生成"是指這樣的細胞現(xiàn)象，其中血管內(nèi)皮細胞增殖并重構(gòu)以從現(xiàn) 有的血管網(wǎng)絡(luò)形成新的血管。促進血管發(fā)生、內(nèi)皮細胞生長、血管穩(wěn)定性和血管形成的血 管生成因子參與血管生成。血管生成因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)和VEGF家族，胎 盤生長因子（PIGF)家族，血小板源性生長因子（PDGF)家族，DLL4,成纖維細胞生長因子家 族（FGF)，TIE配體（血管生成素（angiopoietin))，肝配蛋白，Del-1，成纖維細胞生長因 子（酸性（aFGF)和堿性（bFGF))，卵泡抑素，粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，肝細胞生長因 子（HGF) /分散因子（SF)，白介素-8 (IL-8)，瘦素，中期因子，胎盤生長因子，血小板源性內(nèi) 皮細胞生長因子（H)-ECGF)，血小板源性生長因子，特別是TOGF-BB或TOGFR- 0，多營養(yǎng)因 子（PTN)，顆粒素蛋白前體（progranulin)，增殖蛋白，轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)，轉(zhuǎn)化生 長因子(TGF-0)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)/血管滲透因 子（VPF)等的成員，但不特別限定于此。
[0048] 本發(fā)明的術(shù)語："血管生成拮抗劑"是指直接或間接抑制血管發(fā)生、血管形成或不 希望的血管通透性的低分子量材料、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體或其綴 合物或雙靶向抗體。此外，血管生成抑制劑包括結(jié)合到血管生成因子或其受體以阻斷血 管生成被激活的物質(zhì)。例如，血管生成抑制劑包括血管生成劑的抗體或其它拮抗劑，例如 VEGF-A或VEGF-A的可溶性受體（例如，可溶性KDR受體或Flt-1可溶性受體），VEGF-捕 獲物，血管生成素2, Notchl可溶性受體誘餌，或其保持了與其材料的配體的結(jié)合親和力的 片段，但本發(fā)明不局限于此。
[0049] 如上所述，優(yōu)選地，本發(fā)明提供了雙靶向抗體，其采用這樣的形式，即DLL4的拮抗 劑特別是DLL4的Notchl最小誘餌連接到特異性結(jié)合VEGFR-2的抗體末端，其中該VEGFR-2 特異性抗體優(yōu)選Tanibirumab或其變體，并優(yōu)選由具有選自SEQ ID N0:1至3的任一序列 的重鏈可變區(qū)和具有選自SEQ ID N0 :4至6的任一序列的輕鏈可變區(qū)組成。
[0050] 具體地講，VEGFR-2特異性抗體優(yōu)選由SEQ ID N0 :1的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0 : 4的輕鏈可變區(qū)，SEQ ID NO :2的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :5的輕鏈可變區(qū)，或SEQ ID NO: 3的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :6的輕鏈可變區(qū)組成，并且VEGFR-2特異性抗體可另外在可 變區(qū)包括恒定區(qū)。此外，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是只要擁有與VEGFR-2的結(jié)合親和 力，那么其片段或氨基酸修飾也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0051] 表 1
[0052] [表 1]
[0053] 根據(jù)本發(fā)明結(jié)合至VEGFR-2的抗體的Hv和Lv的序列
[0054]
【主權(quán)項】
1. 一種靶向VEGFR-2和DLL4的雙靶向抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的雙靶向抗體，其中所述抗體包含DLL4拮抗劑，該DLL4拮抗劑與結(jié) 合VEGFR-2的抗體的末端結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的雙革El向抗體，其中所述結(jié)合VEGFR-2的抗體是Tanibirumab或其 變體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的雙靶向抗體，其中所述DLL4拮抗劑是人類Notchl的第^^一和第 十二鈣結(jié)合EGF樣結(jié)構(gòu)域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的雙靶向抗體，其中所述DLL4拮抗劑與結(jié)合VEGFR-2的抗體的輕鏈 可變區(qū)N-末端結(jié)合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的雙靶向抗體，其中所述DLL4拮抗劑通過氨基酸接頭與結(jié)合 VEGFR-2的抗體結(jié)合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3的雙靶向抗體，其中所述結(jié)合VEGFR-2的抗體包含：包含選自SEQ ID NO :1至3的序列的重鏈可變區(qū)，和包含選自SEQ ID NO :4至6的序列的輕鏈可變區(qū)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的雙靶向抗體，其中所述結(jié)合VEGFR-2的抗體包括：包含SEQ ID NO : 1的序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :4的序列的輕鏈可變區(qū)； 包含SEQ ID NO :2的序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :5的序列的輕鏈可變區(qū)； 或 包含SEQ ID NO :3的序列的重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO :6的序列的輕鏈可變區(qū)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4的雙靶向抗體，其中作為DLL4的拮抗劑的人類Notchl的第^^一和 第十二鈣結(jié)合EGF樣結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :7的序列。
