果顯示，抗小鼠Siglec-15多克隆抗體還可以抑制TNF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成 (破骨細(xì)胞的分化和成熟)，而0CIF/0PG不能抑制TNF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。對于采用與上述相同的方法培養(yǎng)制備的96孔板的各孔，使用白細(xì)胞酸性磷酸酶(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))，按照試劑盒所附的說明書進(jìn)行TRAP染色，觀察到TRAP陽性多核 破骨細(xì)胞的形成。其結(jié)果為，添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體抑制TRAP陽性的巨大的多 核破骨細(xì)胞的形成(圖19)。結(jié)果顯示，即使添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的情形也形 成單核破骨細(xì)胞，因此抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對TNF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和成熟中 的細(xì)胞融合過程具有較強的抑制作用。實施例20.添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓來源的原代培養(yǎng)細(xì)胞向 破骨細(xì)胞分化的影響(TRAP活性)在乙醚麻醉下，將7周齡雄性ddY小鼠頸椎脫白，使其安樂死，摘除股骨和脛骨。 除去軟組織后，切去股骨或脛骨的兩端，用帶有25號注射針的注射器，將含10%胎牛血清 的α-MEM培養(yǎng)基注入骨髓中，采集骨髓細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)后，將該細(xì)胞用含10%胎牛血清的 α -MEM培養(yǎng)基制成5X IO6細(xì)胞/ml。將制備的細(xì)胞溶液以100 μ 1/孔鋪于96孔板，加入 活性維生素D3(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))，得到終濃度2X 10_8M。在該細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，加 入實施例14制備的第3組親和純化的抗小鼠Siglec-15抗體以及實施例12制備的免疫前 兔 IgG 使終濃度為 4. 57、13. 7,41. 2、123、370、1，111,3, 333、10，000ng/ml，并在 CO2 培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)8天。另外，第3天和第6天更換培養(yǎng)基和添加受試物質(zhì)。培養(yǎng)第8天除去培養(yǎng)上 清液，用10%中性福爾馬林進(jìn)行細(xì)胞固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗滌2次，以100 μ 1/孔 添加TRAP底物溶液(15mM ρ-硝苯基磷酸鹽、50mM酒石酸鈉、0. IM醋酸鈉緩沖液(pH5. 0))， 室溫下反應(yīng)30分鐘。以50 μ 1/孔添加IN NaOH停止反應(yīng)，通過用酶標(biāo)儀測定405nm的吸 光度來評價細(xì)胞內(nèi)的TRAP活性。其結(jié)果顯示，添加的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體可劑量 依賴性地抑制TRAP活性(圖20-A)。另一方面，添加免疫前IgG的情形中，未見TRAP活性 的降低(圖20-B)。由此可知，活性維生素 所誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞來源的TRAP陽性破骨 細(xì)胞的形成，被與Siglec-15特異性結(jié)合的抗體抑制。實施例21.添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對小鼠骨髓來源原代培養(yǎng)細(xì)胞的破 骨細(xì)胞融合的影響(TRAP染色)乙醚麻醉下，將7周齡雄性ddY小鼠頸椎脫臼，使其安樂死，摘除股骨和脛骨。除 去軟組織后，切去股骨或脛骨的兩端，用帶有25號注射針的注射器將含10%胎牛血清的 α-MEM培養(yǎng)基注入骨髓中，采集骨髓細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)后，將該細(xì)胞用含10%胎牛血清的 α-ΜΕΜ培養(yǎng)基制成5Χ106細(xì)胞/ml，將該制備的細(xì)胞溶液以100 μ 1/孔鋪于96孔板。在該 培養(yǎng)上清液中加入活性維生素D3 (Sigma Co. , Ltd.生產(chǎn))使終濃度為2 X 10_8M，并加入人 RANKL (PeproTech Inc.生產(chǎn))使終濃度為80ng/ml，用作破骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)因子，制備細(xì) 胞培養(yǎng)上清液。在這些細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，添加實施例14中制備的第3組親和純化的抗小 鼠Siglec-15抗體使終濃度為370或3，333ng/ml，并添加實施例12制備的免疫前兔IgG使 終濃度為3，333ng/ml。由活性維生素D3誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞在CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天，由人RANKL誘導(dǎo)分化的系統(tǒng)中，細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。另外，第3 天和第6天更換培養(yǎng)基和添加受試物質(zhì)。培養(yǎng)后除去上清液，添加10%中性福爾馬林進(jìn)行 細(xì)胞固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗滌2次，以100 μ 1/孔添加TRAP染色液(0. 27mM萘酚 AS-MX 磷酸(Sigma Co. ,Ltd.生產(chǎn))、1. 6mM 固紅紫色 LB 鹽(Sigma Co. ,Ltd.生產(chǎn))、1%二 甲基甲酰胺、50mM酒石酸鈉、0. IM醋酸鈉緩沖液(pH5. 0))，室溫下反應(yīng)5分鐘。然后用蒸 餾水洗滌該細(xì)胞2次，顯微鏡下觀察細(xì)胞。其結(jié)果為，無論是活性維生素D3(圖21)還是人RANKL(圖22)所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體均可抑制破骨細(xì) 胞的細(xì)胞融合，且未見巨大的破骨細(xì)胞形成。另一方面，添加免疫前IgG的情形中，未見這 種對破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制。由此可知，活性維生素D3或者人RANKL所誘導(dǎo)的小鼠骨 髓細(xì)胞來源的TRAP陽性破骨細(xì)胞的多核化和細(xì)胞融合，被與Siglec-15特異性結(jié)合的抗體 抑制。實施例22.添加抗小鼠Siglec-15多克隆抗體對RAW264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞的細(xì) 胞融合的影響(TRAP染色)a)抗原蛋白吸收的抗小鼠Siglec-15多克隆抗體的制備用含0.01% Tween 20的D-PBS (Invitrogen，Inc.生產(chǎn))，分別將具有表6所示的 各濃度的實施例14制備的第3組親和純化抗小鼠Siglec-15抗體、實施例8和9制備的小 鼠Siglec-15-His蛋白以及小鼠Siglec-15-Fc蛋白，配制成5種混合液(A E)。將這些 混合液于37°C下孵育2小時后，以20，OOOXg離心10分鐘，將得到的上清液作為20倍濃度 的測試樣品。表6 (單位yg/ml)b)用RAW264. 7進(jìn)行TRAP染色的評價用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將RAW264. 7制成2. 25X IO4細(xì)胞/ml，將制備 的細(xì)胞溶液以200 μ 1/孔鋪于96孔板，添加人肌離！^⑴印偽！^油Inc.生產(chǎn))使終濃度為 40ng/mL·在該細(xì)胞培養(yǎng)上清液中添加a)中制備的A E的測試樣品使終濃度為1/20，并 將該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后除去上清液，添加10%中性福爾馬林進(jìn)行細(xì)胞 固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗滌2次，以100 μ 1/孔添加TRAP染色液(0. 27mM萘酚AS-MX 磷酸(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))U. 6mM 固紅紫色 LB 鹽(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))、1%二甲基 甲酰胺、50mM酒石酸鈉、0. IM醋酸鈉緩沖液(pH5. 0))，室溫下反應(yīng)5分鐘。用蒸餾水洗滌該 細(xì)胞2次，顯微鏡下觀察細(xì)胞。其結(jié)果與未添加測試樣品的對照組(圖23-0)比較，添加抗 小鼠Siglec-15多克隆抗體顯著抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合(圖23-A)。但是，通過用作為免 疫抗原而使用的小鼠Siglec-15-Fc蛋白吸收抗小鼠Siglec-15多克隆抗體，可解除抗小鼠 Siglec-15多克隆抗體對破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制效應(yīng)(圖23-B、C)。并且，通過用小鼠 Siglec-15-His蛋白吸收抗小鼠Siglec-15多克隆抗體，同樣可解除抗小鼠Siglec-15多 克隆抗體對破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制效應(yīng)(圖23-D、E)。從這些結(jié)果可知，與Siglec-15 特異性結(jié)合的抗體，可抑制人RANKL所誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞來源的TRAP陽性破骨細(xì)胞的 多核化和細(xì)胞融合。另外，圖23中A至E的符號所表示的結(jié)果，分別與表6中A至E的測試樣品相對應(yīng)。實施例23.產(chǎn)生大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的建立a)抗原的制備將實施例8制備的小鼠Siglec-15-His蛋白配制成100 μ g/0. 5ml，用玻璃注 射器添加等量的佐劑并制成乳液。作為佐劑，僅在初次免疫時使用弗氏完全佐劑(FCA、 Difco Laboratories, Inc.生產(chǎn))，第二次及后續(xù)的免疫使用弗氏不完全佐劑(FICA、Difco Laboratories, Inc.生產(chǎn))。b)對大鼠的免疫使用4只大鼠(Wistar，雌性，6周齡，購自日本CLEA)作為免疫動物。將a)得到 的乳液用27G注射針進(jìn)行皮下和皮內(nèi)注射，使抗原量為50 μ g/大鼠。第一次免疫后每7天 進(jìn)行一次共進(jìn)行4次免疫。第四次免疫起的7天后，從尾靜脈少量(200μ1)采血，制備抗 血清。