專利名稱：：輪狀病毒的熱滅活的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明主要涉及輪狀病毒組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及熱滅活輪狀病毒的方法和滅活輪狀病毒疫苗組合物。
背景技術：
：在多種引起兒童嚴重腹瀉的腸道病原性病毒中，輪狀病毒是最常見的，它導致每年平均611，000例死亡。幾乎所有兒童在5歲前都會被輪狀病毒感染。所述病毒被認為是高度傳染性的，并被描述為“平等”病毒，因為其感染的影響沒有特別的社會經濟或地理群的差異。盡管大部分兒童能夠獲得足夠的支持性和緩解性醫(yī)療護理，挺過感染而不出現(xiàn)嚴重的長期后果，然而與嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和休克有關的死亡數(shù)目是不可接受的并在可能的情況下需要預防性治療。針對輪狀病毒介導的疾病所進行的接種是一種解決這種重大健康問題的方案。目前，盡管已經開發(fā)和授權了活的口服疫苗，然而對安全性和效力的持續(xù)關注支持用滅活輪狀病毒疫苗進行腸胃外接種的替代方法。缺少滅活輪狀病毒的有效方法和包含滅活輪狀病毒的疫苗組合物。具體的困難為處理活的輪狀病毒以在將其滅活的同時保持抗原性，所述抗原性與基本完整的雙層和三層輪狀病毒粒子相關。對于滅活輪狀病毒的有效方法和包含滅活輪狀病毒的組合物有著持續(xù)的需要。
發(fā)明內容本發(fā)明的實施方案提供包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物，所述滅活輪狀病毒的特征在于具有基本完整的三層輪狀病毒粒子結構。疫苗組合物任選地包含一種佐劑如A10H。此外，任選地，本發(fā)明的疫苗組合物被制成用于腸胃外給予受試者的劑型。本發(fā)明的疫苗組合物中所包含的熱滅活輪狀病毒是任何人或動物輪狀病毒，包括A、B、C、D、E、F和G型輪狀病毒的任一種。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括給予所述受試者治療有效量的包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物。熱滅活輪狀病毒的特征在于具有基本完整的輪狀病毒粒子結構。本發(fā)明的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括對哺乳動物或鳥類受試者給藥。在具體實施方案中，所述受試者為人。本發(fā)明的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括給予熱滅活的人或動物輪狀病毒，包括A、B、C、D、E、F和G型輪狀病毒中的任一種。給予包含熱滅輪狀病毒的疫苗組合物從而針對輪狀病毒對受試者進行接種，可通過任何合適的途徑完成。在具體實施方案中，通過腸胃外途徑將所述疫苗組合物給予所述受試者。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括給予所述受試者至少兩劑所述疫苗組合物。本發(fā)明的實施方案提供滅活輪狀病毒的方法，尤其是用于對受試者進行接種的滅活輪狀病毒的方法。具體方法包括將分離的輪狀病毒粒子懸浮在水性緩沖液中，所述水性緩沖液的摩爾滲透壓濃度為約200-500m0sm，包含至少一種濃度為約lmM-15mM的二價陽離子的鹽以及量為約1-20%w/v的糖和/或糖醇，以得到具有完整輪狀病毒粒子結構的輪狀病毒制劑粒子的起始制劑。將所述輪狀病毒粒子的起始制劑置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下孵育足夠長的時間以使輪狀病毒不能復制或感染，從而得到熱滅活輪狀病毒制劑，所述制劑具有抗原性并基本保持起始制劑的完整輪狀病毒粒子結構。所述輪狀病毒粒子的起始制劑可為雙層輪狀病毒粒子、三層輪狀病毒粒子，或雙層輪狀病毒粒子和三層輪狀病毒粒子的混合物。所述孵育時間為約10分鐘-24小時，包括10分鐘和24小時。任選地，所述孵育時間為約30分鐘-10小時，包括30分鐘和10小時；在具體實施方案中，所述孵育時間為約1-3小時，包括1小時和3小時。在另一個備選方案中，將所述分離的輪狀病毒粒子過濾，然后將輪狀病毒粒子的起始制劑置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下。在本發(fā)明方法的具體實施方案中，將輪狀病毒粒子的所述起始制劑置于約55°C-70°C的溫度下孵育所述時間。在優(yōu)選實施方案中，將所述輪狀病毒粒子的起始制劑置于約58°C_67°C、包括58°C和67°C的溫度下孵育所述時間。任選地，輪狀病毒的熱滅活包括第一孵育期和第二孵育期，其中將輪狀病毒粒子的起始制劑置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下。在這一實施方案中，所述第一孵育期和第二孵育期總共為約10分鐘-24小時，包括10分鐘和24小時。熱滅活輪狀病毒制劑基本保持所述起始制劑的完整輪狀病毒粒子結構，并且所述熱滅活輪狀病毒制劑的特征在于，基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量與存在與于所述起始制劑中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量基本相似。在所述起始制劑包括三層輪狀病毒粒子的情況下，所述熱滅活輪狀病毒制劑的特征在于，基本完整的病毒蛋白VPl、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量與存在于所述起始制劑中的基本完整的病毒蛋白VPl、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。本發(fā)明滅活輪狀病毒的方法適用于輪狀病毒，包括例如人輪狀病毒、猴輪狀病毒、牛輪狀病毒、兔輪狀病毒、豬輪狀病毒、馬輪狀病毒、狗輪狀病毒、山羊輪狀病毒、鳥類輪狀病毒和鼠科輪狀病毒。此外，本發(fā)明滅活輪狀病毒的方法適用于輪狀病毒，包括例如A、B、C、D、E、F和G型輪狀病毒。