專利名稱：：犬胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及犬胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素蛋白(犬"TSLP")、編碼犬TSLP的核酸分子、栽體和宿主細(xì)胞，以及制備和使用犬TSLP的方法。
背景技術(shù)：
：患有反應(yīng)素介導(dǎo)的疾病，例如特應(yīng)性疾病的動(dòng)物，包括人，具有產(chǎn)生涉及免疫球蛋白E(IgE)抗體的速發(fā)變態(tài)反應(yīng)的遺傳傾向。由此得到的這些動(dòng)物的這種表型的表達(dá)是由多個(gè)遺傳因子促成的。特應(yīng)性疾病的速發(fā)過敏性是由于暴露于特定的過敏原，例如室內(nèi)塵螨(D^7miM/^flgwVfes/^n/ijwZm^)、花粉、霉菌、以及毛屑。不出人意料的是，患有特應(yīng)性疾病的個(gè)體更容易患哮喘、遺傳過敏性皮炎、以及與內(nèi)部IgE釋放有關(guān)的其它疾病。特應(yīng)性疾病如過敏性皮炎、哮喘等等，也發(fā)生于犬類，包括家犬。這些犬一般在1到3歲之間開始出現(xiàn)特異反應(yīng)性的征兆。盡管我們知道其它種類的犬，包括雜交品種，也會(huì)出現(xiàn)特異反應(yīng)性，但由于該病的遺傳特性，許多品種，包括金毛獵犬、許多小獵犬、愛爾蘭長(zhǎng)毛獵犬、拉薩獅子犬、斑點(diǎn)犬、斗牛犬、以及英國(guó)古老牧養(yǎng)犬，有更大的傾向出現(xiàn)特異反應(yīng)性。至少一種特定類型的特異反應(yīng)性，即遺傳過敏性皮炎的發(fā)病率在人和犬中都顯著提高。5特異反應(yīng)性犬通常會(huì)摩擦、舔、啃、咬、或抓自己的腳、鼻口部、耳朵、腋窩或腹股溝區(qū)域，導(dǎo)致毛發(fā)脫落、皮膚變紅、增厚。在某些情況下，多種皮膚病共同作用導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)癢，而單獨(dú)一種過敏癥不會(huì)導(dǎo)致如此之癢。這些惡化的問題可能是由于空氣傳播的過敏原(花粉等)、食物中的過敏原、以及來自寄生蟲(跳蚤等)的過敏原。皮膚的細(xì)菌和/或真菌感染也能加重癢的感覺。一種減輕特異反應(yīng)性的惱人癥狀的簡(jiǎn)單方法是避免刺激性的過敏原。遺憾的是，這種避免通常是不現(xiàn)實(shí)的。迄今為止，獸醫(yī)師已經(jīng)通過下列方法治療了犬遺傳過敏性皮炎口服抗組胺藥、口服或外用皮質(zhì)類固醇消炎劑、其它免疫系統(tǒng)抑制劑如環(huán)孢霉素或他克莫司(tacrolimus)、脂肪酸增補(bǔ)劑、以及過敏原特異性免疫療法(需要注射確定的抗原)。然而，上迷療法沒有一種能適用全部病例。此外，這些療法花費(fèi)昂貴和/或產(chǎn)生顯著的副作用。因此，長(zhǎng)期以來需要更安全、更有效、并且更經(jīng)濟(jì)的方法來治療或抑制犬遺傳過敏性皮炎的癥狀。哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答基于一系列復(fù)雜的細(xì)胞相互作用，稱為"免疫網(wǎng)絡(luò)"。大多數(shù)免疫應(yīng)答涉及淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、以及其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)狀相互作用，其中被稱為細(xì)胞因子的可溶性蛋白在介導(dǎo)/控制/調(diào)節(jié)這些細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。因此，細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞介導(dǎo)導(dǎo)致各種炎癥的特定生理機(jī)制或通路。過敏性炎癥是由于復(fù)雜的免疫級(jí)聯(lián)造成的，其導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生源于失調(diào)的2型T輔助淋巴細(xì)胞(TH2)的細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、以及白細(xì)胞介素13UL-13)。這些細(xì)胞因子依次觸發(fā)了支氣管過度反應(yīng)、IgE生成、嗜酸性粒細(xì)胞增多、以及黏液的產(chǎn)生。(參見BusseandLemanske，Jr.(2001)iV./.M^/.Ml:350-62;Holgate(2000)Br.Af^i/231-234;以及Renauld(2001)/尸fl^rt/.M:577-589)。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素蛋白(TSLP)是一種類似白細(xì)胞介素7(IL-7)的細(xì)胞因子，其最初在小鼠中被鑒定為一種因子支持(i)膜表面具有免疫球蛋白M(IgM)的B細(xì)胞的體外發(fā)育，(ii)B細(xì)胞與T細(xì)胞的增殖(Friend等人，1994，ExpHematology2^:321-328，Levin等人，1999，J.Immunol162:677_683)?，F(xiàn)在已知TSLP結(jié)合于一種細(xì)胞受體，其包含IL-7R-a亞單位和一種稱為TSLP-R的獨(dú)有受體亞單位。這種相互作用可在造血細(xì)胞，例如子(STAT)的激活或胸腺和激活可調(diào)節(jié)趨化因子(TARC)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)(參見例如共有的美國(guó)專利第6,890,734號(hào)，合并到本文中作為參考)。TSLP在小鼠的過敏性疾病如遺傳過敏性皮炎和哮喘的發(fā)病機(jī)理中也可能起重要作用。舉例來說，在皮膚中特別誘導(dǎo)TSLP基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出遺傳過敏性皮炎的免疫學(xué)和臨床特征，例如濕療性損傷，其包括炎性皮膚細(xì)胞浸潤(rùn)、表達(dá)皮膚歸巢受體的Th2CD4+T細(xì)胞顯著增多、以及IgE血清水平的升高。此外，表達(dá)肺特異性TSLP基因的小鼠的肺部表現(xiàn)出哮喘的免疫學(xué)和臨床特征，其包括大量白細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化、2型T輔助細(xì)胞因子的增多，以及IgE水平的升高。Sims等用表達(dá)克隆得到了鼠TSLP的cDNA序列，但是用基于鼠TSLP的雜交探針不能克隆人的同源體(Sims等人，2000,/g幼Mgc,192:671—680)。其后，通過詳細(xì)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析，人的同源體被鑒定出來。已發(fā)現(xiàn)人TSLP的核苷酸序列與對(duì)應(yīng)的小鼠序列只有43%的同源性。因此，需要提供新的且更實(shí)用的方法來治療犬特應(yīng)性疾病，包括遺傳過敏性皮炎及其相關(guān)臨床表現(xiàn)。