為了確認(rèn)抗血清的抗體滴度，進(jìn)行使作為抗原使用的小鼠Siglec-15-His蛋白、實施 例9制備的小鼠Siglec-15-Fc蛋白或者牛血清白蛋白(BSA)固相化的ELISA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 只大鼠(大鼠第1 4只)中均具有對小鼠Siglec-15-His蛋白及小鼠Siglec-15-Fc蛋 白的反應(yīng)性。另一方面，未發(fā)現(xiàn)對BSA的反應(yīng)性。由以上結(jié)果可以確認(rèn)，各免疫的大鼠血清 中抗體滴度升高，因此對抗體滴度最高的第2只大鼠進(jìn)行細(xì)胞融合操作。c)細(xì)胞融合按照通常小鼠(大鼠)脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合法進(jìn)行細(xì)胞融合。乙醚麻醉 下從大鼠心臟取全血，并使其安樂死，然后摘除其脾臟。將采集的脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì) 胞的P3X63Ag8. 653細(xì)胞(ATCC CRL 1580)用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行細(xì)胞融合。將得到的細(xì) 胞鋪于96孔板，加入含有次黃嘌呤H)、氨基蝶呤A)、胸苷T)的培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基) 培養(yǎng)7 10天。對確認(rèn)存活的細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞的61孔的培養(yǎng)上清液進(jìn)行收 集。然后通過用固相化的小鼠Siglec-15-His蛋白、實施例9制備的小鼠Siglec-15-Fc蛋 白或者BSA作為抗原的ELISA，進(jìn)行抗體滴度的評價，并篩選產(chǎn)生抗小鼠Siglec-15單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞。根據(jù)篩選的結(jié)果，選出抗體滴度高的12孔，對其中所含的雜交瘤細(xì)胞 進(jìn)行克隆操作。d)雜交瘤的克隆用有限稀釋法對如此選出的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第一次克隆。有限稀釋后將雜交瘤2 周培養(yǎng)，用使固相化的實施例9制備的小鼠Siglec-15-Fc蛋白或者BSAELISA，對培養(yǎng)上清 液中的抗體滴度進(jìn)行確認(rèn)。通過對已確認(rèn)陽性克隆的11個克隆再次進(jìn)行第二次克隆(采 用與第一次克隆相同的操作)，由此最終建立10個產(chǎn)生抗小鼠Siglec-15單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞的克隆(#1A1、#3A1、#8A1、#24A1、#32A1、#34A1、#39A1、#40A1、#41B1、#61A1)。另 外，雜交瘤細(xì)胞#32A1以及雜交瘤細(xì)胞#41B1于2008年8月28日被保藏在日本國獨立行 政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(所在地郵政編碼305-8566日本茨城縣筑 波市東1條1門1中央第6)，雜交瘤細(xì)胞#32A1以名稱抗-Siglec-15雜交瘤#32A1、保藏 編號FERM BP-10999保藏，雜交瘤細(xì)胞#41B1以名稱抗-Siglec-15雜交瘤#41B1、保藏編號 FERM BP-11000 保藏。實施例24.大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體的制備a)裸小鼠腹水的制備
用含10% FCS的TIL培養(yǎng)基I ((株)免疫生物研究所制)培養(yǎng)基培養(yǎng)實施例23 建立的雜交瘤細(xì)胞。在細(xì)胞生長到5X IO5細(xì)胞/ml左右的時間點時，通過進(jìn)行稀釋至四分 之一左右的細(xì)胞繼代培養(yǎng)操作，每2 3天進(jìn)行一次。向預(yù)先腹腔內(nèi)給予(0.2ml/小鼠) 降植烷的裸小鼠的腹腔內(nèi)，以濃度為IXlO7細(xì)胞/小鼠植入如此培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。10個 克隆的雜交瘤細(xì)胞各使用3只裸小鼠進(jìn)行植入。植入后，在明顯見到腹水蓄積的時間點采 集腹水，將從另2只植入相同雜交瘤細(xì)胞的小鼠采集的腹水合并，并測定如此合并的腹水 量后，冷凍保存該腹水，直至抗體純化。各雜交瘤細(xì)胞的腹水采集量歸納于表7。表 7 b)抗體的純化將采集的腹水總量進(jìn)行IgG純化，使用20ml蛋白G柱(GE Healthcare, Co.， Ltd.生產(chǎn))。利用凝膠過濾分析(Superdex 200柱色譜)對純化的IgG進(jìn)行純度測 定，一部分進(jìn)行離心膜濃縮。即，將除#24A1抗體外的9種抗體用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (MiIlipore Co.，Ltd.生產(chǎn))于 3000r. p. m.、4°C下進(jìn)行 30 60 分鐘離心，使其 濃縮至1/6-1/8。接著，將牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白測定試劑盒Bio-Rad Laboratories, Inc.生產(chǎn))對#24A1抗體以及濃縮的其它9種抗體的蛋白濃度進(jìn)行測定。 通過以上操作制備抗小鼠Siglec-15單克隆抗體。實施例25.大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對小鼠Siglec-15蛋白結(jié)合特性的 評價采用ELISA法評價大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對小鼠Siglec-15蛋白的結(jié) 合特性。用0. IM碳酸鈉緩沖液(pH 9. 5)將實施例9制備的小鼠Siglec-15-Fc蛋白稀釋 至 5 μ g/ml，將得到的溶液以 100 μ 1/ 孔加入 96 孔板(Nalge NuncInternational，Inc.生 產(chǎn)、商品編號430341)中。室溫下將板放置1小時后除去溶液，以300 μ 1/孔加入洗滌緩沖 液(含0. 05% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水)，再除去。將該洗滌操作再進(jìn)行一次后，通 過以200 μ 1/孔加入含25% BlockAce (大日本住友制藥社制)的磷酸鹽緩沖生理鹽水，將 板在室溫下放置1小時，由此進(jìn)行封閉。除去液體，以300 μ 1/孔的洗滌緩沖液洗滌該板2 次后，用ELISA緩沖液(含12. 5% BlockAce和0. 05% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水) 將實施例24制備的各大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體或者大鼠對照IgG(R&D systems,Inc.生產(chǎn))稀釋至終濃度為1. 28 20，000ng/ml (5倍稀釋系列)，并將得到的稀釋抗體溶 液以100 μ 1/孔添加至板中。將該板在室溫下放置1小時后除去液體，以300 μ 1/孔的洗滌 緩沖液洗滌該板3次。接著，以100 μ 1/孔添加用ELISA緩沖液稀釋了 1，000倍的HRP (辣 根過氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體(BeckmanCoulter，Inc.生產(chǎn))，將該板在室溫 下放置1小時。除去溶液，以300 μ 1/孔的洗滌緩沖液洗滌3次后，使用過氧化酶用顯色 試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.生產(chǎn))，按照試劑盒所附的說明書進(jìn)行顯色。顯色 后用酶標(biāo)儀(日本MolecularDevices Corporation生產(chǎn))測定492nm下的吸光度。其結(jié) 果確認(rèn)，研究的所有大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體10個受試物質(zhì)中，均以抗體濃度依 賴性的方式與小鼠Siglec-15蛋白結(jié)合(圖24)。另一方面，大鼠對照IgG中未見與小鼠 Siglec-15蛋白的結(jié)合。實施例26.基于小鼠破骨細(xì)胞形成試驗的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體生物 活性評價使用實施例24制備的所有10個受試物質(zhì)的抗小鼠Siglec-15單克隆抗體，檢 測小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響。用含有10% FBS和10ng/mlM-CSF(R&D Systems, Inc.生產(chǎn))的α-MEM培養(yǎng)基將采用實施例16的方法制備的小鼠髓非貼壁細(xì)胞 制成1. 5 X IO5細(xì)胞/nl，并將該制備的細(xì)胞溶液以每孔200 μ 1鋪于96孔板，該細(xì)胞在CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。除去96孔板中舊的培養(yǎng)液，向每孔添加100 μ 1含10% FBS的MEM- α 培養(yǎng)基，該FBS中添加了終濃度為20ng/ml的人RANKL (RANKL、PeproTech Inc.生產(chǎn))和 10ng/ml的M-CSF。向該細(xì)胞培養(yǎng)液中，以濃度32 1，000ng/ml添加實施例24制備的大 鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體、從市售的大鼠對照IgG(純化的大鼠IgG、R&D Systems, Inc.生產(chǎn))除去了疊氮化鈉的樣品或?qū)嵤├?4制備的兔抗小鼠Siglec-15多克隆抗體(第 3組)，該細(xì)胞進(jìn)一步在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，采用實施例17記載的方法測 定形成的破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。酶反應(yīng)停止后測定各孔405nm的 吸光度，該測定作為TRAP活性的指標(biāo)。其結(jié)果如圖25及圖26所示。市售的大鼠對照IgG 中未見顯著的TRAP活性抑制作用。另一方面，#32A1抗體在32ng/ml至lOOOng/ml的范圍 內(nèi)、#8A1抗體和第3組親和純化兔多克隆抗體在63ng/ml至lOOOng/ml的范圍內(nèi)，具有顯 著的TRAP活性抑制。并且，觀察到#3A1抗體、#34A1抗體、#39A1抗體在500ng/ml或以上 的相對高濃度下劑量依賴性地抑制TRAP活性。未發(fā)現(xiàn)其它抗體對小鼠破骨細(xì)胞形成的抑 制。根據(jù)以上結(jié)果，在制備的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體中發(fā)現(xiàn)強烈抑制小鼠破骨 細(xì)胞形成(破骨細(xì)胞的分化和成熟)的抗體。此外，作為#3A1抗體、#8A1抗體、#32A1抗 體、#34A1抗體、#39A1抗體共同的性質(zhì)，可例示lOOOng/ml即1 μ g/ml或以下濃度下對破骨 細(xì)胞形成的抑制活性。實施例27.人來源的成熟破骨細(xì)胞的總RNA的提取用添加含胎牛血清(終濃度10% )、人RANKL和人M-CSF等的OPGM補充套裝(破 骨細(xì)胞SingleQuot 試劑盒，購自三光純藥、商品編號PT-9501)的破骨前體細(xì)胞用基礎(chǔ)培 養(yǎng)基(0ΡΒΜ、購自三光純藥、商品編號PT-8201)，培養(yǎng)正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常人天 然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞購自三光純藥，商品編號2T-110)，3 7天后出現(xiàn)大量TRAP陽性多核 破骨細(xì)胞。按照試劑盒所附說明書使用該細(xì)胞培養(yǎng)體系，來制備人來源的成熟破骨細(xì)胞。a)將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞以IX IO4細(xì)胞/孔鋪于96孔板的60孔中，加入人