圖IA是用磷鎢酸染色的活的經純化猴輪狀病毒的電子顯微照片的復本，所述病毒的特征在于具有三層結構；圖IB是用磷鎢酸染色的根據(jù)一個本發(fā)明方法的實施方案熱滅活的猴輪狀病毒的電子顯微照片的復本，所述病毒的特征在于具有三層結構；圖2A是考馬斯亮藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的數(shù)字圖像的復本，其示出了泳道1中的分子量標記(千道爾頓)、泳道2中的從活的輪狀病毒分離的蛋白和泳道3中的從熱滅活輪狀病毒分離的蛋白；圖2B是免疫印跡的數(shù)字圖像的復本，其示出了泳道1中的從活的輪狀病毒分離的兔抗輪狀病毒免疫反應性蛋白和泳道2中的從熱滅活輪狀病毒分離的兔抗輪狀病毒免疫反應性蛋白；圖3A示出了對熱滅活輪狀病毒的總血清抗體反應；圖3B示出了對熱滅活輪狀病毒的中和抗體反應；圖4A示出了對包含A10H和熱滅活輪狀病毒的組合物的總血清抗體反應；圖4B示出了對包含A10H和熱滅活輪狀病毒的組合物的中和抗體反應；圖5A是純化的活的人輪狀病毒的電子顯微照片的復本；圖5B是純化的熱殺死的人輪狀病毒的電子顯微照片的復本，所述病毒具有與所述起始制劑基本相同的形態(tài)，所述起始制劑的樣品示于圖5A；圖6A是考馬斯亮藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的數(shù)字圖像的復本，其示出了泳道1中的分子量標記(千道爾頓)、泳道2和4中的從活的輪狀病毒分離的蛋白以及泳道3和5中的從熱滅活輪狀病毒分離的蛋白；圖6B是免疫印跡的數(shù)字圖像的復本，其示出了泳道1中的分子量標記(千道爾頓)、泳道2中的從活的輪狀病毒分離的小鼠抗輪狀病毒免疫反應性蛋白VP5和泳道3中的從熱滅活輪狀病毒分離的小鼠抗輪狀病毒免疫反應性蛋白VP5或其聚集體；圖7示出了對活的輪狀病毒(TLPorg)和熱殺死的輪狀病毒(60C2h)的VP5的酶免疫測定(EIA)結果，表明這兩種制劑含有相似水平的VP5蛋白；圖8A示出了用無抗原的750ugA1P04接種的4只小豬的糞便樣品的病毒脫落(virusshedding)；圖8B示出了用無佐劑的熱滅活輪狀病毒免疫的小豬的糞便樣品的病毒脫落；圖8C示出了用熱滅活輪狀病毒和佐劑免疫的小豬的糞便樣品的病毒脫落；圖8D示出了在只用緩沖液免疫的小豬的糞便樣品中測量的病毒脫落；圖9示出了與以安慰劑對照組(GG)接種的受試者相比，用熱滅活輪狀病毒(HH)接種的受試者中輪狀病毒脫落的天數(shù)減少。具體實施例方式本發(fā)明提供熱滅活輪狀病毒的方法和包含熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物。概略地說，根據(jù)本發(fā)明的方法，選擇加熱輪狀病毒粒子的溫度和在該溫度下孵育輪狀病毒的時間的組合，從而有效地使輪狀病毒滅活，同時保持輪狀病毒抗原性并保持基本完整的輪狀病毒粒子結構。術語“被殺死的輪狀病毒”、“失活的輪狀病毒”和“被滅活的輪狀病毒”是指經熱處理并且在活的輪狀病毒能夠復制和/或感染細胞的條件下不能復制或感染的輪狀病毒。輪狀病毒粒子結構是本領域熟知的。術語“三層，，是指輪狀病毒粒子具有三個同心的衣殼層。術語“雙層”是指輪狀病毒粒子失去最外面的衣殼層而保留中間和最內部的衣殼層。術語“抗原”是指能在受試者中引發(fā)免疫反應尤其是保護性免疫反應的物質。滅活輪狀病毒的方法包括將輪狀病毒置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下孵育足夠長的時間以使所述輪狀病毒滅活，但保持輪狀病毒抗原性并保持基本完整的輪狀病毒粒子結構。在其他實施方案中，滅活輪狀病毒的方法包括將輪狀病毒置于約55°C-70°C、包括55°C和70°C的溫度下孵育足夠長的時間以使所述輪狀病毒滅活，但保持輪狀病毒抗原性并保持基本完整的輪狀病毒粒子結構。在一個具體實施方案中，滅活輪狀病毒的方法包括將輪狀病毒置于約58°C_67°C、包括58°C和67°C的溫度下孵育足夠長的時間以使所述輪狀病毒滅活。所滅活的輪狀病毒具有抗原性并保持基本完整的輪狀病毒粒子結構。將輪狀病毒置于選定溫度下的孵育時間為約10分鐘-24小時，包括10分鐘和24小時。在本發(fā)明方法的其他實施方案中，將輪狀病毒置于選定溫度下的孵育時間為約30分鐘-10小時，包括30分鐘和10小時。在本發(fā)明方法的另一些實施方案中，將輪狀病毒置于選定溫度下的孵育時間為約1-3小時，包括1小時和3小時。本發(fā)明滅活輪狀病毒的方法適用于輪狀病毒，包括例如人輪狀病毒、猿輪狀病毒、牛輪狀病毒、兔輪狀病毒、豬輪狀病毒、馬輪狀病毒、狗輪狀病毒、山羊輪狀病毒、鳥類輪狀病毒和鼠科輪狀病毒。此外，本發(fā)明滅活輪狀病毒的方法適用于輪狀病毒，包括例如A、B、C、D、E、F和G型輪狀病毒。通過本發(fā)明的方法滅活的輪狀病毒保持活的輪狀病毒的特性。具體地，在通過在選定溫度下孵育選定時間將三層輪狀病毒滅活的情況下，所述滅活的輪狀病毒粒子保持基本完整的三層輪狀病毒粒子結構。當通過在選定溫度下孵育選定時間將雙層輪狀病毒滅活時，所述滅活的輪狀病毒粒子保持基本完整的雙層輪狀病毒粒子結構。待熱滅活的輪狀病毒粒子的起始制劑任選地包括雙層和三層輪狀病毒粒子。熱滅活之后，所得到的熱滅活輪狀病毒粒子的制劑包含與所述起始制劑基本相似的雙層和三層輪狀病毒粒子的比例。此外，通過本發(fā)明方法滅活的輪狀病毒在病毒蛋白的量和完整性方面與活的輪狀病毒基本相似。具體地，根據(jù)本發(fā)明方法的實施方案熱滅活的輪狀病毒保持一種或多種基本完整的存在于活的輪狀病毒中的病毒蛋白的量基本不變。例如，根據(jù)本發(fā)明方法得到的熱滅活輪狀病毒制劑的特征在于基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量與存在于所述起始制劑中基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。因此，在通過本發(fā)明方法將包括三層輪狀病毒，也可包括雙層輪狀病毒的輪狀病毒起始制劑熱滅活的情況下，所得到的熱滅活輪狀病毒粒子制劑所保持的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量與存在于活的輪狀病毒中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。優(yōu)選地在過濾輪狀病毒粒子之后，加熱所述輪狀病毒粒子以滅活所述粒子。在一個優(yōu)選的備選方式中，使用孔徑為約0.2-0.8微米的過濾器過濾輪狀病毒粒子。并非希望囿于理論思考，過濾被認為減少或消除了輪狀病毒粒子的聚集物，從而使得熱滅活更加有效。在本發(fā)明的滅活輪狀病毒方法的具體實施方案中，在孵育過程中例如通過攪拌搖動粒子對使熱量均勻分配到輪狀病毒粒子上是有利的。在本發(fā)明的具體實施方案中，將輪狀病毒粒子置于第一個容器中孵育第一段時間，然后將輪狀病毒粒子轉移到第二個容器中孵育第二段時間。用于根據(jù)本發(fā)明方法熱滅活的輪狀病毒的起始制劑是根據(jù)標準方法制備的。例如，通常用輪狀病毒對相容的細胞類型進行接種并將所述細胞保持在允許病毒復制和產生感染粒子的條件下。