10. 編碼根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的雙靶向抗體的DNA。
11. 一種重組表達載體，包含根據(jù)權(quán)利要求10的DNA。
12. 由根據(jù)權(quán)利要求11的重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
13. -種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的雙靶向抗體的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要 求12的宿主細胞，然后從培養(yǎng)物中分離雙靶向抗體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，還包括使用具有蛋白質(zhì)A親和色譜、SP瓊脂糖凝膠色譜 和大小排阻色譜的快速蛋白液相色譜法純化所述雙靶向抗體。
15. -種用于治療血管發(fā)生相關(guān)疾病的藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項 的雙靶向抗體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，所述血管發(fā)生相關(guān)疾病是選自腫瘤生長、腫瘤轉(zhuǎn)移、年 齡相關(guān)的黃斑變性（ARMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀肩病、類風濕性關(guān)節(jié)炎和慢性炎癥的組中 的一種或多種。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，所述癌癥是選自結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、乳腺癌、 肺癌、卵巢癌、肝癌、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、胰臟癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、腦癌、前列腺 癌、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、腎癌、食道癌、膽道癌、睪丸癌、直腸癌、頭頸癌、宮 頸癌、輸尿管癌、骨肉瘤、神經(jīng)細胞瘤、黑色素瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、星形細胞瘤、神經(jīng) 母細胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的組中的一種或多種。
18. -種測量根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的雙靶向抗體的DLL4拮抗劑功效的方法， 包括通過共培養(yǎng)表達人DLL4(hDLL4)的細胞系或具有人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)的重組細 胞系，測量Notch 1的活性。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中測量Notch 1的活性是通過測量NI⑶的表達量來實 現(xiàn)的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中測量NI⑶的表達量是通過使用選自SDS-PAGE、 Western印跡、免疫組織化學(xué)染色法、免疫染色法、免疫熒光法、ELISA測定法（直接測量） 和熒光素酶測定法來實現(xiàn)的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述重組細胞系是過表達hDLL4的293細胞系 (293-hDLL4)〇
22. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述共培養(yǎng)物包括（a)培養(yǎng)HUVEC ;和（b)將過表達 hDLL4的293細胞系（293-hDLL4)和雙靶向抗體反應(yīng)并在步驟（a)中培養(yǎng)的HUVEC中進行 處理以實現(xiàn)共培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種靶向VEGFR-2的抗體，更具體地，涉及新形式的雙靶向抗體，其中人Notch的鈣結(jié)合EGF樣結(jié)構(gòu)域11和12結(jié)合到Tanibirumab輕鏈的N端，編碼該抗體的基因，包括該基因的重組表達載體，使用該重組表達載體遺傳修飾的宿主細胞以及通過培養(yǎng)該宿主細胞生產(chǎn)雙靶向抗體的方法，包括該雙靶向抗體的藥物組合物，以及測量該雙靶向抗體的DLL4拮抗劑效力的方法，其中Notch1活性是通過共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和表達人DLL4的細胞系(hDLL4)來測量。本發(fā)明的雙靶向抗體的優(yōu)勢在于更有效地同時打斷VEGF/VEGFR-2和DLL4/Notch1兩不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，能夠治療各種血管生成相關(guān)的疾病，如腫瘤，特別是，能夠克服由于單獨使用新血管的治療劑造成的抗性，并通過直接靶向癌癥干細胞能夠從根本上防止癌癥復(fù)發(fā)。
【IPC分類】C07K19-00, C12N15-62, C07K16-46, A61K39-395
【公開號】CN104870476
【申請?zhí)枴緾N201380065951
【發(fā)明人】金重圭, 柳珍山, 李尚勳, 李元燮, 金圣祐, 沈相烈, 柳珍相, 李英愛, 樸美珠, 卞相順, 李赫峻, 金度鈗, 金衍周, 崔真熺, 南坰晞, 南周伶, 鄭鍾根, 鄭寶煐, 李銀真, 李善暎, 樸仁俶, 李真淑, 尹載烽, 金男禮, 吳先煥
【申請人】藥物抗體公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2013年11月20日
【公告號】CA2892193A1, EP2924052A1, WO2014081202A1