此外，需要分離出導(dǎo)致犬特應(yīng)性疾病的免疫級(jí)聯(lián)所涉及的因子，其可能引發(fā)上述療法的發(fā)展。本文對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)該參考文獻(xiàn)可作為本申請(qǐng)的"現(xiàn)有技術(shù)"。，或樹突細(xì)胞中觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，其經(jīng)由轉(zhuǎn)錄活化因發(fā)明概要本發(fā)明提供了新的且更實(shí)用的方法來治療犬特應(yīng)性疾病，包括遺傳過敏性皮炎及其相關(guān)臨床表現(xiàn)。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了新的分離的和/或重組的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素蛋白(TSLP)，其涉及導(dǎo)致特應(yīng)性疾病的免疫級(jí)聯(lián)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這些TSLP蛋白的抗原片段。在本發(fā)明的某一具體方面，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白。因此本發(fā)明提供了一種TSLP蛋白，其包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有80%或更高的同一性，且不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列，當(dāng)該蛋白作為疫苗施用于實(shí)驗(yàn)犬時(shí)，從接種疫苗的實(shí)驗(yàn)犬取樣的犬血清中可檢測(cè)到抗體，該抗體與包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的犬TSLP蛋白結(jié)合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述TSLP蛋白包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有80%或更高的同一性，且不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列；并且可與包含SEQIDNO:2中氨基酸的犬TSLP的抗體交叉反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種TSLP蛋白，其包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有8(T/o或更高的同一性(不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列)，該蛋白與一種表位特異性的犬TSLP單克隆抗體結(jié)合。在一更具體的實(shí)施方式中，TSLP蛋白包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有90%或更高的同一性，不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列。在另一實(shí)施方式中，TSLP蛋白包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有95%或更高的同一性，不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列。在本發(fā)明的一特定實(shí)施方式中，TSLP蛋白為犬TSLP蛋白，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，TSLP蛋白為成年犬TSLP蛋白，其包含SEQIDNO:2中的氨基酸殘基29-155。本文還提供了本發(fā)明的TSLP蛋白的抗原片段。這些抗原片段包括含一個(gè)或多個(gè)表位的那些片段，所述表位分別由氨基酸序列SEQIDNOs:8-101定義在一種具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種抗原片段包含一個(gè)或多個(gè)表位，其包含一段氨基酸序列，該序列來自SEQIDNOs:30、31、32和/或34。在另一實(shí)施方式中，抗原片段可有一段氨基酸序列，該序列包含在氨基酸序列SEQIDNOs:30、31、32、和/或34的重疊區(qū)內(nèi)，即NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(SEQIDNO:118)。在一種具體的實(shí)施方式中，犬TSLP蛋白的一種抗原片段能夠與抗人TSLP的單克隆抗體結(jié)合。氨基酸序列NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(SEQIDNO:118)的抗原片段的大小在約5個(gè)到約21個(gè)氨基酸殘基之間，本文還提供了疫苗，這些疫苗可包含有效量的下列各項(xiàng)本發(fā)明的任何TSLP蛋白、其一種或多種抗原片段、或者上述全長(zhǎng)蛋白與一種或多種上述片段的組合。在一實(shí)施方式中，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一具體的實(shí)施方式中，一種疫苗包含犬TSLP蛋白的一種或多種抗原片段，該蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸殘基71-92(本文鑒定為SEQIDNO:118)中第5到22位鄰接的氨基酸。在此公開了包括表位的上述抗原片段的實(shí)例，其包含SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、或SEQIDNO:34的氨基酸序列。本發(fā)明的所有疫苗可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的佐劑。本發(fā)明的疫苗可用于誘導(dǎo)抗犬TSLP抗體的方法。一種這樣的方法包括用有效量的疫苗免疫哺乳動(dòng)物。該方法任選包括一種下調(diào)犬體內(nèi)TSLP活性的方法，和/或一種治療或預(yù)防特異反應(yīng)性犬的過敏癥狀的方法，其包括用有效量的疫苗免疫犬。被改善的過敏癥狀可包括過敏性皮炎、哮喘等等。本發(fā)明的疫苗可通過以下途徑施用肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、口服、鼻腔給藥、劃痕法、以及上述方法的組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種核酸分子，其編碼本發(fā)明的一種TSLP蛋白或?qū)嵤┓绞街?，所述核酸分子編碼SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一具體的此類實(shí)施方式中，所述核酸分子包含SEQIDNO:1的核苷酸序列，SEQIDNO:1的核苷酸序列的下列片段也是本發(fā)明的一部分約18個(gè)連續(xù)核苷酸的片段、約24個(gè)連續(xù)核苷酸的片段、約36個(gè)連續(xù)核苷酸的片段、約45個(gè)連續(xù)核普酸的片段、約66個(gè)連續(xù)核苷酸的片段、或更大的片段。