56RANKL使終濃度為66ng/ml，該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。接著，按照試劑所附說明書用 總RNA提取試劑(IS0GEN =Nippon Gene Co.，Ltd.生產(chǎn))從多核破骨細(xì)胞提取總RNA。將 收集的總RNA在-80°C保存直至使用。b)將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞以IX IO4細(xì)胞/孔分別鋪于兩個96孔板的各84 孔中，1個板中加入人RANKL使終濃度為53. 2ng/ml，另一個板中不添加人RANKL，細(xì)胞在CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。接著，按照試劑所附說明書用總RNA提取試劑(IS0GEN =Nippon Gene Co.，Ltd.生產(chǎn))，從該細(xì)胞中提取總RNA。將收集的總RNA在_80°C保存直至使用。實施例28.人Siglec-15開放閱讀框(ORF)序列的獲得a)第一鏈 cDNA 合成以實施例27的a)中制備的總RNA為模板，用oligo(dT)引物(Invitrogen，Inc. 生產(chǎn))和SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))進(jìn)行cDNA合成。按照該酶 所附說明書進(jìn)行操作。b) PCR 反應(yīng)按照常規(guī)方法合成具有下列序列的寡核苷酸5，-attaagcttcaccATGGAAAAGTCCATCTGGCTGC-3，(hSiglec-15-HindIIIkozak-F 序列表中SEQ ID NO 29)；以及5，-agtggatccT CACGGTGAGC ACATGGTGGC-3，(hSiglec-15-BamHI-R 序列表中 SEQ ID NO 30)其用作通過PCR法擴(kuò)增人Siglec-15的ORF cDNA的引物。使用該引物的組合和 a)中制備的cDNA，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR。用PureLink PCR純化試劑盒(Invitrogen，Inc. 生產(chǎn))對得到的PCR反應(yīng)液進(jìn)行純化。c)向 pcDNA3. 1 (+)載體克隆用限制酶處理(BamHI、HindIII)b)中得到的純化PCR反應(yīng)液以及pcDNA3. 1 (+)載 體(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))，凝膠切割并純化后，按照常規(guī)方法進(jìn)行連接酶反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸 桿菌T0P10，對得到的耐藥性克隆進(jìn)行菌落PCR。對于得到設(shè)想尺寸擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆，用DNA 測序儀對插入到質(zhì)粒中的ORFcDNA的總核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其是序列表中SEQ ID NO :1所示的序列。該核苷酸序列與NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中登錄為“人Siglec-15”(登 錄號NM_213602)的序列的ORF編碼區(qū)相同，并且，由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列(序 列表中SEQ ID NO 2)與人Siglec-15的氨基酸序列100%—致。實施例29.伴隨人破骨細(xì)胞分化的人Siglec-15的mRNA表達(dá)(實時PCR分析)在1 μ g實施例27的b)中制備的總RNA中加入1 μ 1的IU/ μ 1 DNAseIU μ 1的 IOXDNAseI緩沖液(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))，加H2O至終體積為10 μ 1，室溫下反應(yīng)15分 鐘后，加入1 μ 1的25mM EDTA并將得到的混合物于65°C加熱10分鐘。從該溶液中取8 μ 1 等分樣品，加入1 μ 1的50 μ M oligo(dT)20引物以及1 μ 1的IOmM dNTPs，得到的混合物在 65°C下加熱5分鐘后，在冰中孵育。向該溶液中加入2 μ 1 10XRT緩沖液(Invitrogen，Inc. 生產(chǎn))、4μ 1 25mM MgCl2、2y 10. IM 二硫蘇糖醇、1 μ 1 RNA 酶抑制劑(RNAse0UT、40U/μ 1、 Invitrogen, Inc.生產(chǎn))、1μ1 SuperscriptIII 逆轉(zhuǎn)錄 (200U/μ l、Invitrogen, Inc.生 產(chǎn))使總量為20 μ 1，混合物50°C下反應(yīng)50分鐘后，85°C下加熱5分鐘，冰中孵育。
使用如此制備的單鏈cDNA，用以下引物組合和熒光標(biāo)記的探針(TaqMan探針、 Applied Biosystems, Inc.生產(chǎn))進(jìn)行實時 PCR。實時PCR條件人組織蛋白酶K擴(kuò)增用引物5，-ccgcagtaat gacacccttt-3，(TqM-hcatK-F 序列表中 SEQ ID NO 31)以及5，-aaggcattgg tcatgtagcc—3，(TqM—hcatK—R 序列表中 SEQ ID NO :32)、人組織蛋白酶K檢測用TaqMan探針5，-Fam-tcagggtcag tgtggttcct gttgggct_TAMRA_3，(TqM-hcatK-探針序歹丨J表 中 SEQ ID NO 33)、人TRAP擴(kuò)增用引物5，-ctgtcctggc tcaagaaaca-3，(TciM-hTRAP-F 序列表中 SEQ ID NO 34)以及5，-ccatagtgga agcgcagata-3，(TqM_hTRAP_R 序歹Ij表中 SEQ ID NO 35)人TRAP檢測用TaqMan探針5，-Fam-tgagaatggcgtgggctacgtgctgagt-TAMRA-3，(TqM-hTRAP-探針序歹丨J表中 SEQ ID NO 36)、人Siglec-15擴(kuò)增用引物5，-cagccaccaa catccatttc-3，(TciM-hSiglec-15-F 序列表中 SEQ ID NO 37)以及5，-cgctcaagct aatgcgtgta-3，(TciM-hSiglec-15-R 序列表中 SEQ ID NO :38)、人Siglec-15 檢測用 TaqMan 探針5' -Fam-aagaacaaag gccagtgcga ggcttggc-TAMRA-3‘ (TqM-hSiglec-15- ^ff" 序列表中SEQ ID NO :39)、人L32核糖體蛋白擴(kuò)增用引物5，-gagatcgctc acaatgtttc ct_3，(TciM-hL32-F 序列表中 SEQ ID NO 40)以及5，-gatgccagat ggcagttttt ac_3，(TqM_hL32_R 序列表中 SEQ ID NO 41)人L32核糖體蛋白檢測用TaqMan探針5，-Fam-accgcaaagc catcgtggaa agagctg_TAMRA_3，(TqM_hL32_ 探針序列表中 SEQ ID NO 42)使用實時PCR 系統(tǒng)(ABI Prism 7700 序列檢測器、Perkin Elmer JapanApplied Biosystems Division生產(chǎn))在以下條件下進(jìn)行實時PCR分析。反應(yīng)中使用TaqMan通用 PCR主要混合物(Applied Biosystems, Inc.生產(chǎn))。首先，向每個25pmol引物、8ng單鏈 cDNA以及IOpmolTaqMan探針中加入蒸餾水至終體積為25 μ 1，再加入25 μ 1 TaqMan通用 PCR主要混合物制成50 μ 1反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在50°C加熱2分鐘后在95°C加熱10分鐘， 重復(fù)進(jìn)行“95°C下0. 25分鐘，60°C下1分鐘”的溫度循環(huán)40次，由此進(jìn)行實時PCR分析。另 外，各基因的mRNA表達(dá)量用L32核糖體蛋白的mRNA表達(dá)量來校正。結(jié)果表明，以已知作為破骨細(xì)胞的標(biāo)志分子的組織蛋白酶K以及TRAP基因相同的方式，Siglec-15基因的表達(dá)量在添加RANKL誘導(dǎo)人破骨細(xì)胞分化時顯著升高(圖27)。實施例30.可溶性人Siglec-15蛋白表達(dá)構(gòu)建體的制備編碼人Siglec-15蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的部分核酸序列由序列表中的SEQ ID NO 43 表示，其氨基酸序列由序列表中的SEQ ID N0:44表示。通過利用這樣的部分序列，可以使 動物細(xì)胞等培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生可溶性人Siglec-15蛋白。a)通過PCR對可溶性人Siglec-15基因的擴(kuò)增按照常規(guī)方法合成具有下列序列的寡核苷酸5' -ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCTGGCTGC-3‘ (hS iglec-15-ECD-F 序列表中 SEQ ID NO 45)以及5' -ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGCGG-3‘ (hSigle c-15-ECD-R 序列表中 SEQ ID NO 46)、其用作通過PCR法擴(kuò)增人Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域cDNA的引物。另外，將上述引物 設(shè)計為在hSiglec-15-ECD-F上附加attBl序列，并在hSiglec-15-ECD-R上附加attB2序 列，并作為擴(kuò)增引物用于制備Gateway進(jìn)入克隆。使用該引物的組合、以及作為模板的實施 例28制備的人Siglec-15/pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR。將得到的PCR反應(yīng) 液用PureLink PCR純化試劑盒(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))進(jìn)行純化。b)通過Gateway BP反應(yīng)制備進(jìn)入克隆采用以下方法來制備進(jìn)入克隆，所述進(jìn)入克隆通過應(yīng)用λ噬菌體位點特異性重 組系統(tǒng)的Gateway技術(shù)(Invitrogen，Inc.)，將人Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA整合至克 隆中。首先，在a)中制備的兩端具有attB序列的PCR產(chǎn)物與具有attP序列的供體載體即 PDN0R221 (Invitrogen, Inc.