專利名稱：：抗緊密連接蛋白3單克隆抗體以及使用該抗體的癌癥的治療和診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥的診斷和治療方法、以及細(xì)胞增殖抑制和抗癌藥。技術(shù)背景近年來，利用單克隆抗體的特征一一高靶特異性和低副作用的特質(zhì)，使用該抗體作為治療藥物的癌癥治療受到關(guān)注。作為治療藥物使用的抗體的主要抗肺瘤機理例如有以下的機理通過抗體，從正常細(xì)胞中識別肺瘤細(xì)月包；具有細(xì)胞毒作用的效應(yīng)細(xì)胞與抗體的結(jié)合，該抗體與在胂瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原特異性結(jié)合；或形成與該抗體結(jié)合的補體復(fù)合物；由效應(yīng)細(xì)胞或補體發(fā)揮的對該腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。以HER-2為耙的乳腺癌治療抗體司徒曼布、以CD20為粑的非何杰金淋巴瘤治療抗體利妥?，斂勺鳛槔每贵w治療癌癥的例子。但是，實際上顯示臨床有效性的抗體的數(shù)目目前僅有少數(shù)。因此，目前認(rèn)為適合抗體治療的對象癌癥種類受到^f艮大限定。對于現(xiàn)有的治療藥物幾乎無法獲得效果、因此幾乎沒有治療選擇方案的癌癥，人們強烈希望開發(fā)副作用少、抗腫瘤效果高的抗體治療藥物，確立新的治療方法。緊密連接蛋白(claudin)3是屬于緊密連接蛋白家族的蛋白質(zhì)的一種，在緊密連接中存在，具有除去緊密連接中特征性的細(xì)胞間空隙的作用。緊密連接是指在動物等生物體組織中，將相鄰的細(xì)胞膜結(jié)合的牢固的結(jié)構(gòu)。緊密連接蛋白3是控制離子等小的溶質(zhì)物質(zhì)的細(xì)胞間透過性的結(jié)構(gòu)蛋白。有報道稱在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等多種癌癥組織中的緊密連接蛋白3分子的表達(dá)升高(非專利文獻(xiàn)1-6)。緊密連接蛋白3的表達(dá)分布可參照TheSwedishHumanProteinAtlas(HPA)的網(wǎng)站(http:Vwww.proteinatlas.org/)。在婦科癌癥中，在美國致死率最高的子宮癌中顯示緊密連接蛋白3和緊密連接蛋白4的表達(dá)在化療藥物抗性的復(fù)發(fā)部位特別升高。緊密連接蛋白4與緊密連接蛋白3同樣，是屬于緊密連接蛋白家族的蛋白質(zhì)的一種。目前有報道稱在人的染色體上存在包白4的24種緊密連接蛋白基因家族。已知緊密連接蛋白3和緊密連接蛋白4均發(fā)揮產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C7oW"^ww;e/:/h力ge"力腸毒素(CPE)的毒素受體的功能。CPE與緊密連接蛋白3、緊密連接蛋白4結(jié)合之后，形成巨大復(fù)合物，由此在細(xì)胞膜上開孔，引發(fā)細(xì)胞壞死。對移植了表達(dá)緊密連接蛋白3、緊密連接蛋白4的人腫瘤細(xì)胞而制備的膽癌模型小鼠給予致死劑量以下(亞致死量)的CPE,則顯示腫瘤體積減小、存活率提高的數(shù)據(jù)(非專利文獻(xiàn)6-7)。雖然有人提出了CPE在人的臨床應(yīng)用的可能性，但是顯示藥效和致死毒性的給予量的差異的狹窄、或CPE本身對人的抗原性尚存疑問，因此實際上尚未達(dá)到臨床應(yīng)用階段。緊密連接蛋白3是具有四次跨膜區(qū)域的蛋白質(zhì)，具有在細(xì)胞外露出2個肽環(huán)的結(jié)構(gòu)。構(gòu)成預(yù)想為胞外環(huán)的肽序列的多肽部分如下所示，僅有51個氨基酸殘基(環(huán)l)和23個氨基酸殘基(環(huán)2)。胞外環(huán)1胞外環(huán)2[30-80][137-159]細(xì)胞膜=[9-29]=====[81國101]=======[116-136]=======[160-180]==[NH2-1畫8][102-115][181畫219畫COOH]胞質(zhì)的胞質(zhì)的胞質(zhì)的除此之外，動物種之間的緊密連接蛋白家族的序列同一性高，因此在常規(guī)免疫方法中極難獲得識別胞外區(qū)的抗體。并且，屬于緊密連接蛋白家族的分子互相具有非常相似的結(jié)構(gòu)，因此尚未確立獲得特異性識別亞型的抗體的方法(非專利文獻(xiàn)8)。作為識別在細(xì)胞上表達(dá)的緊密連接蛋白3的抗體，僅有報道，即，對雞免疫緊密連接蛋白3的部分肽，通過對該肽進行親和純化，獲得多克隆抗體，然后進行分離(非專利文獻(xiàn)3)。對與在細(xì)胞表面表達(dá)的天然分子型緊密連接蛋白-3結(jié)合的單克隆抗體進行分離、從而顯示其抗腫瘤作用的例子目前尚未有報道。非專利文獻(xiàn)1:Soini(2005)Histopathology46,551.非專利文獻(xiàn)2:Santin等人(2005)Br.J.Cancer92,1561.非專利文獻(xiàn)3:Offner等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54,431.非專利文獻(xiàn)4非專利文獻(xiàn)5非專利文獻(xiàn)6非專利文獻(xiàn)7非專利文獻(xiàn)8Long等人(2001)CancerRes.61,7878.Rangel等人(2003)Clin.CancerRes.9,2567.Kominsky等人(2004)Am.J.Path.164,1627.Santin等人(2005)CancerRes.65，4334.Hoevel等人(2002)J.Cell.Physiol.191,60.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供抗緊密連接蛋白3抗體及其用途。更具體地說，其目的在于提供新型的抗緊密連接蛋白3抗體、或使用抗緊密連接蛋白3抗體治療癌癥的新方法、含有抗緊密連接蛋白3抗體的新型的細(xì)胞增殖抑制劑或抗癌藥。本發(fā)明人通過將編碼緊密連接蛋白3多肽的DNA免疫小鼠，成功獲得了抗緊密連接蛋白3抗體。并且本發(fā)明人對這樣得到的抗體測定了與在細(xì)胞表面上表達(dá)的以下的屬于緊密連接蛋白家族的分子的結(jié)合活性。人緊密連接蛋白3蛋白、小鼠緊密連接蛋白3蛋白、人緊密連接蛋白1蛋白、人緊密連接蛋白4蛋白、和人緊密連接蛋白6蛋白。結(jié)果確認(rèn)，本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3抗體具有下述結(jié)合活性的任意一種或全部與人緊密連接蛋白3蛋白的高結(jié)合活性、與人和小鼠緊密連接蛋白3蛋白的高結(jié)合活性、以及與人緊密連接蛋白3蛋白和人緊密連接蛋白4蛋白的結(jié)合活性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)獲得的抗緊密連接蛋白3抗體包含以下抗體與具表面上表達(dá)的^緊密連接蛋白3蛋^特異性結(jié)合的抗體。""本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)獲得的抗緊密連接蛋白3抗體與內(nèi)源性表達(dá)緊密連接蛋白3的人乳腺癌細(xì)胞林MCF7顯示結(jié)合活性，了解到該抗體可用作原發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的各種癌細(xì)胞的診斷。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使用抗緊密連接蛋白3抗體，可以診斷下述各種癌組織的任意一種或全部ii表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的各種癌組織；表達(dá)緊密連接蛋白4蛋白的各種癌組織；以及共表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白和緊密連接蛋白4蛋白的癌組織本發(fā)明人進一步測定了抗緊密連接蛋白3抗體對于穩(wěn)定表達(dá)人緊密連接蛋白3蛋白的DG44細(xì)胞和上述MCF7細(xì)胞的補體依賴性細(xì)胞毒活性(CDC)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3抗體對于任何細(xì)胞均具有CDC活性。并且本發(fā)明人又測定了抗緊密連接蛋白3抗體對MCF7細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒活性(ADCC),發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3抗體對MCF7細(xì)胞具有ADCC活性。根據(jù)以上認(rèn)識，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗緊密連接蛋白3抗體對于原發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的各種癌癥的診斷、預(yù)防或治療有效，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明還提供含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的藥物組合物。本發(fā)明又提供含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的抗癌藥。優(yōu)選與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體是具有細(xì)胞毒活性的抗體。本發(fā)明的優(yōu)選方案中，可作為治療對象的癌癥是卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌。特別優(yōu)選乳腺癌。含有本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3抗體的抗癌藥對于上述緊密連接蛋白3表達(dá)亢進的、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的癌癥的治療有效。或者，本發(fā)明提供含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體和可藥用的載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物對于緊密連接蛋白3表達(dá)亢進的癌癥的治療和預(yù)防的任意一方面或兩者有效。即，本發(fā)明涉及與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體在用于癌癥治療和預(yù)防中的任意一方面或兩者的藥物組合物的制備中的應(yīng)用。在另外的方案中，本發(fā)明提供通過使緊密連接蛋白3表達(dá)細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸，對表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞毒的方法。本發(fā)明還提供通過使表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸，抑制表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞的增殖的方法。優(yōu)選與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體是具有細(xì)胞毒活性的抗體。還優(yōu)選表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞為癌細(xì)胞。在另一種方案中，本發(fā)明提供與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合、且對表選該細(xì)胞毒活性是ADCC活性。優(yōu)選該細(xì)胞毒活性是CDC活性。本發(fā)明還提供結(jié)合了細(xì)胞毒性物質(zhì)的抗體。本發(fā)明中，與抗體結(jié)合的細(xì)胞毒性物質(zhì)可給出化療藥物、放射性同位素、以及毒性肽。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為抗體本身具有細(xì)胞毒活性的抗體。在又一方案中，本發(fā)明提供癌癥的診斷方法，其特征在于使用與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，檢測緊密連接蛋白3蛋白。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選檢測緊密連接蛋白3蛋白的胞外區(qū)。還優(yōu)選本發(fā)明的方法是使用識別緊密連接蛋白3蛋白的抗體進行。在其它方案中，本發(fā)明提供癌癥的診斷方法，該癌癥的診斷方法包含以下步驟(a)由^皮檢者采集試樣的步驟；(b)使用與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，檢測采集的試樣中所含的緊密連接蛋白3蛋白的步驟。本發(fā)明中，上述試樣只要是可從^皮檢者中采集的即可，可以使用任何試樣。在一個方案中，使用從被檢者采集的血液試樣。在其它方案中，也使用通過外科或活檢由被檢者采集的試樣。該診斷方法的癌癥只要是作為對象的癌細(xì)胞表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的癌癥即可，可以是任何癌癥。本發(fā)明中優(yōu)選的癌癥是卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌。特別優(yōu)選乳腺癌。根據(jù)本發(fā)明，可以診斷這些癌癥的原發(fā)性病灶以及轉(zhuǎn)移性病灶的任意一種。本發(fā)明中，從被檢者采集試樣的步驟也可稱作是由受試者提供試樣的步驟。在又一種方案中，本發(fā)明提供癌癥的診斷方法，該診斷方法包含以下步驟(l)將用放射性同位素標(biāo)記的、與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予被檢者的步驟；以及(2)檢測上述放射性同位素的聚集的步驟。在某一方案中，放射性同位素是正電子發(fā)射核素。本發(fā)明中的優(yōu)選正電子發(fā)射核素例如可選自"C、13N、150、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I。在又一方案中，本發(fā)明提供癌癥的診斷方法，其特征在于；險測編碼緊密連接蛋白3蛋白的基因的表達(dá)。在又一方案中，本發(fā)明提供用于本發(fā)明的診斷方法的診斷藥或試劑盒。即，本發(fā)明提供以下發(fā)明。單克隆抗體，該單克隆抗體與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合。[2][l]所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。[2]所述的單克隆抗體，該單克隆抗體基本上不與含有SEQIDN0.2所述氨基酸序列的第30號-第80號氨基酸序列的肽、或含有第137號-159號氨基酸的肽交叉反應(yīng)。[1]-[3]中任一項所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.4所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。[1]-[3]中任一項所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.8所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合?？贵w，該抗體識別由蛋白質(zhì)的2個胞外環(huán)形成的立體結(jié)構(gòu)并結(jié)合，其中，所述蛋白質(zhì)是在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDNO,2、SEQIDN0.4、和SEQIDN0.8中任一個所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。[6]所述的抗體，該抗體基本上不與含有SEQIDNO.2所述氨基酸序列的第30號-第80號氨基酸序列的肽、或含有第137號-159號氨基酸的肽交叉反應(yīng)。[6]或[7]所述的抗體，該抗體是單克隆抗體。[1]-[8]中任一項所述的抗體，該抗體具有細(xì)胞毒活性。[9]所述的抗體，其中，細(xì)胞毒活性是ADCC活性。[9]所述的抗體，其中，細(xì)胞毒活性是CDC活性。[l]-[ll]中任一項所述的抗體，該抗體結(jié)合有化療藥物或毒性肽。抗體，該抗體是與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，結(jié)合有選自化療藥物、毒性肽和放射性同位素的任意一種細(xì)胞毒活性物質(zhì)。[1]-[13]中任一項所述的抗體，該抗體是以下(1)-(61)中任一項所述的抗體(1)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.12所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.14所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.16所述的氨基酸序列作為CDR3;(2)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.20所述的氨基酸序列的139-462號氨基酸序列作為CH;(3)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;14(4)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.24所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.26所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.28所述的氨基酸序列作為CDR3;(5)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.32所述的氨基酸序列的135-240號氨基酸序列作為CL;(6)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(7)抗體，該抗體含有(l)所述的H鏈和(4)所述的L鏈；(8)抗體，該抗體含有(2)所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(9)抗體，該抗體含有(3)所述的H鏈和(6)所述的L鏈；(10)抗體，該抗體是在(l)-(9)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(l)-(9)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(11)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.36所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.38所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.40所述的氨基酸序列作為CDR3;(12)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.44所述的氨基酸序列的140-476號氨基酸序列作為CH;(13)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(14)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.46所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.48所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.50所述的氨基酸序列作為CDR3;(15)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.54所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(16)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(17)抗體，該抗體含有(ll)所述的H鏈和(14)所述的L鏈；(18)抗體，該抗體含有(12)所述的H鏈和(15)所述的L鏈；(19)抗體，該抗體含有(13)所述的H鏈和(16)所述的L鏈；(20)抗體，該抗體是在(11)-(19)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(11)-(19)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(21)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.56所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.58所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.60所述的氨基酸序列作為CDR3;(22)含有pi)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.64所述的氨基酸序列的137-471號氨基酸序列作為CH;(23)含有(21)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(24)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.66所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.68所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.70所述的氨基酸序列作為CDR3;(25)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.74所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(26)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(27)抗體，該抗體含有(21)所述的H鏈和(24)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體含有(22)所述的H鏈和(25)所述的L鏈；(29)抗體，該抗體含有(23)所述的H鏈和(26)所述的L鏈；(30)抗體，該抗體是在(21)-(29)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(21)-(29)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(31)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.76所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.78所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.80所述的氨基酸序列作為CDR3;(32)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.84所述的氨基酸序列的140-463號氨基酸序列作為CH;(33)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(34)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.86所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.88所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.90所述的氨基酸序列作為CDR3;(35)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.94所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(36)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(37)抗體，該抗體含有(31)所述的H鏈和(34)所述的L鏈；(38)抗體，該抗體含有(32)所述的H鏈和(35)所述的L鏈；(39)抗體，該抗體含有(33)所述的H鏈和(36)所述的L鏈；(40)抗體，該抗體是在(31)-(39)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(31)-(39)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(41)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.96所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.98所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.100所述的氨基酸序列作為CDR3;(42)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.104所述的氨基酸序列的140-474號氨基酸序列作為CH;(43)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(44)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.106所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.108所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.110所述的氨基酸序列作為CDR3;(45)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.114所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(46)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(47)抗體，該抗體含有(41)所述的H鏈和(44)所述的L鏈；(48)抗體，該抗體含有(42)所述的H鏈和(45)所述的L鏈；(49)抗體，該抗體含有(43)所述的H鏈和(46)所述的L鏈；(50)抗體，該抗體是在(41)-(49)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(41)-(49)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(51)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.167所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.169所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.171所述的氨基酸序列作為CDR3;17(52)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.173所述的氨基酸序列的118-447號氨基酸序列作為CH;(53)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(54)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.179所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.181所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.183所述的氨基酸序列作為CDR3;(55)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.185所述的氨基酸序列的113-218號氨基酸序列作為CL;(56)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(57)抗體，該抗體含有(51)所述的H鏈和(54)所述的L鏈；(58)抗體，該抗體含有(52)所述的H鏈和(M)所述的L鏈；(59)抗體，該抗體含有(53)所述的H鏈和(56)所述的L鏈；(60)抗體，該抗體是在(51)-(59)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(51)-(59)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(61)抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與(1)-(60)中任一項所述的抗體所結(jié)合的緊密連接蛋白3蛋白的表位相同。