專利名稱：：雞骨草總黃酮碳苷有效部位、其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于天然藥物領域，具體涉及從中藥毛雞骨草中提取分離的一種總黃酮碳苷有效部位，其制備方法及其在制備預防及治療急慢性肝炎及其相關疾病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
：肝病是嚴重威脅人類健康的常見傳染病、多發(fā)病之一，根據(jù)病因可分為病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物中毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、遺傳代謝性肝病和其他感染因子引起的肝炎。肝炎中以病毒性肝炎對人類危害最大，而病毒性肝炎中以乙肝和丙肝尤為突出。乙型肝炎是世界性疾病，全球約有3.5億患者，我國是乙肝大國，乙肝表面抗原(HBsAg)陽性者約占總?cè)丝诘?/10。目前全世界約有3億(我國1.2億)乙肝病毒攜帶者。近年來，國際醫(yī)藥界對防治肝炎藥物研究工作比較活躍，主要針對抑制肝炎病毒復制、改善肝功能障礙、抗肝細胞脂質(zhì)過氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面進行研究。臨床上常用的肝炎藥物包括抗病毒類的干擾素、阿昔洛韋，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺，保肝的水飛薊素、聯(lián)苯雙酯等。目前，化學藥物對于病毒性肝炎，尤其是慢性肝炎的防治尚無明確的療效，并且存在著毒副作用等弊端。我國有著豐富的天然藥物資源，在防治肝炎的臨床應用等許多方面有著豐富的經(jīng)驗，并成功開發(fā)出茯芩多糖、甘利欣(甘草酸二銨)、水飛薊素、聯(lián)苯雙酯等天然藥物，并用于臨床治療，但由于肝炎發(fā)病機制較為復雜，多數(shù)藥物療效有限，對肝炎不能有效根治，故研究和開發(fā)出新一代的肝炎治療藥物是非常必要的。中藥防治肝損傷作用主要為改善肝功能，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、降低血清總膽紅素Bil，增加血清白蛋白Alb;促進肝糖元合成，保護肝細胞，防止急慢性肝損傷造成的糖元合成障礙；改善肝細胞病理，對急性肝損傷能減輕細胞腫脹，防止脂肪變性、阻止肝纖維化；抑制肝膠原纖維、網(wǎng)狀纖維增生。通常認為中藥的抗肝傷作用在于能提高SOD或其他抗氧化酶活性，從而清除自由基，阻止肝細胞脂質(zhì)過氧化，維持細胞膜的正常結(jié)構(gòu)，避免細胞的損害。雞骨草為豆科植物雞骨草J6msca"towi'e旭kHance和毛雞骨草X6nwmo/foHance的干燥全株。具有清熱利濕、舒肝止痛、活血散瘀的功效，臨床用于治療急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛、風濕痹痛等癥。其中毛雞骨草為豆科植物相思子屬毛雞骨草J6A"twmo/to去除莢果后干燥全草，主要分布于中國的南部地區(qū)，如廣西、廣東、福建及海南等。相思子屬植物中雞骨草和毛雞骨草治療傳染性肝炎療效顯著，從民間草藥使用發(fā)展到中成藥制劑，廣泛應用于臨床，現(xiàn)有雞骨草沖劑、復方雞骨草片、雞骨草丸等劑型。目前國內(nèi)外對藥材雞骨草和毛雞骨草的化學成分研究較少，文獻報道本植物分離得到脂肪酸、三萜、齒體、異黃酮等，已有的化學成分研究與藥效活性篩選工作脫節(jié)，未能系統(tǒng)地闡明藥材雞骨草治療肝炎的藥效物質(zhì)基礎。文獻報道雞骨草提取物及雞骨草中三萜皂苷槐花皂苷ni和大豆皂苷i具有保肝降酶的活性(MiyaoH，"a/,KaikasaponinIII.andSoyasaponinI，majortriterpenesaponinsof爿6nwc。Wo/n'e肌'j，actonGOTandGPT:influenceontransaminaseelevationofratlivercellsconcomitantlyexposedtoCCl4foronehour.尸/a"to64(1):5-7,)。到目前為止，國內(nèi)外均未明確提出雞骨草治療肝炎的藥效物質(zhì)基礎，更無文獻報道雞骨草植物中治療肝炎的有效成分為黃酮碳苷類有效成分。為了尋找傳統(tǒng)中藥雞骨草的治療肝炎的藥效活性成分，本發(fā)明在對中藥毛雞骨草進行系統(tǒng)的化學成分研究基礎上，結(jié)合與治療肝炎相關的藥效活性篩選，尋找出本植物治療肝炎的藥效活性部位為黃酮碳苷類化合物，主要成分為"菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷和芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷。從中藥毛雞骨草中提取分離一種總黃酮碳苷有效部位，及其制備預防和治療急慢性肝炎及其相關疾病藥物的用途，未見文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容.本發(fā)明公開了利用現(xiàn)代分離技術(shù)從中藥毛雞骨草中提取分離得到的總黃酮碳苷有效部位，主要含有芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)等黃酮碳苷類化學成分，化學結(jié)構(gòu)如通式I所示OHO.弓'.R21GlcGlc2GlcAra3AraGlc41齊菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-yff-D陽glucopyranoside),Vicenin;2芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(apigenin6-C-yff-D-glucopyranosyl-8-C--L-arabinopyranoside)，Schaftoside;3開菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin6-C--L-Arabinopyranosyl-glucopyranoside),Isoschaftoside;本發(fā)明的雞骨草總黃酮碳苷有效部位，由以下方法制備得到a.以水溶性溶劑作為提取溶劑提取中藥毛雞骨草原料，提取液濃縮至適量，得到提取濃縮液，所述的水溶性溶劑選自水、乙醇中的一種溶劑或兩種溶劑組成的混合溶劑；b.提取液濃縮液，過濾或離心，濾液或上清液上樣于層析柱，依次用水、30~60%乙醇洗脫，洗脫至流出液無色，收集30~60%乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得總黃酮碳苷提取物，其中層析柱選自大孔吸附樹脂柱或聚酰胺樹脂柱。上述的雞骨草總黃酮碳苷有效部位，其中大孔吸附樹脂為聚苯乙烯骨架的極性或非極性大孔吸附樹脂，可選自D101型、HPD100'型、HPD200型、AB-8型。D101型、AB-8型、HPD100型。其中層析用聚酰胺樹脂的規(guī)格可選自30~60目、60~100目、100目以上各種孔徑。上述方法得到的總黃酮碳苷提取物再經(jīng)精制過程，便能得到純度更高的提取物，所述的精制方法為同樣或不同的層析方法純化，或者將總黃酮碳苷提取物以合適極性的溶劑進行提取，提取液回收溶劑，濃縮、干燥后即得到純度更高的提取物，所述合適極性的溶劑選自體積比為75-100:25-0的乙醇水、丙酮水或甲醇水。本發(fā)明進一步提出所述的中藥雞骨草可以是豆科相思子屬植物毛雞骨草J&"S70//&及雞骨草X6nwoi"fo"z'ewi'，優(yōu)選為毛雞骨草。采用色譜和波譜技術(shù)，對雞骨草黃酮碳苷有效部位進行分離及結(jié)構(gòu)鑒定，分離得到3個黃酮碳苷單體化合物，分別鑒定為芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-(:-葡萄糖糖-8-(:-阿拉伯苷(2)及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)?；衔飈:淡黃色粉末(MeOH),AlCl3反應陽性，提示為黃酮類化合物，mp235-236。C，結(jié)合l3CNMR信息推斷該化合物的分子式為C27H3。015。IR(KBr)Vn^cm":3397(OH)，1650(C=0),1564(Ar),1512(At),1042(C-O)。！HNMR(500MHz，DMSO-^)5ppm:13.80(lH,s,C5-OH)，10.33(IH,，C7-OH)，9.40(1H，，C4'-OH)，8.04(2H，d，/=8.7Hz，H-2',6'),6.91(2H，d，J=8.7Hz，H陽3'，5'),6.79(1H，s,3鄰，4.80(1H,d,/=9.4Hz，H-l"ofGlc),4.71(IH，d，《/=9.8Hz，H-l"'ofGlc)。