本發(fā)明了還提供了下列核酸約18個(gè)核苷酸、約24個(gè)核苷酸、約36個(gè)核苷酸、約45個(gè)核苷酸、約66個(gè)核苷酸、或更大的核酸，包括編碼全長(zhǎng)TSLP蛋白的核酸，其在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQIDNO:l雜交。本發(fā)明的所有核酸分子及其片段可進(jìn)一步包含異源核苷酸序列。本發(fā)明還提供表達(dá)栽體，其包括前面所述的核酸分子和/或其片段.另外，本發(fā)明提供包含這種表達(dá)栽體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可任選為原核或真核宿主細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在一具體的此類實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞為包含T7RNA聚合酶基因的五.//BL21(DE3)/pLysS，該基因受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的lacUV5啟動(dòng)子調(diào)控。本發(fā)明進(jìn)一步提供重組病毒栽體和/或棵DNA栽體，其包含上述編碼犬TSLP的核酸分子中的一種，例如SEQIDNO:l和/或該其片段。這些栽體可用于，舉例來說，適合施用于患有遺傳過敏性皮炎的犬的疫苗。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)本發(fā)明的TSLP蛋白的方法。這樣的方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。該方法可進(jìn)一步包括從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離和/或提純TSLP蛋白的步驟。分離和/或提純所得到的蛋白也是本發(fā)明的一部分。一部分。在一此類實(shí)施方式中應(yīng)用哺乳動(dòng)物雜交瘤體系。在一具體的實(shí)施方式中，抗體被分離和/或提純。所述抗體可以是多克隆或單克隆的。根據(jù)本發(fā)明，在非犬物種中誘導(dǎo)產(chǎn)生的單克隆抗體可任選進(jìn)行犬源化改造，從而在給實(shí)驗(yàn)犬注射時(shí)盡量降低抗原性.在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的任何抗體的結(jié)合區(qū)可任選轉(zhuǎn)換為(例如通過裂解)比原抗體小的結(jié)合片段，和/或成為一種重組Fv、Fab、以及F(ab')2結(jié)合蛋白。本發(fā)明還包括源于抗體的治療用蛋白，其包含天然重鏈抗體(例如NANOBODIES)所獨(dú)有的結(jié)構(gòu)和功能特性。另外，本發(fā)明還包括具有TSLP高親和性和低免疫原性的抗體替代物(例如從TSLP受體的結(jié)合區(qū)制備的高親合性多聚體)。這些新的抗犬TSLP抗體及高親合性多聚體可方便地用于治療特異反應(yīng)性犬的過敏癥狀的方法，該方法通過施用有效量的抗犬TSLP抗體進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供疫苗，其包含有效量的非TSLP免疫原，該免疫原與有效量的下列各項(xiàng)組合本發(fā)明的TSLP蛋白、該蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原片段、或者全長(zhǎng)蛋白與一個(gè)或多個(gè)上述片段的組合。在一具體的此類實(shí)施方式中，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白。在一更具體的實(shí)施方式中，犬TSLP蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。本發(fā)明另外提供診斷方法，這些方法應(yīng)用新的犬TSLP蛋白、該蛋白的片段、和/或犬TSLP及其片段誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供診斷犬遺傳過敏性皮炎的方法，其包括犬表皮樣品的取樣，以及在表皮樣品中檢測(cè)犬TSLP蛋白的存在。通過參考以下附圖和詳述部分，可以更好地了解本發(fā)明的上述方面和其它方面。附圖簡(jiǎn)述圖1所示為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，所分析蛋白來源于表達(dá)犬TSLP蛋白的無真核細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)。第l道蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道.'不可溶蛋白。TSLP蛋白條帶以箭頭標(biāo)示。圖2A所示為蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析，所分析蛋白來源于表達(dá)犬TSLP蛋白的無真核細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)。該蛋白與購(gòu)自Invitrogen^^司的Anti-His(CTerm)/APAb反應(yīng)。第1道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道不可溶蛋白。犬TSLP蛋白在全蛋白和不可溶蛋白中檢出(如箭頭所示).圖2B所示為蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析，所分析蛋白來源于表達(dá)犬TSLP蛋白的無真核細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)，該蛋白與人TSLP特異性的大鼠單克隆抗體反應(yīng).第l道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道不可溶蛋白。犬TSLP蛋白在全蛋白和不可溶蛋白中檢出(如箭頭所示)，圖3A所示為來源于大腸桿菌(E.coli)宿主細(xì)胞的TSLP的表達(dá)與純化，并且顯示了存在于可溶性E.coli餾分的一個(gè)61kd條帶，這表示犬TSLP與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白以及一個(gè)6組氨酸標(biāo)簽的融合。"M"表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(在圖3A-3D中相同)。第l道和第2道為包含質(zhì)粒1265-93B的E.coliB121(DE3)pLysS的可溶性餾分，分別沒有進(jìn)行和進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)。箭頭標(biāo)示了GST-TSLP-His融合蛋白條帶(在圖3A-3D中相同)。