允許輪狀病毒感染、復制和產生粒子的細胞類型的一個具體實例為哺乳動物細胞系如非洲綠猴腎細胞系。術語“分離的輪狀病毒粒子”是指從輪狀病毒粒子通常所在的環(huán)境中分離出的輪狀病毒粒子，所述環(huán)境為例如生物體、細胞、培養(yǎng)細胞上清液和諸如糞便或下水道污物的廢棄物。通常從細胞培養(yǎng)上清液中收集輪狀病毒粒子用于進行熱滅活。所述輪狀病毒粒子可從細胞培養(yǎng)上清液中通過例如過濾和/或離心而分離。在一個具體的實例中，將分離的輪狀病毒重懸浮于稀釋緩沖液中并置于約500C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下孵育足夠長的時間以使所述輪狀病毒滅活。用于懸浮分離的輪狀病毒粒子的稀釋緩沖液是水性緩沖液，尤其是pH保持在5-9的水性緩沖液，例如但不限于，磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、乙酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、馬來酸鹽緩沖液、PIPES緩沖液、MOPS緩沖液、MOPSO緩沖液或組氨酸緩沖液。在優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的稀釋緩沖液的摩爾滲透壓濃度為約200-500m0sm，優(yōu)選為約225_450m0sm，更優(yōu)選為約250_350m0sm。稀釋緩沖液中包含至少一種二價陽離子的鹽，包括但不限于CaCl2、MgCl2和MgS04。所述稀釋緩沖液中包含至少一種濃度為約lmM-15mM的二價陽離子的鹽。所述稀釋緩沖液中優(yōu)選地包含病毒粒子穩(wěn)定劑。在具體實施方案中，病毒粒子穩(wěn)定劑是糖如單糖和/或二糖，或糖醇。所述稀釋緩沖液中包含一種或多種糖和/或糖醇以使所述糖和/或糖醇的總濃度達到約1-20%w/Vo糖或糖醇的實例包括但不限于，山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖。在某些實施方案中，用于輪狀病毒熱滅活方法中的稀釋緩沖液基本不含氨基酸。在其他實施方案中，用于輪狀病毒熱滅活方法中的稀釋緩沖液基本不含維生素。任選地，用于輪狀病毒熱滅活方法中的稀釋緩沖液基本不含氨基酸和維生素。在本發(fā)明的實施方案中，用于輪狀病毒熱滅活方法中的稀釋緩沖液含有濃度為約200-2000mg/L的NaHC03。在其他實施方案中，用于輪狀病毒熱滅活方法中的稀釋緩沖液含有濃度為約300-500mg/L的NaHCO3。在一個具體的實例中，稀釋緩沖液為含有1.3mMCaCl2、0.5mMMgCljnO.4mMMgSO4的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)，并添加有10%的山梨糖醇。滅活后，任選地將分離的輪狀病毒粒子凍干，例如用于以后重懸浮于藥學可接受的載體中。本發(fā)明的實施方案提供包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物，所述滅活輪狀病毒的特征在于具體基本完整的三層輪狀病毒粒子結構。在其他實施方案中，本發(fā)明的實施方案提供包含具有基本完整的三層輪狀病毒粒子結構和基本完整的雙層輪狀病毒粒子結構的疫苗組合物。本文所用的術語“疫苗組合物”是指包含熱滅活輪狀病毒的組合物，所述熱滅活輪狀病毒能夠在用所述疫苗組合物接種的受試者中誘導免疫反應。在一個具體的實施方案中，包含熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物刺激產生抗所述熱滅活輪狀病毒的中和抗體。疫苗組合物優(yōu)選地包括藥學可接受的載體。術語“藥學可接受的載體”是指對受試者基本無毒并且基本不與疫苗組合物中所包含的熱滅活輪狀病毒反應的載體。藥學可接受的載體為固體、液體或凝膠形式并通常為無菌和無熱原的。本發(fā)明的疫苗組合物可以適于給予受試者的任何形式存在。疫苗組合物通過任何合適的給藥途徑給藥，所述途徑包括口服和腸胃外途徑如皮內、肌內、粘膜、經鼻或皮下給藥途徑。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物通過腸胃外途徑給藥。用于腸胃外給藥的疫苗組合物可被配制為包含熱滅活輪狀病毒和藥學可接受載體的可注射液體。合適的水性和非水載體的實例包括水、乙醇、多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等，以及它們合適的混合物；植物油如橄欖油；以及可注射有機酯如油酸乙酯。例如可通過使用包衣如卵磷脂，通過保持分散相所需的粒徑，和/或通過使用表面活性劑如十二烷基硫酸鈉來保持合適的流動性。任選地包含穩(wěn)定劑如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化劑。用于給藥或者用于在給藥前懸浮于液體中的固體劑型包括例如膠囊劑、片劑、粉劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，將輪狀病毒與以下成分混合至少一種載體，所述載體包括緩沖劑如檸檬酸鈉或堿金屬磷酸鹽，所述堿金屬磷酸鹽包括例如磷酸鈉、磷酸鉀和磷酸鈣；填充劑如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；粘合劑如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；保濕劑如甘油；崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、植物淀粉如馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些復合硅酸鹽和碳酸鈉；溶液緩聚劑如石蠟；吸收加速劑如季銨化合物；潤濕劑如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯和乙二醇；吸附劑如高嶺土和膨潤土；潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇或月桂基磺酸鈉；防腐劑如抗細菌劑和抗真菌劑，包括例如山梨酸、慶大霉素和苯酚；以及穩(wěn)定劑如蔗糖EDTA、EGTA和抗氧化劑。固體劑型任選地包含包衣如腸溶衣。所述腸溶衣通常為聚合材料。優(yōu)選的腸溶衣材料的特征在于為可生物蝕解的、可逐漸水解的和/或可逐漸溶于水的聚合物。用于固體劑型的包衣材料的量通常決定服藥和藥物釋放之間的時間間隔。