l3CNMR(125MHz,DMSO-^)<5ppm:163.7(C-2)，102.2(C-3)，182.3(C4)，161.5(C-5)，08.5(C層6)，159.9(C-7),105.1(C-8),159.0(C-9)，103.9(C-IO)，121.4(C-l')，128.9(C-2',6:)，115.9(C-3'，5'),161.2(C-4'),73.9(C-l"ofGlc)，71.3(C-2"ofGlc),78.8(C-3"ofGlc),70.3(C-4"ofGlc),81.1(C-5"),61.2(C-6"ofGlc)，72.3(C-l"'ofGlc),70.1(C-2'"ofGlc),79.2(C-3'"ofGlc)，70.5(C-4'〃ofGlc)，81.8(C-5'"ofGlc)，59.7(C-6"'ofGlc)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，并與文獻對照，鑒定化合物1為芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6,8-di-C-j6-D-glucopyranoside，Vicenin)?；衔?:淡黃色粉末，'A1C13反應陽性，鹽酸—鎂粉反應陽性，mp.201-203。C;Positive-ESI-MS/n/z:587[M+Na]+結(jié)合'H^CNMR信息推斷化合物2的分子式為C26H28014。IR(KBr)vmaxcm":3365(OH)，1649(00)，1583(OC)，1512(C=C)，1092(C-O)。&NMR(500MHz,DMSO-^)(5ppim13.79(1H,s,C5-OH)，8.09(2H,d，/=6.7Hz，H-2'，6〕，6.91(2H,d,/=8.8Hz，H-3',5')，6.75(1H,s，H-3),4.78(1H，d,/=9.4Hz,H-l"ofGlc),4.71(1H，d，/=9.8Hz,H-l'"ofAra)。13CNMR(125MHz,DMS0陽rf《)5ppm:163.7(C-2),102.2(C-3),182.0(C-4),161.1(C-5),108.5(C-6),159.5(C-7),104.3(C-8)，159.5(C-9),103.6(C-10),121.3(C-l1)，129.0(C陽2'，6')，115.9(C-3'，5，，16U(C-4'),73.6(C國l"ofGlc)，70.9(C-2〃ofGlc)，78.7(C-3"ofGlc),70.1(C-4〃ofGlc)，81.3(C-5"ofGlc),60.9(C-6〃)，74.5(C-l〃')，69.1(C-2")，75.0(C-3'"),68.8(C-4"'),70.7(C-5"')。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，并與文獻對照，鑒定化合物2為芹菜素-6-<:-葡萄糖-8-(:-阿拉伯苷(apigenin6-C-yff-D-glucopyranosyl-8-C-ct-L-arabinopyranoside，Schaftoside)?；衔?:淡黃色粉末，AlCl3反應陽性，鹽酸一鎂粉反應陽性，mp.200-201。C;Positive-ESI-MS/n/z:587[M+Na]+，結(jié)合11^13CNMR信息推斷化合物3的分子式為C26H280"。IR(KBr)v加肌cm":3362(OH),1649(C-O),1582(C=C),1520(C=C)，1090(C-O)。NMR(300MHz，DMS0-4)5ppm:13.80(5-OH)，7.99(2H，d,J-8.4Hz，H-2'，6'),6.89(2H,(!，/=8.2Hz,H-3',5'),6.73(1H，s,H-3)4.80(1H，d,/=9,2Hz,H-l"ofGlc)，4.65(1H,(!，/=8.8Hz,H-l〃'ofAra)。13CNMR(75MHz，DMSO-^)5ppm:163.5(C-2)，102.3(C-3)，181.8(C-4)，161.1(C-5)，108.2(C-6)，161.1(C國7)，104.4(C-8)，154.8(C-9),102.3(C-10)，121.6(C-l〕，128.7(C層2'，6')，115.8(C-3'，5')，158.4(C-4'),74.3(C-l"ofAra)，74.0(C-2〃ofAra)，71.0CC-3"ofAra)，70.0(C-4"ofAra),68.6(C陽5"ofAra)，73.3(C-l'"ofGlc),70.6(C-2'"ofGlc)，78,9(C-3'"ofGlc),70.5(C-4'"ofGlc),81.8(C-5'"ofGlc),61.2(C-6"'ofGlc)。綜合以上信息，并與文獻比較，化合物3的以上數(shù)據(jù)與異夏佛塔苷一致，故鑒定化合物3為芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin6-C-a-L陽arabi加syl-8-Gv5-D-glycopyranoside，Isoschaftoside)。本發(fā)明的雞骨草黃酮碳苷有效部位提取物的總黃酮碳苷含量40~卯％。