癌癥的診斷方法，該診斷方法包含將上述[1]-[14]中任一項所述的抗體與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的步驟。癌癥的i貪斷方法，該診斷方法包含以下步驟(a)從被檢者采集試樣的步驟；(b)使用與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，檢測釆集的試樣中所含的緊密連接蛋白3蛋白的步驟。癌癥的診斷方法，該診斷方法包含以下步驟(l)將用放射性同位素標(biāo)記的、與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予^^企者的步驟；以及(2)檢測上述放射性同位素的聚集的步驟。[17]所述的診斷方法，其中，放射性同位素是正電子發(fā)射核素。[19][18]所述的診斷方法，其中，正電子發(fā)射核素是選自UC、13N、150、18F、"Tl55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I的任意之一的核素。[20][15]-[19]中任一項所述的診斷方法，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。[20]所述的診斷方法，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。[22][20]所述的診斷方法，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。[23]用于癌癥的診斷方法的診斷藥，該診斷藥含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體。用于癌癥的診斷方法的試劑盒，該試劑盒含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體和含有緊密連接蛋白3蛋白的生物試樣。藥物組合物，該藥物組合物含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分。細(xì)胞增殖抑制劑，該細(xì)胞增殖抑制劑含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分?？拱┧帲摽拱┧幒信c緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分。[27]所述的抗癌藥，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。[28]所述的抗癌藥，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。[30][28]所述的抗癌藥，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。[31][28]所述的抗癌藥，其中，抗體為[1]-[14]中任一項所述的抗體。[32]與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體在制備抗癌藥中的應(yīng)用。[34][33]中所述的應(yīng)用，其中，癌癥為選自卯巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。[33]所述的應(yīng)用，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。[36][33]所述的應(yīng)用，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。[37][32]或[33]中所述的應(yīng)用，其中，抗體為[1]-[14]中任一項所述的抗體。抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包含將與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)19合的抗體給予對象的步驟。預(yù)防或治療癌癥的方法，該方法包含將與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予對象的步驟。[39]所述的方法，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。[39]所迷的方法，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。[42][39]所述的方法，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。[43][38]或[39]所述的方法，其中，抗體為[1]-[14]中任一項所述的抗體。對表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞毒的方法，該方法包含將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸的步驟。抑制表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞的增殖的方法，該方法包含將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸的步驟。[44]或[45]所述的方法，其中，表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞為癌細(xì)月包。[44]-[46]中任一項所述的方法，其中，抗體是具有細(xì)胞毒活性的抗體。[44]-[46]中任一項所述的方法，其中，抗體是[1]-[14]中任一項所述的抗體。與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，該抗體應(yīng)用于癌癥的治療方法。[49]所述的抗體，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。[50]所述的抗體，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。[52][50]所述的方法，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。[53][50]所述的抗體，該抗體是[1]-[14]中任一項所述的抗體。20圖l是表示緊密連接蛋白3胞外環(huán)與人緊密連接蛋白家族分子的比對和沖對狀圖。圖2是表示人、小鼠緊密連接蛋白3氨基酸序列比對的圖。下劃線部表示預(yù)想的跨膜區(qū)域，方框部表示預(yù)想的胞外區(qū)。圖3是表示表達(dá)緊密連接蛋白3的DG44細(xì)胞和Ba/F3細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞抹MCF7中的抗緊密連接蛋白3抗體結(jié)合反應(yīng)性不同的圖。(A)表示Ba/F3細(xì)胞，(B)表示乳腺癌細(xì)胞抹MCF7?？v軸、一黃軸表示X幾何平均數(shù)值(熒光強度(相對值))。圖4是表示抗緊密連接蛋白3單克隆抗體與緊密連接蛋白3胞外環(huán)肽區(qū)域的結(jié)合性的圖?？v軸表示405nm的吸光度(參照波長655nm)，橫軸表示抗緊密連接蛋白3抗體的抗體濃度(ng/mL)。圖5是表示抗緊密連接蛋白3抗體誘導(dǎo)抗原表達(dá)依賴性的細(xì)胞毒活性的圖?？v軸表示通過添加補體使死亡細(xì)胞增加的比例(％)。圖6是表示抗緊密連接蛋白3抗體誘導(dǎo)對MCF7細(xì)胞的補體依賴性毒活性的圖?？v軸表示鉻游離率(％)。圖7是表示抗緊密連接蛋白3抗體誘導(dǎo)對MCF7細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒活性的圖?？v軸表示鉻游離率(％)。圖8是使用流式細(xì)胞儀表示重組嵌合抗體與緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞特異性結(jié)合的圖。縱軸表示細(xì)胞數(shù)(熒光系數(shù))，橫軸表示熒光強度值。圖9-1是表示對各種抗緊密連接蛋白3抗體與以下表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性進行分析的FACS的結(jié)果圖表(單克隆抗體CDN1、CDN2、和CDN3的結(jié)果)。CLD3/3:天然型表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞，1/3:CLD1/3嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞、3/1:CLD3/1嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞、Ba/F3:宿主細(xì)胞Ba/F3。X軸表示熒光強度，Y軸表示各熒光強度下的相對細(xì)胞數(shù)。圖9-2接續(xù)圖9-1(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN4、CDN5、和CDN7的結(jié)果)圖9-3接續(xù)圖9-2(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN8、CDN16、和CDN17的結(jié)果)圖9-4接續(xù)圖9-3(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN24、CDN27、和CDN28的結(jié)果)圖9-5接續(xù)圖9-4(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN29、CDN30、和CDN31的結(jié)果)圖9-6接續(xù)圖9-5(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN32、CDN33、和CDN35的結(jié)果)圖9-7接續(xù)圖9-6(抗緊密連接蛋白3單克隆抗體CDN36、CDN37、和CDN38的結(jié)果)圖9-8接續(xù)圖9-7(抗緊密連接蛋白3抗血清[稀釋200倍]、抗緊密連接蛋白3抗血清[稀釋IOOO倍]和未添加陰性的結(jié)果)。圖IO是表示圖9-1至圖9-7中所示的直方圖橫軸的相對熒光強度為100以上的細(xì)胞相對于全體細(xì)月包的比例圖表。圖11是表示通過流式細(xì)胞術(shù)表示重組嵌合抗體與緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合結(jié)果的圖?？v軸表示細(xì)胞數(shù)(熒光系數(shù))，橫軸表示熒光強度?；疑摼€、黑色實線分別表示未添加嵌合抗體、添加時的細(xì)胞焚光強度分布。圖12是表示軟瓊脂集落形成/MTT雜交測定體系中，抗緊密連接蛋白3抗體抑制MCF7細(xì)胞增殖的情形的圖表。圖13是表示創(chuàng)面愈合測定中，通過添加抗緊密連接蛋白3抗體(CDN04)來抑制細(xì)胞運動能力的情形的照片。虛線所框取的區(qū)域的細(xì)胞是經(jīng)剝離處理后移動的細(xì)胞。具體實施例方式緊密連接蛋白3是屬于緊密連接蛋白家族的蛋白質(zhì)的一種，是控制細(xì)胞間透過性的結(jié)構(gòu)蛋白。人緊密連接蛋白3的氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的堿基序列分別如SEQIDN0.2和SEQIDNO.1所示(GenBankAccessionNo.NM—001306)。本發(fā)明中，單克隆抗體所識別的緊密連接蛋白3蛋白是指保持天然的緊密連接蛋白3蛋白的立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選識別緊密連接蛋白3的胞外區(qū)并結(jié)合。緊密連接蛋白3蛋白的胞外區(qū)在SEQIDN0.2的氨基酸序列中相當(dāng)于第30-80號(環(huán)1),在SEQIDN0.2的氨基酸序列中相當(dāng)于第137-159號(環(huán)2)。含有這些胞外區(qū)的氨基酸序列的多肽只要可保持細(xì)胞表面的緊密連接蛋白3的立體結(jié)構(gòu)即可，本發(fā)明的單克隆抗體可以識別該多肽。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選與保持在細(xì)胞表面表達(dá)的天然的緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)的多肽結(jié)合。多肽保持天然的緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)，這例22如可如下確認(rèn)。即，本發(fā)明的單克隆抗體與在細(xì)胞表面表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞免疫學(xué)結(jié)合被某種多肽抑制時，可以確認(rèn)該多肽保持了天然的緊密連接蛋白3胞外區(qū)的立體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明特別優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體識別含有由緊密連接蛋白3的2個胞外環(huán)區(qū)構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)的表位。本發(fā)明中，含有立體結(jié)構(gòu)的表位包含通過1個或多個肽鏈間的相互作用而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。這樣的表位被稱為立體結(jié)構(gòu)表位(構(gòu)象性表位)。例如，由構(gòu)成緊密連接蛋白3的胞外結(jié)構(gòu)域的2個環(huán)之間的相互作用而構(gòu)成的表位包含含有本發(fā)明的立體結(jié)構(gòu)的表位。即，本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選識別由緊密連接蛋白3的2個胞外環(huán)構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)表位。單克隆抗體識別立體結(jié)構(gòu)表位，這例如可如下確i人。例如，合成線狀的肽，該線狀肽含有構(gòu)成緊密連接蛋白3胞外環(huán)的氨基酸序列。該肽可化學(xué)合成?；蛘呃镁o密連接蛋白3的cDNA中編碼相當(dāng)于環(huán)部分的氨基酸序列的區(qū)域，通過基因工程方法獲得。接著，評價含有構(gòu)成環(huán)部分的氨基酸序列的線狀肽與受試抗體的結(jié)合活性。例如，通過以被固定的線狀肽作為抗原的ELISA,可評價受試抗體與該肽的結(jié)合活性?；蛘吒鶕?jù)受試抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合中線狀肽的抑制水平，可以明確與線狀肽的結(jié)合活性。通過這些實驗，可以明確受試抗體與線狀肽的結(jié)合活性。本發(fā)明中，與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合的抗體與線狀肽也具有結(jié)合活性時，稱作"抗體與線狀肽具有交叉反應(yīng)性"。本發(fā)明中的優(yōu)選的單克隆抗體是與線狀肽基本上不具有交叉反應(yīng)性的抗體，其中線狀肽含有構(gòu)成緊密連接蛋白3胞外環(huán)的氨基酸序列。與線狀肽基本上不具有交叉反應(yīng)性是指同抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合活性相比，與線狀肽的結(jié)合活性例如為50%以下，通常為30%以下，優(yōu)選20%以下。本發(fā)明的單克隆抗體識別立體結(jié)構(gòu)表位，這可如下確認(rèn)。首先準(zhǔn)備表達(dá)嵌合分子的細(xì)胞，該嵌合分子使緊密連接蛋白3的2個胞外環(huán)分別與其它的緊密連接蛋白3樣分子的胞外環(huán)連接而成。緊密連接蛋白3樣分子例如可使用人緊密連接蛋白1。例如，制作表達(dá)如下構(gòu)成的嵌合分子的強制表達(dá)細(xì)胞。3/1嵌合1/3嵌合天然23環(huán)1緊密連接蛋白3緊密連接蛋白1緊密連接蛋白3環(huán)2緊密連接蛋白1緊密連接蛋白3緊密連接蛋白3使受試抗體與這些強制表達(dá)細(xì)胞接觸，同與天然型的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合活性相比，與3/1嵌合表達(dá)細(xì)胞和1/3嵌合表達(dá)細(xì)胞兩者的結(jié)合活性低的單克隆抗體是識別緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)表位的抗體。如上所述，例如識別由構(gòu)成緊密連接蛋白3胞外結(jié)構(gòu)域的2個環(huán)之間的相互作用構(gòu)成的表位的單克隆抗體是本發(fā)明的識別緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)表位的抗體的優(yōu)選方案之一。更具體的表現(xiàn)是本發(fā)明的優(yōu)選的單克隆抗體與強制表達(dá)人緊密連接蛋白3的細(xì)胞強烈結(jié)合，而與3/1嵌合表達(dá)細(xì)胞和1/3嵌合表達(dá)細(xì)胞兩者均實質(zhì)性不結(jié)合。這里，實質(zhì)性不結(jié)合是指與表達(dá)人緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合活性的80%以下，通常為50%以下，優(yōu)選30%以下，特別優(yōu)選15%以下的結(jié)合活性。測定抗體與細(xì)胞的結(jié)合活性的方法例如有抗體實驗手冊(EdHarlow:DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)中的359-420頁所述的方法。即，可通過以細(xì)胞作為抗原的ELISA或FACS(熒光激活細(xì)胞分選儀)的原理進行評價。在ELISA形式中，抗體與細(xì)胞的結(jié)合活性通過比較酶促反應(yīng)產(chǎn)生的信號水平來定量評價。即，向固定了各強制表達(dá)細(xì)胞的ELISA板上加入受試抗體，利用識別受試抗體的酶標(biāo)記抗體來檢測與細(xì)胞結(jié)合的抗體?；蛘咴贔ACS中，制備受試抗體的稀釋系列，通過確定與各強制表達(dá)細(xì)胞的抗體結(jié)合效價來比較與細(xì)胞的結(jié)合活性。在懸浮于緩沖液等中的細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原與抗體的結(jié)合可通過流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀例如已知有以下裝置。FACSCantoTMIIFACSAriaTMFACSArrayFACSVantageSEFACSCalibur(均為BDBiosciences的商品名)EPICSALTRAHyPerSortCytomicsFC500EPICSXL-MCLADCEPICSXLADCCellLabQuanta/CellLabQuantaSC(均為BeckmanCoulter的商品名).受試緊密連接蛋白3抗體與抗原的結(jié)合活性的優(yōu)選測定方法的一個例子是以下方法。首先用FITC標(biāo)記的二次抗體染色，該二次抗體識別與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞反應(yīng)的受試抗體。受試抗體的濃度用適合的緩沖液適當(dāng)稀釋，調(diào)節(jié)成所需濃度使用。例如，可以以10ng/mL-10ng/mL之間的任意濃度使用。接著，通過FACSCalibur(BD制備)測定焚光強度和細(xì)胞數(shù)?？贵w與該細(xì)胞的結(jié)合量是使用CELLQUEST軟件(BD制備)進行分析，反映為熒光強度、即幾何平均數(shù)值。即，通過獲得該幾何平均數(shù)值，可以測定由抗體的結(jié)合量表示的抗體的結(jié)合活性。本方法中，例如"基本上不與3/1嵌合表達(dá)細(xì)胞結(jié)合"可通過以下方法判斷。首先將受試抗體用二次抗體染色，該受試抗體與表達(dá)上述3/1嵌合分子的細(xì)胞結(jié)合。例如，如果受試抗體為小鼠的抗體，則可以利用FITC標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白抗體作為二次抗體。接著，檢測細(xì)胞的熒光強度。熒光檢測是使用FACSCalibur作為流式細(xì)胞術(shù)時，所得熒光強度可使用CELLQUEST軟件分析。按照下述計算式，由受試抗體存在和非存在下的幾何平均數(shù)值計算該比(AGeo-Mean),由此可以求出受試抗體的結(jié)合導(dǎo)致的熒光強度增加的比例。AGeo-Meai^Geo-Mean(受試抗體存在下)/Geo-Mean(受試抗體非存在下)將通過分析得到的、反映了受試抗體與3/1嵌合分子表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合量的幾何平均數(shù)比值(3/1嵌合分子AGeo-Mean值)與反映了受試抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合量的AGeo-Mean值比較。這種情況下，特別優(yōu)選求出3/1嵌合分子表達(dá)細(xì)胞以及表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的AGeo-Mean比值時所使用的受試抗體的濃度可以用互相相同或基本上相同的濃度調(diào)節(jié)。對照抗體可以利用預(yù)先確認(rèn)了識別緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)表位的單克隆抗體。例如圖9所示的以下的本發(fā)明的單克隆抗體可用作識別緊密連接蛋白3的立體結(jié)構(gòu)表位的抗體。