生產(chǎn))之間，使用BP克隆酶(Clonase)進(jìn)行BP反應(yīng)。用該反 應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，對耐藥性克隆進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)插入片段大小。對于已確認(rèn)具 有正確大小的插入片段的克隆，對插入片段的總DNA序列進(jìn)行序列分析，結(jié)果得到與編碼 人Siglec-15蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)核酸序列(序列表中SEQ ID NO 43)完全一致的進(jìn) 入克隆。c)通過Gateway LR反應(yīng)的表達(dá)克隆的制備采用以下方法來制備表達(dá)克隆，所述表達(dá)克隆通過應(yīng)用λ噬菌體位點特異性重 組系統(tǒng)的Gateway技術(shù)(4 > '卜口夕工 >社)，將人Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA整合至 克隆中。b)中制備的進(jìn)入克隆含有兩端具有attL序列的插入片段。在該進(jìn)入克隆與具有 attR序列的兩種目標(biāo)載體(destination vectors)之間用LR克隆酶進(jìn)行LR反應(yīng)。另外， 作為目標(biāo)載體，使用設(shè)計為該插入片段的C末端附加V5表位標(biāo)簽和6XHis標(biāo)簽的pDONM、 以及該插入片段的C末端附加人Fc標(biāo)簽的phlgFc這兩種載體。使用通過LR反應(yīng)制得的反 應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，對得到的耐藥性克隆進(jìn)行序列分析，以確認(rèn)是否發(fā)生正確重組。序列分析的結(jié)果是，pDONM和phlgFc均分別得到正確重組的表達(dá)克隆(可溶性人 Siglec-15/pDONM 以及可溶性人 Siglec-15/phIgFc)。通過將可溶性人 Siglec-15/pDONM 轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞等，具有序列表中SEQ ID NO :47所示的堿基序列的mRNA轉(zhuǎn)錄，并翻譯成 具有序列表中SEQ ID NO :48所示的氨基酸序列的蛋白(人Siglec-15-His)。此外，通過 將可溶性人Siglcc-15/phIgFc轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞等，具有序列表中SEQ ID NO 49所示的堿基序列的mRNA轉(zhuǎn)錄，并翻譯成具有序列表中SEQ ID NO :50所示的氨基酸序列的蛋白(人 Siglec-15-Fc)。實施例31.使用293-F細(xì)胞，含可溶性人Siglec-15蛋白的培養(yǎng)液的大量制備a)含有人Siglec-15-His的培養(yǎng)液的制備制備約25mg實施例30得到的可溶性人Siglec-15/pDONM。另外，在來自大量培養(yǎng) 的大腸桿菌的質(zhì)粒純化中，使用Invitrogen，Inc.的PureLink HiPure質(zhì)粒大量制備試劑 盒Invitrogen，Inc.生產(chǎn))。將如此制備的質(zhì)粒與Opti-MEM(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))混 合，加入50ml轉(zhuǎn)染試劑293fectin (Invitrogen，Inc.生產(chǎn))，得到的混合物室溫下孵育20 分鐘。將該混合液添加到FreeStyle 293-F細(xì)胞(Invitrogen, Inc.生產(chǎn))中，該FreeStyle 293-F細(xì)胞在含青霉素-鏈霉素的FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen，Inc.生產(chǎn)) 中培養(yǎng)，用 25L 生物過程培養(yǎng)裝置(bioprocess culture apparatus) (WAVEBioreactor)使 細(xì)胞密度達(dá)到1.0 3. 4X IO6細(xì)胞/ml。在6 12% CO2濃度、37°C下旋動培養(yǎng)(30轉(zhuǎn)/ 分)96小時(4天)后，收集培養(yǎng)液，離心分離制成培養(yǎng)上清液。認(rèn)為由此制備的培養(yǎng)上清液 中，表達(dá)人Siglec-15的胞外結(jié)構(gòu)域C末端側(cè)附加V5表位標(biāo)簽和6 XHis標(biāo)簽的蛋白(人 Siglec-15-His)。b)含有人Siglec-15-Fc的培養(yǎng)液的制備制備約5mg實施例30得到的可溶性人Siglec-15/phIgFc。另外，在來自大量培 養(yǎng)的大腸桿菌的質(zhì)粒純化中，使用Invitrogen，Inc.的PureLink HiPure質(zhì)粒大量制備 試劑盒(Invitrogen，Inc.生產(chǎn))。將如此制備的質(zhì)粒與0pti-MEM(Invitrogen，Inc.生 產(chǎn))混合，濾器滅菌后添加IOml轉(zhuǎn)染試劑293feCtin (Invitrogen，Inc.生產(chǎn))，并將得到 的混合物在室溫下孵育20分鐘。將該混合液添加到錐形瓶中培養(yǎng)的FreeStyle 293-F細(xì) 胞(Invitrogen, Inc.生產(chǎn))中，該 FreeStyle 293-F 細(xì)胞在 FreeStyle 293 表達(dá)培養(yǎng)基 (Invitrogen, Inc.生產(chǎn))中使細(xì)胞密度達(dá)到1. 0 3. 0 X IO6細(xì)胞/ml X 5L (5個IL/燒瓶)。 在8.0% CO2濃度、37°C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(125轉(zhuǎn)/分)96小時(4天)后，收集培養(yǎng)液，離心分離 制成培養(yǎng)上清液。認(rèn)為由此制備的培養(yǎng)上清液中，表達(dá)人Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域C末端側(cè) 附加人Fc標(biāo)簽的蛋白(人Siglec-15-Fc)。實施例32.可溶性人Siglec-15蛋白的純化a)可溶性人Siglec-15-His的純化a-i) HisTrap HP 柱色譜在12L使實施例31的a)中制備的表達(dá)人Siglec-15-His的293F細(xì)胞培養(yǎng)液中加 入1350mL IOx緩沖液(500mM Tris, 1. 5M NaCl,200mM咪唑，pH8. 0)，得到的混合物充分?jǐn)?拌后，用MilliPak 60濾器(Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾。將該培養(yǎng)液以10ml/min的 流速加載至預(yù)先用純水(Milli Q水)洗滌的Ni-瓊脂糖HP (Amersham Biosciences, Inc. 生產(chǎn)制)IOOmL 柱。用 400ml 含 300mM NaCl 的 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH8. 0)以 8mL/min 的流速洗柱后，用200mL含300mM NaCl、500mM咪唑的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)以 2. 5mL/min的流速對吸附在柱上的蛋白進(jìn)行洗脫，洗脫液分餾在Mini-sorp管(Nunc，Inc. 生產(chǎn)制)中。為防止蛋白沉淀，在約40mL含洗脫的蛋白的餾分中加入8mL 5MNaCl溶液并攪 拌，然后將得到的混合物用離心膜濃縮器AmiconUltra-15 (Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))濃 縮至約20mL。在3000r. p. m.、4°C下離心30分鐘以除去濃縮時產(chǎn)生的不溶物，將2. 5mL得
60到的上清液加載至預(yù)先用含IM NaCl的磷酸鹽緩沖生理鹽水(N-PBS)平衡的PD-10脫鹽柱 (AmershamBiosciences, Inc.生產(chǎn)制)，并用N-PBS進(jìn)行洗脫，由此得到將溶劑置換為N-PBS 的3. 5mL樣品。將該操作進(jìn)一步重復(fù)進(jìn)行7次，得到約28mL部分純化的人Siglec-15-His 溶液。a-ii)Resource Q 柱色譜在含0. 1 % CHAPS 的 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 5)中，將 12ml 用 Ni-瓊脂糖 HP柱色譜純化的溶劑置換為N-PBS的樣品在4°C下透析過夜(1L、3次)，得到的透析液在 4°C>3, OOOr. p.m.下離心 30 分鐘，除去沉淀。用 Millex GV 濾器(Millipore Co. ,Ltd.生 產(chǎn))過濾得到的上清液，然后將濾出液以lml/min的流速加載至預(yù)先用含0. 1 % CHAPS的 50mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7· 5)平衡的 Resource Q 6mL 柱(Amersham Biosciences, Inc. 生產(chǎn))中，接著用該緩沖液以lml/min的流速洗柱，收集未吸附在柱上的蛋白餾分。用含 0. 1% CHAPSUMNaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)以lml/min的流速洗脫吸附在柱上 的蛋白。用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))將26. 5ml未吸 附在柱上的餾分濃縮至3. Oml后，濃縮液在4°C、3，OOOr. p. m.下離心10分鐘，并除去沉淀。 將2. 5mL得到的上清液加載至預(yù)先用含50mM鹽酸精氨酸的磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7. 0、 A-PBS)平衡的 PD-10 脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))，然后用 A-PBS 洗脫，由 此得到溶劑置換為A-PBS的3. 5mL樣品。為防止可溶性人Siglec-15-His沉淀，在制備的 樣品溶劑中添加了鹽酸精氨酸。將離心后的上清液在-80°C冷凍保存直至使用。以上的純 化操作(Resource Q柱色譜)重復(fù)進(jìn)行2次。a-iii)純化的人Siglec-15-His的檢測和純度測定用上述純化操作(Ni-瓊脂糖HP柱色譜、Resource Q柱色譜)中制備的樣品，在還 原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色。即，在5μ 1各純化步驟的各樣品中加入 等量的SDS-處理液，得到的混合物在95°C下進(jìn)行10分鐘熱處理。將0. 3 μ 1熱處理后的各 樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。除了使用彩虹分子量標(biāo)記(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))作為分子量標(biāo)記以外，采用與實施例8相同的方法進(jìn)行電泳操作。電泳結(jié)束后 用 PhastGel 銀染色試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和 PhastSystem 進(jìn)行銀染 色，其結(jié)果如圖28所示。結(jié)果顯示，未吸附在Resource Q柱上的蛋白餾分中分子量約35kDa 的蛋白質(zhì)(人Siglec-15-His)被有效純化并濃縮。a-iv)純化的人Siglec-15-His的蛋白濃度的測定對于純化人Siglec-15-His (未吸附在Resource Q柱上的蛋白餾分)，將牛血清 白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白測定試劑盒BioRad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測定蛋白濃 度。通過2次純化操作共得到1. 66mg純化的人Siglec-15-His。b)可溶性人Siglec-15-Fc的純化