采用HPLC-UV法，色譜柱為ZorbaxSBC184.6x250mm,流動相為甲醇-水梯度洗脫，檢測波長為272nm，以分離得到的3種黃酮碳苷為對照，對本發(fā)明的總黃酮碳苷提取物進行多成分定量分析，結(jié)果表明，該提取物中芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)的含量分別為17.0%，15.1%,及19.6%。本發(fā)明的雞骨草總黃酮碳苷提取物可以作為藥物活性成分制備成各種臨床用藥物制劑，其中含有治療有效量的雞骨草總黃酮碳苷提取物及藥學上可接受的載體。還可以作為活性部位與其它中藥提取物/有效部位或相關化學合成藥物與藥學上可接受的賦性劑或輔料一起用于制備藥物組合物。上述兩種藥物組合物均可采用藥劑學的常規(guī)方法制備成各種劑型，如膠囊、片劑、顆粒劑、滴丸、緩釋劑等口服制劑及注射劑等胃腸外給藥劑型。藥理學試驗表明，本發(fā)明的雞骨草總黃酮碳苷有效部位具有顯著的保肝降酶、利膽等功效。雞骨草總黃酮碳苷提取物可以作為活性部位制備預防和治療急慢性肝炎及其相關疾病藥物，急慢性肝炎及其相關疾病包括病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝和膽囊炎。本發(fā)明的雞骨草總黃酮碳苷提取物用于臨床治療時，建議劑量范圍200-800mg/天，也可根據(jù)劑型的不同和疾病嚴重程度，使用劑量超出該范圍。下面通過實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本發(fā)明并不限于實施例所述范圍。具體實施方式實施例1雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備取毛雞骨草藥材lKg,加70%乙醇回流提取2次，合并醇提液，減壓回收至無醇味，離心，上清液上樣于已處理好的D101大孔吸附樹脂柱吸附后，依次用3升去離子水，5升50%乙醇洗脫，收集50。/o乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得雞骨草總黃酮碳苷提取物21g。采用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷、開菜素-6-0:-葡萄糖-8-(:-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為17.0%,15.1%,及19.6%。實施例2雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備實施例1所得提取物加入10倍量的95%乙醇，加熱回流提取1h，趁熱抽濾，濾液回收乙醇后真空干燥，即得純度較高的雞骨草總黃酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法進行定量分析，^菜素-6，8-二c-葡萄糖苷、芹菜素-6-(:-葡萄糖-8-<:-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-(:-阿拉伯糖-8-(:-葡萄糖苷的含量分別為20.0%,17.5%,及25.6%。實施例3雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備實施例1所得提取物加入IO倍量的75%乙醇，加熱回流提取1h,趁熱抽濾，濾液回收乙醇后真空干燥，即得純度較高的雞骨草總黃酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為22.0%，15.5°/o,及24.3%。實施例4雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備實施例1所得提取物加適量的水溶解后，上樣于已處理好的D101大^Jt附樹脂柱吸附后，依次用去離子水，20%乙醇、40%乙醇洗脫，收集40%乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得純度較高的雞骨草總黃酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為23.0%，13.4%,及25.8%。實施例5雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備實施例1所得提取物加適量的水溶解后，上樣于己處理好聚酰胺柱，依次用去離子水、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得純度較高的雞骨草總黃酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6《-葡萄糖-8-<:-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為25.0%，18.4%及28.8%。