圖3B顯示GST-TSLP-His標(biāo)簽融合蛋白可用谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化。第1到3道表示谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂的不同洗脫悔分。圖3C顯示B道的融合蛋白可用鎳-次氨基三乙酸(Ni-NTA)樹脂進(jìn)一步純化。本圖所示為谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化后的GST-TSLP-His融合蛋白用Ni-NTA樹脂的再次純化。第l道為流穿液，第2道為Ni-NTA樹脂的洗脫液。圖3D所示為GST-TSLP-His融合蛋白的蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)，證實(shí)了該融合蛋白可被一種抗GST抗體(GEHealthCare公司商品編號(hào)27457701)識(shí)別。圖4所示為損傷皮膚組織的石蠟包埋塊切片的異硫氰酸熒光素(FITC)染色，樣品取自被診斷為遺傳過敏性皮炎的10197號(hào)犬。所述切片與兔抗人TSLP多克隆抗體反應(yīng)，該反應(yīng)用鏈霉親和素-FITC(異硫氰酸焚光素)顯影。熒光強(qiáng)度(照亮區(qū))顯示組織中出現(xiàn)兔抗人TSLP多克隆抗體與TSLP的結(jié)合。圖5A所示為損傷皮膚組織的石蠟包埋塊切片的免疫過氧化物酶染色，樣品取自一只被診斷為遺傳過敏性皮炎的犬，在此切片中，皮膚標(biāo)本的表皮層有一大鼠抗人TSLP單克隆抗體導(dǎo)致的彌漫染色(暗區(qū))。圖5B所示為一對(duì)照切片。該切片來源于損傷皮膚組織的石蠟包埋塊，樣品取自一只被診斷為遺傳過敏性皮炎的犬，只用磷酸緩沖液對(duì)照處理過。圖6所示為犬TSLP蛋白與大鼠抗人TSLP單克隆抗體的表位圖。需特別注意的峰來自第22-26號(hào)表位(SEQIDNOs29-33)。表位22-26還進(jìn)行了N端修飾(55號(hào)及以上各峰)，以證實(shí)結(jié)合表位不需要N端氨基酸殘基。圖7所示為犬TSLP表位25(SEQIDNO:32)與人的同源體(SEQIDNO:3)的多肽序列比較。圖8A所示為犬TSLP基因的DNA序列(SEQIDNO:1)。圖8B所示為預(yù)測(cè)的由圖8A所示DNA序列表達(dá)的TSLP多肽(SEQIDNO:2)。星號(hào)標(biāo)注了起始信號(hào)序列(氨基酸殘基1-28)的N末端，下劃線標(biāo)注的氨基酸殘基71-92(SEQIDNO:118)表示一個(gè)域，從該域中確定了表2中相互重疊的表位22-26,發(fā)明詳述遺傳過敏性皮炎("AD")是一種Th2介導(dǎo)的過敏性炎性疾病。該病在病人和病犬中顯示出很多類似的臨床特征。考慮到涉及皮膚損傷的細(xì)胞類型和細(xì)胞因子，犬AD的免疫發(fā)病機(jī)理很可能與人AD類似。TARC配體(CCL22)與Th2淋巴細(xì)胞上選擇性表達(dá)的CC趨化因子受體4(CCR4)的結(jié)合可誘導(dǎo)這些細(xì)胞向過敏性損傷選擇性遷移。已有報(bào)道TARC及其受體CCR4在犬AD皮膚損傷中上調(diào)，既然TSLP是人TARC的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，我們假設(shè)TSLP可能在犬AD損傷中存在。因此在AD病犬的損傷皮膚上測(cè)試了抗人TSLP抗體。如圖4所示，這些皮膚樣品的免疫組織化學(xué)證實(shí)了損傷中存在與抗人TSLP抗體反應(yīng)的抗原。然而，鼠和人TSLP基因的犬直向同源基因的鑒定工作特別困難，其原因如本文所公開的，在于哺乳動(dòng)物中各物種的TSLP的核酸及氨基酸序列有高度差異。用本發(fā)明的一種TSLP和/或其一種或多種抗原片段免疫家犬，可降低內(nèi)源TSLP的活性水平，并因此減輕、消除、和/或預(yù)防被免疫犬的一種或多種特應(yīng)性癥狀，例如哮喘和/或遺傳過敏性皮炎出現(xiàn)的癥狀。另外，犬TSLP蛋白可用作誘發(fā)抗犬TSLP抗體的抗原，這些抗體可用作家犬或其它哺乳動(dòng)物的研究和/或診斷試劑?；蛘?，在特定情況下，犬TSLP蛋白和/或編碼犬TSLP的核酸可上調(diào)免疫損傷犬的免疫系統(tǒng)因子，例如通過造血細(xì)胞中STAT的活化或TARC的表達(dá)。為了更全面地了解本發(fā)明，提供以下定義。為描述方便而使用的單數(shù)術(shù)語絕非有意如此限制。因此，舉例來說，提及一種組合物包含"一種多肽"，包括提及一種或多種這樣的多肽。本文中使用的術(shù)語"大概"可與術(shù)語"大約"互換使用，表示數(shù)值與所述數(shù)值相差百分之二十以內(nèi)，即一種包含"大概"50個(gè)氨基酸殘基的多肽可包含40到60個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語"結(jié)合組合物"系指與犬TSLP特異性結(jié)合的分子，例如在抗體-抗原反應(yīng)中。特異性的內(nèi)涵可大可小，例如僅限于一具體的實(shí)施方式、或限于相關(guān)的一組實(shí)施方式，例如犬TSLP和/或犬抗體。本文中使用的"犬"一詞包括所有家犬，拉丁名Orn"/"/"s/a附"/ar"或Cfl"&/fl附/〃fln's，除非另有說明。本文中使用的術(shù)語"多肽"可與術(shù)語"蛋白"和"肽"互換使用，系指包含2個(gè)或多個(gè)氨基酸由肽鍵連接而成的聚合體。本文中使用的"多肽"一詞包括一種重要的片段或部分，并包含一段延長(zhǎng)的氨基酸殘基，其包含至少約8個(gè)氨基酸，通常至少約12個(gè)氨基酸，一般至少約16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約20個(gè)氨基酸，在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少約30個(gè)氨基酸，例如35、40、45、50個(gè)等等。這種片段可在幾乎所有位置上有開始和/或結(jié)束的末端，例如開始于氨基酸殘基l、2、3等等，結(jié)束于155、154、153等等，包括所有實(shí)用的組合。多肽可任選缺少由基因或mRNA編碼的某些氨基酸殘基。舉例來說，基因或mRNA可編碼多肽N端的氨基酸殘基序列(即信號(hào)序列)，該序列被切除掉，因此不是最終蛋白的一部分。本文中如果一段氨基酸序列與另一段氨基酸序列完全相同，則這兩段氨基酸序列100%"同源"，和/或僅因下文定義的中性或保守替換而不同。因此，如果一段氨基酸序列與另一端M酸序列約80%相同，則這兩段氨基酸序列約80%"同源"，和/或僅因中性或保守替換而不同。序列中的氨基酸殘基通?？杀还δ芟嗤陌被釟埢鎿Q，導(dǎo)致保守的氨基酸替換。這種改變定義了本文中使用的術(shù)語"保守替換"。舉例來說，序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被另一個(gè)具有同樣極性、相同功能的氨基酸替換，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸的替換者可選自該氨基酸所屬種類中的其它成員。