CD畫，CDN02,CDN03,CDN04，CDN05,CD麗，CD濯，CDN16,CDN17,CDN24,CDN27,CDN28,CDN29,CD畫，CDN31,CDN32,CDN33,CDN35,CDN36,CDN37或CDN38本發(fā)明中，受試抗體與3/1嵌合分子表達(dá)細(xì)胞的AGeo-Mean比值至少為受試抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的AGeo-Mean比值的80%,優(yōu)選50%、進一步優(yōu)選30%，特別優(yōu)選比15%還小，則為"與3/1嵌合分子表達(dá)細(xì)胞基本上不結(jié)合"。求出Geo-Mean值(幾何平均數(shù))的計算式記于CellQUEST軟件用戶指南(BDBiosciences)。與1/3嵌合分子表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性也可同樣進行評價。公知的結(jié)合活性評價中使用的表達(dá)3/l嵌合分子、1/3嵌合分子、以及緊密連接蛋白3各分子的細(xì)胞均利用共通的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞制備，優(yōu)選各細(xì)胞的表達(dá)量為同等程度。本發(fā)明的單克隆抗體包含以下的單克隆抗體與表達(dá)人緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合、且與表達(dá)包含人緊密連接蛋白3胞外環(huán)和人緊密連接白3的細(xì)胞的結(jié)合活性低的單克隆抗體?；蛘?發(fā)明的優(yōu)選:々單克隆抗體包含下述單克隆抗體與表達(dá)人緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合、且與表達(dá)包含人緊密連接蛋白3胞外環(huán)和人緊密連接蛋白l胞外環(huán)的嵌合分子的細(xì)胞基本上不結(jié)合的單克隆抗體?？咕o密連接蛋白3單克隆抗體的制備本發(fā)明的單克隆抗體可通過DNA免疫獲得。本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3單克隆抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包含通過雜交瘤生成的、以及通過基因工程方法由用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主所生成的。本發(fā)明的生成單克隆抗體的雜交瘤可使用DNA免疫如下制備。DNA免疫是將載體DNA給予該免疫動物，使免疫抗原在免疫動物的機體內(nèi)表達(dá)，由此獲得免疫刺激的方法。其中所述載體DNA以編碼抗原蛋白質(zhì)的基因可在免疫動物中表達(dá)的方式構(gòu)建。與給予蛋白質(zhì)抗原的常頭見免疫方法相比，DNA免疫有以下的優(yōu)越性。一可保持緊密連接蛋白3這樣的膜蛋白的結(jié)構(gòu)，并獲得免疫刺激一無需純化免疫抗原但是，在DNA免疫中，難以與佐劑等免疫刺激手段組合使用。緊密連接蛋白3的人-小鼠之間的同一性特別是在構(gòu)成胞外區(qū)的環(huán)1中為46/51,極高。識別這種種間同一性高的蛋白質(zhì)的單克隆抗體可通過DNA免疫獲得，這是預(yù)想外的成果。通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體時，首先是將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的DNA給予免疫動物。編碼緊密連接蛋白3的DNA可通過PCR等公知的方法合成。將所得DNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，給予免疫動物。表達(dá)載體例如可利用pcDNA3.1等市售的表達(dá)載體。將載體給予生物體的方法也可利用常規(guī)使用方法。例如將吸附有表達(dá)載體的金顆粒通過基因槍射入細(xì)胞內(nèi)，由此可進行DNA免疫。根據(jù)本發(fā)明人的認(rèn)識，通過腹腔內(nèi)給予緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞進行免疫的小鼠中無法高效率獲得生成緊密連接蛋白3結(jié)合性抗體的雜交瘤。而利用DNA免疫進行免疫的小鼠中可高效率獲得生成緊密連接蛋白3結(jié)合性抗體的雜交瘤。特別是在DNA免疫后進一步給予緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞的小鼠中，可容易地獲得目標(biāo)雜交瘤。即，DNA免疫后通過表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞進行追加免疫(激發(fā))，這是獲得本發(fā)明的單克隆抗體的優(yōu)選方法。本發(fā)明中，可以利用任意的非人動物作為免疫動物。為了通過細(xì)胞融合法獲得單克隆抗體，優(yōu)選考慮與細(xì)胞融合中所使用的母細(xì)胞的相容性來選擇免疫動物。通常優(yōu)選嚙齒類的動物作為免疫動物。具體可以將小鼠、大鼠、倉鼠或兔作為免疫動物。其它也可以使用猴等作為免疫動物。如上所述，確認(rèn)免疫動物被免疫、血清中目標(biāo)抗體效價升高，然后從免疫動物中采集抗體生成細(xì)胞，進行克隆。優(yōu)選的免疫細(xì)胞(抗體生成細(xì)胞)是脾細(xì)胞。與上述免疫細(xì)胞融合的細(xì)胞可使用哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選具備用于進行篩選的適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是指在特定的培養(yǎng)條件下可(或者無法)存活的細(xì)胞。公知的選擇標(biāo)記有次黃噪呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸苷激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等。具有HGPRT或TK缺損的細(xì)胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性細(xì)胞無法在HAT選擇性培養(yǎng)基中進行DNA合成，會死亡，但與正常的細(xì)胞融合，則可利用正常細(xì)胞的補救途徑繼續(xù)合成DNA,因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也可增殖。27HGPRT缺損或TK缺損的細(xì)胞可分別由含有6-硫代鳥噤呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5，-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基選擇。正常的細(xì)胞會將這些嘧啶類似物攝入到DNA中，因此死亡。而缺損這些酶的細(xì)胞無法攝入這些嘧啶類似物，因此可在選擇培養(yǎng)基中存活。除此之外，被稱為G418抗性的選擇標(biāo)記通過新霉素抗性基因獲得對2-脫氧鏈霉胺系抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。細(xì)胞融合中優(yōu)選的各種骨髓瘤細(xì)胞是公知的。例如可以將下述骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)用于本發(fā)明的單克隆抗體的制備。P3(P3x63Ag8.653)(丄Immunol.(1979)123，1548-1550);P3x63Ag8U.1(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology(1978)81,1-7);NS-1(Kohler.G.和Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519);MPC-11(Margulies.D.H等人，Cell(1976)8,405-415);SP2/0(Shulman,M等人，Nature(1978)276，269-270);FO(deStGroth,S.F等人，J.Immunol.Methods(1980)35,1-21);S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323);R210(Galfre,G等人，Nature(1979)277,131-133)等基本上可按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G和Milstein,C.,MethodsEnzymol.(1981)73,3國46)等，進行上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)月包融合。更具體地說，例如可在細(xì)胞融合促進劑的存在下、在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施上述細(xì)胞融合。融合促進劑例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。為了進一步提高融合效率，可以根據(jù)需要添加二曱基亞砜等輔助劑。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的使用比例可任意設(shè)定。例如相對于骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使免疫細(xì)胞為1-10倍。上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液例如可利用適合上述骨髓瘤細(xì)胞抹增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、其它在該種細(xì)胞培養(yǎng)中使用的常規(guī)培養(yǎng)液。還可以在培養(yǎng)液中進一步添加胎牛血清(FCS)等的血清補液。細(xì)胞融合是將上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的規(guī)定量在上述培養(yǎng)液中充分混合，再混合預(yù)先加溫至37。C左右的PEG溶液來形成目標(biāo)融合細(xì)胞(雜交瘤)。細(xì)胞融合法中，例如通常可以以30-60%(w/v)的濃度添加平均分子量1000-6000左右的PEG。接著依次添加上述例舉的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，離心，除去上清，將這些操作反復(fù)進行，除去雜交瘤生長發(fā)育不優(yōu)選的細(xì)胞融合劑等。這樣得到的雜交瘤可通過選擇培養(yǎng)液進行選擇，所述選擇培養(yǎng)液根據(jù)在細(xì)胞融合中使用的骨髓瘤所具有的選擇標(biāo)記而得到。例如具有HGPRT或TK缺損的細(xì)胞可以通過在HAT培養(yǎng)液(含有次黃噤呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來選擇。即，將HAT感受性的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞融合時，在HAT培養(yǎng)液中，可以選擇性增殖與正常細(xì)胞成功地進行了細(xì)胞融合的細(xì)胞。可以繼續(xù)使用上述HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)至使目標(biāo)雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡所足夠的時間。具體來說，通常通過數(shù)天-數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇目標(biāo)雜交瘤。接著，實施通常的極限稀釋法，可以實施生成目標(biāo)抗體的雜交瘤的篩選和單一克隆?；蛘甙凑諊H公開WO03/104453所述的方法制備識別緊密連接蛋白3的抗體。目標(biāo)抗體的篩選和單一克隆可通過基于公知的抗原抗體反應(yīng)的篩選方法實施。例如，本發(fā)明中優(yōu)選的單克隆抗體可以與在細(xì)胞表面表達(dá)的緊密連接蛋白3結(jié)合。上述單克隆抗體例如可以通過FACS(熒光激活細(xì)胞分類術(shù))進行篩選。FACS是將與熒光抗體接觸的細(xì)胞用激光進行分析，測定各個細(xì)胞發(fā)出的熒光，由此測定抗體與細(xì)胞表面的結(jié)合的系統(tǒng)。為了根據(jù)FACS篩選生成本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤，首先準(zhǔn)備表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞。用于篩選的優(yōu)選的細(xì)胞是強制表達(dá)緊密連接蛋白3的哺乳動物細(xì)胞。通過使用未被作為宿主轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞作為對照，可以選擇性檢測抗體與細(xì)胞表面的緊密連接蛋白3的結(jié)合活性。即，通過選擇生成未與宿主結(jié)合而與緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗體的雜交瘤，可以獲得生成本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體的雜交瘤。的細(xì)胞的結(jié)合活性。例如，表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞固定在ELISA板的孔中。使雜交瘤的培養(yǎng)上清與孔內(nèi)的固定細(xì)胞接觸，檢測與固定細(xì)胞結(jié)合的抗體。單克隆抗體來自小鼠時，與細(xì)胞結(jié)合的抗體可根據(jù)抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。生成抗體的雜交瘤可通過極限稀釋法等克隆，所29述抗體是通過這些篩選選擇的、具有與抗原的結(jié)合能力的抗體?；蛘邽榱双@得識別緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)表位的單克隆抗體，例如可進行下述篩選。首先準(zhǔn)備表達(dá)該嵌合分子的細(xì)胞，該嵌合分子將緊密連接蛋白3的兩個胞外環(huán)分別與其它緊密連接蛋白3樣分子的胞外環(huán)連接而成。緊密連接蛋白3樣分子例如可使用人緊密連接蛋白1。即，制作表達(dá)下述構(gòu)成的嵌合分子的強制表達(dá)細(xì)胞。3/1嵌合1/3嵌合天然環(huán)1緊密連接蛋白3緊密連接蛋白1緊密連接蛋白3環(huán)2緊密連接蛋白1緊密連接蛋白3緊密連接蛋白3使受試抗體與這些強制表達(dá)細(xì)胞接觸，比較天然型與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合活性，通過選擇與3/1嵌合表達(dá)細(xì)胞和1/3嵌合表達(dá)細(xì)胞兩者的結(jié)合活性低的單克隆抗體，可以獲得本發(fā)明的識別緊密連接蛋白3立體結(jié)構(gòu)表位的單克隆抗體。用于篩選的優(yōu)選的細(xì)胞是哺乳動ELISA或FACS確認(rèn)。如上所述，生成制備的單克隆抗體的雜交瘤可在通常的培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)。也可以將該雜交瘤在液氮中長期保存。按照常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤，可以由該培養(yǎng)上清中獲得目標(biāo)單克隆抗體?；蛘邔㈦s交瘤給予與其具有相容性的哺乳動物，使其增殖，以其腹水的形式獲得單克隆抗體。前者的方法適合于獲得高純度的抗體。本發(fā)明中，可以利用由抗體基因編碼的抗體，該抗體基因由抗體生成細(xì)胞克隆得來。克隆的抗體基因可以通過摻入到適當(dāng)?shù)妮d體中并導(dǎo)入宿主來以抗體的形式表達(dá)?？贵w基因的分離和向載體導(dǎo)入、以及宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)確立(例如參照Vandamme,A.M.等人，Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775)。例如，可以由生成抗緊密連接蛋白3抗體的雜交瘤細(xì)胞獲得編碼抗緊密連接蛋白3抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。為此，通常是首先由雜交瘤提取總RNA。由細(xì)胞j是取mRNA的方法例如可利用以下方法。胍超離心法(Chirgwin,J.M.等人，Biochemistry(1979)18,5294-5299)AGPC法(Chomczynski,P.等人，Anal.Biochem.(1987)162,156-159)提取的mRNA可使用mRNA純化試劑盒(GE》只少7^4才廿4工7義制備)等來純化?；蛘呷鏠uickPrepmRNA純化試劑盒(GE、/kX少7Z4才廿4工>只制備)等，直接由細(xì)胞中提取總mRNA的試劑盒也有銷售?？梢允褂蒙鲜鲈噭┖?，由雜交瘤獲得mRNA。使用反轉(zhuǎn)錄酶，可以由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可通過AMV反轉(zhuǎn)錄酶第一條鏈cDNA合成試劑盒(生化學(xué)工業(yè)制備)等合成。為了進行cDNA的合成和擴增，可以利用使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(Clontech制備)和PCR的5，-RACE法(Frohman,M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002;Belyavsky,A.等人，NucleicAddsRes.(1989)17,2919-2932)。還可以在上述cDNA的合成過程中，向cDNA的兩末端導(dǎo)入后述的適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c。由所得PCR產(chǎn)物純化目標(biāo)cDNA片段，接著與載體DNA連接。如上所述制備重組載體，導(dǎo)入大腸肝菌等，選擇集落，然后可由該形成集落的大肝腸菌制備所需重組載體。該重組載體是否具有目標(biāo)cDNA的堿基序列，這可以通過7>知的方法、例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等確認(rèn)。為了獲得編碼可變區(qū)的基因，利用5'-RACE法是最簡便的，其中該5，-RACE法使用可變區(qū)基因擴增用的引物。首先，以由雜交瘤細(xì)胞提取的RNA作為才莫板，合成cDNA，獲得5，-RACEcDNA文庫。5，-RACEcDNA文庫的合成使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒等市售的試劑盒較為便利。以所得5，-RACEcDNA文庫作為模板，通過PCR法擴增抗體基因。根據(jù)公知的抗體基因序列，可以設(shè)計小鼠抗體基因擴增用的引物。這些引物是免疫球蛋白的亞類分別不同的堿基序列。因此，優(yōu)選亞類預(yù)先使用IsoStrip小鼠單克隆抗體同型分型試劑盒(口夕二'夕'47夕、'乂只r47夕只)等市售的試劑盒確定。具體來說，例如為了獲得編碼小鼠IgG的基因時，可利用可以進行編碼重鏈yl、y2a、y2b、y3,輕鏈k鏈和x鏈的基因的擴增的引物。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，通常利用對3，一側(cè)的引物、對接近可變區(qū)、相當(dāng)于恒定區(qū)的部分進行退火的引物。而5'—側(cè)的引物可以利用5，-RACEcDNA文庫制備試劑盒中所附的引物。利用這樣擴增的PCR產(chǎn)物，可以重構(gòu)含有重鏈和輕鏈組合的免疫球蛋白。以重構(gòu)的免疫球蛋白與緊密連接蛋白3的結(jié)合活性作為指標(biāo)，可以篩選目標(biāo)抗體。例如，在以獲得緊密連接蛋白3的抗體為目的時，進一步優(yōu)選抗體與緊密連接蛋白3的結(jié)合是特異性的。與緊密連接蛋白3結(jié)合的抗體例如可如下進;f于篩選。(1)使抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞接觸的步驟，所述抗體含有由雜交瘤得到的、由cDNA編碼的V區(qū)；(2)檢測表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞與抗體的結(jié)合的步驟；和(3)選擇與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合的抗體的步驟。檢測抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合的方法是公知的。具體可通過之前所述的FACS等方法檢測抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的結(jié)合。為評價抗體的結(jié)合活性，可利用表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的固定標(biāo)本。以結(jié)合活性作為指標(biāo)的抗體的篩選方法可以采用利用噬菌體載體的淘選法。以重鏈和輕鏈亞類的文庫的形式從多克隆抗體表達(dá)細(xì)胞組中獲得抗體基因時，利用噬菌體載體的篩選方法有利。編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因可通過用適當(dāng)?shù)慕宇^序列連接來制成單鏈Fv(scFv)。將編碼scFv的基因插入到噬菌體載體中，則可以獲得在表面表達(dá)scFv的噬菌體。將該噬菌體與目標(biāo)抗原接觸，回收與抗原結(jié)合的噬菌體，則可以回收編碼具有目標(biāo)結(jié)合活性的scFv的DNA?？梢愿鶕?jù)需要重復(fù)該操作，由此可以4吏具有目標(biāo)結(jié)合活性的scFv濃縮。本發(fā)明中，編碼抗體的多核苷酸可以編碼抗體的全長，或者編碼抗體的一部分?？贵w的一部分是指抗體分子的任意部分。以下，表示抗體的一部分的術(shù)語可使用抗體片段。本發(fā)明中的優(yōu)選的抗體片段包含抗體的互補鏈決定區(qū)(CDR)。進一步優(yōu)選本發(fā)明的抗體片段包含構(gòu)成可變區(qū)的3個CDR的全部。在獲得編碼目標(biāo)抗緊密連接蛋白3抗體的V區(qū)的cDNA之后，通過限制酶來消化該cDNA，該限制酶識別插入到該cDNA的兩個末端的限制酶切位點。優(yōu)選的限制酶是識別在構(gòu)成抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)可能性低的堿基序列并消化。并且，為了將1個拷貝的消化片段以正確的方向插入到載體中，優(yōu)選具有粘性末端的限制酶。將上述消化的、編碼抗緊密連接蛋白3抗體的V區(qū)的cDNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，由此可獲得抗體表達(dá)載體。此時，通過使編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因、和編碼上述V區(qū)的基因在符合讀框內(nèi)融合，可獲得嵌合抗體。這里，嵌合抗體是指恒定區(qū)和可變區(qū)的來源不同。因此，除小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也包含在本發(fā)明的嵌合抗體中。預(yù)先向具有恒定區(qū)的表達(dá)載體中插入上述V區(qū)基因，可以構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體。具體來說，例如可在保有編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達(dá)載體的5，一側(cè)配置消化上述V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。將兩者用同樣組合的限制酶消化，通過符合讀框的融合，可以構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體。為了制備本發(fā)明的抗緊密連接蛋白3單克隆抗體，可以將抗體基因摻入到表達(dá)載體中，使其在表達(dá)控制區(qū)的控制下進行表達(dá)。用于表達(dá)抗體的表達(dá)控制區(qū)例如包含增強子或啟動子。接著，通過用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，可以獲得重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞表達(dá)編碼抗緊密連接蛋白3抗體的DNA。在抗體基因的表達(dá)中，編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA可分別摻入到其它表達(dá)載體中。摻入了H鏈和L鏈的載體同時轉(zhuǎn)化相同的宿主細(xì)胞(共轉(zhuǎn)化)，可以使具備H鏈和L鏈的抗體分子表達(dá)?；蛘咭部蓪⒕幋aH鏈和L鏈的DNA摻入到單一的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參照國際公開W094/11523)。先分離抗體基因，導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦?，制備抗體，其中的宿主與表達(dá)載體的大部分的組合都是公知的。這些表達(dá)系統(tǒng)均可應(yīng)用于本發(fā)明。使用真核細(xì)胞作為宿主時，可以4吏用動物細(xì)J包、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。具體來說，可用作本發(fā)明的動物細(xì)胞例如可例舉以下細(xì)胞。