實施例6雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備取毛雞骨草藥材lKg，加水回流提取2次，離心，上清液上樣于D101大孔吸附樹脂柱吸附后，，依次用3升去離子水，3升20%乙醇、5升50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓蒸干，所得提取物加入10倍量的95%乙醇，加熱回流提取lh,趁熱抽濾，濾液回收乙醇后真空干燥，即得雞骨草總黃酮碳苷提取物24g。釆用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為15.4%,12.5%，及21.6%。實施例7雞骨草總黃酮碳苷提取物的制備取毛雞骨草藥材1Kg，加70%乙醇回流提取2次，合并醇提液，減壓回收至無醇味，離心，上清液上樣于已處理好聚酰胺樹脂柱，依次用3升去離子水，5升50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓蒸干，所得提取物加入10倍量的70%乙醇，加熱回流提取lh，趁熱抽濾，濾液回收乙醇后真空干燥，即得雞骨草總黃酮碳苷提取物24g。即得雞骨草總黃酮碳苷提取物26g。采用HPLC-UV法進行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分別為28.021.5%,及28.6%。實施例8雞骨草總黃酮碳苷有效部位的藥效學研究1.實驗材料1.1動物ICR種小白鼠，雌雄各半，初始體重i8-22g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，合格證號SCXK(蘇)2002-0009;SD大鼠，體重180~220g,購自揚州大學比較醫(yī)學中心，合格證號SCXK(蘇)2002-0009。1.2試劑與藥物四氯化碳(CCU)，分析純，南京化學試劑一廠；D-半乳糖胺(D-gal)，購自南京生興生物技術(shù)公司；大腸桿菌脂多糖(LPS)，10mg/瓶，Sigma公司，批號017k098;凍干卡介苗(BCG),1xi(^菌苗/mg,上海生物制品研究所，批號200701001;雞骨草總黃酮碳苷，本發(fā)明實施例1方法制備得到，批號070911;陽性藥l:雞骨草膠囊，廣西玉林制藥有限責任公司；陽性藥2:甘草酸二銨鹽，江蘇正大天晴制藥有限公司；陽性藥3:茵梔黃注射液，山西太行藥業(yè)股份有限公司；陽性藥4:東寶肝泰膠囊，吉林通化東寶藥業(yè)有限公司。2.實驗方法2.1雞骨草總黃酮碳苷提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護作用ICR種小白鼠，雌雄各半，初始體重18-22g，隨機分為7組，每組動物10只，分為正常對照組，模型對照組，雞骨草總黃酮碳苷提取物(AMExt)低劑量組(25mg/kg,ig)、中劑量組(50mg/kg,ig)和高劑量組(100mg/kg,ig),陽性藥雞骨草膠囊(12g/kg，ig),陽性藥甘草酸二銨鹽(25mg/kg，iv)。本試驗采取預防和治療結(jié)合給藥方案，各組動物預防給藥5天，每天上午給藥l次，第5天上午給藥完畢lh后，除正常組外，其余組動物均ip0.151/0四氯化碳10ml/kg，造成急性肝損傷模型，'四氯化碳造模后6h、22h，各組分別治療給藥1次，造模24h后，每組動物摘眼球取血，分離血清，測定ALT、AST、TP、ALB和GLU。2.2雞骨草總黃酮碳苷提取物對D-半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護作用ICR種小白鼠，雌雄各半，初始體重18-22g，分組同上，每組動物10只，本試驗采取預防和治療結(jié)合給藥方案，各組動物預防給藥5天，每天上午給藥1次，第5天上午給藥完畢lh后，除正常組外，其余組動物均ipZ)-半乳糖胺(Z)-gal)800mg/kg。Z)-gal造模后6h，各組分別治療給藥l次，造模16h后，每組動物摘眼球取血，分離血清，測定ALT、AST、TP、ALB和GLU。2.3雞骨草總黃酮碳苷提取物對卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用ICR種小白鼠，雌雄各半，初始體重18-22g，隨機分為6組，每組動物10只，分為正常對照組，模型對照組，雞骨草總黃酮碳苷提取物(AMExt)低劑量組(25mg/kg，ig)、中劑量組(50mg/kg,ig)和高劑量組(100mg/kg,ig)，陽性藥甘草酸二銨鹽(25mg/kg，iv)。正常組小鼠尾靜脈注射生理鹽水10ml/kg外，其余各組小鼠尾靜脈注射卡介苗(BCG)0.2ml(含lx10'7活菌)。次日起，各藥物組按上述劑量給藥。正常對照組和模型組均尾靜脈注射等體積的生理鹽水，連續(xù)9d。