使用的包衣具有一個厚度，使得整個包衣不溶解在與胃酸有關的PH小于3的胃腸液中，而溶解在pH大于3的小腸環(huán)境中。可以預期，在實施本發(fā)明的過程中，任何具有PH依賴性的溶解性特征的陰離子聚合物都可容易地作為腸溶衣，以實現(xiàn)將所述活性物質遞送到下胃腸道中。具體腸溶衣材料的選擇倚賴于以下性質，例如，對胃中分解的抗性；在胃中對胃液和活性物質擴散的不滲透性；在目標腸位置消散的能力；儲存過程中的物理和化學穩(wěn)定性；無毒性；以及易用性。合適的腸溶衣材料包括，例如，纖維素聚合物如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、偏苯三酸9乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；丙烯酸聚合物和共聚物，優(yōu)選地由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸銨、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙酯形成；乙烯基聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、鄰苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；蟲膠；以及它們的組合。一種具體的腸溶衣材料包括例如美國專利No.6，136，345所述的丙烯酸聚合物和共聚物。所述腸溶衣任選地包含增塑劑以防止形成可使胃液滲入所述固體劑型的孔和裂縫。合適的增塑劑包括，例如，檸檬酸三乙酯(Citroflex2)、三醋精(三醋酸甘油酯)、乙酰檸檬酸三乙酯(CitroflecA2)、CarbOWax400(聚乙二醇400)、鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三丁酯、乙?；视鸵凰狨?、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和鄰苯二甲酸二丁酯。具體地，由陰離子羧基丙烯酸聚合物構成的包衣通常含有大約10-25襯％增塑劑，尤其是鄰苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、檸檬酸三乙酯和三醋精。所述包衣也可含有其他包衣賦形劑如防粘劑、消泡劑、潤滑劑(如硬脂酸鎂)和穩(wěn)定劑(如羥丙基纖維素，酸或堿)以溶解或分散所述包衣材料并且改善包衣性能和所包覆的產品。用于口服給藥的液體劑型包含熱滅活輪狀病毒和被制成乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酏劑的藥學可接受的載體。本發(fā)明的疫苗組合物的液體劑型可包括潤濕劑、乳化劑、助懸齊U、增甜劑、調味劑或芳香劑。關于用于制備劑型的常規(guī)組分、設備和方法的詳細信息參見PharmaceuticalDosageForms:Tablets，eds.H.A.Liebermanetal.，NewYork:MarcelDekker,Inc.，1989；L.V.Allen，Jr.etal.，Ansel'sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,8thEd.，Philadelphia，PA:Lippincott，Williams&Wilkins,2004；A.R.Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,LippincottWilliams&Wilkins,20thed.，2003；禾口J.G.Hardmanetal.，Goodman&Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-HillProfessional，IOthed.，2001o本發(fā)明實施方案的疫苗組合物中任選地包含佐劑。本文所用的術語“佐劑，，是指增強受試者對抗原的免疫反應而基本無不良反應的物質。佐劑為本領域所知曉，并且包括例如Freund佐劑、氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁、氧化鐵、皂角甙、葡聚糖如DEAE-葡聚糖，植物油(如花生油、橄欖油和/或維生素E醋酸酯)、礦物油、細菌脂多糖、肽聚糖和蛋白聚糖。本發(fā)明的實施方案提供針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，包括給予所述受試者治療有效量的包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物，所述熱滅活輪狀病毒的特征在于具有基本完整的三層和/或雙層輪狀病毒粒子結構。本文所用的術語“治療有效量”是指一個可有效地誘導免疫反應并賦予保護性免疫力以預防或改善輪狀病毒介導的疾病的體征或癥狀的量。在受試者中誘導保護性免疫反應可通過多種本領域所知技術中的任何技術確定，所述技術包括例如抗輪狀病毒抗體的檢測、抗輪狀病毒抗體滴度的測量和/或淋巴細胞增殖測定?？杀O(jiān)測輪狀病毒介導的疾病的體征和癥狀以檢測受試者中本發(fā)明疫苗組合物給藥所誘導的免疫反應。例如，免疫反應的誘導可通過輪狀病毒介導的疾病的臨床體征和癥狀的減輕來檢測，例如糞便中病毒脫落量的下降、病毒脫落在糞便中的天數(shù)的減少、受試者腹瀉的天數(shù)的減少、死亡率的下降、發(fā)病率的下降、體重減少的下降或體重增加。在具體實施方案中，給予本發(fā)明方法的疫苗組合物包括一次性給予受試者一劑或多劑疫苗組合物?；蛘撸g隔地給予兩劑或多劑疫苗組合物。給予疫苗組合物藥劑的合適方案倚賴若干因素，包括例如受試者的年齡和健康程度，所用的疫苗組合物的類型和給藥途徑。本領域技術人員能夠容易地確定用于給予具體受試者的給藥劑量和方案。根據(jù)本發(fā)明的實施方案的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括給予所述受試者至少兩劑所述疫苗組合物。盡管所用術語“受試者”在本申請中主要指人，然而應理解，根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案也可給非人動物接種，所述非人動物包括例如牛、馬、綿羊、山羊、豬、狗、貓、鳥類、家禽和嚙齒動物。因此，根據(jù)本發(fā)明的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法包括對哺乳動物或鳥類受試者給藥。在具體實施方式中，所述受試者為人。