舉例來說，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這種改變不會(huì)影響聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的表觀分子量或者等電點(diǎn)。、色氨酸、和酪氨酸。中性極性的氨基酸包括甘氨酸、特別優(yōu)選的保守替換有:,如此可保留一個(gè)正電荷；谷氨酸替換天冬氨酸及相反，如此可保留一個(gè)負(fù)電荷；絲氨酸替換蘇氨酸，如此可保留一個(gè)自由羥基；以及谷氨酰胺替換天冬跣胺，如此可保留一個(gè)自由氨基。氨基酸也可分為下述類似組(l)脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸；(2)谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸；(3)組氨酸、賴氨酸、和精氨酸；(4)半胱氨酸；(5)纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸；以及(6)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，兩種高度同源的DNA序列可通過其自身同源性或其所編碼氨基酸的同源性進(jìn)行鑒定。這種序列比較可用序列數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)軟件進(jìn)行。在一具體的實(shí)施方式中，兩種高度同源的DNA序列編碼的氨基酸序列有約80%的同一性，優(yōu)選有約90。/o的同一性，更優(yōu)選有約95%的同一性。更具體地所，兩種高度同源的氛基酸序列有約80%的同一性，優(yōu)選約90V。的同一性，更優(yōu)選約95%的同一性。如本文中使用的，確定蛋白和DNA序列的同一性百分比可使用軟件鑒定，例如Accelrys公司(Burlington,Massachusetts)出售的MacVectorv9，和ClustalW算法，應(yīng)用默認(rèn)的排列參數(shù)和默認(rèn)的同一性參數(shù)。參見Thompson,等人.1994.iVc/e/cyl"Vfe及"^:4673-4680。用于Dos、Macintosh,和Unix平臺(tái)的ClustalW可從例如歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBLI)、歐洲生物信息學(xué)研究所免費(fèi)下栽。本下栽鏈接位于http:〃www.ebi.ac.uk/clustahv/。這些和其它可用的程序還可以4吏用相同的或相似的默認(rèn)參數(shù)來確定序列相似性。"多核苷酸"或"核酸分子"系指包含核苷酸的分子，其包括但不限于RNA、cDNA、基因組DNA、甚至人工DNA序列。包括任何本領(lǐng)域已知的DNA和RNA的堿基類似物的核酸分子也可包含在上述術(shù)語中。本發(fā)明提供了可與編碼本發(fā)明的TSLP蛋白的核苷酸序列雜交的核酸。當(dāng)在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下，該核酸分子的單鏈形式可與另一核酸分子退火，一核酸分子"可雜交"于另一核酸分子，例如cDNA、基因組DNA、或RNA,[參見SambrookandRussell，AfC/柳/ig,4/fl60r她rj;3/fl/id/，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborL.L(2000)j。高度嚴(yán)格的雜交條件對(duì)應(yīng)于最高的Tm，例如5(T/。甲酰胺、5X或6XSSC。雜交需要包含互補(bǔ)序列的兩種核酸，雖然依賴于雜交的嚴(yán)格性，堿基錯(cuò)配仍然可能。合適的核酸雜交嚴(yán)格性依賴于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)的程度，本領(lǐng)域熟知的變量。兩種核苷酸序列的相似度或同源性越高，包含這些序列的核酸的雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(相當(dāng)于較高的Tm)以下述順序遞減RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)度超過100個(gè)核苷酸的雜交體，已經(jīng)得到計(jì)算Tm的公式(equationsforcalculatingTmhavebeenderivedstrength)I參見SambrookandRussell,Afo/ecZa/*C7tfM,./ig，/aZwfl勿/jMa肌a/，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborL丄(2000)1。對(duì)于較短核酸即寡核苷酸的雜交，錯(cuò)配的位置更為重要，而寡核苷酸的長(zhǎng)度決定了其特異性?？呻s交的核酸的最小長(zhǎng)度優(yōu)選為至少約12個(gè)核苷酸；更優(yōu)選至少約18個(gè)核苷酸；甚至更優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約24個(gè)核苷酸；最優(yōu)選至少約36個(gè)核苷酸。在一特定的實(shí)施方式中，"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"一詞系指Tm551C，并應(yīng)用上述條件，在另一特定的實(shí)施方式中，嚴(yán)格的條件系指雜交和洗滌條件中分別為Tm65t:。DNA"編碼序列"或者某具體蛋白或多肽的"編碼序列"，系指在合適的調(diào)控因子控制下，可在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄并翻譯生成多肽的DNA序列。編碼序列的范圍由位于5，端的起始密碼子和位于3，端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于原核序列、真核mRNA的cDNA、真核(例如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、甚至合成DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3，端。"可操作的連接"系指多因子的排列，其中各組分被配置以執(zhí)行其正常功能。因此，可操作地與編碼序列連接的調(diào)控因子能夠影響編碼序列的表達(dá)。調(diào)控因子并不需要與編碼序列相連續(xù)，只要它們起指示其表達(dá)的功能。因此，舉例來說，未翻譯的已轉(zhuǎn)錄序列可以存在于啟動(dòng)子和編碼序列之間，此時(shí)啟動(dòng)子仍可被認(rèn)為與編碼序列"可操作地連接"。本文中使用的"異源核苷酸序列"系指一種核苷酸序列，其通過重組方法添加至本發(fā)明的核苷酸序列，從而形成非自然界天然形成的核酸。這種核酸可編碼融合(例如嵌合)蛋白。因此異源核苷酸序列可編碼包含調(diào)控和/或結(jié)構(gòu)特性的多肽和或/蛋白。在另一此類實(shí)施方式中，所述異源核苷酸序列可編碼蛋白或多肽，其可作為在重組核酸表達(dá)后可檢測(cè)本發(fā)明的核普酸序列編碼的蛋白或多肽的工具.