9d后，除正常對照組以生理鹽水0.2ml/只尾靜脈注射外，其余各組以脂多糖(LPS)10ng/0.2ml/只尾靜脈注射，10h后每組動物摘眼球取血，分離血清，測定ALT、AST。2.4雞骨草總黃酮碳苷提取物對a-萘異硫氰酸脂致小鼠黃疸性肝損傷的保護作用ICR種小白鼠，雌雄各半，初始體重18-22g，隨機分為6組，每組動物10只，分為正常對照組，模型對照組，雞骨草總黃酮碳苷提取物(AMExt)低劑量組(25mg/kg，ig)、中劑量組(50mg/kg,ig)和高劑量組(100mg/kg,ig)，陽性藥茵梔黃注射液組(2ml/kg，iv)。各藥物組按照劑量給藥，正常對照組和(i-萘異硫氰酸酯模型組每天腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)7d。末次給藥后lh，除正常對照組外，其余各組小鼠按劑量100mg/kg灌服ct-萘異硫氰酸酯造模，同時禁食不禁水，48h后由眼眶靜脈叢取血，常規(guī)分離血清，采用試劑盒按咖啡因法測定總膽紅素(T.BIL)的含量。2.5雞骨草總黃酮碳苷提取物對CCU致大鼠慢性肝損傷的保護作用SD大鼠，全部雄性，體重180220g,隨機分為5組，每組動物10只，分為正常對照組，模型對照組，雞骨，總黃酮碳苷提取物(AMExt)低劑量組(25mg/kg，ig)、中劑量組(50mg/kg，ig)，陽性藥甘草酸二銨鹽組(25mg/kg，iv)。除正常對照組外，其余4組每周灌胃50n/。CCl42次(周二、五)，給藥體積為0.1ml/100g。除正常對照組及模型組外，其余3組給藥組動物在每周灌胃CCU的同時，分別igAMExt.25mg/kg、50mg/kg，iv甘草酸二銨鹽25mg/kg,每天1次。造模和給藥時間為l個月，期間全部動物每周測定體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。最后l次灌胃CCl424h后，全部動物股動脈取血，分離血清，測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、i膽紅素(TB)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G)、白球比(A/G)、血糖(GLU)。測定肝臟重量系數(shù)，另取部分肝臟福爾馬林固定后進行組織病理學檢査。2.6雞骨草總黃酮碳苷提取物對酒精性大鼠肝損傷的保護作用SD大鼠，全部雄性，體重180~220g，隨機分為5組，每組動物10只，分為正常對照組，模型對照組，雞骨草總黃酮碳苷提取物(AMExt)低劑量組(25mg/kg,ig)、中劑量組(50mg/kg,ig),陽性藥東寶肝泰膠囊(600mg/kg,ig)。正常對照組動物給予普通飼料，其余4組動物每天上午灌胃56度紅星二鍋頭0.5ml/100g,每天下午灌胃3%膽固醇高脂乳劑1ml/100g(高脂乳劑配制將3g膽固醇溶于熔化的6g豬油中；將0.6g膽酸鈉、0.3g甲基硫氧嘧啶溶于約40ml蒸餾水中再加1.2ml丙二醇。將兩液混勻，加1.2ml吐溫80攪拌成乳劑，最后加蒸餾水定溶至100ml);另每隔5d皮下注射40%CCU橄欖油溶液0.15ml/100g,共5次。各藥物組每日灌胃造模后3h按上述劑量灌胃給藥1次。造模和給藥時間為20d，期間全部動物每周測定體重l次,根據(jù)體重調(diào)整給藥量。最后1次皮下注射40。/。CCl4橄欖油溶液后16h，全部動物股動脈取血，取肝制備10%(丙二醇-丙酮，1:1)肝勻漿，離心，檢測肝勻槳上清液中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)，檢測血清中ALT和AST。另取部分肝臟福爾馬林固定后進行組織病理學檢查。3.結(jié)果與討論3.1雞骨草總黃酮碳苷提取物對CCU致小鼠急性肝損傷的保護作用CCl4造模24hr后，與正常對照組相比，模型組血清中ALT和AST活力顯著升高(PO.Ol)。陽性藥甘草酸二銨鹽(25mg/kg,iv)、雞骨草膠囊組(12g/kg，ig)及測試藥物組雞骨草總黃酮碳苷提取物25、50、100mg/kg三個劑量組均可顯著降低CCU所致的小鼠的ALT和AST活力升高，呈劑量相關性。結(jié)果見表l。表l.雞骨草總黃酮碳苷對CCl4致小鼠急性肝損傷的影響(3f±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*尸<0.05,**尸<0.01vs模型組；*尸<0.05,糊750.01vs正常組.3.2雞骨草總黃酮碳苷提取物對D-半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護作用D-半乳糖胺造模24hr后，與正常對照組相比，模型組血清中ALT和AST活力顯著升高(PO.Ol)。