專利名稱：：川楝皮提取物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的川楝皮提取物及其提取方法和用途。背景介紹川楝皮系楝科楝屬植物，分布廣泛，具有驅(qū)蟲、療癬作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，川楝皮除具有驅(qū)蟲作用外，還具有抗腫瘤作用、抑菌抗病毒作用、抗肉毒作用，影響循環(huán)、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)。國內(nèi)外有關(guān)楝科植物化學(xué)成分的研究工作表明其含有三砲、香豆精、多糖類、黃酮、色素及油脂等多種化學(xué)成分，其中楝烷型四環(huán)三砲類化合物具有驅(qū)蟲、抗腫瘤、抗瘧、鎮(zhèn)痛、抗炎、催眠、抗焦慮等多方面作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了新的川楝皮提取物。本發(fā)明還提供了新的川楝皮提取物的混合物。本發(fā)明還提供了包含新的川楝皮提取物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了包含新的川楝皮提取物的混合物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了新的川楝皮提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了新的川楝皮提取物的混合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所指的新的川楝皮提取物，具有式I的結(jié)構(gòu)通式I其特征是化合物S1:R產(chǎn)OCOCH(CH3)CH2CH3，R2=R5=H,R3=OAc，R4=0H;或者化合物S2:R尸OCOCH(CH3)CH2CH3，R2=OAc，RfR4-H,R5=OH;或者化合物S3:R尸OCOCH(CH3)2，R2=R5=H，R3=OAc，R4K)H。本發(fā)明的新的川楝皮化合物的分離過程如下-川楝皮粉碎呈塊狀，95%乙醇浸漬過夜，加熱回流提取3次(3.0h，1.5h，1.5h)，提取液減壓回收乙醇，得乙醇提取物。該提取物加水分散后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分別減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部分。將乙酸乙酯部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚:乙酸乙酯系統(tǒng)(1:0，3:1，1:1,0:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分A。粗分組分A反復(fù)經(jīng)過硅膠柱層析、S印hadexLH-20凝膠柱、反相柱層析以及HPLC分離、純化，得到以上三個(gè)新化合物。相關(guān)的鑒定數(shù)據(jù)如表l、表2和表3:表1化合物S1NMR數(shù)據(jù)(CD3OD,JinHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2化合物S2NMR數(shù)據(jù)(CD30D，JinHz)NOl3C-NMR(7SMHz)'H-醒R(300MHz)HMBC(C)Roesy174.6,CH4.06,d(4.6)2,3，5，102,9,19a267.7，CH4.49,t(4.8)31,3,19b76.4,CH5.48,d(4.4)1,2,4,5,1'2,19^28441.7,qC29.1，CH2.72,m6b,286a24.2,CH22.17,m6b,306b1.73,m5,6a,28770.0,CH4.01,dd(1.6,3.2)6a'6b,14,30846.6,qC952.2,CH3.59,s1,8,10,11,14,19,30l，5,12b,14，181043.6'qC11213.6,qC12a51.7,CH22.60，d(16.3)11,13,14,1712b，3012b2.38，d(16.3)11,13,17181345.2,qC1461.8，CH3.34，s7,8,151815220.2,qC16a44.7,CH22.69，m1816b2.49,m1742.5,CH3.27，s12a，16b，301828.1，CH31.00's12,13,14,1719a65.8,CH24.55,d(13.勺1l，19b19b4.29，d(12.7)16a,19a,29，3020123.7,qC21141.9，CH7.45,s20,22,23I6a,1722U1.7，CH6.43，dd(0.8,1.7)20,21,2316a，17,18,2323144.4,CH7.48,1(1.6)20,21222818.8,CH30.80,s3,4,5,292995.3.CH5.75,s3,4,1"19b,28,2'3020.2,CH31.07,s7,8,9,14-0￡OCH3(l')172.9,qC21.0,CH32.11，sr-0￡OCH(CH3)CH2CH3(1")176.6，qC-OCO￡H(CH3)CH2CH3(2")42.4,CH2.45,mr-OCOCHH2CH3(5")16.9，CH31.17，d(7.0)r,2",3"-OCOCH(CH,)C%CHi(3''a)27.7，CH21.69,m-OCOCH(CH3)￡HaCH3(3"b)1.53,mr,2"-OCOCH(CH,)CH，CH，(4")11.8，CH30.94,t(7.4)2",3"表3化合物S3NMR數(shù)據(jù)(CD30D,JinHz)NO"C-NMR(125MHz)'H-隨R(500MHz)HMBC(C)Roesy174.4,CH4.19,dd(1.4,3.8)28272.3，CH5.70，t(3.8)1,3，19a,19b,2974.3，CH4.05，d(1.5)28442.7,qC27.9,CH2.79,dd(3.1,15.4)6b,9'286a24.3,CH22.15,m6b,306b1.74，dt(14.3,3.2)2870.0,CH4.04,m6a,6b，30846.4，qC952.2,CH3.61,s8,11,19,305'12b,141044.2,qC11213.6,qC12a51.8,CH22.61，d(16.4)11,14,1712b，1712b2.32,d(16.3)11,13,189'12a，181345.1，qC1461.8,CH3.34，s8,15,17,18,309,1815220.1,qC16a44.7,CH22.69，ddd(1.6，12.1,18.9)1516b16b2.49,dd(l8.9,8.2)13,14,15171742.6，CH3.29,t(4.0)18,21,3012a,16b,301828.1，CH30.99，s12,13,14,1619a65.3，CH24.48,dd(12.9,l.l)3,5,293019b4.32,d(12.9)13020123.7,qC21141.9,CH7.43，d(0.7)20,22,2316a22111.7'CH6.42，dd(1.0,0.8)20,21,2316a23144.4，CH7.47，t(1.6)20,21222819.5,CH30.96,s3,4,5,29292995.6,CH5.78,s3,1'2,6a,19a,19b,2'3020.2,CH31.08,s7,8,9,14-0￡OCH3(l')172.2，qC-OCOCH!(2')21.0,CH32.12,sr-0￡OCH(CH3)2(r)177.2,qC-OCO￡H(CH3)2(2")35.4,CH2.59,ml",3"，4"3"-OCOCH(CH2、2(3".4")19.1,CH31.18,d(l.l);1.16，d(1.1)l"，2"本發(fā)明的新的川楝皮化合物在分離的過程中可形成多組分的混合物，包括上述提及的三個(gè)新化合物。