b-i) HiTrap 蛋白 A 柱色譜 將1.5L實施例31的b)中制備的表達(dá)人Siglec-15-Fc的293F細(xì)胞培養(yǎng)液用 Sterivex GV濾器(Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾后，濾出液以5ml/min的流速加載至 預(yù)先用 Dulbecco，s PBS(D_PBS、Invitrogen, Inc.生產(chǎn))平衡的 HiTrap 蛋白 A 5mL 柱 (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)中。用 70ml D-PBS 以 5ml/min 的流速洗柱后， 用24ml 0. IM檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0)以1. 2ml/min的流速對吸附在柱上的蛋白進(jìn)行洗脫。以每餾分1.2ml將洗脫液分餾在Mini-sorp管(Nunc，Inc.生產(chǎn)制)中，然后立即加 入0. 31ml IM Tris中和洗脫液。將約7. 5ml合并洗脫的蛋白餾分(餾分5 9)得到的溶 液中的2. 5ml等分樣品加載至預(yù)先用含50mM鹽酸精氨酸的磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7. 0、 A-PBS)平衡的 PD-10 脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)中，然后用 A-PBS 洗 脫，由此得到溶劑置換為A-PBS的3.5ml樣品。將該操作重復(fù)進(jìn)行2次。為了防止可溶性 人Siglec-15-Fc沉淀，在溶劑中添加鹽酸精氨酸。洗脫的蛋白餾分(餾分5 9)的剩余溶 液的2. 5ml加載至預(yù)先用含IM NaCl的磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH6. 7、N_PBS)平衡的PD-10 脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)中，然后用N-PBS洗脫，由此得到溶劑置換 為N-PBS的3. 5ml樣品。為了防止可溶性人Siglec-15-Fc沉淀，在制備的樣品溶劑中添 加NaCl而不添加精氨酸等含氨基的化合物。溶劑置換為N-PBS的人Siglec-15-Fc樣品僅 用于后述實施例34的c)中制備固定化柱時的情形，除此之外的實施例均使用溶劑置換為 A-PBS的人Siglec-15-Fc。將以上操作所制備的樣品在_80°C冷凍保存直至使用。b-ii)純化的人Siglec-15-Fc的檢測和純度測定用上述純化操作制備的樣品在還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染 色。即，在5μ 1各純化步驟的各樣品中加入等量的SDS-處理液，得到的混合物在95°C下加 熱10分鐘。用1/2濃度的SDS-處理液將熱處理的各樣品稀釋至1/100或1/300，將0. 3 μ 1 得到的樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用與a-iii)所述的人Siglec-15-His的純 度測定相同的方法進(jìn)行電泳和銀染色，其結(jié)果如圖29所示。結(jié)果顯示從HiTrap蛋白A柱 洗脫的蛋白餾分中分子量約55kDa的蛋白質(zhì)(人Siglec-15-Fc)被有效純化并濃縮。b-iii)純化的人Siglec-15-Fc的蛋白濃度的測定對于純化人Siglec-15-Fc (從PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾分)，將牛血清白蛋白作 為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白純化試劑盒BioRad社制)測定蛋白濃度。如表8所示，通過2次純 化操作共得到25. 2mg純化的人Siglec-15-Fc。表8 實施例33.兔抗人Siglec-15多克隆抗體的制備(對兔的免疫)a)抗原的制備將實施例32的b)中制備的人Siglec-15-Fc蛋白制備成lOOyg/O. 5ml，用玻璃 注射器添加等量的佐劑制成乳液。作為佐劑，僅在初次免疫時使用弗氏完全佐劑(FCA、 Difco Laboratories, Inc.生產(chǎn))，第2次及后續(xù)的免疫使用弗氏不完全佐劑(FICA、Difco Laboratories, Inc.生產(chǎn))。b)對兔的免疫
使用3只兔(日本白色種雌性兔，體重3kg)作為免疫動物。另外，在免疫前采血， 每只兔得到IOml免疫前血清。用27G注射針在皮下和皮內(nèi)注射a)中得到的乳液使抗原量 為50 μ g/兔。第一次免疫后每14天進(jìn)行一次共進(jìn)行8次免疫。自第8次免疫起7天后采 集全血，每只兔得到74. 4 74. 9ml的抗血清。通過將抗原固相化的ELISA法來確認(rèn)免疫 前血清中和抗血清中的抗體滴度。結(jié)果確認(rèn)所有3只兔的抗血清中的抗體滴度均升高。將 抗血清在-20°C保存直至使用。實施例34.兔抗人Siglec-15多克隆抗體的純化a) HiTrap蛋白A柱色譜分別在40ml實施例33的b)中制備的三組兔抗血清中各加入40mlDulbecco，s PBS(D-PBS、Invitrogen，Inc.生產(chǎn))并混合，得到的混合物用 SterivexGV 濾器(MiHipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾。然后將濾出液以2ml/min的流速加載至預(yù)先用D-PBS平衡的兩根 HiTrap 蛋白 A 5mL柱(將兩根柱串聯(lián)，AmershamBiosciences，Inc.生產(chǎn))。用 35ml D-PBS 以 lml/min的流速洗柱后，用50ml 0. IM檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0)以lml/min的流速對吸附在 柱上的蛋白進(jìn)行洗脫。以每餾分2.5ml將洗脫液分餾在Mini-sorp管(NimC，InC.生產(chǎn)制) 中后，立即加入0.6ml IM Tris中和洗脫液。用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))將約15. 5ml合并含洗脫蛋白的餾分(Fr. 3 7)得到的溶液濃縮至5ml后， 將其中2. 5ml等分樣品加載至預(yù)先用含0. 01% Tween 20的大塚注射用生理鹽水(TO-SS) 平衡的PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)，然后用T0-SS洗脫，由此得 到溶劑置換為TO-SS的3.5ml樣品。將該操作重復(fù)進(jìn)行2次。將如此制備的樣品在-80°C 冷凍保存直至使用。b)免疫前兔IgG的純化在人Siglec-15-Fc的免疫開始前，從實施例33中使用的3只兔中預(yù)先采血，制備 免疫前血清。將該血清各5ml等分樣品混合后加入15ml D-PBS，得到的混合物用Millex GV濾器(Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾。然后將得到的血清樣品以lml/min的流速加 載至預(yù)先用D-PBS平衡的兩根HiTrap蛋白A 5mL柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn) 制)。用35ml D-PBS以lml/min的流速洗柱后，用50ml 0. IM檸檬酸鈉緩沖液(ρΗ3· 0)以 lml/min的流速對吸附在柱上的蛋白進(jìn)行洗脫。以每餾分2. 5ml將洗脫液分餾到Mini-sorp 管(Nunc，Inc.生產(chǎn)制)中，然后立即加入0. 6ml IM Tris中和洗脫液。用離心膜濃縮器 AmiconUltra-15 (Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))將合并含洗脫的蛋白餾分(餾分4 6)得 到的溶液濃縮至2. 5ml后，將該濃縮液加載至預(yù)先用含0. 01% Tween 20的大塚注射用生理 鹽水(TO-SS)平衡的 PD-10 脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)，然后用 T0-SS 洗脫，由此得到溶劑置換為TO-SS的3. 5ml樣品。采用實施例8所述的方法對如此純化的 該免疫前兔IgG樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色，以確認(rèn)IgG蛋白被充分純化，然后 測定蛋白濃度。將如此純化的該免疫前兔IgG樣品在-80°C冷凍保存直至使用。c)將人Siglec-15-Fc固定其上的親和柱的制備用離心膜濃縮器Amicon Ultra 4(Millipore Co. ,Ltd.生產(chǎn))將3ml實施例32的 b)中制備的溶劑置換為N-PBS的純化人Siglec-15-Fc (合計7. 8mg蛋白)濃縮至2ml。在濃 縮液中加入偶聯(lián)緩沖液(0. 2M NaHC03、0.5M NaCl，pH8. 3)至終體積為2. 5ml，然后用PD-10 脫鹽柱將其溶劑置換為3. 5ml的偶聯(lián)緩沖液。將NHS-活化的HiTrap柱(1ml、AmershamBiosciences, Inc.生產(chǎn)制)內(nèi)的異丙醇置換為ImM鹽酸后，用注射器向柱中注入3ml制備 的人Siglec-15-Fc，用連接在柱出口的另一注射器交替注入溶液來進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。室溫下 反應(yīng)30分鐘后，為了滅活過剩的活性基團(tuán)，按照Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)的說明 書，依次注入6ml封閉緩沖液(含0. 5M NaCl的乙醇胺緩沖液、pH8. 3)、6ml洗滌緩沖液(含 0. 5M NaCl的醋酸鈉緩沖液、pH4. 0)、6ml封閉緩沖液，然后將柱在室溫下放置30分鐘。然 后，再次依次向柱中注入6ml洗滌緩沖液、6ml封閉緩沖液、6ml洗滌緩沖液，最后將柱內(nèi)的 緩沖液置換為含0. 15M NaCl的IOmMTris-HCl緩沖液(pH7. 2)。將該柱保存于4°C直至使 用。d)兔抗人Siglec-15多克隆抗體的親和柱純化d-i)親和柱色譜用Millex GV濾器(Millipore Co. , Ltd.生產(chǎn))過濾a)中制備的純化抗人 Siglec-15多克隆抗體(第1、2、3組)各7ml，然后將得到的濾出液以0. 25ml/min的流速 加載至c)中制備的將人Siglec-15-Fc固定其上的柱，所述柱預(yù)先用應(yīng)用緩沖液平衡。用 5ml應(yīng)用緩沖液以0. 25ml/min的流速洗柱后，用5ml含0. 5MNaCl的0. IM鹽酸甘氨酸緩 沖液(PH2.7)以0.25ml/min的流速對吸附在柱上的蛋白進(jìn)行洗脫。用親和柱純化抗人 Siglec-15多克隆抗體(第1、2、3)的色譜圖如圖30所示。以每餾分0. 5ml將洗脫液分餾 在Mini-sorp管(Nunc, Inc.生產(chǎn)制)中，然后立即加入16μ1 IM Tris中和該洗脫液。