(1)哺乳類細(xì)胞CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎細(xì)胞)、Hela、Vero等(2)兩棲類細(xì)胞非洲爪蟾卵母細(xì)胞等(3)昆蟲細(xì)胞sf9、sf21、Tn5等或者植物細(xì)胞中，由煙草(Mco"a"ato6"cww)等來自煙草屬(tV/co"朋")的細(xì)胞得到的抗體基因的表達(dá)體系為公知的。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中可以利用進行了愈傷組織培養(yǎng)的細(xì)胞。并且真菌細(xì)J包可以利用下述細(xì)胞。酵母酉良酒酵母(iSWcc/zaromycescgrev/w'ae)等的酵母屬33(Sacc/zaramycM)、巴斯德畢赤式酵母(尸zc/n'(2poston力等畢赤式屬霉菌黑曲霉(j^erg/〃2^m'ge。等的曲霉屬(j^ergz〃uy)或者，利用原核細(xì)胞的抗體基因的表達(dá)系統(tǒng)也是公知的。例如使用細(xì)菌細(xì)胞時，可以將大腸桿菌(Eco/z')、枯草桿菌等細(xì)菌細(xì)胞在本發(fā)明中利用。通過轉(zhuǎn)化，將含有目標(biāo)抗體基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到這些細(xì)胞中。通過體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，可以從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得所需抗體。重組抗體的生產(chǎn)中，除上述宿主細(xì)胞之外，也可以利用轉(zhuǎn)基因動物。即，可由導(dǎo)入了編碼目標(biāo)抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，抗體基因符合讀框插入到編碼在乳汁中特性生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)部，以融合基因的形式構(gòu)建。例如可利用山羊卩酪蛋白等作為乳汁分泌的蛋白質(zhì)。含有融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，該注入胚胎導(dǎo)入到雌山羊體內(nèi)，其中，所述融合基因中插入了抗體基因。可以由接受了胚胎融合蛋白的形式;得所需^體、。為了使轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的i所需抗體的乳汁量增加，可以對轉(zhuǎn)基因山羊適當(dāng)應(yīng)用激素(Ebert,K.M等人,Bio/Technology(1994)12,699-702)。本發(fā)明的重組抗體的C區(qū)可使用來自動物抗體的C區(qū)。例如，小鼠抗體的H鏈C區(qū)可使用Cy1、Cy2a、Cy2b、Cy3、Cju、C5、Ca1、Ca2和Cs,L鏈的C區(qū)可使用Ck和C入。小鼠抗體以外的動物抗體可使用大鼠、兔、山羊、綿羊、駱駝、猴等的動物抗體。這些序列是公知的。為了改善抗體或其生成的穩(wěn)定性，可以對C區(qū)進行修飾。本發(fā)明中，將抗體給予人時，為了降低對人的異種抗原性等，可以制成人工變異的基因重組型抗體。基因重組型抗體例如包含嵌合抗體、人源化抗體等。這些變異抗體可采用公知的方法制備。嵌合抗體是指將來源不同的可變區(qū)和恒定區(qū)互相連接的抗體。例如含有小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)，和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體是小鼠-人異種嵌合抗體。編碼小鼠抗體的可變區(qū)的DNA與編碼人抗體的恒定區(qū)的DNA連接，將其摻入到表達(dá)載體中，由此可制備表達(dá)嵌合抗體的重組載體。培養(yǎng)通過該載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，使摻入的DNA表達(dá)，由此可獲得在培養(yǎng)中生成的該嵌合抗體。嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)可使用人抗體。例如H鏈中，可以利用Cyl、Cy2、Cy3、Cy4、Cju、C5、Cal、Ca2和Cs作為C區(qū)。L鏈中，可以使用Ck和C人為C區(qū)。這些C區(qū)的氨基酸序列、以及編碼這些氨基酸序列的堿基序列是公知的。為了改善抗體本身或抗體生成的穩(wěn)定性，可以對人抗體的C區(qū)進行修飾。通常嵌合抗體由來自人以外的動物的抗體的V區(qū)和來自人抗體的C區(qū)(CDR)和來自人抗體的支架區(qū)(FR)以及來自人抗體的C區(qū)構(gòu)成。人源化抗體在人體內(nèi)的抗原性降低，因此適合作為本發(fā)明的治療藥的有效成分。例如，將基于本發(fā)明制備的抗緊密連接蛋白3單克隆抗體的可變區(qū)與構(gòu)成人恒定區(qū)的氨基酸序列連接，由此得到的小鼠-人嵌合抗體優(yōu)選作為本發(fā)明的單克隆抗體。即，本發(fā)明提供小鼠-人嵌合單克隆抗體，該抗體含有H鏈的可變區(qū)和L鏈的可變區(qū)，該H鏈的可變區(qū)含有下述(l)-(6)中任一項的氨基酸序列。G)cd廳H鏈SEQIDN0.18所述的氨基酸序列L鏈SEQIDNO.30所述的氨基酸序列(2)CDN16H鏈SEQIDN0.42所述的氨基酸序列L鏈SEQIDN0.52所述的氨基酸序列(3)CDN27H鏈SEQIDN0.62所述的氨基酸序列L鏈SEQIDN0.72所述的氨基酸序列(4)CDN28H鏈SEQIDN0.82所述的氨基酸序列L鏈SEQIDN0.92所迷的氨基酸序列(5)CDN35H鏈SEQIDNO.102所述的氨基酸序列L鏈SEQIDN0.112所述的氨基酸序列(6)CDN38H鏈SEQIDN0.165所述的氨基酸序列L鏈SEQIDN0.177所述的氨基酸序列作為上述小鼠-人嵌合抗體的一個例子，本發(fā)明的還提供小鼠-人嵌合抗體，該小鼠-人嵌合抗體是將CDN38的可變區(qū)與人恒定區(qū)連接得到的，含有含SEQIDN0.175所述氨基酸序列的H鏈和含SEQIDN0.187所述的氨基酸序列的L鏈?？贵w的可變區(qū)通常是由被4個支架(FR)夾持的3個互補決定區(qū)(CDR)構(gòu)成。CDR是基本上決定抗體結(jié)合特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列富于多樣性。而構(gòu)成FR的氨基酸序列在具有不同的結(jié)合特異性的抗體之間大多顯示高同一性。因此，通常通過CDR的移植，可以將某種抗體的結(jié)合特異性移植到其它抗體中。人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體。具體來說，公知的是將人以外的動物例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中所得的人源化抗體等。為獲得人源化抗體而采用的常規(guī)的基因重組方法也是已知的。具體來說，將小鼠的抗體的CDR移植到人FR中的方法例如公知重疊延伸PCR。重疊延伸PCR中，用于合成人抗體FR的引物中附加有編碼要移植的小鼠抗體CDR的堿基序列。引物是對4個FR分別準(zhǔn)備。通常在小鼠的CDR向人FR移植中，選擇與小鼠的FR同一性高的人FR,這在保持CDR的功能方面有利。即，通常優(yōu)選利用的人FR含有與要移植的小鼠CDR所相鄰的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列。連接的堿基序列被設(shè)計成互相符合讀框地連接。由各引物分別合成人FR。結(jié)果，可得到在各FR上附加有編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物編碼的小鼠CDR的堿基序列被設(shè)計成互相重疊。接著，將以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR部分互相退火，進行互補鏈合成反應(yīng)。通過該反應(yīng)，人FR經(jīng)由小鼠CDR的序列連接。最終3個CDR與4個FR連接而成的V區(qū)基因通過在其5'末端和3，末端退火并附加適當(dāng)?shù)南拗泼缸R別序列所得的引物擴增其全長。上述得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA插入到表達(dá)載體中，通過符合讀框融合，由此可制備人抗體表達(dá)用載體。將該摻入載體導(dǎo)入到宿主中，構(gòu)建重組細(xì)胞，然后培養(yǎng)該重組細(xì)胞，使編碼該人源化抗體的DNA表達(dá)，EP239400、國際7>開WO96/02576)。并評價，由此可以適當(dāng)選擇在經(jīng)由CDR連接時該CDR可形成良好的抗原結(jié)合部位的人抗體的FR。還可根據(jù)需要置換FR的氨基酸殘基，使重構(gòu)的人抗體CDR形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位。例如，可應(yīng)用在小鼠CDR移植到人FR中時所使用的PCR法，向FR中導(dǎo)入氨基酸序列的突變。具體來說，可以向在FR上退火的引物中導(dǎo)入部分堿基序列的突變。由上述引物合成的FR中可導(dǎo)入堿基序列的突變。按照上述方法對置換氨基酸得到的突變型抗體與抗原的結(jié)合活性進行測定并評價，由此可以選擇具有所需性質(zhì)的突變FR序列(Sato,K.等人，CancerRes.1993,53,851-856)。W093/12227、W092簡18、WO94/02602、W094/25585、WO96/34096、W096/33735)作為免疫動物，通過DNA免疫可獲得所需的人抗體。并且還已知使用人抗體文庫、通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，可以將人抗體的V區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達(dá)，選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。通過分析所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的V區(qū)的DNA序列。確定了與抗原的scFv的DNA序列后，通過將該V區(qū)序列與所需人抗體的C區(qū)的序列在符合讀框融合，然后插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，由此可以制備表達(dá)載體。將該表達(dá)載體導(dǎo)入到上述例舉的優(yōu)選的表達(dá)細(xì)胞中，通過使編碼該人抗體的基因表達(dá)，可以獲得該人抗體。這些方法是已公知的(參照國際公開WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、W093/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388)。本發(fā)明的單克隆抗體只要與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合即可，不僅是以IgG為代表的二價抗體，也包含一價抗體或以IgM為代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體包含具有完全相同的抗原結(jié)合部位的多價抗體，或者是具有部分或全部不同的抗原結(jié)合部位的多價抗體。本發(fā)明的單克隆抗體不限于抗體的全長分子，只要與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合即可，可以是低分子化抗體或其修飾物。低分子化抗體包含全長抗體(例如全長IgG等)的一部分缺損的抗體片段。只要具有與緊密連接蛋白3抗原的結(jié)合能力即可，允許抗體分子的部分缺損。本發(fā)明的抗體片段優(yōu)選包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的其中之一或兩者。VH或VL的氨基酸序列可以包含置換、缺失、37附加和/或插入。并且，只要具有與緊密連接蛋白3抗原的結(jié)合能力即可，可以使VH和VL的其中一方或兩者的一部分缺損?？勺儏^(qū)還可以進行嵌合化或人源化?？贵w片段的具體例子例如有Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv等。低分子化抗體的具體例子例如有Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、二價抗體(Diabody)、sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)等。這些抗體的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包含在本發(fā)明的低分子化抗體中?？贵w的片段可通過用酶處理抗體、生成抗體片段來獲得。生成抗體片段的酶例如有公知的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纖溶酶等?；蛘邩?gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入到表達(dá)載體中，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(例如參照Co,M.S等人，J.Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M.和Horwitz，A,H.,MethodsinEnzymology(1989)178,476-496;Plueckthun,A和Skerm,A.,MethodsinEnzymology(1989)178,476-496;Lamoyi,E.,MethodsinEnzymology(1989)121,652-663;Rousseaux,J等人，MethodsinEnzymology(1989)121,663-669;Bird,R.E.等人,TIBTECH(1991)9,132-137)。消化酶可以切斷抗體片段的特定位置，獲得下述特定結(jié)構(gòu)的抗體片段。對上述通過酶切獲得的抗體片段采用基因工程的方法，則可以使抗體的任意部分缺失。木瓜蛋白酶消化F(ab)2或Fab胃蛋白酶消化F(ab，)2或Fab，纖溶酶消化Facb因此，本發(fā)明中的低分子化抗體只要具有對緊密連接蛋白3的結(jié)合親和性即可，可以是任意區(qū)域缺失的抗體片段。并且，特別是在本發(fā)明的對癌癥等細(xì)胞增殖性疾病的治療中，抗體希望保持其效應(yīng)活性。即，本發(fā)明的優(yōu)選的低分子化抗體具有與緊密連接蛋白3的結(jié)合親和性和效應(yīng)功能兩者?？贵w的效應(yīng)功能包含ADCC活性和CDC活性。本發(fā)明的治療用的抗體特別優(yōu)選具備ADCC活性和CDC活性的其中一種或兩者效應(yīng)功能。二價抗體是指通過基因融合構(gòu)建的二價(二價體)的抗體片段(HolligerP.等人,Proc.Natl,Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993);EP404,097號；WO93/11161號)。二價抗體是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體。通常構(gòu)成二聚體的多肽鏈分別是在同一鏈中VL和VH通過接頭結(jié)合。二價抗體中的接頭通常短到VL和VH互相無法結(jié)合。具體來說，構(gòu)成接頭的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，在同一多肽鏈上編碼的VL和VH無法形成單鏈可變區(qū)片段，只能與其它單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。結(jié)果二價抗體具有2個抗原結(jié)合部位。scFv通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連接獲得。在scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)經(jīng)由4妻頭、優(yōu)選肽接頭連接(Huston,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988,85,5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以來自本說明書中作為抗體記載的任意的抗體。連接V區(qū)的肽接頭沒有特別限定。例如可以使用含有3-25個殘基左右的任意的單鏈肽作為接頭。具體來說，例如可以使用后述的肽接頭等。V區(qū)例如可按照上述PCR法連接。為了通過PCR法進行V區(qū)的連接，首先在下述的DNA中，利用全部或者編碼所需部分氨基酸序列的DNA作為沖莫4反編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA序列、以及編碼上述抗體的L鏈或L鏈V區(qū)的DNA序列通過PCR法，分別擴增編碼H鏈和L鏈的V區(qū)的DNA，該PCR法使用具有與要擴增的DNA的兩端的序列對應(yīng)的序列的一對引物。接著準(zhǔn)備編碼肽接頭部分的DNA。編碼肽接頭的DNA也可利用PCR合成。此時可利用的引物的5，一側(cè)可以附加可與另外合成的各V區(qū)的擴增產(chǎn)物連接的堿基序列。接著，利用[H鏈V區(qū)DNA]-[肽接頭DNA]-[L鏈V區(qū)DNA]的各DNA和裝配PCR用的引物進行PCR反應(yīng)。裝配PCR用的引物包含在[H鏈V區(qū)DNA]的5'—側(cè)退火的引物和在[L鏈V區(qū)DNA]的3，一側(cè)退火的引物的組合。即，裝配PCR用的引物是可擴增編碼要合成的scFv全長序列的DNA的引物組。而[肽接頭DNA]上可以附加可與各V區(qū)DNA連接的堿基序列。結(jié)果，這些DNA連接，進一步通過裝配PCR用的引物，最終以擴增產(chǎn)物的形式生成scFv的全長。制備了編碼scFv的DNA,則可以按照常規(guī)方法獲得含有它們的表達(dá)載體以及通過該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。另外，其結(jié)果，對得到的重組細(xì)胞進行培養(yǎng)，使編碼該scFv的DNA表達(dá)，由此可獲得該scFV。sc(Fv)2是將2個VH和2個VL通過接頭等結(jié)合，制成單鏈的低分子化抗體(Hudson等人，J.Immunol.Methods1999;231:177-189)。sc(Fv)2例如可通過用接頭將scFv連接來制備。還優(yōu)選具有如下特征的抗體2個VH和2個VL以單鏈多肽的N末端一側(cè)為基點，依次排列VH、VL、VH、VL([VH]接頭[VL]接頭[VH]接頭[VL])。2個VH和2個VL的順序并不特別限定于上述配置，可以是任何順序排列。例如有以下的配置-接頭-[VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL][VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH][VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL][VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VH][VL]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VH]與抗體可變區(qū)結(jié)合的接頭可以使用可通過遺傳工程導(dǎo)入的任意的肽接頭、或合成化合物接頭(例如ProteinEngineering,9(3)，299-305,1996)中公開的接頭等。本發(fā)明中優(yōu)選肽接頭。肽接頭的長度沒有特別限定，可以根據(jù)目的由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。通常，構(gòu)成肽接頭的氨基酸殘基為1-100個氨基酸，優(yōu)選3-50個氨基酸，進一步優(yōu)選5-30個氨基酸，特別優(yōu)選12-18個氨基酸(例如15個氨基酸)。構(gòu)成肽接頭的氨基酸序列只要不妨礙scFv的結(jié)合作用即可，可以采取任何序列。例如，肽接頭可以利用下述氨基酸序列。SerGlySerGlyGlySerSer.GlyGlyGly.GlyGlySer(SEQIDNO.149)Ser.Gly.Gly.Gly(SEQIDN0.150)Gly.GlyGlyGlySer(SEQIDNO.L51)SerGlyGly.Gly.Gly(SEQIDNO.152)Gly.GlyGly.Gly.Gly.Ser(SEQIDNO.153)Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly(SEQIDNO.154)GlyGlyGlyGly.Gly.Gly.Ser(SEQIDNO.155)SerGlyGly.GlyGly.Gly.Gly(SEQIDNO.156)(Gly.Gly.Gly.Gly,Ser(SEQIDNO.157))n(Ser'Gly.Gly.Gly.Gly(SEQIDNO.158))n[n為1以上的整數(shù)]肽接頭的氨基酸序列可以根據(jù)目的由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。例如，確定上述肽接頭的長度的n通常為1-5，優(yōu)選l-3，更優(yōu)選1或2。即而，本發(fā)明中特別優(yōu)選的sc(Fv)2的方案例如有以下的sc(Fv)2:[VH]-肽接頭(15個氨基酸)-[VL]-肽接頭(15個氨基酸)-[VH]-肽接頭(15個氨基酸)-[VL]或者利用合成化學(xué)物接頭(化學(xué)交聯(lián)劑)連接V區(qū)。也可在本發(fā)明中利用肽化合物等的交聯(lián)中通常使用的交聯(lián)劑。例如下述化學(xué)交聯(lián)劑是公知的。這些交聯(lián)劑有市售商品。N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)辛二酸雙(硫代琥珀酰亞胺S旨)(BS3)二硫代雙(琥珀酰亞胺丙酸酯)(DSP)二疏代雙(硫代琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DTSSP)雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)雙(硫代琥珀酰亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(硫代-EGS)二琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫代琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(硫代-DST)、雙[2-(琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和雙[2-(硫代琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(硫代-BSOCOES)等。結(jié)合有4個抗體可變區(qū)時，通常必須有3個接頭。多個接頭可以相同，也可以使用不同的接頭。本發(fā)明中，優(yōu)選的低分子化抗體是二價抗體或sc(Fv)2。為獲得上述低分子化抗體，可以將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等進行處理，生成抗體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的DNA,將其導(dǎo)入到表達(dá)載體中，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(參照Co,M.S.等人，J.Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M.和Horwitz,A.H.,MethodsEnzymol.(1989)178，476-496;Pluckthun,A.和Skerra,A.,MethodsEnzymol.(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,MethodsEnzymol,(1986)121,652-663;Rousseaux,J.等人，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669;以及Bird,R.E.和Walker,B.W.,TrendsBiotechnol.(1991)9,132-137)。本發(fā)明的單克隆抗體包含識別緊密連接蛋白3并結(jié)合的任意的抗體。例如以下(1)-(61)中所述的抗體可作為優(yōu)選的抗體例舉。這些抗體例如可以是全長抗體、低分子化抗體、動物抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。