陽性藥甘草酸二銨鹽(25mg/kg,iv)、雞骨草膠囊組(12g/kg，ig)及測試藥物雞骨草總黃酮碳苷提取物25、50、100mg/kg三個劑量組均可顯著降低D-半乳糖胺致所致的小鼠的ALT和AST活力升高，呈劑量相關性。結(jié)果見表2。表2.雞骨草總黃酮碳苷對半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的影響(3F±S,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.3雞骨草總黃酮碳苷提取物對卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用造模10h后，與正常對照組相比，模型組血清ALT活力和AST活力顯著升高(戶O.Ol)。陽性藥甘草酸二銨鹽(25mg/kg，iv)和測試藥物雞骨草總黃酮碳苷提取物25、50、lOOmg/kg三個劑量組均可顯著降低卡介苗聯(lián)合LPS引起的ALT和AST活力升高。結(jié)果見表3c表3.雞骨草總黃酮碳苷對小鼠免疫性肝損傷的影響(3f±s,n=10)組別齊慢(mg/kg)ALT(U/L)AST正常組BCG+LPS模型組甘草酸二銨鹽AMExt.AMExt.AMExt.25(iv)25(ig)50(ig)100(ig)58.2±4.7108.8±49.2##71.2±9.7*67.6±11.7*64.1±8.5*61.3±6.6*155.3±21.6261.8±109.1##174.2±30.2*154.8±16.5"163.7±29.7*165.3±24.3*1尸<0.05，**尸<0.01vs模型組；*尸<0.05,糊戶O.Olvs正常組.3.4雞骨草總黃酮碳苷提取物對a-萘異硫氰酸酯致小鼠黃疸性肝損傷的保護作用與對照組相比，a-萘異硫氰酸酯顯著提高小鼠血清中T.BIL含量(PO.01),引起小鼠黃疽性肝損傷。陽性藥茵梔黃注射液和雞骨草總黃酮碳苷提取物的三個劑量組均能抑制a-萘異硫氰酸酯引起的小鼠血清T.BIL含量升高(與模型組比較，P<0.01)，呈劑量相關性。結(jié)果見表4。表4.雞骨草總黃酮碳苷對a-萘異硫氰酸酯致小鼠黃疸性肝損傷的影響(x±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.5雞骨草總黃酮碳苷提取物對CCU致大鼠慢性肝損傷的保護作用與對照組相比，CCI4所致慢性肝損傷模型組大鼠表現(xiàn)為血清ALT、AST和ALP水平顯著增高(均為P《01)，GLU水平顯著降低(尸O.Ol)。雞骨草總黃酮碳苷提取物(AMExt.)的兩個劑量組對多數(shù)指標均有不同程度的改善作用，與模型組相比達到統(tǒng)計學顯著差異的指標包括ALT,AST,ALP和GLU,結(jié)果見表5。CCI4致大鼠慢性肝損傷的病理學檢查結(jié)果計數(shù)資料以非參數(shù)方法進行統(tǒng)計學處理，結(jié)果見表6。表5.雞骨草總黃酮碳苷.對CCU致大鼠慢性肝損傷血液生化學指標的影響(n=10，3f±s)組另lj劑量(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)GLU(mmo1/10正常組108.0±16.9239.0±43.1309.8±55.17.81±0.63模型組1373.0±292.1**926.2±269.0**741.6±181.7**5.49±0.35**甘草酸二銨鹽25589.3±225.8**451.4±148.6**643.9土209.5**5.45±0.79**AMExt.25548.1*112.2****433.8*137.8**537.9±124.3****6.01±0.67**#AMExt.50425.6±62.2****323.4±87.8**384.3±84.3****6.82±0.57*****戶<0.05，"戶〈0.01vs正常組；#尸<0.05，糾戶〈0.01vs模型組表6.雞骨草總黃酮碳苷.對<:<:14致大鼠慢性肝損傷病理結(jié)果(n=10,3f±s)組另lj劑量Cmg/kg)點狀壞死(個/每肝切片)灶狀壞死(個/每肝切片)肝細胞脂肪變性(級別)肝匯管區(qū)纖維化(級別)正常組0.0±0.0**o.o土o.o0.0±0.0**0.0士0.0**模型組178.8±30.738.4±5.22.9±0,42,8±0.4甘草酸二銨鹽2550.2±8.4**29.5±5.21.8±0.5**1.710.5**AMExt.2539.1±5.2**23.4±0.9**2.2±0.4#AMExt.5030.3±4.3**22.9±3.4w0.5±0.4**1.7±0.5M尸<0.05、^P〈0.01vs模型組3.6雞骨草總黃酮碳苷提取物對酒精性大鼠肝損傷的保護作用與對照組相比，酒精性大鼠肝損傷模型組大鼠表現(xiàn)為血清TC、TG、ALT和AST水平顯著增高(均為/<0.01)。