在另一實(shí)施方式中，所述異源核苷酸序列可作為檢測(cè)本發(fā)明的核苷酸序列的工具。異源核苷酸序列可包含非編碼序列，其包括限制性酶切位點(diǎn)、調(diào)控位點(diǎn)、啟動(dòng)子等等。本文中使用的術(shù)語"融合蛋白"和"融合肽"可互換使用并包含下列各詞"嵌合蛋白和/或嵌合肽"、以及融合"內(nèi)含肽蛋白/肽"。融合蛋白包含本發(fā)明的一種犬TSLP蛋白的至少一部分，其通過肽鍵與另一蛋白的至少一部分連接，例如非犬TSLP蛋白的至少一部分，和/或包含犬TSLP蛋白的兩個(gè)或多個(gè)非連續(xù)部分的組合，例如表位，其在犬TSLP多肽中并不天然地處于相鄰位置(例如，一種10個(gè)氨基酸殘基的融合肽，其包含由肽鍵連接的SEQIDNO:2的氨基酸殘基71-75和101-105)在優(yōu)選的實(shí)施方式中，犬TSLP蛋白的各部分是有功能的，例如保持抗原性。融合蛋白還可包含標(biāo)記蛋白、或有助于本發(fā)明的犬TSLP蛋白的分離和/或純化的蛋白(例如FLAG標(biāo)簽，參見下述實(shí)施例)、和/或抗原性。非犬TSLP序列可以氨基端或羧基端與犬TSLP序列連接。編碼本發(fā)明的融合蛋白的重組DNA分子，舉例來說，可包含編碼非犬TSLP蛋白的至少一部分的一段序列，其插入犬TSLP編碼序列中，并可進(jìn)一步編碼特定的蛋白酶，例如凝血酶或Xa因子的酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)優(yōu)選位于或接近于犬TSLP序列和非犬TSLP序列的結(jié)合部。在一特定的實(shí)施方式中，融合蛋白在原核細(xì)胞中表達(dá)。通過使用與犬TSLP融合的蛋白和/或標(biāo)簽特異性的親和柱，這種融合蛋白可用于分離本發(fā)明的犬TSLP(參見下述實(shí)施例)。純化的犬TSLP,舉例來說，可通過使用蛋白水解酶或上述酶切位點(diǎn)從融合蛋白中釋放出來。"載體"或"復(fù)制栽體"為一種復(fù)制子，例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、或粘粒，另一DNA片段可附加或整合其中，以進(jìn)行附加片段的復(fù)制。所述術(shù)語還包括一種復(fù)制子，其包括所整合或附加的感興趣DNA片段。本發(fā)明中可使用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合的DNA片段、以及其它可幫助核酸分子整合進(jìn)宿主基因組的載體。質(zhì)粒是最普遍使用的栽體，但是所有其它具有同等功能的或本領(lǐng)域已知的栽體都適用于本發(fā)明。參見例如Pouwels等人，C7柳V^Flcto/x.4laZwr她/j她朋fl/，1985及其補(bǔ)充,Elsevier,N.Y.，以及Rodriguez等人(eds.)，F(xiàn)e"譜45"wn^MfecM/afC7簡(jiǎn)wgflwdrAe/r"ey,1988，Buttersworth，Boston,MA.j當(dāng)DNA和載體末端都包含合適的限制性酶切位點(diǎn)時(shí)，編碼新的犬TSLP蛋白的DNA可以容易地插入栽體。如果不能做到，可能需要修飾DNA和/或栽體的末端，方法為消化掉限制性內(nèi)切酶裂解產(chǎn)生的單鏈DNA突出端以產(chǎn)生鈍末端，或者用合適的DNA聚合酶填補(bǔ)單鏈末端以達(dá)到同樣的結(jié)果?；蛘?，例如通過在末端上連接核苷酸序列(連接子)來產(chǎn)生所需位點(diǎn)。這種連接子可包含特定的確定所需限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸序列。限制性酶切位點(diǎn)還可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生.參見，例如Saiki等人，5"d^ice239:487(1988)。如果需要，裂解過的栽體和DNA片段也可用同聚物加尾修飾。本發(fā)明中使用的重組表達(dá)載體一般為自我復(fù)制的DNA或RNA結(jié)構(gòu)，其包含編碼本發(fā)明的犬TSLP蛋白和/或其抗原片段的核酸，該核酸通?？刹僮鞯嘏c合適的基因調(diào)控因子連接，這些因子能在合適的宿主細(xì)胞中調(diào)控核酸的表達(dá)?；蛘{(diào)控因子可包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，一般包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、可選的控制轉(zhuǎn)錄開始的操縱子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適的核糖體結(jié)^^位點(diǎn)的序列、以及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)栽體還可包含復(fù)制起點(diǎn)，其允許栽體獨(dú)立于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。編碼新的犬TSLP蛋白的核酸表達(dá)可通過常規(guī)方法在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行。"宿主細(xì)胞"系指臨時(shí)性或永久性包含或能夠包含、并表達(dá)外源核酸分子的細(xì)胞。當(dāng)這種外源DNA已被引入細(xì)胞膜內(nèi)，則該細(xì)胞已被外源DNA"轉(zhuǎn)化"。外源DNA可整合或不整合(共價(jià)結(jié)合)入構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA。舉例來說，在原核生物和酵母中，所述外源DNA可保持在游離因子上，例如質(zhì)粒。對(duì)真核細(xì)胞來說，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是其中外源DNA整合到染色體中，因此可以通過染色體復(fù)制遺傳到子細(xì)胞中的細(xì)胞。這種穩(wěn)定性表現(xiàn)在真核細(xì)胞可以建立細(xì)胞系或克隆的能力，其包含一群含有外源DNA的子細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性和陽(yáng)性生物，例如E.coli和枯草桿菌(B.subtilis)。真核細(xì)胞包括來源于動(dòng)物細(xì)胞的已建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系，可來自非哺乳動(dòng)物如昆蟲細(xì)胞和烏類，和來自哺乳動(dòng)物如人、靈長(zhǎng)動(dòng)物、以及嚙齒動(dòng)物。原核宿主-栽體系統(tǒng)包括用于很多不同物種的多種載體。用于擴(kuò)增DNA的栽體包括pBR322及其多種衍生物，或pET42b(+)表達(dá)栽體(Novagen)。