(1)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.12所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.14所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.16所述的氨基酸序列作為CDR3;(2)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.20所述的氨基酸序列的139-462號氨基酸序列作為CH;(3)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(4)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.24所述的氨基酸序列作為CDRl、SEQIDN0.26所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.28所述的氨基酸序列作為CDR3;(5)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.32所述的氨基酸序列的135-240號氨基酸序列作為CL;(6)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO,34所述的42氨基酸序列作為CL;(7)抗體，該抗體含有(l)所述的H鏈和(4)所述的L鏈；(8)抗體，該抗體含有(2)所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(9)抗體，該抗體含有(3)所述的H鏈和(6)所述的L鏈；(10)抗體，該抗體是在(l)-(9)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(l)-(9)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(11)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.^所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.38所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.40所述的氨基酸序列作為CDR3;(12)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.44所述的氨基酸序列的140-476號氨基酸序列作為CH;(13)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.M所述的氨基酸序列作為CH;(14)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.46所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.48所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.50所述的氨基酸序列作為CDR3;(15)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.54所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(16)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(17)抗體，該抗體含有(ll)所述的H鏈和(14)所述的L鏈；(18)抗體，該抗體含有(12)所述的H鏈和(15)所述的L鏈；(19)抗體，該抗體含有(13)所述的H鏈和(16)所述的L鏈；(20)抗體，該抗體是在(11)-(1"中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(11)-(19)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(21)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.56所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.58所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.60所述的氨基酸序列作為CDR3;(22)含有(21)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.64所述的氨基酸序列的137-471號氨基酸序列作為CH;(23)含有(21)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(24)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.66所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.68所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.70所述的氨基酸序列作為CDR3;(25)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.74所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(26)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(27)抗體，該抗體含有pl)所述的H鏈和(M)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體含有(22)所述的H鏈和(25)所述的L鏈；(29)抗體，該抗體含有(23)所述的H鏈和(26)所述的L鏈；(30)抗體，該抗體是在(21)-(29)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(21)-(29)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(31)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.76所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.78所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.80所述的氨基酸序列作為CDR3;(32)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.84所述的氨基酸序列的140-463號氨基酸序列作為CH;(33)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(34)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.86所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.88所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.90所述的氨基酸序列作為CDR3;(35)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.94所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(36)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(37)抗體，該抗體含有(31)所述的H鏈和(34)所述的L鏈；(38)抗體，該抗體含有(32)所述的H鏈和(35)所述的L鏈；(39)抗體，該抗體含有(33)所述的H鏈和(36)所述的L鏈；(40)抗體，該抗體是在(31)-(39)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(31)-(39)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(41)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.M所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.98所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.100所述的氨基酸序列作為CDR3;(42)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.104所述的氨基酸序列的140-474號氨基酸序列作為CH;(43)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(44)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.1(^所迷的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.108所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.110所述的氨基酸序列作為CDR3;(45)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.114所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(46)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(47)抗體，該抗體含有(41)所述的11鏈和(44)所述的L鏈；(48)抗體，該抗體含有(42)所述的H鏈和(45)所述的L鏈；(49)抗體，該抗體含有(43)所述的H鏈和(46)所述的L鏈；(50)抗體，該抗體是在(41)-(49)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(41)-(49)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(51)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.167所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.169所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.171所述的氨基酸序列作為CDR3;(52)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.173所述的氨基酸序列的118-447號氨基酸序列作為CH;(53)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(54)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.179所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.181所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.183所述的氨基酸序列作為CDR3;(55)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.185所述的氨基酸序列的113-218號氨基酸序列作為CL;(56)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(57)抗體，該抗體含有(M)所述的H鏈和(S4)所述的L鏈；(58)抗體，該抗體含有(52)所述的H鏈和(55)所述的L鏈；(59)抗體，該抗體含有(53)所述的H鏈和(56)所述的L鏈；(60)抗體，該抗體是在(51)-(59)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(51)-(59)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(61)抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與(l)-(60)中任一項所述的抗體所結(jié)合的緊密連接蛋白3蛋白的表位相同。本發(fā)明中，優(yōu)選的單克隆抗體含有來自CDN04、CDN16、CDN27、CDN28、CDN35、CDN38的任意一種的、構(gòu)成重鏈和輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列作為CDR的氨基酸序列。這些單克隆抗體的CDR的氨基酸序列如下。因此，可變區(qū)含有由以下SEQIDNO.所示的氨基酸序列形成的CDR的單克隆抗體優(yōu)選作為本發(fā)明的單克隆抗體。例如，各單克隆抗體中，V區(qū)序列和全長氨基酸序列分別如以下所示SEQIDNO.。含有這些氨基酸序列作為V區(qū)的單克隆抗體可以作為本發(fā)明的優(yōu)選的單克隆抗體給出。重鏈輕鏈CDR3SEQIDNO.20SEQIDNO,32的139-462號SEQIDNO.20的135-240號]CDRlSEQIDN0.36CDN16CDR2SEQIDN0.38CDR3SEQIDNO.40SEQIDNO.54的133-238號]SEQIDN0.54]CDRlCDN27CDR2CDR3SEQIDN0.74的133-234號]SEQIDNO.74]CDRlCDN28CDR2CDR3SEQIDN0.94的133-238號]SEQIDN0.94]CDRlCDN35CDR2CDR3SEQIDNO.114的133-238號]SEQIDNO.114]47CDR3CDN38CDR2CDR1SEQIDNO.173SEQIDNO.185的113-218號]本發(fā)明的單克隆抗體除含有上述CDR的可變區(qū)之外，還可以含有恒定區(qū)。各單克隆抗體的含有恒定區(qū)的全長序列分別如上所述。并且，可以給出例如以下的來自人的氨基酸序列作為構(gòu)成本發(fā)明的單克隆抗體的恒定區(qū)SEQIDN0.21(人IgGl國CH序列)SEQIDN0.33(人IgGl.CLkappa序列)SEQIDN0.22(人IgGl.CH序列)SEQIDN0.34(人IgGl.CLkappa序列)因此，在含有上述CDRl、2、3的可變區(qū)接合上述SEQIDNO.所示的、含有來自人的氨基酸序列的恒定區(qū)所得的單克隆抗體是本發(fā)明中優(yōu)選的單克隆抗體。可以例舉上述(3)、(13)、(23)、(33)、(43)和(53)所述的單克隆抗體作為上述單克隆抗體。這些單克隆抗體可以分別含有上述(6)、(16)、(26)、(36)、(46)和(56)所述的輕鏈作為輕鏈。上述(IO)、(20)、(30)、(40)、(50)、(60)所述的抗體的優(yōu)選方案是在CDR上未發(fā)生變異的抗體。其中的一個例子，上述(10)所述的抗體中，"在(l)所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入的抗體，是與(l)所述的抗體具有同等活性的抗體"的優(yōu)選方案是"與(l)所述的抗體具有同等的活性，在(l)所述的抗體中有l(wèi)或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入的抗體，是含有H鏈的抗體，所述H鏈具有SEQIDNO.12所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.14所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.16所述的氨基酸序列作為CDR3"。上述(IO)、(20)、(30)、(40)、(50)、(60)所述抗體中，其它的抗體的優(yōu)選方案也可同樣表現(xiàn)。向多肽中導(dǎo)入突變的方法是用于制備與某種多肽功能性同等的多肽的、本領(lǐng)域常知的方法之一。例如本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用位點專一性誘變法(Hashimoto-Gotoh,T等人(1995)Gene152,271-275;Zoller，MJ和Smith,M.(1983)MethodsEnzymol.100,468-500;Kramer，W等人(1984)NucleicAcidsRes.12,9441-9456;KramerW和FritzHJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367;Kunkel,TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492;Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85,2763陽2766)等，向本發(fā)明的抗體中適當(dāng)導(dǎo)入突變，由此可制備與該抗體功能性同等的抗體。氨基酸的突變在自然界中也發(fā)生。如上所述，本發(fā)明的抗體的氨基酸序列中，具有1或多個氨基酸發(fā)生了突變的氨基酸序列、與該抗體功能性同等的抗體也包含在本發(fā)明的抗體中。上述突變體中的突變的氨基酸數(shù)目通常在50個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選30個氨基酸以內(nèi)，進一步優(yōu)選10個氨基酸以內(nèi)(例如5個氨基酸以內(nèi))。突變的氨基酸殘基中，優(yōu)選突變?yōu)榘被嶂ф湹男再|(zhì)得到保存的其它的氨基酸。例如根據(jù)氨基酸支鏈的性質(zhì)，確立了下述分類。疏水性氛基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)具有脂族支鏈的氨基酸(G、A、V、L、.I、P)具有含羥基的支鏈的氨基酸(S、T、Y)具有含硫原子的支鏈的氨基酸(C、M)具有含羧酸和酰胺的支鏈的氨基酸(D、N、E、Q)具有含堿基的支鏈的氨基酸(R、K、H)具有含芳族支鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號內(nèi)均表示氨基酸的單字母標(biāo)記)我們已經(jīng)了解，具有對于某種氨基酸序列有l(wèi)或多個氨基酸殘基的缺失、附加和/或通過其它氨基酸的置換而被修飾的氨基酸序列的多肽可以保持其生物學(xué)活性(Mark,D.F等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81,5662-5666;Zoller,M.J.和Smith,MNucleicAcidsResearch(1982)106487-6500;Wang,A等人，Science224,1431-1433;Dalbadie-McFarland,G等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,6409-6413)。即,通常在構(gòu)成某種多肽的氨基酸序列中，被分類為各組的氨基酸在相互置換時，保49持該多肽的活性的可能性高。本發(fā)明中，將上述氨基酸組的組內(nèi)氨基酸之間的置換稱為保存性置換。本發(fā)明還提供一種抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與本發(fā)明中公開的單克隆抗體所結(jié)合的表位相同。即，本發(fā)明涉及識別與本發(fā)明的單克隆抗體所識別的表位相同表位的抗體及其用途。上述抗體例如可通過以下方法獲得。受試抗體與表位結(jié)合，且該表位與某種抗體所結(jié)合的表位相同，即，與某種抗體共有表位，這可以通過兩者對相同表位的竟?fàn)巵泶_認(rèn)。本發(fā)明中，抗體之間的竟?fàn)幙赏ㄟ^FACS或交叉阻斷測定等來^r測。FACS中，首先將本發(fā)明的單克隆抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合，測定熒光信號。接著，在候補的竟?fàn)幙贵w反應(yīng)后，將本發(fā)明的單克隆抗體與同樣的細(xì)胞反應(yīng)，同樣通過FACS分析?；蛘邔⒈景l(fā)明的單克隆抗體和受試竟?fàn)幙贵w同時與相同細(xì)胞反應(yīng)。竟?fàn)幙贵w反應(yīng)時，如果本發(fā)明的單克隆抗體的FACS分析圖鐠變化，則可確認(rèn)竟?fàn)幙贵w識別與本發(fā)明的單克隆抗體相同的表位。除此之外，例如竟?fàn)嶦LISA測定是優(yōu)選的交叉阻斷測定。具體來說，在交叉阻斷測定中，在微量滴定板的孔上固定表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞。在候補的竟?fàn)幙贵w的存在下或非存在下進行預(yù)溫育，然后添加本發(fā)明的單克隆抗體?？字械呐c緊密連接蛋白3蛋白表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的本發(fā)明的單克隆抗體的量與候補竟?fàn)幙贵w(受試抗體)的結(jié)合能力成逆相關(guān)，該候補竟?fàn)幙贵w對于與相同表位的結(jié)合是竟?fàn)幮缘?。即，受試抗體與同一表位的親和性越大，則本發(fā)明的單克隆抗體與固定了緊密連接蛋白3蛋白表達(dá)細(xì)胞的孔的結(jié)合量低?；蛘呦喾矗茉嚳贵w與同一表位的親和性越大，則受試抗體與固定有緊密連接蛋白3蛋白表達(dá)細(xì)胞的孔的結(jié)合量增加。與孔結(jié)合的抗體量可通過預(yù)先標(biāo)記抗體而容易地測定。例如，生物素標(biāo)記的抗體可通過使用抗生物素蛋白過氧化物酶接合物和適當(dāng)?shù)牡孜飦頊y定。將利用過氧化物酶等酶標(biāo)記的交叉阻斷測定特別稱為竟?fàn)嶦LISA測定?？贵w可用可檢測或測定的其它標(biāo)記物標(biāo)記。具體來說，放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記等是公知的。并且，受試抗體具有來自與本發(fā)明的單克隆抗體不同種的恒定區(qū)時，可以通過特異性識別來自任意種的恒定區(qū)的標(biāo)記抗體來測定與孔結(jié)合的任意的抗體?；蛘呒词故莵碜酝N的抗體而類不同時，通過特異性識別各類的抗體可以測定與孔結(jié)合的抗體。相比，候補抗體如果至少可以阻斷20%、優(yōu)選至少20-50%、進一步優(yōu)選至少50%的本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合，則該候補竟?fàn)幙贵w與本發(fā)明的單克隆抗體基本上相同的表位結(jié)合，或者是對與相同表位結(jié)合進行竟?fàn)幍目贵w。與同單克隆抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合的抗體例如有上述(61)所述的抗體。如上所述，上述(1)-(61)所述的抗體中不僅含有一價抗體，也含有多價抗體。本發(fā)明的多價抗體包含具有完全相同的抗原結(jié)合部位的多價抗體或具有部分或完全不同的抗原結(jié)合部位的多價抗體。抗體的修飾物可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體?？贵w中可以結(jié)合化療藥物、毒性肽或放射性化學(xué)物質(zhì)等。上述抗體修飾的修飾方法在該領(lǐng)域中已;至確立。'如:所述^可以以歡特異性:體等的分子型的形式獲得，該雙特異性抗體等的分子型是釆用基因重組技術(shù)，設(shè)計成不僅識別緊密連接蛋白3蛋白，也識別化療藥物、毒性肽或放射性化學(xué)物質(zhì)等得到的。本發(fā)明中的"抗體"也包含這些抗體。與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合并發(fā)揮細(xì)胞毒活性功能的化療藥物可例舉以下的化療藥物。氮尿苷、阿那曲唑、5-氮雜胞苷、博來霉素、硼替佐米(bortezomib)、薯司他丁-1、白消安、喜樹堿、羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉑、伊立替康、卡鉑、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴。秦、多西他賽、放線菌素D、柔紅霉素葡糖苷酸、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、亞葉酸、洛莫氮芥、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、6-巰基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、司莫司汀鏈脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷類(taxanes)、紫素、丙酸睪酮、51沙立度胺、硫鳥嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓樸替康、尿嘧啶氮芥、長春堿、長春烯堿、長春新堿本發(fā)明中，優(yōu)選的化療藥物是低分子的化療藥物。低分子的化療藥物與抗體結(jié)合之后，干擾抗體功能的可能性低。本發(fā)明中，低分子的化療藥物通常具有100-2000、優(yōu)選200-1000的分子量。這里所例舉的化療藥物均為低分子的化療藥物。這些本發(fā)明中使用的化療藥物也包含在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)換為活性化療藥物的前藥。前藥的活化可以是酶性轉(zhuǎn)換、也可以是非酶性轉(zhuǎn)換。l.另夕卜，也可以用蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcalenterotoxin-A)、美洲商陸4元病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)、截短型細(xì)胞毒素(gelonin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、L-天冬酰胺酶、PEGL-天冬酰胺酶等的毒性肽修飾抗體。在另一方案中，將一或兩種以上的低分子化療藥物與毒性肽分別組合，可以用于抗體的修飾。單克隆抗體與上述低分子化療藥物的結(jié)合可利用共價鍵或非共價鍵。結(jié)合了這些化療藥物的抗體的制備方法是公知的。并且，蛋白質(zhì)性的藥物或毒素可以通過基因工程的方法與抗體結(jié)合。具體來說，例如將編碼上述毒性肽的DNA與編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA進行符合讀框融合，可以構(gòu)建摻入到表達(dá)載體中的重組載體。將該載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，培養(yǎng)由此得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使摻入的DNA表達(dá)，可以以融合蛋白質(zhì)的形式獲得結(jié)合了毒性肽的抗緊密連接蛋白3抗體。