陽性藥東寶肝泰膠囊(600mg/kg)及測試藥物組雞骨草總黃酮碳苷提取物25、50mg/kg二個劑量組均可顯著降低酒精等綜合因素所致大鼠的TC、TG、ALT和AST活力升高，呈劑量相關性。結(jié)果見表7。病理切片檢査結(jié)果表明，酒精性肝損傷造模大鼠肝與正常組比較有明顯的組織學變化，肝細胞呈彌漫性輕至重度脂肪變性，可見明顯脂滴，并有少量炎細胞浸潤。陽性藥東寶肝泰、測試藥物雞骨草總黃酮碳苷二個劑量組與模型組比較，均有明顯的組織學改善，肝細胞脂肪變性顯著改善，肝組織的脂肪變性和脂滴空泡均明顯減少。14表7.雞骨草總黃酮碳苷對酒精性大鼠肝損傷的影響(n=10,3f±s)組另lj劑量(mg/kg)TC(mg/g)TG(mg/g)ALT(U/L)AST(U/L)正常組6.65±2.53102.1±26.53108.0±16.9239.0±43.1模型組26.73±6.42"186.4±23.69**873.0±292.1**900.2±213.0**東寶肝泰60012.67±2.44**162.1±20.4#489.3±225.8#351.4±148.6**AMExt.2510.28±4.09**'147.9±30.3448.1±112.2**333.8±97.8AMExt.509.10i3.27^132.1±18.4**425.6士62323.肚87.8***_P<0.05,*'TO.Olvs正常組；#戶<0.05，^i^O.Olvs模型組1權(quán)利要求1.一種從中藥毛雞骨草中提取分離得到的總黃酮碳苷提取物，主要含有芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，其化學結(jié)構(gòu)通式為id="icf0001"file="S2008100234600C00011.gif"wi="65"he="35"top="47"left="77"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1、R2代表葡萄糖或阿拉伯糖，R1和R2彼此相同或者不同。2.如權(quán)利要求1所述的總黃酮碳苷提取物，其黃酮碳苷含量達40%以上，其中序菜素-6,8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷所占比例分別為10~30%，5~30°/。和10~40%。3.權(quán)利要求1至2所述的總黃酮碳苷提取物，其特征在于由以下方法制備得到a.以水溶性溶劑作為提取溶劑提取中藥毛雞骨草原料，提取液濃縮至適量，得到提取濃縮液，所述的水溶性溶劑選自水、乙醇的一種溶劑或兩種溶劑組成的混合溶劑；b.上述a得到的提取液濃縮液，過濾或離心，濾液或上清液上樣于層析柱，以水、30~60%乙醇梯度洗脫，收集30~60%乙醇洗脫液，減壓回收至干，即得總黃酮碳苷提取物，其中所述的層析柱選自大孔吸附樹脂柱或聚酰胺樹脂柱。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中得到的總黃酮碳苷提取物再經(jīng)精制過程，便能得到純度更高的提取物，所述的精制方法為同樣或不同的層析方法純化，或者將總黃酮碳苷提取物以合適極性的溶劑進行提取，提取液回收溶劑，濃縮、干燥后郎得到純度更高的提取物，所述合適極性的溶劑選自體積比為75-100:25-0的乙醇水、丙酮水或甲醇水。5.—種藥物組合物，其特征是含有權(quán)利要求1至4任一項的總黃酮碳苷有效部位提取物及藥學上可接受的載體。6.權(quán)利要求1至5任一項的黃酮碳苷有效部位提取物在制備預防和治療急慢性肝炎及其相關疾病藥物中的應用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于急慢性肝炎及其相關疾病包括病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝和膽囊炎。全文摘要本發(fā)明屬于天然藥物領域，具體涉及從中藥毛雞骨草中提取分離的一種總黃酮碳苷有效部位提取物，主要含有芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、以及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，其黃酮碳苷含量達40％以上。本發(fā)明還涉及上述總黃酮碳苷提取物的提取分離方法。藥效學試驗表明，雞骨草總黃酮碳苷提取物可以作為活性部位制備預防和治療急慢性肝炎及其相關疾病藥物。文檔編號C07H17/07GK101250207SQ200810023460公開日2008年8月27日申請日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者劉卓偉,葉文才,張陸勇,江振洲,豪汪,非熊,趙守訓申請人:中國藥科大學