以下實施例舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的實施方案。提供這些實施例是出于說明的目的，而不應被認作對本發(fā)明組合物和方法的范圍的限制。實施例實施例1將非洲綠猴腎細胞在添加有5%胎牛血清(InvitrogenCorporation,GrandIsland,NY)和50μg/ml新霉素(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation,GrandIsland,NY)中培養(yǎng)。將轉瓶(rollerbottle)中單層匯合的非洲綠猴腎細胞用猴輪狀病毒YK-I感染，感染復數(shù)為0.1。YK-I是一種新近分離的具有P[3]，G3特異性的輪狀病毒毒株，如Virol.J.,3:40,2006所述。在感染后4天收集感染的培養(yǎng)物。實施例2通過以下方式從上清液中純化利用溶于三層輪狀病毒粒子使用SW32Ti轉頭通過TNC緩沖液(IOmMTristpH8.0],140mMNaCl,IOmMCaCl2)中的40%蔗糖墊層以106，750g離心2小時，然后使用SW40Ti轉頭通過在CsCl梯度中以111，160g等密度離心17小時。將純化的病毒粒子重懸浮于稀釋緩沖液中進行熱滅活，所述稀釋緩沖液為含有1.3mMCaCl2、0.5mMMgCl2和0.4mMMgSO4并添加有10%的山梨糖醇的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)。實施例3將純化的病毒粒子重懸浮于含有CaCl2和MgCl2(Invitrogen)并添加有10%山梨糖醇(Sigma)的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)中，并儲存在_70°C下直至進行熱滅活和注射到受試者中。將純化的三層輪狀病毒粒子用稀釋緩沖液稀釋至300μg/ml的濃度并使用MiIlex-HVPVDFSyringe驅動過濾裝置(0.45微米；MilliporeCorporation，Bedford,ΜΑ)過濾除菌。為熱滅活輪狀病毒，將病毒粒子置于3.6ml的凍存管(NalgeNunc，Rochester,NY)中并在60"C的循環(huán)水水浴(型號為NesLabExlO；ThermoElectronCorporation,Newington,NH)中孵育1小時，然后轉移到另一個新管中并在60°C下再孵育1小時。立即取一小份等分試樣檢測任何殘留的感染性，將剩余的儲存在-70°C下直至用于給受試者免疫。實施例4將熱處理的輪狀病毒懸浮液接種到轉管(rollertube)中的單層非洲綠猴腎細胞中并在37°C下在滾動設備中孵育7天，以檢測滅活效果。然后將感染的細胞培養(yǎng)物在非洲綠猴腎細胞中以相同方式進行第二輪的7天擴增。如果使用市售的EIA試劑盒(Rotaclone;Meridian，Cincinnati,OH)測出接種的細胞培養(yǎng)物為輪狀病毒陰性，那么認為YK-I輪狀病毒是滅活的。在對照中，將未經熱處理的YK-I以相同方式接種到非洲綠猴腎細胞中，感染的培養(yǎng)物經測試為輪狀病毒陽性。實施例5由電子顯微技術確定熱滅活之前和之后的輪狀病毒粒子的完整性。從感染的非洲綠猴腎病毒培養(yǎng)物中純化YK-I輪狀病毒，只將三層粒子用于所述滅活研究。將活的和滅活的三層YK-I粒子用磷鎢酸染色并用電子顯微鏡檢查。在60°C下熱處理2小時后，發(fā)現(xiàn)YK-I粒子保持了生物物理學完整性，表現(xiàn)為保持了與活的天然病毒粒子在形態(tài)學上相似的三層結構。用磷鎢酸染色的經純化的活YK-I輪狀病毒的電子顯微圖像的復本示于圖1A。用磷鎢酸染色的經純化的熱滅活YK-I輪狀病毒的電子顯微圖像的復本示于圖1B。圖IA和圖IB中所示的比例尺都表示IOOnm長度。實施例6用本發(fā)明的熱滅活方法滅活的輪狀病毒粒子的純度和蛋白組成是通過以下方式確定的進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后進行考馬斯亮藍染色或使用輪狀病毒特異性兔超免疫血清進行免疫印跡分析。從感染的非洲綠猴腎病毒培養(yǎng)物中純化YK-I輪狀病毒，并且只將三層粒子用于所述滅活研究。在60°C下熱處理2小時后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳配合考馬斯亮藍染色或者配合使用輪狀病毒特異性兔超免疫血清的免疫印跡進行分析熱滅活的粒子。熱處理樣品中的輪狀病毒在非洲綠猴腎細胞中連續(xù)兩次傳代后仍不生長，這確認了所述病毒的滅活。在對照中，在被原始的、活的、未經熱處理的YK-I輪狀病毒感染的細胞中觀察到了旺盛的病毒生長。對于此分析，使用牛IgG作為標準品(Bio-Rad，Hercules,CA)通過布拉德福特法測量純化粒子的蛋白濃度。通過以下方式分析活的和熱滅活的三層輪狀病毒粒子先在12%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后進行考馬斯亮藍染色。此分析顯示熱滅活的病毒粒子含有全部的主要結構病毒蛋白——VP1、VP2、VP4、VP6和VP7并且具有抗原性，如通過使用抗RRV輪狀病毒的兔超免疫血清的蛋白質印跡分析檢測所證明的那樣，如圖2A和2B所示。圖2A示出了考馬斯亮藍染色的聚丙烯烯胺凝膠的數(shù)字圖像的復本，其中泳道1含有分子量標記(千道爾頓)而泳道2和3分別含有活的和殺死的YK-I。圖2B示出了使用輪狀病毒特異性兔超免疫血清的免疫印跡的數(shù)字圖像的復本，所述免疫印跡顯示了主要輪狀病毒蛋白的抗原性。泳道1含有來自活的YK-I的蛋白，泳道2含有來自殺死的YK-I的蛋白。主要結構病毒蛋白由圖2A和2B右側的標簽標示。實施例7對雌性近交系BALB/C小鼠(CovanceResearchProducts,Denver,PA)預抽血,用EIA測得輪狀病毒特異性總抗體(IgA、IgG和IgM)為陰性。用溶于稀釋緩沖液中的20μg或2yg殺死的YK-I通過兩次肌內注射對小鼠(每組7只)進行免疫，在21天后進行增強免疫。對于對照，用緩沖液以相同方式對小鼠(每組6只)進行免疫。對于免疫，將ΙΟΟμΙ的疫苗或緩沖液注射到小鼠的后肢中，在第0、21和35天抽血，并在第49天大量采血。在小鼠中測定對熱滅活輪狀病毒的總血清抗體和中和抗體反應。用熱滅活的YK-I通過兩次肌內注射(Ι.Μ.)給小鼠接種，用EIA測定輪狀病毒特異性總抗體(IgA、IgG和IgM)和中和抗體。對于總抗體，以初始稀釋度1100對每個血清樣品進行檢測。預抽血的血清樣品在此稀釋度下檢測不到抗體，用數(shù)值20確定幾何平均滴度和作圖。以初始稀釋度120檢測中和抗體。