將 約2. 5ml用鹽酸甘氨酸緩沖液洗脫每種抗體的IgG蛋白餾分(餾分3 7)合并得到的溶 液，加載至預(yù)先用含0. 01% Tween 20的Dulbecco，s磷酸鹽緩沖平衡鹽溶液(T-PBS)平衡 的PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)制)，然后用T-PBS洗脫，由此得到溶 劑置換為T-PBS的3. 5ml樣品。將制備的樣品在_80°C冷凍保存直至使用。d-ii)親和純化的兔抗人Siglec-15多克隆抗體的蛋白濃度的測定對于純化的兔抗人Siglec-15多克隆抗體樣品(從PD-10脫鹽柱洗脫的蛋白餾 分)，將牛IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC-蛋白測定試劑盒BioRad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測定 蛋白濃度。如表9所示，第1 3各組均可制成約9. 1 11. 9mg親和純化的抗人Siglec-15 多克隆抗體。表 9 實施例35.添加兔抗人Siglec-15多克隆抗體對正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞 融合的影響(TRAP染色)將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常人天然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、購自三光純藥、商 品編號2T-110)按照細(xì)胞所附說明書以IXlO4細(xì)胞/孔鋪于96孔板。作為培養(yǎng)基，使用添加了 OPGM補充套裝(破骨細(xì)胞SingleQuot 試劑盒，購自三光純藥、商品編號PT-9501)的 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0ΡΒΜ、購自三光純藥、商品編號PT-8201)，0PGM補充套裝 含有胎牛血清(終濃度10% )、人RANKL (終濃度69ng/ml)以及人M_CSF(終濃度33ng/ml) 等。向得到的培養(yǎng)上清液中添加實施例34的d)中制備的第2組親和純化抗人Siglec-15 抗體使終濃度為3或30 μ g/ml,并添加實施例34的b)中制備的免疫前兔IgG使終濃度 為30μ g/ml，該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后除去上清液，添加10%中性福爾馬 林進(jìn)行細(xì)胞固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗滌該細(xì)胞2次，以100 μ 1/孔添加TRAP染色 液(0. 27mM 萘酚 AS-MX 磷酸(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))、1. 6mM 固紅紫色 LB 鹽(Sigma Co.， Ltd.生產(chǎn))、1%二甲基甲酰胺、50mM酒石酸鈉、0. IM醋酸鈉緩沖液(pH5. 0))，室溫下反應(yīng) 5分鐘。然后用蒸餾水洗滌該細(xì)胞2次，然后顯微鏡下觀察(圖31)。其結(jié)果為，添加抗人 Siglec-15多克隆抗體可顯著抑制高度細(xì)胞融合所致的巨大破骨細(xì)胞的形成。另一方面，添 加免疫前IgG的情形未見這種對破骨細(xì)胞融合的抑制。對于這些固定、染色后的孔，用倒置 顯微鏡對細(xì)胞核數(shù)目在5個或以上的TRAP陽性多核細(xì)胞計數(shù)(圖32)。其結(jié)果為，在添加 了終濃度為30 μ g/ml的第2組親和純化抗人Siglec-15抗體的孔中，觀察到對多核破骨細(xì) 胞形成的顯著抑制。而添加30 μ g/ml免疫前IgG時也可見對多核破骨細(xì)胞形成的抑制傾 向。但與上述孔相比較，顯示添加第2組抗人Siglec-15抗體可顯著抑制多核破骨細(xì)胞的 形成。由此，結(jié)果表明，來自正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的TRAP陽性破骨細(xì)胞的多核化和細(xì) 胞融合，被與Siglec-15特異性結(jié)合的抗體抑制。實施例36.大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對人Siglec-15蛋白的結(jié)合特性評 價通過ELISA法評價大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對人Siglec-15蛋白的結(jié)合 特性。用0. IM碳酸鈉緩沖液(ρΗ9· 5)將實施例32的b)中制備的人Siglec-15-Fc蛋白 稀釋至5 μ g/ml，將得到的溶液以100 μ 1/孔添加于96孔板(NalgeNunc International, Inc.生產(chǎn)、商品編號430341)。該板室溫下放置1小時后除去溶液，以300 μ 1/孔添加洗 滌緩沖液(含有0. 05% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水)，并除去。將該洗滌操作再進(jìn)行 1次后，以200 μ 1/孔添加含25% BlockAce (大日本住友制藥社制)的磷酸鹽緩沖生理鹽 水，該板在室溫下放置1小時以進(jìn)行封閉。除去溶液，以300 μ 1/孔的洗滌緩沖液洗滌2次。 然后用ELISA緩沖液(含12. 5% BlockAce和0. 05% Tween 20的磷酸鹽緩沖生理鹽水) 將實施例24制備的各大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體或者大鼠對照IgG(R&D systems, Inc.生產(chǎn))稀釋至終濃度為1. 28 20，000ng/ml (5倍稀釋系列)，將得到的稀釋抗體溶液 以100 μ 1/孔添加至板中。該板在室溫下放置1小時后除去溶液，用300 μ 1/孔的洗滌緩 沖液洗滌3次。接著以100 μ 1/孔添加用ELISA緩沖液稀釋了 1，000倍的HRP (辣根過氧 化物酶)標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體(BeckmanCoulter，Inc.生產(chǎn))，該板室溫下放置1小 時。除去溶液，用300 μ 1/孔的洗滌緩沖液洗滌該板3次后，使用過氧化酶用顯色試劑盒 (Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.生產(chǎn))，按照試劑盒所附說明書進(jìn)行顯色。顯色后，用酶標(biāo) 儀(日本Nihon Molecular DevicesCorporation生產(chǎn))測定492nm處的吸光度。結(jié)果確 認(rèn)，檢測的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體的10個受試物質(zhì)中，所有抗體均以濃度依賴 性的方式與人Siglec-15蛋白結(jié)合(圖33)。具體來說，結(jié)合活性特別強的是#1A1、#3A1、 #24A1、#32A1、#61A1這5個受試物質(zhì)，而#8A1、#34A1、#39A1這3個受試物質(zhì)的結(jié)合活性較弱。另一方面，大鼠對照IgG中未見與人Siglec-15蛋白的結(jié)合。以上結(jié)果表明，實施 例24制備的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體不僅與小鼠Siglec-15結(jié)合，而且也與人 Siglec-15結(jié)合，此外，發(fā)現(xiàn)一部分抗體與人Siglec-15的結(jié)合活性較強。實施例37.添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的 細(xì)胞融合以及骨吸收活性的影響(體外生物活性評價)既然實施例36中確認(rèn)大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體也與人Siglec-15結(jié)合， 因此檢測這些抗體對人破骨細(xì)胞形成及骨吸收活性的效果。a)添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體對正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的破骨細(xì) 胞融合的影響(TRAP染色)按照細(xì)胞所附說明書，以IX IO4細(xì)胞/孔將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常人天 然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、購自三光純藥、商品編號2T-110)鋪于96孔板。作為培養(yǎng)基，使用添 加了 OPGM補充套裝(破骨細(xì)胞SingleQuot 試劑盒，購自三光純藥、商品編號PT-9501)的 破骨前體細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0ΡΒΜ、購自三光純藥、商品編號PT-8201)，該OPGM補充套裝含 有胎牛血清(終濃度10% )、人RANKL(終濃度66ng/ml)以及人M_CSF(終濃度33ng/ml) 等。在得到的培養(yǎng)上清液中，添加實施例24制備的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體以及 大鼠對照IgG (R&D systems, Inc.生產(chǎn))使終濃度為30 μ g/ml，該細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4天。培養(yǎng)后除去上清液，添加10%中性福爾馬林進(jìn)行細(xì)胞固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗 滌2次，以100 μ 1/孔添加TRAP染色液(0. 27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))、 1.6mM固紅紫色LB鹽(Sigma Co. , Ltd.生產(chǎn))、1%二甲基甲酰胺、50mM酒石酸鈉、0. IM醋 酸鈉緩沖液(PH5.0))，室溫下反應(yīng)5分鐘。然后該細(xì)胞用蒸餾水洗滌2次，顯微鏡下觀察 (圖34)。其結(jié)果為，添加#32A1抗體幾乎完全抑制高度細(xì)胞融合所致的巨大破骨細(xì)胞的形 成。并且，#41B1抗體也顯著抑制高度細(xì)胞融合所致的巨大破骨細(xì)胞的形成。另一方面，除 此之外的其他大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(例如#1A1抗體)以及大鼠對照IgG中 未見這種對破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的顯著抑制。由此結(jié)果表明，來自正常人破骨細(xì)胞前體細(xì) 胞的TRAP陽性破骨細(xì)胞的多核化和細(xì)胞融合，被與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗 體抑制。b)添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1)對正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的 破骨細(xì)胞融合的影響(TRAP染色)按照細(xì)胞所附說明書，以IX IO4細(xì)胞/孔將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常人天 然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、購自三光純藥、商品編號2T-110)鋪于96孔板。