本發(fā)明的新的川楝皮化合物或其混合物可與藥學(xué)上可接受的載體形成組合物。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的細(xì)胞毒活性化合物的常規(guī)篩選方法，通過體外多種腫瘤細(xì)胞株的篩選研究，研究人員發(fā)現(xiàn)，式I化合物具有一定的抗腫瘤活性，可作為抗腫瘤藥物的候選藥。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本發(fā)明中沒有具體描述的提取、分離方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)說明書的提示采用藥典規(guī)定的方法或者其他操作規(guī)程限定的方法結(jié)合所使用儀器的說明書進(jìn)行操作，即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。實(shí)施例1粗分組分的制備川楝皮30kg，粉碎呈塊狀，95%乙醇浸漬過夜，加熱回流提取3次G.0h，1.5h，1.5h)，提取液減壓回收乙醇，得乙醇提取物。該提取物加水分散后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分別減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部分250g。將乙酸乙酯部分進(jìn)行硅膠柱層析分離，用石油醚:乙酸乙酯系統(tǒng)(1:0，3:1，1:1,0:1，V:V)梯度洗脫，按薄層含相同斑點(diǎn)合并，得粗分組分A(29.2g)。實(shí)施例2化合物Sl、S2、S3的分離將組分A(29.2g)，依次經(jīng)硅膠柱層析(氯仿:甲醇(8:1、1:1、0:1)梯度〕、SephadexLH-20凝膠柱層析(氯仿:甲醇(l:l))、硅膠柱層析〔氯仿:甲醇(20:1、10:1))、ODS反相柱層析〔75%甲醇)、SephadexLH-20凝膠柱層析(甲醇)、硅膠柱層析〔氯仿:甲醇(卯:l、70:1))、HPLC(32。/。-36。/。乙腈梯度)分離純化，分別得到化合物Sl(tR=83分鐘)、S2(tR=66分鐘)、S3(t^55分鐘)。實(shí)施例3活性實(shí)驗(yàn)篩選的細(xì)胞株有人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)測定按常規(guī)采用SRB法。材料細(xì)胞株人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)以上細(xì)胞株用相應(yīng)培養(yǎng)基，于37'C，5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.藥物化合物S1、S2、S3以及VP163.試劑3.1RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI1640+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/D。3.2高糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10%小牛血清+}^￡83.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。3.3胰酶、DMSO4.設(shè)備4.1C02培養(yǎng)箱、無菌操作臺、酶標(biāo)儀、離心機(jī)等。4.2移液槍、移液管、離心管、96孔板等。二.方法-2.1操作步驟2丄1接種取處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入適量胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，用含10%小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整稀釋至一定濃度.取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔。2丄2培養(yǎng)將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入恒溫C02培養(yǎng)箱中，在37°C，5%(202及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。2丄3初篩加藥受試化合物先用DMSO配制成0.1M濃度，再作5個(gè)稀釋度，用于篩選(濃度見結(jié)果)。加入受試化合物，20ul/孔，培養(yǎng)72小時(shí)。每組設(shè)3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次。2丄4染色將96孔板各孔接種細(xì)胞加TCA固定1h，水洗5遍干燥，加SRB染色15min，醋酸洗滌5遍干燥，Tris溶解。2丄5測定酶標(biāo)儀設(shè)定波長為490nm,測定96孔板每孔吸光值，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。2.2注意事項(xiàng)2.2.1細(xì)胞懸液需充分混勻，以避免各孔之間細(xì)胞分布不均，加細(xì)胞的過程應(yīng)控制在4小時(shí)以內(nèi)，避免細(xì)胞活性受損。2.2.2各板需單獨(dú)設(shè)定空白對照及陰性對照。2.3.1細(xì)胞抑制率的計(jì)算對照組平均OD值-給藥組平均OD值抑制率=-xl00%對照組平均OD值2.3.2ICso的計(jì)算根據(jù)Logit方法計(jì)算所得。活性篩選結(jié)果(IC5o,uM):化合物_人結(jié)腸癌(HT-29)5118.75214.35316.8VP1621,910權(quán)利要求1、從川楝皮中提取分離的化合物，具有式I結(jié)構(gòu)其特征是化合物S1R1＝OCOCH(CH3)CH2CH3，R2＝R5＝H，R3＝OAc，R4＝OH；或者化合物S2R1＝OCOCH(CH3)CH2CH3，R2＝OAc，R3＝R4＝H，R5＝OH；或者化合物S3R1＝OCOCH(CH3)2，R2＝R5＝H，R3＝OAc，R4＝OH。2、一種從川楝皮中提取的混合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的化合物。3、一種藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體c4、一種藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求2所述的混合物和藥學(xué)上可接受的載體c5、權(quán)利要求1的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求2的混合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了具有式I結(jié)構(gòu)的新的川楝皮化合物及其混合物，或與藥學(xué)上可接受的載體構(gòu)成的組合物，以及它們在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號C07J71/00GK101328202SQ20081002314公開日2008年12月24日申請日期2008年7月29日優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日發(fā)明者周春燕,唐海英,桑已曙申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司