通常使用的原核表達(dá)調(diào)控序列包含啟動(dòng)子，其包括源自P-內(nèi)酰胺酶(P-lactamase)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)的啟動(dòng)子[Chang等人，Nature,198:1056(1977)1，例如pUC系列，源自色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)的啟動(dòng)子[Goeddel等人，7V"ddc/4dA及d8:4057(1980)1，例如pBR322-trp，源自lambdaPl啟動(dòng)子系統(tǒng)的啟動(dòng)子[Shimatake等人，A^re，292:128(1981)1，lambda-pP或pR啟動(dòng)子(pOTS),阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(InVitrogen),tac啟動(dòng)子[DeBoer等人，iVoc.iVfl".4carf.1/54292:128(1983)J，Ipp啟動(dòng)子(pIN系列)；或者雜交啟動(dòng)子，例如ptac(pDR540)。許多包含這種調(diào)控序列的其它表達(dá)栽體是本領(lǐng)域已知的，并有商業(yè)出售。[也參見Brosius等入,"ExpressionVectorsEmployingLambda—,trp畫，lac垂，andIpp國(guó)derivedPromoters",inRodriguezandDenhardt(eds.)Kecto/x.4SMn^yAfo/"/flrC7o//igKec似rs訓(xùn)</TTte/z*(/鄉(xiāng)，1988，Buttersworth，Boston,pp.205-236J。適用于E.coli的等效的栽體，其可用于其它原核生物，也可用來表達(dá)本發(fā)明的TSLP蛋白。酵母以及高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞也能用作重組生產(chǎn)的宿主，用來生產(chǎn)新的犬TSLP蛋白、和/或抗犬TSLP抗體、和/或這些抗體的片段。雖然可以使用任何高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系，包括昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞是優(yōu)選的。此類細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以及增殖已經(jīng)成為常規(guī)例行程序。有用的細(xì)胞系實(shí)例包括人子宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼大鼠腎(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系(例如SF9)，鳥類細(xì)胞系(例如DF-ll)、Madin誦darby牛腎(MDBK)細(xì)胞、Madin醫(yī)Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞系、非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、HEK-293細(xì)胞系以及猴(COS)細(xì)胞系。用于此類細(xì)胞系的表達(dá)栽體通常包括，舉例來說，復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、翻譯起始點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)(如果使用基因組DNA)、多腺苷酸位點(diǎn)、以及轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)。這些栽體通常還包含選擇基因或擴(kuò)增基因。合適的表達(dá)栽體可以是包含啟動(dòng)子的質(zhì)粒、病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒，其啟動(dòng)子來源于，例如腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、牛痘病毒、或巨細(xì)胞病毒。合適的表達(dá)栽體的典型實(shí)例包括pCR3.1、pCDNAl、pCD[Okayama等人，AfoiCWZ及》i5:1136(1985)j、pMClneoPoly-A[Thomas等人，CC51:503(1987)卜pUC19、pREP8、pSVSPORT及其衍生物、以及桿狀病毒載體，例如pAC373或pAC610。表達(dá)以后，新的犬TSLP可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱色譜等等(參見R.Scopes,ProteinPurification,Springer—Verlag，N.Y.(1982))。藥用中優(yōu)選的是至少約卯％到95%同質(zhì)化的幾乎完全純的組合物，最優(yōu)選的是98%到99%或更高的同質(zhì)化。純化可以是部分的，或直至所需的同質(zhì)化。如果犬TSLP用于治療，該蛋白幾乎完全不能含有內(nèi)毒素。用結(jié)合抗TSLP抗體的純化柱或結(jié)合TSLP受體的純化柱選擇性純化表達(dá)的TSLP,是獲取高純度犬TSLP蛋白的可用策略。純化的方法本領(lǐng)域熟知，舉例來說，純化核酸可用沉淀、色語、超速離心以及其它方法。純化蛋白和多肽以及肽可用多種方法，其包括但不限于，制備圓盤凝膠電泳、等電子聚焦、高效液相色譜(HPLC)、反向HPLC、剿歐過濾、離子交換與分配色鐠、沉淀與鹽析色譜、提取與反流分布。在某些方面，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)多肽，使蛋白包含有助于純化的額外序列標(biāo)簽，例如但不限于，多組氨酸序列、或特異性與抗體結(jié)合的序列，例如FLAG⑧和GST。多肽的抗體或其結(jié)合片段可用作純化試劑。溶劑和電解質(zhì)通常為用來保持生物活性的生物相容緩沖液，并通常近似于生理水溶劑。通常溶劑的pH為中性，通常在5到10之間，優(yōu)選約7.5。某些情況下，要加入一種或多種去污劑，通常是溫和的不導(dǎo)致變性的，例如CHS(膽甾醇半琥珀酸酯)或CHAPS(3-(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基卜l-丙磺酸)，或者濃度足夠低以免嚴(yán)重影響所迷蛋白的結(jié)構(gòu)或生理特性。在其它情況下，強(qiáng)烈的表面活性劑可用來進(jìn)行強(qiáng)烈變性。另一選擇是，來源于E//或其它細(xì)菌的異源功能蛋白可通過強(qiáng)變性劑增溶和隨后重新折疊的方法從包涵體中分離。本領(lǐng)域已知的變性劑包括，筒單舉例來說，尿素、硫氰酸鉀、鹽酸胍("GuHCl")、碘酸鉀、和/或捵化鈉，以及這些試劑的組合。優(yōu)選GuHCl被用作還原劑，例如濃度約6到8M，在堿性條件下，例如約pH8。或者使用另一種還原劑，二硫蘇糖醇("DTT")，可以單獨(dú)使用或與GuHCl組合使用。如果使用DTT，其濃度范圍，簡(jiǎn)單舉例來說，從約50mM到約0.5mMDTT。