作為培養(yǎng)基，使用添 加了 OPGM補充套裝(破骨細(xì)胞SingleQuot 試劑盒，購自三光純藥、商品編號PT-9501)的 破骨前體細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0ΡΒΜ、購自三光純藥、商品編號PT-8201)，該OPGM補充套裝含 有胎牛血清(終濃度10% )、人RANKL (終濃度68. 4ng/ml)以及人M-CSF (終濃度33ng/ml) 等。在得到的培養(yǎng)上清液中添加實施例24制備的大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1 抗體)使終濃度為0.1、0.3、1或3yg/ml，細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后除去上清 液，添加10%中性福爾馬林進(jìn)行細(xì)胞固定。細(xì)胞固定后，用蒸餾水洗滌2次，以100 μ 1/孔 添加TRAP染色液(0. 27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))、1. 6mM固紅紫色LB鹽 (Sigma Co.，Ltd.生產(chǎn))、1%二甲基甲酰胺、50mM酒石酸鈉、0. IM醋酸鈉緩沖液(ρΗ5·0))， 室溫下反應(yīng)5分鐘。然后該細(xì)胞用蒸餾水洗滌2次，顯微鏡下觀察細(xì)胞(圖35)。其結(jié)果為，#32A1抗體在0. 3 μ g/ml至3 μ g/ml的范圍內(nèi)濃度依賴性地抑制TRAP陽性多核破骨細(xì) 胞的形成。c)添加大鼠抗小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1)對正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的 骨吸收活性的影響(使用膠原涂層板的評價)。已知破骨細(xì)胞通過釋放組織蛋白酶K等蛋白酶來降解作為骨組織的構(gòu)成成分的I 型膠原蛋白。破骨細(xì)胞裂解測定試劑盒(L0nza，InC.生產(chǎn)、商品編號PA-1500)提供涂布有 綴合銪的人膠原蛋白的96孔板(96-孔破骨細(xì)胞裂解細(xì)胞培養(yǎng)板)，通過測定同一塊板上 培養(yǎng)破骨細(xì)胞時上清液中游離的熒光膠原蛋白片段量，可以評價體外的破骨細(xì)胞骨吸收活 性。按照細(xì)胞所附說明書，以IXlO4細(xì)胞/孔將正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(正常人 天然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、購自三光純藥、商品編號2T-110)鋪于96-孔破骨細(xì)胞裂解細(xì)胞 培養(yǎng)板。作為培養(yǎng)基，使用添加了 OPGM補充套裝(破骨細(xì)胞SingleQuot 試劑盒，購自三 光純藥、商品編號PT-9501)的破骨前體細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0ΡΒΜ、購自三光純藥、商品編號 PT-8201)，該OPGM補充套裝含有胎牛血清(終濃度10% )、人RANKL (終濃度68. 4ng/ml)以 及人M-CSF(終濃度33ng/ml)等。在得到的培養(yǎng)上清液中添加實施例24制備的大鼠抗小 鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)使終濃度為0. 1、0. 3、1或3 μ g/ml，細(xì)胞在CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)3天。收集10 μ 1培養(yǎng)上清液的等份樣品，添加200 μ 1破骨細(xì)胞裂解測定套裝中 的熒光團(tuán)釋放試劑，通過用熒光板閱讀儀(fluorescence platereader) (ALVO MX、Perkin Elmer Inc.生產(chǎn))測定熒光強度(激發(fā)340nm、發(fā)射615nm)，由此對培養(yǎng)上清液中釋放的 游離熒光膠原蛋白片段量進(jìn)行定量(圖36)。其結(jié)果為，#32A1抗體在0. 3 μ g/ml至3 μ g/ ml的范圍內(nèi)，以濃度依賴的方式抑制添加RANKL所增加的熒光膠原蛋白片段量。由此表明， 人破骨細(xì)胞的骨吸收活性被與Siglec-15蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體抑制。實施例38.小鼠抗人Siglec-15單克隆抗體的制備可通過以下工序來制備抗人Siglec-15抗體。(1)免疫對4 10周齡雌性BALB/c小鼠腹腔內(nèi)給予實施例30至32中獲得的可溶性人 Siglec-15蛋白。2周后腹腔內(nèi)給予同樣的膜組分溶液以加強免疫。(2)細(xì)胞融合加強免疫3天后取出小鼠脾臟，將其放入無血清培養(yǎng)基，在網(wǎng)篩(mesh)上用壓舌 板(spatula)研碎。對通過網(wǎng)篩的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心以使脾臟細(xì)胞沉淀。另一方面，以相同的方式用無血清培養(yǎng)基洗滌并混懸骨髓瘤細(xì)胞NSl (American Type Culture Collection TIB-18)。按照常規(guī)方法用得到的表達(dá)Siglec-15的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。(3)篩選產(chǎn)生抗人Siglec-15抗體的融合細(xì)胞，可通過使用細(xì)胞ELISA的方法和使用流式 細(xì)胞儀的方法進(jìn)行篩選。(4)克隆對上述(3)篩選的一組細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行5次包括(3)所述的使用細(xì)胞ELISA的方 法和流式細(xì)胞儀的方法的一系列操作，可得到多個能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞的克隆，
67該單一抗體與表達(dá)人Siglec-15的細(xì)胞結(jié)合，但不與轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞結(jié)合。(5)抗體的純化對經(jīng)過(1)至(4)步驟制備的小鼠-小鼠雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集得到的上清 液。對得到的上清液進(jìn)行收集并透析后，用高效液相色譜儀進(jìn)行抗體的部分純化。通過使 用人Siglec-15蛋白的ELISA法對色譜的各餾分中的抗人Siglec-15抗體滴度進(jìn)行測定。 收集抗體滴度高的餾分，用于抗體親和純化柱。用柱平衡緩沖液洗滌柱內(nèi)后，抗體用柱洗脫 緩沖液洗脫。洗脫結(jié)束后立即將各洗脫液加入離心超濾器的上部進(jìn)行離心。除去濾器下部 收集的濾液后，在上部加入PBS，洗滌5次。將濾器上部殘留的溶液作為抗人Siglec-15抗 體樣品。實施例39.大鼠抗人Siglec-15單克隆抗體的制備根據(jù)實施例23以及24所述的方法，使用實施例30至32中獲得的可溶性人 Siglec-15蛋白，可制備大鼠抗人Siglec-15單克隆抗體。實施例40.抗人Siglec-15單克隆抗體對破骨細(xì)胞分化的影響使用實施例38或39得到的抗人Siglec-15單克隆抗體，可檢驗該抗體對破骨細(xì) 胞形成的抑制效應(yīng)。為了檢驗對小鼠破骨細(xì)胞形成的效應(yīng)，可采用實施例17、19、20、21、22、 或26的方法。為了檢驗對人破骨細(xì)胞形成的抑制效果，可采用實施例35或37的方法。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的抗Siglec-15抗體具有對破骨細(xì)胞分化或骨吸收活性的抑制作用，并且 含有該抗Siglec-15抗體的藥物組合物可為骨代謝異常疾病的治療劑或預(yù)防劑。
權(quán)利要求
抗體或該抗體的功能性片段，其特異性地識別由以下的(a)至(i)中任一項所述的氨基酸序列構(gòu)成的一個或多個的多肽，并抑制破骨細(xì)胞的形成和/或破骨細(xì)胞性的骨吸收(a)序列表中的SEQ ID NO2表示的氨基酸序列；(b)由序列表中的SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328位構(gòu)成的氨基酸序列；(c)由序列表中的SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第260位構(gòu)成的氨基酸序列；(d)由序列表中的SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第260位的構(gòu)成的氨基酸序列；(e)序列表中的SEQ ID NO4表示的氨基酸序列；(f)由序列表中的SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第341位構(gòu)成的氨基酸序列；(g)由序列表中的SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第258位構(gòu)成的氨基酸序列；(h)由序列表中的SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第258位構(gòu)成的氨基酸序列；(i)包括(a)至(h)中所述的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.抗體或該抗體的功能性片段，其特異性地識別由以下的(j)至(η)中任一項所述的 核苷酸序列編碼的氨基酸序列構(gòu)成的一個或多個的多肽，并抑制破骨細(xì)胞的形成和/或破 骨細(xì)胞性的骨吸收(j) SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；(k)SEQ ID NO :3表示的核苷酸序列；(I)SEQ ID NO :19表示的核苷酸序列；(m)SEQ ID NO :43表示的核苷酸序列；(η)具有與包含與(j)至(m)中記載的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴(yán) 格條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或該抗體的功能性片段，其抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞融 合過程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其抑制由TNF-α 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在30μ g/ml或 以下的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在3μ g/ml或以下的濃度下 抑制體外破骨細(xì)胞形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在1μ g/ml或以下的濃度下 抑制體外破骨細(xì)胞形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在63ng/ml至1μ g/ml的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其抑制破骨細(xì)胞 性的骨吸收。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在3μg/ml或以下的濃度下 抑制體外破骨細(xì)胞性的骨吸收。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或該抗體的功能性片段，其在0.3 μ g/ml至3 μ g/ml 的濃度下抑制體外破骨細(xì)胞性的骨吸收。