獲得與抗體的融合蛋白時，通常在抗體的'C末端一側(cè)配置蛋白質(zhì)性的藥物或毒素?？贵w與蛋白質(zhì)性的藥物或毒素之間可以存在肽接頭。本發(fā)明的單克隆抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體是指在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體。本發(fā)明中，雙特異性抗體可以具有識別緊密連接蛋白3分子上的不同表位的抗原結(jié)合部位。上述雙特異性抗體相對1個分子的緊密連接蛋白3可以結(jié)合2個分子的抗體分子。結(jié)果，有望實現(xiàn)更為強烈的細(xì)胞毒作用?；蛘撸梢灾瞥梢粋€抗原結(jié)合部位識別緊密連接蛋白3,另一個抗原結(jié)合部位識別細(xì)胞毒性物質(zhì)的雙特異性抗體。細(xì)胞毒性物質(zhì)具體來說包含化療藥物、毒性肽或放射性化學(xué)物質(zhì)等。上述雙特異性抗體與表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞結(jié)合，同時捕獲細(xì)胞毒性物質(zhì)。結(jié)果，可以使細(xì)胞毒性物質(zhì)直接作用于表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞。即，通過識別細(xì)胞毒性物質(zhì)的雙特異性抗體，可以特異性毒害腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明中，可以將識別緊密連接蛋白3以外的抗原的雙特異性抗體組合。例如可以組合下述雙特異性抗體識別與緊密連接蛋白3同樣是在作為靶的癌細(xì)胞的細(xì)胞表面特異性表達(dá)、但與緊密連接蛋白3不同的抗原的雙特異性抗體。制備雙特異性抗體的方法是公知的。例如，可將識別抗原不同的2種抗體結(jié)合，制備雙特異性抗體。所結(jié)合的抗體可以是分別具有H鏈和L鏈的l/2分子，也可以是只含有H鏈的1/4分子?；蛘呤鞘股刹煌膯慰寺】贵w的雜交瘤融合，制備生成雙特異性抗體的融合細(xì)胞。還可以通過基因工程的方法制備雙特異性抗體。如上所述構(gòu)建的抗體基因可通過公知的方法表達(dá)并獲得。為哺乳類細(xì)胞時，可以在常用的有效啟動子、要表達(dá)的抗體基因、其3，一側(cè)下游功能性結(jié)合polyA信號并使其表達(dá)。例如，啟動子/增強子有.'人巨細(xì)胞病毒早期啟動子/增強子。除此之外，為了抗體的表達(dá)，還可以使用病毒啟動子/增強子、或者人延長因子la(HEFla)等來自哺乳類細(xì)胞的啟動子/增強子等?？梢岳脝幼?增強子的病毒具體有反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。使用SV40啟動子/增強子時，可利用Mulligan等人的方法(Nature(1979)277,108)。另外，HEFla啟動子/增強子可通過Mizushima等人的方法(NucleicAcidsRes.(1990)18,5322)容易地應(yīng)用于目標(biāo)基因表達(dá)。為大腸桿菌時，可以將常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號序列和要表達(dá)的抗體基因功能性結(jié)合，表達(dá)該基因。啟動子例如有l(wèi)acZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可利用Ward等人的方法(Nature(1989)341,544-546;FASEBJ.(1992)6,2422-2427)?；蛘遖raB啟動子通過Better等人的方法(Science(1988)240,1041-1043)應(yīng)用于目標(biāo)基因的表達(dá)。用于抗體分泌的信號序列在大腸桿菌的周質(zhì)中生成時，可以使用pe舊信號序列(Lei,S.P等人，J.Bacteriol.(1987)169,4379)。將在周質(zhì)中生成的抗體進行分離，然后通過使用如尿素的胍鹽酸鹽等的蛋白質(zhì)改性劑，可以重新改正抗體結(jié)構(gòu)，使其具有所需結(jié)合活性。插入到表達(dá)載體中的復(fù)制起源可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等起源的。為了在宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴增基因拷貝數(shù)，可以在表達(dá)載體中插入選擇標(biāo)記。具體來說可利用如下選擇標(biāo)記氨基葡糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。為了制備本發(fā)明的單克隆抗體，可以使用任意的表達(dá)系統(tǒng)、例如真核細(xì)胞或原核細(xì)月包系統(tǒng)。真核細(xì)J包例如有建立的哺乳類細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、絲狀真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞等動物細(xì)胞等。原核細(xì)胞例如有大腸桿菌細(xì)胞等細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選使用哺乳類細(xì)月包表達(dá)。哺乳類細(xì)胞例如可以利用CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、Hela細(xì)胞等。接著，在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，生成目標(biāo)抗體。宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可按照公知的方法進行。例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養(yǎng)液，可以結(jié)合使用胎牛血清(FCS)等的血清補液。如上所述表達(dá)并生成的抗體通過單獨采用在通常的蛋白質(zhì)純化中使用的公知的方法、或者適當(dāng)組合進行純化。例如，通過適當(dāng)選擇蛋白A柱等親和柱、色譜柱、濾器、超濾、鹽析、透析等并組合，可以分離并純化抗體(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988》抗體與抗原的結(jié)合活性(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)的測定可采用^>知的方法。例如可釆用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測法)、EIA(酶聯(lián)免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或熒光免疫法等。本發(fā)明的單克隆抗體可以是糖鏈變異的抗體。已知通過使抗體的糖鏈變異，可以增強抗體的細(xì)胞毒活性。糖鏈變異的抗體例如^^知有下述抗體修飾為葡糖基化的抗體(W099/54342等)、糖鏈上附加的果糖缺損的抗體(W000/61739、WO02/31140等)、具有糖鏈的抗體，該糖鏈具有平分型GlcNAc(WO02/79255等)等。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選為具有細(xì)胞毒活性的抗體。本發(fā)明的細(xì)胞毒活性例如有抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)性細(xì)胞毒(ADCC)活性、補體依賴性細(xì)胞毒(CDC)活性等。本發(fā)明中，CDC活性是指通過補體系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞毒活性。而ADCC活性是在特異性的抗體附著于耙細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原上時，保有Fcy受體的細(xì)胞(免疫細(xì)胞等)經(jīng)由Fcy受體與其Fc部分結(jié)合，使靶細(xì)胞獲得毒活性。本發(fā)明中，單克隆抗體是否具有ADCC活性或者是否具有CDC活斗生可通過7>^口的方';去測定(例々口CurrentProtocolsinImmunology,7章.人類的免疫學(xué)研究，Editor,JohnE.Coligan等人，JohnWiley&Sons,Inc.,(闊等)。具體來說，首先實施效應(yīng)細(xì)胞、補體溶液、靼細(xì)胞的制備。(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備從CBA/N小鼠等中摘除脾臟，在RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制備)中分離脾細(xì)胞。用含有10。/o胎牛血清(FBS,HyClone制備)的相同培養(yǎng)基清洗，然后將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5xl06/mL，由此可制備效應(yīng)細(xì)胞。(2)補體溶液的制備將幼兔補體(CEDARLANE制備)用含10%FBS的培養(yǎng)基(Invitrogen制備)稀釋10倍，可制備補體溶液。(3)靶細(xì)胞的制備將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與0.2mCi的51Cr-鉻酸鈉(GE、^只少7六^f才廿4工》；^制備)一起在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中、在37。C下培養(yǎng)1小時，由此可以對該粑細(xì)胞進行放射性標(biāo)記。表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞可以利用由編碼緊密連接蛋白3蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌細(xì)胞等。放射性標(biāo)記后，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞清洗3次，將細(xì)胞濃度制備為2xl05/mL，由此可以制備該靶細(xì)胞。ADCC活性或CDC活性可按照下述方法測定。測定ADCC活性時，分別向96孑LU底板(BectonDickinson制備)中添加50|iL的革巴細(xì)胞和抗緊密連接蛋白3抗體，在水上反應(yīng)15分鐘。然后加入100pL-丈應(yīng)細(xì)胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時?？贵w的終濃度為0或10昭/mL。培養(yǎng)后回收100pL的上清，通過y射線計數(shù)儀(COBRAIIAUTO-GAMMA，型號D5005,PackardInstrumentCompany制備)測定放射活性。細(xì)胞毒活性(°/。)可使用所得的值，按照(A-C)/(B-C)x100的計算式計算。A表示各試樣的放射活性(cpm),B表示加入l%NP-40(NacalaiTesque制備)試樣后的放射活性(cpm),C表示只含有靶細(xì)胞的試樣的放射活性(cpm)。進行CDC活性測定時，分別向96孔平底板(BectonDickinson制備)中加入50pL靶細(xì)胞和抗緊密連接蛋白3抗體，在水上反應(yīng)15分鐘。然后加入100^L補體溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時?？贵w的終濃度為0或3^ig/mL。培養(yǎng)后回收100)iL的上清，通過y射線計數(shù)儀測定放射活性。細(xì)胞毒活性與ADCC活性測定同樣計算。另一方面，測定抗體接合物產(chǎn)生的細(xì)胞毒活性時，分別向96孔平底板(BectonDickinson制備)中添加50粑細(xì)胞和抗緊密連接蛋白3抗體接合物，在水上反應(yīng)15分鐘。在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時。抗體的終濃度為0或3(ig/mL。培養(yǎng)后回收100)iL的上清，通過Y射線計數(shù)儀測定放射活性。細(xì)胞毒活性可以與ADCC活性的測定同樣計算。本發(fā)明中，單克隆抗體抑制其增殖的細(xì)胞只要是表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞即可，沒有特別限定。優(yōu)選的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞例如為癌細(xì)胞。更優(yōu)選卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌細(xì)胞。因此，抗緊密連接蛋白3抗體可用于起因于細(xì)胞增殖的疾病、例如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等的治療、預(yù)防的目的。藥物《且合物在另外一個觀點中，本發(fā)明提供藥物組合物，該藥物組合物含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體作為有效成分。本發(fā)明還涉及抗癌藥，該抗癌藥含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體作為有效成分。本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑和抗癌藥優(yōu)選給予罹患了癌癥的對象或可能復(fù)發(fā)的對象。本發(fā)明中，含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體作為有效成分的抗癌藥可以表現(xiàn)為包含將與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予對象的步驟的預(yù)防或治療癌癥的方法；或者是與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體在抗癌藥的制備中的應(yīng)用。本發(fā)明中，"含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體作為有效成分"是指含有抗緊密連接蛋白3單克隆抗體作為主要的活性成分，并不限制單克隆抗體的含有率。本發(fā)明的藥物組合物或抗癌藥中，可以根據(jù)需要進一步配合多種單克隆抗體。例如，通過制成與緊密連接蛋白3結(jié)合的多種單克隆抗體的雞尾酒，可能強化對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用?；蛘叱伺c緊密連接蛋白3結(jié)合的抗體之外，通過配合識別其它腫瘤相關(guān)抗原的抗體，可以提高治療效果。本發(fā)明的藥物組合物(例如細(xì)胞增殖抑制劑、抗癌藥。以下也相同)中含有的單克隆抗體只要與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合即可，沒有特別限定，可例舉本說明書中所述的抗體。本發(fā)明的藥物組合物或抗癌藥可通過口服、非口服給予的任意方法給予患者。優(yōu)選非口服給予。所述給予方法具體有注射給予、經(jīng)鼻給予、經(jīng)肺給予、透皮給予等。作為注射給予的例子，例如可通過靜脈注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等，使本發(fā)明的藥物組合物全身或局部給予?？梢愿鶕?jù)患者的年齡、癥狀選擇適當(dāng)?shù)慕o予方法。給予量例如每次的給予可以是1kg體重在0.0001mg-1000mg的范圍內(nèi)選擇給予量?；蛘呃缑课换颊咴?.001-100000mg/個體的范圍內(nèi)選擇給予量。但是，本發(fā)明的藥物組合物并不受這些給予量的限定。本發(fā)明的藥物組合物可以按照常規(guī)方法制成制劑(例如Remington'sPharmaceuticalScience,latestedition,MarkPublishingCompany,Easton,U.S.A),可以共同含有藥物所接受的載體或添加物。例如有:表面活性劑、賦型劑、著色劑、香味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、混懸劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。并不受這些限定，可以適當(dāng)使用其它常用的載體。具體的載體有輕質(zhì)硅酸酐、乳糖、結(jié)晶纖維素、甘露糖醇、淀粉、羥曱基纖維素鈣、羥曱基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥基丙基曱基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。本發(fā)明提供通過使表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞同與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體接觸，來對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞引發(fā)毒性的方法；或抑制細(xì)胞增殖的方法。與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的單克隆抗體作為本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑中含有的與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合57的抗體如上所述?？咕o密連接蛋白3抗體所結(jié)合的細(xì)胞只要是表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞即可，沒有特別限定。本發(fā)明的優(yōu)選的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞是癌細(xì)胞。具體來說，卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌細(xì)胞適合作為本發(fā)明的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞。本發(fā)明中，"接觸"是例如通過向在試管內(nèi)培養(yǎng)的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加抗體而進行的。這種情況下，所添加的抗體的形狀可以適當(dāng)采用溶液或通過冷凍干燥等得到的固體等的形狀。以水溶液的形式添加時，可以是只含有純粹的抗體的水溶液，例如可以是含有上述表面活性劑、賦型劑、著色劑、香味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、混懸劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。所添加的濃度沒有特別限定，培養(yǎng)液中的終濃度優(yōu)選在1pg/mL-lg/mL的范圍，更優(yōu)選1ng/mL國lmg/mL，進一步優(yōu)選1|ig/mL-lmg/mL。本發(fā)明中，"接觸"進而在又一方案中可通過給予體內(nèi)移植了表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的非人動物、或具有內(nèi)源性表達(dá)緊密連接蛋白3的癌細(xì)胞的動物來進行。給予方法可通過口服、非口服給予的任何方式實施。特別優(yōu)選非口服給予的給予方法，所述給予方法具體有注射給予、經(jīng)鼻給予、經(jīng)肺給予、透皮給予等。注射給予的例子例如可以是通過靜脈注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等，全身或局部給予本發(fā)明的藥物組合物細(xì)胞增殖抑制劑和抗癌藥。還可根據(jù)受試動物的年齡、癥狀等選擇適當(dāng)?shù)慕o予方法。以水溶液的形式給予時，可以是只含有純粹的抗體的水溶液，例如可以是含有上述表面活性劑、賦型劑、著色劑、香味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、混懸劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。給予量例如是在每次的給予中、對于1kg體重可以在0.0001mg-1000mg的范圍內(nèi)選擇給予量?；蛘呃缑课换颊咴?.001-100000mg/個體的范圍內(nèi)選擇給予量。但是，本發(fā)明的抗體的給予量并不限于這些給予量。通過抗緊密連接蛋白3抗體的接觸來評價或測定表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞中引發(fā)的細(xì)胞毒的方法優(yōu)選采用以下的方法。在試管中進^f亍該細(xì)胞毒活性的評價或測定的方法有上述抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)性細(xì)胞毒(ADCC)活性、補體依賴性細(xì)胞毒(CDC)活性等的測定方法?？咕o密連接58蛋白3抗體是否具有ADCC活性或是否具有CDC活性，可通過公知的方法測定(例如CurrentprotocolsinImmunology,7章,人類的免疫學(xué)研究,Editor,JohnE.Coligan等人，JohnWiley&Sons,Inc.,(1993)等)。活性測定時，與抗緊密連接蛋白3抗體同樣地使用具有與緊密連接蛋白3抗體相同的同型、但不具有該細(xì)胞毒活性的結(jié)合抗體作為對照抗體，通過抗緊密連接蛋白3抗體顯示比對照抗體強的細(xì)胞毒活性來判斷活性?？贵w的同型由該抗體的氨基酸序列的H鏈恒定區(qū)的序列規(guī)定。在生物體內(nèi)，通過在生成抗體的B細(xì)胞成熟時發(fā)生的染色體上的基因重組而產(chǎn)生的類別轉(zhuǎn)換最終確定抗體的同型。同型的不同反映為抗體的生理、病理機能的不同。具體來說，例如已知細(xì)胞毒活性的強度與抗原的表達(dá)量一起受到抗體的同型影響。因此，上述所述細(xì)胞毒活性測定時，作為對照使用的抗體優(yōu)選使用與受試抗體相同的同型。為了在生物體內(nèi)評價或測定細(xì)胞毒活性，例如將表達(dá)緊密連接蛋白3的癌細(xì)胞移植到非人受試動物的皮內(nèi)或皮下，然后由當(dāng)天或第二天起每天或間隔數(shù)天將受試抗體給予靜脈或腹腔內(nèi)。每天測定腫瘤的大小，由此可確定細(xì)胞毒活性。與試管內(nèi)的評價同樣，給予具有同一亞型的對照抗體，抗緊密連接蛋白3抗體給予組中胂瘤大小比對照抗體給予組中肺瘤的大小顯著減小，由此可判定細(xì)胞毒活性。使用小鼠作為非人受試動物時，優(yōu)選使用胸腺遺傳缺損、其T淋巴細(xì)胞功能缺失的棵(nu/nu)小鼠。通過使用該小鼠評價所給予的抗體的細(xì)胞毒活性進行評價、測定時，可以排除受試動物中T淋巴細(xì)胞的參與。通過抗緊密連接蛋白3抗體的接觸評價或測定對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的增殖的抑制效果的方法可以優(yōu)選釆用同位素標(biāo)記的胸苷向細(xì)胞中的攝取的測定或者MTT法。生物體內(nèi)評價或測定細(xì)胞增殖抑制活性的方法可以優(yōu)選采用與上述所述的生物體內(nèi)評價或測定細(xì)胞毒活性的方法相同的方法。本說明書中引用的所有的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照援引到本說明書中。實施例以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實施例并不限于本發(fā)明。[實施例1]基因克隆和強制表達(dá)細(xì)胞的制備克隆人緊密連接蛋白3、緊密連接蛋白1、緊密連接蛋白4、緊密連接蛋白6和小鼠緊密連接蛋白3的基因，制備哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，建立強制表達(dá)細(xì)胞。以各自的GenBank參照序列為基礎(chǔ)制備引物，以基因表達(dá)組織cDNA文庫作為模板，分別進行基因的PCR擴增，分離目標(biāo)基因。通過DNA序列分析確認(rèn)所得基因的序列。在基因克隆中使用的引物、cDNA文庫(夕口一>r7夕制備的7，乂》cDNA文庫)如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>將所得各基因摻入到通過小鼠CMV啟動子轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體中，制備哺乳動物表達(dá)載體。表達(dá)載體構(gòu)建中使用的cDNA堿基序列如SEQIDNO.l、3、5、7、9所示。這些表達(dá)載體除了人和小鼠的緊密連接蛋白3,均是在重組蛋白的C末端附加編碼FLAG標(biāo)志的石咸基序列。通過電穿孔法將表達(dá)載體導(dǎo)入到以下的細(xì)胞抹中。Ba/F3是來自小鼠的淋巴細(xì)胞的癌細(xì)胞株。而DG44是來自中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的二氫葉酸還原酶缺損(dhfr—)林。各轉(zhuǎn)化細(xì)胞是使用表達(dá)載體的選擇標(biāo)記——遺傳霉素(Geneticin)(Invitrogen制備)來進4亍選擇。Ba/F3(理化學(xué)研究所生物資源中心制備，細(xì)胞編號RCB0805)DG44(Invitrogen制備，12613014)遺傳霉素抗性林中的重組蛋白質(zhì)表達(dá)的有無可通過SDS-PAGE.