通過改良的免疫測定法測量血清中輪狀病毒特異性抗體(IgM、IgG和IgA)，細節(jié)如JiangB，etal.，Vaccine1999；17:1005_13所述。簡言之，用稀釋的抗RRV輪狀病毒的兔超免疫血清包被96孔板(NalgeNunc，Rochester,NY)，用RRV感染的MA104細胞的上清液孵育，然后加入連續(xù)稀釋的小鼠血清。用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗小鼠IgA、IgG和IgM抗體(KirkegaardandPerry,Gaithersburg，MD)孵育96孔板，然后再用底物四甲基聯(lián)苯胺(Aldrich，Milwaukee,WI)孵育。用1NHCl終止所述反應，用EIA讀數(shù)器(MRXRevelation,DynexTechnologies,Chantilly,VA)IlJM450nmTW^WiS(OD)。清中的抗體滴度被定義為凈OD值(RRV的OD減去5%blotto的0D)大于0.1時最高稀釋度的倒數(shù)。通過微量中和測定法測量輪狀病毒中和抗體，細節(jié)如JiangB,etal.,Vaccine1999；171005-13所述。將小鼠血清進行兩倍系列稀釋，每個稀釋度設兩個平行試驗，用以胰蛋白酶活化的RRV輪狀病毒孵育。將活化的輪狀病毒或經類似處理的不含血清的MEM培養(yǎng)基在無血清的情況下孵育，分別用作陽性和陰性對照。將添加有終濃度為10μg/ml的胰蛋白酶和0.5%雞血清(Invitrogen)的MEM培養(yǎng)基中的MA104細胞加入每孔中。在37°C下孵育18小時后，用福爾馬林固定96孔板。通過用兔抗RRV超免疫血清、HRP-標記的抗兔IgG然后用四甲基聯(lián)苯胺孵育96孔板來檢測MA104細胞中的輪狀病毒抗原。血清中的中和抗體滴度被定義為吸收值比病毒對照吸收值降低70%時的最高稀釋度的倒數(shù)。圖3A和3B所示的結果表明，熱滅活輪狀病毒具有高免疫原性，如用熱滅活的輪狀病毒對小鼠的接種所證明的。圖3A示出了對包含根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案熱滅活的輪狀病毒的組合物的總血清抗體反應。圖3A中的抗體滴度被表示為每組(η=7或6)的幾何平均值。誤差棒表示1標準誤差。圖3Α示出了在小鼠血清中觀察到的輪狀病毒特異性總抗體反應，所述小鼠接受了用20μg或2μg熱滅活的YK-I輪狀病毒進行的單劑免疫。接受用20μg熱滅活的輪狀病毒進行兩次免疫的小鼠具有很高的總抗體滴度。在用2yg熱滅活的輪狀病毒接種兩次的小鼠中觀察到盡管較低但是具有可比性(2-8倍)的抗體滴度。最后的血清樣品中的抗體高水平保持2周，然后將小鼠無痛殺死。在接受稀釋緩沖液的對照小鼠中未檢測到抗體滴度(<100)。用微量中和測定法檢測從各個小鼠獲得的血清中的輪狀病毒特異性中和抗體，并以同總抗體反應相似的方式檢測中和抗體的滴度，如圖3B所示。圖3B中的抗體滴度被表示為每組(η=7或6)的幾何平均值。誤差棒表示1標準誤差。除2個以外的全部預抽血清的中和滴度都<20，并且剩余2個的中和滴度為40。用20μg熱滅活的輪狀病毒或2μg熱滅活的輪狀病毒接種一次的小鼠(每組7只)的中和抗體滴度升高較小(2到8倍)，但中和抗體滴度在第二次接種后劇烈升高至1280。中和抗體滴度保持高水平2周，然后將小鼠無痛殺死。用稀釋緩沖液免疫的小鼠的中和滴度沒有升高。以與檢測總抗體相同的方式檢測輪狀病毒特異性IgA，在接種小鼠的血清中未檢測到滴度升高。實施例8在具體的試驗中，將AlOH佐劑加入組合物以加強所述熱滅活輪狀病毒疫苗的免疫原性。在這些試驗中，將30只BALB/C小鼠分成5組，每組6只；用含有或不含600μgAlOH的2μg或0.2μg抗原通過肌內注射對4組小鼠進行一次免疫。用600μgAlOH以相同方式對第5組中的對照小鼠進行免疫。在第0和21天對小鼠抽血，并在第35天大量采血。全部血清儲存在-70°C下直至檢測。用EIA測定中和抗體。對于總抗體，以初始稀釋度1100對每個血清樣品進行檢測。預抽血的血清樣品在此稀釋度下檢測不到抗體，用數(shù)值20表示幾何平均滴度和作圖。以初始稀釋度120檢測中和抗體。結果示于圖4A和4B。圖4A示出了對包含AlOH和根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案熱滅活的輪狀病毒的組合物的總血清抗體反應。將佐劑AlOH加入熱滅活YK-I輪狀病毒中增強了對所述熱滅活YK-I輪狀病毒的免疫反應，并且用極低劑量的抗原產生了高滴度的抗體，如圖4A和4B所述。在圖4A和4B中，抗體滴度被表示為每組(η=6)的幾何平均值。誤差棒表示1標準誤差。用不含或含有600μgAlOH的2μg或0.2μg殺死的YK_1通過肌內注射對小鼠(每組6只)進行一次免疫。圖4Α顯示，在接受2μg或0.2μg抗原的小鼠中檢出了輪狀病毒特異性抗體的滴度，并且加入AlOH增加了總抗體滴度。這些高水平抗體滴度又增加了2周，然后將小鼠無痛殺死。在接受600μgAlOH的對照小鼠中未檢出輪狀病毒特異性抗體的滴度(<100)。圖4B示出了對包含AlOH和根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案熱滅活的輪狀病毒的組合物的中和抗體反應。實施例9將純化的具有基因型P[8]，Gl的A型人輪狀病毒粒子毒株重懸浮于稀釋緩沖液中，所述稀釋緩沖液為含有1.3mMCaCl2、0.5mMMgCl2和0.4mMMgSO4的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)，并添加有10%的山梨糖醇；儲存在-70°C下直至熱滅活和注射到受試者中。用稀釋緩沖液將純化的人輪狀病毒粒子樣品稀釋至300μg/ml的濃度，所述稀釋緩沖液為含有1.3mMCaCl2、0.5mMMgCl2和0.4mMMgS04并添加有10%的山梨糖醇的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)；使用Millex-HVPVDFSyringe驅動過濾裝置(0.45微米；MilliporeCorporation,Bedford,ΜΑ)過濾除菌。為熱滅活人輪狀病毒，將稀釋緩沖液中的病毒粒子置于3.6ml的凍存管(NalgeNunc,Rochester,NY)中并在6O°C的循環(huán)水水浴(型號為NesLabExlO；ThermoElectronCorporation,Newington,NH)中孵育1小時,然后轉移到另一個新管中并在60°C下再孵育1小時。立即取一小份等分試樣檢測任何殘留的感染性，將剩余的儲存在-70°C下直至用于給受試者免疫。