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或該抗體功能性片段，其通過包括以下 的步驟1)和2)的方法得到1)制備特異性識別一個或多個多肽的抗體的步驟，所述多肽包含以下(a)至(i)中任 一項所述的氨基酸序列(a)序列表中的SEQID NO 2表示的氨基酸序列；(b)由序列表中的SEQID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第328位 構(gòu)成的氨基酸序列；(c)由序列表中的SEQID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第260位構(gòu) 成的氨基酸序列；(d)由序列表中的SEQID NO :2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第260位 構(gòu)成的氨基酸序列；(e)序列表中的SEQID NO 4表示的氨基酸序列；(f)由序列表中的SEQID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第341位 構(gòu)成的氨基酸序列；(g)由序列表中的SEQID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第1位至第258位構(gòu) 成的氨基酸序列；(h)由序列表中的SEQID NO :4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基第21位至第258位 構(gòu)成的氨基酸序列；(i)包括(a)至(h)中所述的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加 的氨基酸序列；以及2)篩選顯示破骨細(xì)胞形成抑制活性和/或骨吸收抑制活性的抗體的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或該抗體功能性片段，其通過包括以下 的步驟1)和2)的方法得到1)制備特異性識別一個或多個的多肽的抗體的步驟，所述多肽由以下(j)至(η)中任 一項所記載的核苷酸序列編碼的氨基酸序列構(gòu)成(j) SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；(k)SEQ ID NO 3表示的核苷酸序列；(I)SEQ ID NO 19表示的核苷酸序列；(m)SEQ ID NO 43表示的核苷酸序列；(η)具有與包含與(j)至(m)中記載的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴(yán) 格條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸的核苷酸序列；2)篩選顯示破骨細(xì)胞形成抑制活性和/或骨吸收抑制活性的抗體的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求(1)至(13)中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在 于，所述抗體為單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，具有與雜交瘤 #32A1 (FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體相同的表位特異性。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其與雜交瘤 #32A1 (FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體競爭。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所述抗體為雜 交瘤#32A1(FERM BP-10999)產(chǎn)生的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，具有與雜交瘤 #4IBl (FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體相同的表位特異性。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，其與雜交瘤 #4IBl (FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體競爭。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所述抗體為雜 交瘤#41B1(FERM BP-11000)產(chǎn)生的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為嵌合抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為人源化的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-16、18或19中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征 在于，所述抗體為人抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗體或該抗體的功能性片段，其特征在于，所 述抗體為IgG抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中所述的抗體的功能性片段，其選自Fab、F(ab，)2、Fab，以 及Fv。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至16、18、或19中任一項所述的抗體，其特征在于，其為scFv。
27.藥物組合物，其特征在于，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至26中所述的抗體或該抗體的功 能性片段的至少一種。
28.根據(jù)權(quán)利要求27中所述的藥物組合物，其特征在于，其為骨代謝異常的治療劑和/ 或預(yù)防劑。
29.治療和/或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，其特征在于，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至 26中所述的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種，以及選自二膦酸鹽、活性維生素D3、降 鈣素及其衍生物、如雌二醇的激素制劑、SERMs (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維 生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF受 體制劑、抗TNF-α抗體或該抗體的功能性片段、抗PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或 該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能性片段、抗RANKL 抗體或該抗體的功能性片段以及OCIF(破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子)的至少一種。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的藥物組合物，其中所述骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤以及癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破 壞、巨細(xì)胞瘤、牙周炎導(dǎo)致的牙齒缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、佩吉特骨病、腎病性骨營養(yǎng)不良以及成骨不全。
31.根據(jù)權(quán)利要求30中所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松 癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
32.根據(jù)權(quán)利要求31中所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨 質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治療用藥劑而導(dǎo)致的繼發(fā) 性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
33.骨代謝異常的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，給予根據(jù)權(quán)利要求1至26中所述 的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種。
34.骨代謝異常的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，同時或連續(xù)給予根據(jù)權(quán)利要求1 至26中所述的抗體或該抗體的功能性片段的至少一種，以及選自二膦酸鹽、活性維生素D3、 降鈣素及其衍生物、如雌二醇的激素制劑、SERMs (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、 維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH(甲狀旁腺激素)制劑、非留體類抗炎藥、可溶性TNF 受體制劑、抗TNFa抗體或該抗體的功能性片段、抗PTHrP(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗 體或該抗體的功能性片段、IL-I受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體的功能性片段、抗 RANKL抗體或該抗體的功能性片段以及OCIF(破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子)的至少一種。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34中所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，所述骨代謝異 常為骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35中所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松癥為絕 經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用類固醇以及免疫抑制劑等治療用藥劑而導(dǎo)致 的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
37.雜交瘤#32A1 (FERM BP-10999)。
38.雜交瘤#41B1 (FERM BP-11000)。
全文摘要
提供使用在破骨細(xì)胞中強表達(dá)的基因的骨代謝異常的檢測方法、具有骨代謝異常治療和/或預(yù)防效果的化合物的篩選方法、以及治療和/或預(yù)防骨代謝異常的醫(yī)藥組合物。提供以人Siglec-15基因的表達(dá)為指標(biāo)的骨代謝異常的檢測方法，以及提供包含具有特異性識別人Siglec-15，并抑制破骨細(xì)胞形成的活性的抗體的藥物組合物等。
文檔編號A61K38/23GK101896501SQ20088011044
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者晝間由晴, 津田英資 申請人:第一三共株式會社