蛋白質(zhì)印跡法檢測。利用在蛋白質(zhì)C末端遺傳工程學(xué)附加的FLAG序列作為表達(dá)標(biāo)志，通過抗FLAGM2抗體(Sigma制備)檢測人緊密連接蛋白1、緊密連接蛋白4、緊密連接蛋白6蛋白。人和小鼠緊密連接蛋白3蛋白表達(dá)通過抗緊密連接蛋白3抗體(Zymed，34-1700)檢測。分別篩選確認(rèn)有高蛋白質(zhì)表達(dá)量的克隆，培養(yǎng)保持細(xì)胞，用于以后的分析?？咕o密連接蛋白3單克隆抗體雜交瘤的建立通過使用Helios基因槍系統(tǒng)(Bio-Rad制備)的DNA免疫法免疫小鼠，建立生成抗緊密連接蛋白3單克隆抗體的雜交瘤。首先，用于DNA免疫的表達(dá)載體如下構(gòu)建。通過PCR,從腎cDNA文庫(Clontech制備)中擴增人緊密連接蛋白3的cDNA。PCR使用LATaqDNA聚合酶反應(yīng)溶液(Takara)。cDNA擴增用的引物使用克隆引物1、克隆引物2(表1表示)。將擴增的cDNA片段摻入到pGEM-TEasy載體中，確定堿基序列。通過EcoRI切取含有緊密連接蛋白3的cDNA片段，將該片,殳摻入到作為動物細(xì)胞表達(dá)載體的pMC的EcoRI位點，得到DNA免疫用的表達(dá)載體(人緊密連接蛋白3全長表達(dá)載體)。人緊密連接蛋白3全長表達(dá)載體的堿基序列如SEQIDNO.159所示。SEQIDNO.159的石灰基序列中，836-1498堿基的減基序列編碼緊密連接蛋白3的氬基酸序列。金-DNA(人緊密連接蛋白3全長表達(dá)載體)顆粒在外筒管上的涂布是按照Helios基因槍的操作手冊進行。測取50mgl.0nm的金顆粒，用0.1mL0.05M亞精胺溶液懸浮并混合，加入0.1mL1mg/mL的質(zhì)粒溶液，渦輪攪拌。進一步加入O.lmL1MCaCl2，放置10分鐘，輕輕離心后除去上清，用乙醇懸浮并離心。將乙醇的脫水操作重復(fù)3次，然后最終懸浮于6mL0.05mg/mL聚乙烯基吡咯烷酮/乙醇溶液中。將該溶液吸入到涂布用管中，涂布管并干燥，用管切刀切成0.5英寸的長度。對達(dá)到4誦5周齡的小鼠(日本fY—A只"J^—,MRL/MpJ-Tnfrsf6"Crlj)以1-3次/周的間隔進行DNA免疫(最高200psi氦壓)，該期間斷續(xù)地進行血清中抗緊密連接蛋白3抗體滴度的監(jiān)測。對于確認(rèn)其血清抗體滴度升高的個體，將緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞抹(5乂106個細(xì)胞/每只)給予腹腔內(nèi)。飼養(yǎng)2-3天后摘除脾臟，分離含有抗體生成細(xì)胞的單核細(xì)胞。將來自脾臟的細(xì)胞用P3-X63Ag8U.1(ATCCCRL-1597)以約2:1的比例混合，緩十曼加入PEG1500(RocheDiagnostics制備)，由此進行細(xì)胞融合。小心地加入RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCOBRL制備)，稀釋PEG1500,通過離心操作除去PEG1500。然后將含有下述組成的RPMI1640培養(yǎng)基(以下稱為HAT培養(yǎng)基)播種于96孔培養(yǎng)板中，濃度為200iiL/孔，在37°C、5%C02下大約培養(yǎng)1周。腦FBSlxHAT培養(yǎng)基添加液(SIGMA制備)、和0.5xBM-CondimedHl雜交瘤克隆添加液(RocheDiagnostics制備)通過顯微鏡下確認(rèn)雜交瘤集落的形成，然后通過使用緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)篩選培養(yǎng)上清中是否有緊密連接蛋白3結(jié)合抗體。與強制表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的小鼠抗體使其與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter制備)結(jié)合，使用FASCalibur(BectonDickinson)檢測。在強制表達(dá)細(xì)胞和非重組的母抹的比較中，確認(rèn)了抗體與緊密連接蛋白3的結(jié)合選擇性的陽性孔的雜交瘤通過極限稀釋法進行克隆。通過腹腔內(nèi)給予緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞進行免疫的小鼠中幾乎無法獲得生成緊密連接蛋白3結(jié)合性抗體的雜交瘤。而預(yù)先進行DNA免疫后腹腔內(nèi)給予緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞的小鼠中，可以高效率獲得生成緊密連接蛋白3結(jié)合性抗體的雜交瘤?？寺〉碾s交瘤所生產(chǎn)的抗體亞型通過小鼠單克隆抗體分型試劑盒(RocheDiagnostics制備)進行分析。為了純化單克隆抗體，通過使用FBS、UltralowIgG(Invitrogen)制63備的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤，回收其上清。屬于亞型IgGl、IgG2a、以及l(fā)gG2b的抗體是使用HiTrapProteinGHP(AmershamBiosciences制備)，按照制備者的指示純化。屬于亞型IgG3和IgM的抗體是使用ProteinL瓊脂糖(Sigma)柱，按照與ProteinG同樣的條件純化。洗脫組分是使用PD-10柱(AmershamBiosciences制備)置換成PBS，然后超濾濃縮，在4。C下保存。純化抗體的濃度通過以小鼠IgG為標(biāo)準(zhǔn)的Bradford法計算。單克隆抗體的結(jié)合特異性分析在人染色體上存在24種緊密連接蛋白基因家族。在氨基酸全長區(qū)域內(nèi)與緊密連接蛋白3同源性高的分子是緊密連接蛋白4。為了掌握通過單克隆抗體識別的細(xì)胞表面表位的重復(fù)度和特異性特征，制作了緊密連接蛋白3的預(yù)想胞外區(qū)部分序列和與其相當(dāng)?shù)耐葱愿叩募易宸肿有蛄械姆秩阂约靶蛄斜葘D(圖1)。在胞外環(huán)1區(qū)中同源性最高的家族分子是緊密連接蛋白4(51個殘基中48個殘基相同)。接著是緊密連接蛋白6以及緊密連接蛋白9(51個殘基中的41個殘基相同)與緊密連接蛋白3的同一性高。胞外環(huán)2區(qū)與胞外環(huán)1區(qū)相比，同源性不太高(緊密連接蛋白6和緊密連接蛋白8是22個殘基中有15個殘基同一)。人-小鼠種間的緊密連接蛋白3序列保存性高，胞外環(huán)1區(qū)顯示46/51殘基，環(huán)2區(qū)顯示22/23殘基的同一性(圖2)。為了驗證單克隆抗體的特異性、對表位進行分類，通過流式細(xì)胞術(shù)，與人緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞一起，對與同一性高的、以下的緊密連接蛋白家族分子的強制表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性進行評價。小鼠緊密連接蛋白3、人緊密連接蛋白1、人緊密連接蛋白4、和人緊密連接蛋白6向各強制表達(dá)細(xì)胞中添加單克隆抗體，在4。C下溫育30分鐘。溫育后的細(xì)胞用含有1。/o胎牛血清的PBS溶液清洗l次，接著添加稀釋為150倍的FITC-山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(BeckmanCoulter制備)，進一步在4"C下溫育30分鐘。每個細(xì)胞的結(jié)合抗體量通過FACSCalibur測定，使用FACSCalibur附帶的分析軟件CELLQuestPro計算單位細(xì)胞熒光強度<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>0.1pg/mL時，均觀察到各種抗體的結(jié)合量伴隨著濃度的增加而增加。使用在Ba/F3上強制表達(dá)的人緊密連接蛋白3、人緊密連接蛋白1、人緊密連接蛋白4、人緊密連接蛋白6、小鼠緊密連接蛋白3，評價抗體終濃度為2昭/mL時的交叉反應(yīng)性。與強制表達(dá)抹的母抹Ba/F3細(xì)胞相比，分離的所有抗體均與人緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞強烈結(jié)合。另外，任何抗體均與序列同一性不高的人緊密連接蛋白1、人緊密連接蛋白6強制表達(dá)細(xì)胞幾乎不結(jié)合。顯示緊密連接蛋白3選擇性高結(jié)合性的抗體如下所述。CDN08、CDN16、CDN14、CDN28、CDN29、CD畫、CDN32、CDN33、和CDN36CDN16、CDN35對于人和小鼠緊密連接蛋白3幾乎顯示同等高的結(jié)合性。識別動物種間共通表位的特異抗體可用作分析在病態(tài)模型動物中的藥效與毒性的差分的工具使用。即，將特異性識別動物種間其序列保存的表位的抗體給予病態(tài)模型動物并觀察其藥物動力時，該抗體有望顯示與作為該病態(tài)的治療對象的動物種之間的的動力同樣的表現(xiàn)。與人緊密連接蛋白3結(jié)合的CDN02、CDN05、CDN17、CDN24、CDN27和CDN31顯示與人緊密連接蛋白4也結(jié)合，這顯示兩者是識別共通或者極為相似的序列結(jié)構(gòu)的肽。通過細(xì)胞流術(shù)對抗體與內(nèi)源性表達(dá)緊密連接蛋白3的乳腺癌細(xì)胞抹MCF7(ATCC,HTB-22)的結(jié)合性進行研究。與強制表達(dá)細(xì)胞同樣，可見抗體濃度依賴性的結(jié)合量的增強，而與MCF7結(jié)合的強弱與強制表達(dá)細(xì)胞的結(jié)果未必相關(guān)(圖3)。顯示表位暴露的形式在強制表達(dá)細(xì)胞和癌細(xì)胞抹中有不同。[實施例4]單克隆抗體與胞外環(huán)區(qū)序列肽的結(jié)合性通常，即使將多個跨膜蛋白的短環(huán)作為線狀的肽進行免疫、可順利獲得抗體，也幾乎未見與天然型蛋白具有高親和性并結(jié)合的情況。相反，如果是與牢固的立體結(jié)構(gòu)部分結(jié)合的抗體，則有幾乎不與線狀肽結(jié)合的可能性。使用GST-胞外肽環(huán)融合蛋白，對于與在細(xì)胞上表達(dá)的緊密連接蛋白3結(jié)合的單克隆抗體同相當(dāng)于胞外環(huán)區(qū)的線狀化肽序列的結(jié)合性進行評價。預(yù)想為人緊密連接蛋白3的胞外區(qū)的部分如下所述。66環(huán)1:相當(dāng)于SEQIDN0.2中的氨基酸殘基號為30-80的序列環(huán)2:相當(dāng)于SEQIDN0.2中的氨基酸殘基號為137-159的序列利用大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4T2，構(gòu)建表達(dá)單元，在環(huán)序列的N末端一側(cè)附著GST融合蛋白，在C末端一側(cè)附著His標(biāo)志，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)，純化融合蛋白。環(huán)l、環(huán)2融合蛋白的氨基酸序列分別由SEQIDNO.116和SEQIDNO.117表示。環(huán)1融合蛋白質(zhì)以不溶性蛋白質(zhì)的形式聚集在大腸桿菌內(nèi)，因此在大腸桿菌破碎后回收不溶性組分，用7M尿素使其溶解，在尿素存在下使用鎳親和柱進行純化。用咪唑洗脫后，用50mMTris-HCl(pH8)進行透析，除去尿素。環(huán)2融合蛋白以可溶性蛋白的形式表達(dá)，因此通過谷胱甘肽親和柱純化融合蛋白。純化的融合蛋白質(zhì)涂布在Nunc免疫板上，用含有BSA的溶液阻斷，然后分析單克隆抗體的結(jié)合反應(yīng)性。與涂布的融合蛋白結(jié)合的陽性抗體是使用抗His小鼠單克隆抗體(SantaCmz制備)。反應(yīng)1小時后清洗板，添加堿性磷酸酶標(biāo)志的抗小鼠IgG(H+L)抗體并反應(yīng)，清洗后加入檢測試劑Sigmal04,分析抗體結(jié)合量(圖4)。陽性對照抗His抗體與涂布在板上的融合蛋白結(jié)合，而抗緊密連接蛋白3單克隆抗體幾乎不與環(huán)1、和環(huán)2的任何肽片段結(jié)合。即使僅見微少結(jié)合的抗體也與環(huán)1和環(huán)2融合蛋白同等結(jié)合，未觀察到結(jié)合特異性。由以上結(jié)果顯示，此次分離的抗體完全與緊密連接蛋白3蛋白的剛性結(jié)構(gòu)部分結(jié)合。用目前唯一報道的與緊密連接蛋白3結(jié)合的多克隆抗體是用肽進行免疫、經(jīng)由肽親和純化獲得的，很明確，已報道的抗體與此次分離的抗體與抗原的結(jié)合方式不同。證明在可以以更高效率與在細(xì)胞上表達(dá)的緊密連接蛋白3結(jié)合方面，本發(fā)明的單克隆抗體有效。[實施例5]通過單克隆抗體誘導(dǎo)細(xì)胞毒性使用幼兔補體對單克隆抗體產(chǎn)生的表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞的選擇性補體依賴性細(xì)胞毒活性進行評價。使用人強制表達(dá)緊密連接蛋白3的DG44細(xì)胞作為表達(dá)人緊密連接蛋白3的細(xì)胞，使用母株DG44細(xì)胞作為對照，添加純化的單克隆抗體，使終反應(yīng)濃度為5嗎/mL，然后在4。C下溫育30分鐘。添加幼兔補體(Cederlane,Cat.No.CL3441),使終濃度為1%,在37。C、5。/oC02下溫育90分鐘。溫育后添加DNA結(jié)合熒光試劑7-氨基放線菌素D(7-AAD,Invitrogen制備)，使終濃度為1昭/mL,遮光放置10分鐘。離心后除去上清，將細(xì)胞懸浮于含1%胎牛血清的PBS中，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的染色熒光強度。預(yù)先設(shè)定機器和測定域值條件，使抗體、補體均為非添加狀態(tài)下的7-AAD陽性染色細(xì)胞為5%以下，然后測定抗體的補體依賴性細(xì)胞毒活性。對于母抹DG44細(xì)胞，與未添加抗體的情形同樣，幾乎不誘導(dǎo)細(xì)胞毒，而亞型IgGl的抗體以外的抗體均對強制表達(dá)人緊密連接蛋白3的DG44細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性(圖5)。CDN28、CDN32的抗體亞型是IgGl,顯示細(xì)胞毒誘導(dǎo)活性。以上顯示，此次分離的抗體的大部分具有抗原表達(dá)依賴性的補體依賴性細(xì)胞毒活性誘導(dǎo)能力。接著，通過鉻游離法研究單克隆抗體的對乳腺癌細(xì)胞抹MCF7的補體依賴性細(xì)胞毒活性。MCF7的培養(yǎng)是使用含有10%胎牛血清、10嗎/mL人胰島素的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制備)。將MCF7細(xì)胞鋪于96孔板中，培養(yǎng)過夜，然后添加鉻-51(規(guī)格CJS4,AmershamBiosciences),進一步持續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。將該細(xì)胞用培養(yǎng)基清洗，然后重新添加培養(yǎng)基。接著，向各孔中添加抗緊密連接蛋白3單克隆抗體和對照小鼠IgG2a抗體?？贵w是終濃度為10pg/mL。接著添加幼兔補體，使終濃度為2%,將板在5%。02培養(yǎng)箱中、在37。C下靜置1.5小時。靜置后將板離心(1000rpm,5分鐘，4°C),由各孔中分別回收100pL上清，通過y射線計數(shù)儀(1480WIZARD3",Wallac制備)測定放射活性。通過下式求出特異性鉻游離率。特異性鉻游離率(％)=(A-C)x100/(B-C)式中，A、B和C分別表示以下數(shù)值。A:各孔中的放射活性(cpm)B:添加100細(xì)胞、1002%NP-40溶液(NonidetP-40,CodeNo.252-23,NacalaiTesque制備)的孔中的放射活性(cpm)的平均值C:添加100^L細(xì)胞、100pL培養(yǎng)基的孔中的放射活性(cpm)的平均值在各實驗條件下分別測定3次，對于特異性鉻游離率是計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖6)。下面的單克隆抗體對于MCF7顯示強烈的補體依賴性細(xì)胞毒活性。CDN27、CDN31、CDN35、CD廳、CDN08、CDN16、CDN17、和CDN24毒活性的強度與通過流式細(xì)胞術(shù)法測定的抗體結(jié)合量大致成相關(guān)性。而對照小鼠IgG2a抗體在相同濃度下不顯示補體依賴性的細(xì)胞毒活性。按照鉻游離法測定以MCF7細(xì)胞為靶的抗體依賴性細(xì)胞性毒活性。即，用96孔平底板培養(yǎng)細(xì)胞，與鉻-51反應(yīng)，然后用RPMI1640培養(yǎng)基清洗，添加新的100jliL的培養(yǎng)基。接著添加抗緊密連接蛋白3單克隆抗體和對照(無抗體)，使終濃度為0.1昭/mL。接著，向各孔中添加MCF7的約50倍細(xì)胞數(shù)的效應(yīng)細(xì)胞溶液，將板在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、在37。C下培養(yǎng)。將C3H/HeNCrlCrlj小鼠(日本fY—>7.卩乂《一株式會社)的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用含有50ng/mL重組人白細(xì)胞介素-2(CatNo.200-02,Peprotech)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。靜置6小時后測定特異性的鉻游離率，分別計算平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖7)。與未添加抗體的和對照抗體(亞型IgG2a)相比，通過添加CDN04、CDN27、CDN35、CDN16,誘導(dǎo)了鉻游離，確認(rèn)是對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞顯示抗體依賴性的細(xì)胞毒活性的抗體?？贵w可變區(qū)的克隆和重組抗體的制備利用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(Clonetech制備)，克隆編碼抗體可變區(qū)的cDNA，確定其堿基序歹'J。使用RNeasyMini(Qiagen制備)，由培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中回收總RNA。以此為基礎(chǔ)，按照SMARTRACEcDNA擴增試劑盒手冊，合成cDNA,使用亞型特異性引物，通過PCR擴增抗體基因可變區(qū)的cDNA。擴增中使用的亞型特異性引物序列如表3所示。69[表3]抗體亞型引物序列IgG15'-CCATGGAGTTAGTTTGGGCAGGAGATCC-3'(SEQIDNO129)IgG2a5'-CAGGGGCGAGTGGATAGACCGATG-3'(SEQIDNO130)IgG2b5'-CAGGGGCGAGTGGATAGACTGATG-3'(SEQIDNO131)IgG35'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAA-3'(SEQIDNO188)IgK5'-GGGACCTCCAGATGTTMCTGGTCACT-3'(SEQIDNO132)IgL5'-TCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAAG-3'(SEQIDNO133)將使用TakaraExTaqDNA聚合酶(夕力，制備)擴增的片段克隆到pGEM-TEasy載體上，確定堿基序列。根據(jù)確定的抗體可變區(qū)，制備重組抗體表達(dá)載體。即，在人抗體IgGl恒定區(qū)和人IgK恒定區(qū)上分別連接克隆的重鏈、輕鏈可變序列，使翻譯讀框一致。制備上述構(gòu)建的小鼠-人嵌合抗體基因通過小鼠CMV啟動子轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體。表達(dá)載體導(dǎo)入到COS7細(xì)胞中，得到瞬時性重組抗體表達(dá)細(xì)胞。通過采用培養(yǎng)2天后的上清和抗人IgG(H+L)-FITC作為二次抗體的該流式細(xì)胞術(shù)，確認(rèn)重組抗體顯示緊密連接蛋白3強制表達(dá)細(xì)胞特異性的結(jié)合(圖8)。單克隆抗體與在細(xì)胞上表達(dá)、呈遞的環(huán)的結(jié)合分析如之前所述，本發(fā)明的單克隆抗體對于與GST蛋白融合得到的直鏈狀的預(yù)想胞外環(huán)肽未見結(jié)合性。為了獲得該單克隆抗體的表位相關(guān)信息，對于各抗體與環(huán)1和環(huán)2哪一個結(jié)合進行了分析。此次分離的單克隆抗體幾乎不與人緊密連接蛋白1結(jié)合。使具有緊密連接蛋白3的環(huán)1和緊密連接蛋白1的環(huán)2的嵌合分子(CLD1/3)、具有緊密連接蛋白1的環(huán)1和緊密連接蛋白3的環(huán)2的嵌合分子(CLD3/1)在細(xì)胞上表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)法分析抗體與細(xì)胞的結(jié)合性。如果與表達(dá)CLD1/3的細(xì)胞結(jié)合、但不與表達(dá)CLD3/1的細(xì)胞結(jié)合，則抗體與環(huán)2結(jié)合；如果不與表達(dá)CLD1/3的細(xì)胞結(jié)合，但與表達(dá)CLD3/1的細(xì)胞結(jié)合，則抗體與環(huán)1結(jié)合。對緊密連接蛋白3和緊密連接蛋白1的氨基酸序列進行比較，則在第3號的預(yù)想跨膜區(qū)中存在共通的序列基序FLLA。以該部分為分界，設(shè)計為其前后的氨基酸序列置換連接而成的嵌合結(jié)構(gòu)。設(shè)計的嵌合分子的氨基酸信息如下。CLDl/3蛋白緊密連接蛋白l氨基酸序列l(wèi)-127和緊密連接蛋白3氨基酸序列126-220CLD3/1蛋白緊密連接蛋白3氨基酸序列1-125和緊密連接蛋白1氨基酸序列128-211各嵌合分子的堿基序列和氨基酸序列由如下SEQIDNO.所示。具體來說，如下進行基因構(gòu)建。以緊密連接蛋白1、3cDNA序列為模板，PCR擴增基因部分片段，并且通過PCR裝配連接基因片段，形成具有嵌合分子結(jié)構(gòu)。將其符合翻譯讀框地?fù)饺氲絼游锛?xì)胞表達(dá)載體中，在C末端上附加FLAG標(biāo)志。向Ba/F3細(xì)胞中導(dǎo)入載體，獲得抗藥性細(xì)胞抹。抗藥性林中的蛋白質(zhì)表達(dá)通過使用抗FLAG抗體的蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)，選擇表達(dá)量高的株，建立了嵌合分子表達(dá)細(xì)胞。使用嵌合分子表達(dá)細(xì)胞林的單克隆抗體結(jié)合表位分析顯示了另人以外的結(jié)果。所分析的單克隆抗體的大部分是與具有天然型氨基酸序列的緊密連接蛋白3(CLD3/3)強烈結(jié)合。即，在圖9的FACS的結(jié)果中，可以確認(rèn)檢測出熒光信號的明確的峰。而幾乎所有的單克隆抗體與實驗中所使用的兩種嵌合蛋白表達(dá)細(xì)胞完全不結(jié)合。對于一部分抗體雖然可見弱的熒光峰，也只是可見結(jié)合傾向的程度。例如，在CDN16和CLD1/3、CDN35和CLD1/3之間可見弱的結(jié)合。對于抗緊密連接蛋白3小鼠抗血清也觀察到顯示同樣傾向的結(jié)果。由這些結(jié)果可以推斷，在雜交瘤篩選的階段，不是由于篩選偏倚的問題；為了抗體與在細(xì)胞上表達(dá)的緊密連接蛋白3強烈結(jié)合，必須有環(huán)1和環(huán)2兩者?？咕o密連接蛋白3嵌合抗體恒定表達(dá)細(xì)胞林的制備使用人嵌合抗體表達(dá)載體，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化DG44細(xì)胞。以遺傳霉素抗性為指標(biāo)，進行重組細(xì)胞克隆選擇，其中，所述遺傳霉素抗性由;咸基序列CLDl/3蛋白SEQIDNO.160CLD3/1蛋白SEQIDNO.162氨基酸序列SEQIDNO.161SEQIDNO.163存在于人嵌合抗體表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記獲得。通過使用抗人抗體的夾層ELISA法檢測所克隆的重組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體量，篩選重組抗體表達(dá)細(xì)胞。使用HiTrap蛋白A柱(AmershamBioscience制備)，按照所附說明書，由篩選的重組細(xì)胞的培養(yǎng)上清進行人嵌合抗體的純化。通過流式細(xì)胞術(shù)對強制表達(dá)緊密連接蛋白3的DG44細(xì)胞、人嵌合抗體與緊密連接蛋白3強制表達(dá)Ba/F3的結(jié)合性進行分析。向強制表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞中添加嵌合抗體并反應(yīng)后，使用抗人IgG(H+L)-FITC檢測結(jié)合的嵌合抗體。如圖ll所示，通過添加嵌合抗體可觀察到直方圖的顯著的位移，確定了嵌合抗體與緊密連接蛋白3的結(jié)合。添加抗緊密連接蛋白3抗體導(dǎo)致軟瓊脂中集落的形成和抑制細(xì)胞遷移能力Agarwal等人由使用緊密連接蛋白3、4強制表達(dá)以及小干擾RNA的分析，報道了緊密連接蛋白3、緊密連接蛋白4的過量表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的存活能力提高、浸潤性的獲得有關(guān)(Agarwal等人(2005)CancerRes65,7378-7385)。而Michl等人報道了通過緊密連接蛋白4過量表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤能力(Michl等人(2003)CancerRes63,6265-6271)。