將經熱處理的人輪狀病毒懸浮液接種到轉管中的單層非洲綠猴腎細胞中并在37°C下在滾動設備中孵育7天，以確認滅活效果。然后將感染的細胞培養(yǎng)物在非洲綠猴腎細胞中以相同方式進行第二輪的7天擴增。如果使用市售的EIA試劑盒(Rotaclone；Meridian,Cincinnati,OH)測出接種的細胞培養(yǎng)物為人輪狀病毒陰性，那么認為人輪狀病毒是滅活的。在對照中，將未經熱處理的人輪狀病毒以相同方式接種到非洲綠猴腎細胞中，感染的培養(yǎng)物經檢測為人輪狀病毒陽性。由電子顯微技術確定熱滅活之前和之后的輪狀病毒粒子的完整性。將活的和滅活的人輪狀病毒粒子用磷鎢酸染色并用電子顯微鏡檢查。在60°C下熱處理2小時后，發(fā)現(xiàn)人輪狀病毒粒子保持了生物物理學完整性，表現(xiàn)為保持了與活的天然病毒粒子在形態(tài)學上相似的三層結構。圖5A和5B為顯示經純化的活的和熱殺死(滅活的)的人輪狀病毒A⑶C-9的電子顯微照片的復本。熱滅活后，通過聚丙烯烯胺凝膠電泳和染色以及通過免疫測定來檢測人輪狀病毒粒子以確定所述粒子的蛋白含量和完整性。圖6A是考馬斯亮藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的數(shù)字圖像的復本，其示出了泳道1中的分子量標記(千道爾頓)、泳道2和4中來自活的人輪狀病毒的蛋白以及泳道3和5中來自熱滅活的人輪狀病毒的蛋白。將泳道2和3中的樣品在分析前在37°C下孵育10分鐘，而將泳道4和5中的樣品在分析前在97°C下處理5分鐘。圖6B是免疫印跡的數(shù)字圖像的副本，其示出了泳道2中的從活的人輪狀病毒分離的小鼠抗輪狀病毒免疫反應性蛋白VP5和泳道3中的從熱滅活的人輪狀病毒分離的小鼠抗輪狀病毒免疫反應性蛋白VP5或其聚集體。將泳道2和3中的樣品在分析前在37°C下孵育10分鐘。在泳道4和5的樣品中未檢出VP5人輪狀病毒免疫反應性蛋白或VP5聚集體，其中將所述樣品在分析前在97°C下處理5分鐘。結果表明，熱滅活不破壞VP5(VP4的裂解產物)但可導致VP5的聚集或重排。圖7示出了用VP5特異性單克隆抗體通過EIA對人輪狀病毒CDC-9的分析。在活的和熱滅活的CDC-9制劑中檢出了相似VP5的水平。實施例10定菌小豬-I輪狀病毒疾病的定菌小豬模型被用于具體實施例中。此小豬模型使得檢測可在確定環(huán)境下進行，從而避免動物所處環(huán)境問題，并使得疾病可用作結果變量。此模型還可檢測具有抗同型Wa攻擊的Gl血清型的熱滅活輪狀病毒疫苗。選擇13只定菌小豬并隨機分為表1所示的4組。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表1所示的每組動物是相互隔離的。分別用不含或含有佐劑的熱滅活輪狀病毒疫苗通過肌內注射給組BB和CC中的動物接種三次。此實施例中的疫苗制劑在混合有750μgAlPO4的稀釋液中包含75μg熱滅活的經純化⑶C-9——一種具有血清型P[8]，Gl的A型人輪狀病毒毒株。分別用750ygAlPO4和緩沖液以相同方式給組AA和DD中的動物接種。用布拉德福特法測定抗原吸收，顯示約50%的抗原與AlPO4結合。在這些免疫接種中，結合和未結合的抗原都被注射。如表1所示，用包含750μgAlPOJS無抗原、包含75μg抗原但無AlPO4、包含75μg抗原和750μgAlPO4或者既無抗原也無AlPO4-即僅緩沖液的疫苗制劑對小豬進行免疫。每次接種都是通過將0.5ml疫苗制劑注射到所述小豬的后肢肌肉內進行。在以10-12天的間隔給予3劑疫苗制劑后，給小豬口服強毒Wa輪狀病毒進行攻擊。病毒攻擊之前，對每只小豬給予3ml碳酸氫鈉以中和胃中的酸。每天從被攻擊的小豬收集糞便樣品，持續(xù)10天。在整個實驗過程中，以7-14天的間隔采集血樣。圖8A示出了用無抗原的750μgAlPO4接種的4只小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖8B示出了用無佐劑的抗原免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖8C示出了用抗原和佐劑免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖8D示出了在只用緩沖液免疫的小豬的糞便樣品中測量的病毒脫落。這些附圖顯示，只用AlPO4或只用稀釋緩沖液假接種的小豬均脫落輪狀病毒最多至5天并處于高滴度。相反，用無AlPO4的熱滅活輪狀病毒接種的小豬得到了部分保護，表現(xiàn)為縮短至1天的脫落或者延遲和降低的脫落。在用熱滅活的輪狀病毒和AlPO4接種的3只小豬中，2只得到了完全保護，1只只有短短1天的、降低的脫落。因此這些結果表明了本發(fā)明實施方案的熱滅活疫苗制劑的效力。實施例11定菌小豬-II選擇11只定菌小豬并隨機分為表2所示的2組。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如表2所示，用包含600μgAlP04但無抗原或者包含50μg抗原和600μgAlPO4W疫苗制劑對小豬進行免疫。每次接種都通過將0.5ml疫苗制劑注射到所述小豬的后肢肌肉內進行。以10-12天的間隔給予3劑疫苗制劑后，給小豬口服強毒Wa輪狀病毒進行攻擊。病毒攻擊之前，對每只小豬給予3ml碳酸氫鈉以中和胃中的酸。每天從被攻擊的小豬收集糞便樣品，持續(xù)10天。在整個實驗過程中，以7-14天的間隔采集血樣。表3顯示的數(shù)據(jù)為用熱滅活的人輪狀病毒或安慰劑通過肌內注射進行接種并通過口服人輪狀病毒Wa進行攻擊的小豬中的中和抗體滴度。所用縮寫ID，識別代號；PID，接種后天數(shù)；PCD；攻擊后天數(shù)；ND，未確定。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4顯示用熱滅活的人輪狀病毒(IRV)或安慰劑通過肌內注射進行接種并通過口服人輪狀病毒Wa進行攻擊的小豬中抗原脫落情況。表4示出了Wa攻擊后0_10天從小豬收集的糞便樣品中人輪狀病毒抗原的檢測。人輪狀病毒抗原的檢測是通過市售EIA試劑盒(Rotaclone)進行。所示為OD值。所用縮寫PID。數(shù)據(jù)顯示，給予熱滅活人輪狀病毒降低了輪狀病毒脫落的強度和持續(xù)時間。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>圖9示出了用熱滅活的輪狀病毒接種的小豬在受到Wa輪狀病毒攻擊后自其收集的糞便樣品中輪狀病毒脫落持續(xù)時間有所下降。人輪狀病毒抗原的檢測是通過市售EIA試劑盒(Rotaclone)進行。數(shù)據(jù)顯示用熱滅活的輪狀病毒接種具有抗感染的保護作用。