上述報道中對于有否表達(dá)或者增減帶來的影響進行了研究，而與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體顯示可改變細(xì)胞的功能的文獻(xiàn)報道至今尚未見。對于抗緊密連接蛋白3抗體的結(jié)合是否會使癌細(xì)胞的存活能力或浸潤性變化、抗體的添加對MCF7細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成、和對細(xì)胞遷移能力的影響進行了分析?？贵w添加對軟瓊脂中集落形成的影響是使用CytoSlect96孔體外癌細(xì)胞感受性測定(CellBiolabs,Inc.制備)進行評價。每孔中添加5000個MCF7細(xì)胞，與小鼠抗體一起散入軟瓊脂中，在37。C下、在5%(302下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后通過MTT法對細(xì)胞數(shù)進行定量(圖12)。通過添加抗緊密連接蛋白3抗體，可抑制集落的形成，在CDN04中其效果特別強。抗體添加對細(xì)胞遷移能力的影響是按照以下的方法(wound-healing測定)進行評價。將MCF7細(xì)胞鋪于12孔塑料板中，持續(xù)培養(yǎng)至可附著增殖的細(xì)胞密度飽和。用移液管的頭將細(xì)胞單層劃成線狀。更換新培養(yǎng)72液，然后添加抗體，終濃度為10嗎/mL，持續(xù)培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后可見，不添加抗體的對照孔中細(xì)胞移動，覆蓋劃痕區(qū)域，而在添加CDN04抗體的孔(IOpg/mL)中，幾乎未見細(xì)胞向劃痕區(qū)域移動(圖13)。在添加CDN16、CDN27、CDN28、CDN35、CDN38的孔中，未觀察到顯著的細(xì)胞遷移抑制。本實施例首次確認(rèn)了通過緊密連接蛋白3結(jié)合抗體，可以進行癌癥細(xì)胞特征性的無貼壁依賴性增殖、細(xì)胞移動等細(xì)胞功能的控制。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明提供抗緊密連接蛋白3單克隆抗體。緊密連接蛋白3在種間的同一性高，因此不容易通過常規(guī)免疫方法獲得抗體。因此，本發(fā)明提供識別緊密連接蛋白3的抗體，其意義非常大。特別是在優(yōu)選的方案中，由本發(fā)明提供的單克隆抗體可以與在細(xì)胞表面表達(dá)的緊密連接蛋白3結(jié)合，同時基本上未并觀察到與相當(dāng)于緊密連接蛋白3胞外結(jié)構(gòu)域的、含氨基酸序列的線狀肽的反應(yīng)性。即，可以預(yù)測本發(fā)明的單克隆抗體是在利用相當(dāng)于胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域肽免疫中無法獲得的抗體。并且，屬于緊密連接蛋白家族的很多分子結(jié)構(gòu)類似。并且胞外結(jié)構(gòu)域的長度短，可以預(yù)測是較難獲得可以互相識別在細(xì)胞表面上表達(dá)的緊密連接蛋白家族分子的抗體的。但是在優(yōu)選的實施方案中，由本發(fā)明提供的單克隆抗體可以免疫學(xué)識別緊密連接蛋白3和緊密連接蛋白6。構(gòu)成緊密連接蛋白3胞外環(huán)1的氨基酸序列51個殘基中，41個殘基與緊密連接蛋白6的胞外環(huán)1的氨基酸序列同一。這樣，可以免疫學(xué)識別同一性高的分子的抗體可以稱為特異性優(yōu)異的抗體。因此，本發(fā)明提供特異性識別在癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的緊密連接蛋白3并可結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體，可以檢測出高表達(dá)緊密連接蛋白3的癌癥。例如已確認(rèn)卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等中的緊密連接蛋白3表達(dá)亢進。即，本發(fā)明的單克隆抗體可用作卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等緊密連接蛋白3表達(dá)亢進的癌癥的i貪斷。在優(yōu)選方案中，已證實本發(fā)明的單克隆抗體對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞顯示細(xì)胞毒作用。具體來說，例如可提供具有對乳腺癌的CDC作用、ADCC作用的單克隆抗體。并且在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體不僅識別緊密連接蛋白3,還識別緊密連接蛋白4。已報道緊密連接蛋白4是子宮癌患者的在具有化療藥物抗性的復(fù)發(fā)部位表達(dá)亢進的基因。因此，本發(fā)明的單克隆抗體顯示對于高表達(dá)緊密連接蛋白3或緊密連接蛋白4的癌癥的治療有效。并且本發(fā)明的單克隆抗體在進行了將恒定區(qū)置換為來自人的氨基酸序列的嵌合化之后，仍保持對緊密連接蛋白3的結(jié)合活性。這證實本發(fā)明提供的單克隆抗體可作可為嵌合化、可以給予人的癌癥治療用的抗體。即，本發(fā)明的單克隆抗體對于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等緊密連接蛋白3和緊密連接蛋白4其中一種或者兩種表達(dá)亢進的癌癥的治療有效。權(quán)利要求1.單克隆抗體，該單克隆抗體與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合。2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，該單克隆抗體基本上不與含有SEQIDNO.2所述氨基酸序列的第30號-第80號氨基酸序列的肽、或含有第137號-159號氨基酸的肽交叉反應(yīng)。4.權(quán)利要求l-3中任一項所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.4所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。5.權(quán)利要求l-3中任一項所述的單克隆抗體，該單克隆抗體與在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.8所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。6.抗體，該抗體識別由蛋白質(zhì)的2個胞外環(huán)形成的立體結(jié)構(gòu)并結(jié)合，其中，所述蛋白質(zhì)是在細(xì)胞膜上表達(dá)的、含有SEQIDN0.2、SEQIDN0.4、和SEQIDN0.8中任一個所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。7.權(quán)利要求6所述的抗體，該抗體基本上不與含有SEQIDN0.2所述氨基酸序列的第30號-第80號氨基酸序列的肽、或含有第137號-159號氨基酸的肽交叉反應(yīng)。8.權(quán)利要求6或7所述的抗體，該抗體是單克隆抗體。9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的抗體，該抗體具有細(xì)胞毒活性。10.權(quán)利要求9所述的抗體，其中，細(xì)胞毒活性是ADCC活性。11.權(quán)利要求9所述的抗體，其中，細(xì)胞毒活性是CDC活性。12.權(quán)利要求l-ll中任一項所迷的抗體，該抗體結(jié)合有化療藥物或毒性肽。13.抗體，該抗體是與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，結(jié)合有選自化療藥物、毒性肽和放射性同位素的任意一種細(xì)胞毒活性物質(zhì)。14.權(quán)利要求1-13中任一項所述的抗體，該抗體是以下(1)-(61)中任一項所述的抗體(1)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.12所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.14所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.16所述的氨基酸序列作為CDR3;(2)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.20所述的氨基酸序列的139-462號氨基酸序列作為CH;(3)含有(l)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(4)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.24所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.26所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.28所述的氨基酸序列作為CDR3;(5)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.32所述的氨基酸序列的135-240號氨基酸序列作為CL;(6)含有(4)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.34所述的氨基酸序列作為CL;(7)抗體，該抗體含有(l)所述的H鏈和(4)所迷的L鏈；(8)抗體，該抗體含有(2)所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(9)抗體，該抗體含有(3)所述的H鏈和(6)所述的L鏈；(10)抗體，該抗體是在(l)-(9)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(l)-(9)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(11)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.36所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.38所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.40所迷的氨基酸序列作為CDR3;(12)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO,44所述的氨基酸序列的140-476號氨基酸序列作為CH;(13)含有(ll)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(14)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.46所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.48所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.50所述的氨基酸序列作為CDR3;(15)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO,54所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(16)含有(14)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(17)抗體，該抗體含有(11)所述的H鏈和(14)所述的L鏈；(18)抗體，該抗體含有(12)所述的H鏈和(15)所述的L鏈；(19)抗體，該抗體含有(13)所述的H鏈和(16)所述的L鏈；(20)抗體，該抗體是在(11)-(19)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(11)-(19)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(21)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.56所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.58所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.60所述的氨基酸序列作為CDR3;(22)含有(21)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO,64所述的氨基酸序列的137-471號氨基酸序列作為CH;(23)含有(21)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(24)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.66所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.68所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.70所述的氨基酸序列作為CDR3;(25)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.74所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(26)含有(24)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(27)抗體，該抗體含有(21)所述的H鏈和(24)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體含有(22)所述的H鏈和(25)所述的L鏈；(29)抗體，該抗體含有(23)所迷的H鏈和(26)所述的L鏈；(30)抗體，該抗體是在(21)-(29)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(21)-(29)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(31)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.76所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.78所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.80所述的氨基酸序列作為CDR3;(32)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.84所述的氨基酸序列的140-463號氨基酸序列作為CH;(33)含有(31)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(34)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.M所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.88所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.卯所述的氨基酸序列作為CDR3;(35)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.94所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(36)含有(34)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(37)抗體，該抗體含有(31)所述的H鏈和(34)所述的L鏈；(38)抗體，該抗體含有(32)所述的H鏈和(35)所述的L鏈；(39)抗體，該抗體含有(33)所述的H鏈和(36)所述的L*i;(40)抗體，該抗體是在(31)-(39)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(31)-(39)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(41)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.96所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.98所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.100所述的氨基酸序列作為CDR3;(42)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.104所述的氨基酸序列的140-474號氨基酸序列作為CH;(43)含有(41)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.22所述的氨基酸序列作為CH;(44)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO,106所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.108所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDNO.110所述的氨基酸序列作為CDR3;(45)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.114所述的氨基酸序列的133-238號氨基酸序列作為CL;(46)含有(44)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.34所述的氨基酸序列作為CL;(47)抗體，該抗體含有(41)所述的H鏈和(44)所述的L鏈；(48)抗體，該抗體含有(42)所述的H鏈和(45)所述的L鏈；(49)抗體，該抗體含有(43)所述的H鏈和(46)所述的L鏈；(50)抗體，該抗體是在(41)-(49)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(41)-(49)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(51)含有H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDNO.167所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDN0.169所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.171所述的氨基酸序列作為CDR3;(52)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.173所述的氨基酸序列的118-447號氨基酸序列作為CH;(53)含有(51)所述的H鏈的抗體，該H鏈具有SEQIDN0.22所述的氨基酸序列作為CH;(54)含有L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.179所述的氨基酸序列作為CDR1、SEQIDNO.181所述的氨基酸序列作為CDR2、和SEQIDN0.183所述的氨基酸序列作為CDR3;(55)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDN0.1S5所述的氨基酸序列的113-218號氨基酸序列作為CL;(56)含有(54)所述的L鏈的抗體，該L鏈具有SEQIDNO.34所述的氨基酸序列作為CL;(57)抗體，該抗體含有(51)所述的H鏈和(54)所述的L鏈；(58)抗體，該抗體含有(52)所述的H鏈和(H)所述的L鏈；(59)抗體，該抗體含有(53)所述的H鏈和(56)所述的L鏈；(60)抗體，該抗體是在(51)-(59)中任一項所述的抗體中有1或多個氨基酸置換、缺失、附加和/或插入所得的抗體，與(51)-(59)中任一項所述的抗體具有同等的活性；(61)抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與(l)-(60)中任一項所述的抗體所結(jié)合的緊密連接蛋白3蛋白的表位相同。15.癌癥的診斷方法，該診斷方法包含將上述權(quán)利要求1-14中任一項所述的抗體與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的步驟。16.癌癥的診斷方法，該診斷方法包含以下步驟(a)從^皮檢者釆集試樣的步驟；(b)使用與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體，檢測采集的試樣中所含的緊密連接蛋白3蛋白的步驟。17.癌癥的診斷方法，該診斷方法包含以下步驟(l)將用放射性同位素標(biāo)記的、與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予被檢者的步驟；以及(2)檢測上述放射性同位素的聚集的步驟。18.權(quán)利要求17所述的診斷方法，其中，放射性同位素是正電子發(fā)射核素。19.權(quán)利要求18所述的診斷方法，其中，正電子發(fā)射核素是選自UC、13N、150、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I的任意之一的核素。20.權(quán)利要求15-19中任一項所述的診斷方法，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的任意之一的癌癥。21.權(quán)利要求20所述的診斷方法，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。22.權(quán)利要求20所述的診斷方法，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。23.用于癌癥的診斷方法的診斷藥，該診斷藥含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體。24.用于癌癥的診斷方法的試劑盒，該試劑盒含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體和含有緊密連接蛋白3蛋白的生物試樣。25.藥物組合物，該藥物組合物含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分。26.細(xì)胞增殖抑制劑，該細(xì)胞增殖抑制劑含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分。27.抗癌藥，該抗癌藥含有與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分。28.權(quán)利要求27所述的抗癌藥，其中，癌癥為選自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的4壬意之一的癌癥。29.權(quán)利要求28所述的抗癌藥，其中，癌癥為原發(fā)性癌癥。30.權(quán)利要求28所述的抗癌藥，其中，癌癥為轉(zhuǎn)移性癌癥。31.權(quán)利要求28所述的抗癌藥，其中，抗體為權(quán)利要求1-14中任一項所述的抗體。32.與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。33.與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體在制備抗癌藥中的應(yīng)用。34.抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包含將與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予對象的步驟。35.預(yù)防或治療癌癥的方法，該方法包含將與緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體給予對象的步驟。36.對表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞毒的方法，該方法包含將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸的步驟。37.抑制表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞的增殖的方法，該方法包含將表達(dá)緊密連接蛋白3蛋白的細(xì)胞與同緊密連接蛋白3蛋白結(jié)合的抗體接觸的步驟。全文摘要本發(fā)明提供與在細(xì)胞表面上表達(dá)的緊密連接蛋白3特異性結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體可用作卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等緊密連接蛋白3表達(dá)亢進的癌癥的診斷。本發(fā)明還提供對這些癌癥細(xì)胞顯示細(xì)胞毒作用的單克隆抗體。即，公開了使表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞同與緊密連接蛋白3結(jié)合的抗體接觸，對表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞毒的方法，以及抑制表達(dá)緊密連接蛋白3的細(xì)胞增殖的方法。并且本發(fā)明還公開了癌癥的診斷或治療方法。文檔編號C07K16/28GK101663322SQ20078005133公開日2010年3月3日申請日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者吉田賢二申請人:株式會社未來創(chuàng)藥研究所