本說明書提到的所有專利或出版物都以引用的方式納入本文中，程度相當于每篇單獨的出版物都具體地且分別地以引用的方式納入本文中。本文所述的組合物和方法在目前表示優(yōu)選的實施方案，它們是示范性的，而非意圖作為對本發(fā)明范圍的限制。本領域技術人員會想到其中的改變和用于其他應用。這些改變和其他應用可在不背離如權利要求所限定的本發(fā)明范圍的情況下作出。權利要求一種包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物，所述熱滅活輪狀病毒的特征在于具有基本完整的輪狀病毒粒子結構。2.權利要求1的疫苗組合物，其中所述基本完整的輪狀病毒粒子結構選自三層輪狀病毒粒子、雙層輪狀病毒粒子以及三層輪狀病毒粒子和雙層輪狀病毒粒子的組合。3.權利要求1的疫苗組合物，還包括一種佐劑。4.權利要求3的疫苗組合物，其中所述佐劑為一種含鋁的佐劑，其選自A10H、一種鋁鹽以及它們的組合。5.權利要求3的疫苗組合物，其中所述佐劑為A1P04。6.權利要求1的疫苗組合物，其被制成用于對受試者腸胃外給藥的劑型。7.一種針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，包括給予所述受試者治療有效量的包含抗原性熱滅活輪狀病毒的疫苗組合物，所述熱滅活輪狀病毒的特征在于具有基本完整的輪狀病毒粒子結構。8.權利要求1的疫苗組合物，其中所述基本完整的輪狀病毒粒子結構選自三層輪狀病毒粒子、雙層輪狀病毒粒子以及三層輪狀病毒粒子和雙層輪狀病毒粒子的組合。9.權利要求7的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，其中所述受試者為人。10.權利要求7的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，其中將所述疫苗組合物通過腸胃外途徑給予所述受試者。11.權利要求7的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，其中所述疫苗組合物還包含一種佐劑。12.權利要求7的針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，其中所述疫苗組合物的給藥包括給予至少兩劑所述疫苗組合物。13.一種滅活輪狀病毒的方法，包括將分離的輪狀病毒粒子懸浮在水性緩沖液中，所述水性緩沖液的摩爾滲透壓濃度為約200-500m0sm，包含濃度為約lmM-15mM的二價陽離子的鹽以及量為約1_20%w/v的糖和/或糖醇，以得到具有完整輪狀病毒粒子結構的輪狀病毒粒子的起始制劑；將所述輪狀病毒粒子的起始制劑在約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下孵育足夠長的時間以使輪狀病毒不能復制或感染，從而得到熱滅活的輪狀病毒制劑，所述制劑具有抗原性并基本保持起始制劑的完整輪狀病毒粒子結構。14.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒的起始制劑具有的完整輪狀病毒粒子結構選自雙層輪狀病毒粒子、三層輪狀病毒粒子以及雙層輪狀病毒粒子和三層輪狀病毒粒子的混合物。15.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述孵育時間為約10分鐘-24小時，包括10分鐘和24小時。16.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，還包括將所述分離的輪狀病毒粒子過濾，然后將所述輪狀病毒粒子的起始制劑置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下。17.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中將所述輪狀病毒的起始制劑置于約50°C-80°C、包括50°C和80°C的溫度下，所述方法包括第一孵育期和第二孵育期，其中所述第一孵育期和第二孵育期總共為約10分鐘-24小時，包括10分鐘和24小時。18.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒是一種人或動物輪狀病19.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒是一種A型輪狀病毒。20.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒是一種B型輪狀病毒。21.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒是一種C型輪狀病毒。22.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述輪狀病毒選自D型輪狀病毒、E型輪狀病毒、F型輪狀病毒和G型輪狀病毒。23.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述熱滅活的輪狀病毒制劑的特征在于基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量與存在于所述起始制劑中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。24.權利要求13的滅活輪狀病毒的方法，其中所述熱滅活的輪狀病毒制劑的特征在于基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量與存在于所述起始制劑中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量基本相似。25.—種基本如本文所述的滅活輪狀病毒疫苗。26.—種基本如本文所述的熱滅活輪狀病毒的方法。27.—種基本如本文所述的給受試者接種的方法。28.基本如本文所述的滅活輪狀病毒的制劑的用途。全文摘要本發(fā)明提供熱滅活輪狀病毒的方法，包括將輪狀病毒置于約50℃-80℃、包括50℃和80℃的溫度下孵育足夠長的時間以使所述輪狀病毒不能復制或感染。所述熱滅活的輪狀病毒具有抗原性并保持基本完整的輪狀病毒粒子結構。本發(fā)明還提供疫苗組合物和針對輪狀病毒對受試者進行接種的方法，包括熱滅活輪狀病毒的產生和應用。文檔編號A61K39/15GK101835488SQ200880110436公開日2010年9月15日申請日期2008年9月4日優(yōu)先權日2007年9月4日發(fā)明者B·江,J-F·薩魯佐,R·I·格拉斯申請人:美國政府(由衛(wèi)生和人類服務部、疾病控制和預防中心的部長所代表)