本領(lǐng)域已熟知，在增溶步驟中必須有還原劑來切斷或變性二疏鍵。一種典型的還原緩沖液為O.lMTris(三羥甲基氨基甲烷)pH8.0，6M胍，2mMEDTA(乙二胺四乙酸)，和0.3MDTE(二硫赤蘚醇)。通常在氧化劑存在下將變性與還原的蛋白稀釋(例如IOO倍)到重新折疊緩沖液可完成復(fù)性?？梢允褂萌魏魏线m的本領(lǐng)域已知的氧化劑，只要其允許理想產(chǎn)量的正確折疊.舉例來說，還原和氧化形式的低分子量疏醇試劑可以進(jìn)行氧化和重新折疊，如Saxena，等人，1970，5wc&挑&^v9:5015-5021中所述，該文合并到本文中作為參考，并特別如Buchner，等人(引文同上)所述。通常將變性與還原的蛋白稀釋(例如100倍)到重新折疊緩沖液可完成復(fù)性。一種典型的重新折疊緩沖液為TrisHCl100mM,pH10.0，25mMEDTA，NaC10.1M，GSSG551mg/L，0.5M精氨酸。GSSG為氧化形式的谷胱甘肽。多肽的大小和結(jié)構(gòu)通常應(yīng)處于相當(dāng)穩(wěn)定的狀態(tài)，并且通常不處于變性的狀態(tài)。多肽可與其它多肽在四級(jí)結(jié)構(gòu)中結(jié)合，例如可增加溶解度，或與脂類或去污劑結(jié)合。幾乎完全純，例如描述蛋白的上下文中，通常表示該蛋白不含其它污染的蛋白、核酸、或其它源于有機(jī)物來源的其它生物制品。純度可通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，通常依據(jù)重量，普通的至少約40%純，一般至少約50%純，經(jīng)常至少60%純，通常至少80。/。純，優(yōu)選至少90%純，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中至少95%純。通常添加栽體或賦形劑。純度可通過下列方法評(píng)估色譜、凝膠電泳、免疫測(cè)定、成分分析、生物測(cè)定、以及其它本領(lǐng)域已知的方法。從功能方面看，根據(jù)本發(fā)明的分離的犬TSLP蛋白與其它物質(zhì)充分分離，包括前體犬TSLP蛋白和/或成熟的犬TSLP蛋白，因此能夠誘發(fā)犬TSLP蛋白特異性的免疫應(yīng)答。多肽或片段的可溶性取決于環(huán)境和多肽本身。很多參數(shù)影響多肽可溶2性，包括溫度、電解質(zhì)環(huán)境、多肽大小和分子特性、以及溶劑的性質(zhì)。通常所用多肽的溫度在約4。C到約65。C之間。一般溫度高于約18°C。進(jìn)行診斷時(shí)，溫度一般為室溫或更高，但是低于方法中各成分的變性溫度。進(jìn)行治療時(shí)，溫度一般為體溫，通常約36。C到40°C(例如狗約39。C),在某些情況下溫度可能在原位或體外升高或降#。本文中使用的一種具體蛋白的"抗原片段"一詞，系指該蛋白的一種片段(包括僅比全長(zhǎng)蛋白少一個(gè)氨基酸的大片段)，其具有抗原性，即能夠特異性地與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子反應(yīng)，例如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體。舉例來說，本發(fā)明的犬TSLP的抗原片段是犬TSLP的具有抗原性的片段。只要這種片段與用于免疫的栽體分子結(jié)合后能用來產(chǎn)生TSLP蛋白的抗體，其不須具有自身免疫原性，即在沒有栽體的情況下誘發(fā)免疫應(yīng)答。在一具體的實(shí)施方式中，犬TSLP的抗原片段包含5到150個(gè)氨基酸殘基。在一具體的實(shí)施方式中，犬TSLP的抗原片段包含多于120個(gè)氨基酸殘基。在另一實(shí)施方式中，犬TSLP的抗原片段包含10到120個(gè)氨基酸殘基。在另一實(shí)施方式中，犬TSLP的抗原片段包含20到IOO個(gè)氨基酸殘基。在另一實(shí)施方式中，犬TSLP的抗原片段包含25到75個(gè)氨基酸殘基。犬TSLP的抗原片段可從重組來源、天然來源中分離的蛋白、或化學(xué)合成得到。此外，抗原片段可從下列途徑得到犬TSLP或其片段的水解消化、重組表達(dá)、或者從頭產(chǎn)生，例如通過肽合成。疫苗本發(fā)明進(jìn)一步提供了疫苗，這些疫苗包含有效量的下列各項(xiàng)本發(fā)明的TSLP蛋白、該蛋白的一種或多種抗原片段、或者上迷全長(zhǎng)蛋白與一種或多種上述片段的組合。舉例來說，犬TSLP蛋白和/或其片段，如下述表2中所列舉，可整合進(jìn)任何蛋白或肽相容的疫苗組合物。此類疫苗組合物是本領(lǐng)域熟知的，可以但并不必須包括，例如生理上適合的緩沖液和生理鹽水等等，以及藥學(xué)上可接受的佐劑，例如CARBOPOL②或Emulsigen。必要時(shí)，疫苗組合物可用來在實(shí)驗(yàn)犬體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性抗TSLP抗體，例如為了治療與實(shí)驗(yàn)犬體內(nèi)TSLP活性下調(diào)有關(guān)的疾病或病癥的臨床癥狀。另外，或與之相關(guān)的，本發(fā)明的疫苗也可用來誘發(fā)篩選和/或鑒定犬TSLP的抗血清，例如作為鑒定過量表達(dá)TSLP犬的試劑盒的成分。如下述表2中公開的TSLP肽及其變體可用作免疫原，可單獨(dú)或以多種組合使用。此類肽可通過化學(xué)或重組DNA技術(shù)任選互相連接和/或與作為載體的大蛋白連接。栽體可增強(qiáng)作為免疫應(yīng)答目標(biāo)的宿主動(dòng)物對(duì)多肽的識(shí)別，并增加TSLP多肽的免疫原性。很多栽體是本領(lǐng)域已知的，包括破傷風(fēng)類毒素或無毒的破傷風(fēng)毒素C片段、白喉類毒素、PhoP蛋白、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、p牛乳糖、源于l型牛皰療病毒(BHV-1)的gD蛋白、源于狂犬病毒的G蛋白、源于犬瘟熱病毒的F蛋白、以及合成載體，例如用已知的"通用"T細(xì)胞表位聚合而成的栽體。使用已知的算法，可用作免疫原的TSLP多肽可從下述表2中的多肽及其變體中選擇出來，這些算法評(píng)估如下特性天然TSLP蛋白的表面可達(dá)性、親水性、原子遷移率、以及抗原性。表2中多肽及其變體的表位也可基于其與下列抗體的反應(yīng)活性進(jìn)行選擇與天然TSLP蛋白反應(yīng)的抗體、特別是能夠中和TSLP生物活性的抗體。此類抗原可包括用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)從本文所公開的序列中制備的合成肽，和/或或者從重組或天然TSLP蛋白得到的片段。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的佐劑可從多種來源獲得，其包括天然來源、重組來源和/或化學(xué)合成等等。作為佐劑的化合物實(shí)例包括但不限于，鋁化合物、可代謝和不可代謝的油、嵌段共聚物、ISCOM，s(免疫刺激復(fù)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒、以及維生素B12)、和QuilA(皂苷)、弗氏完全佐劑、以CARBOPOl/商標(biāo)出售的丙烯酸與聚烯基醚或二乙烯基乙二醇交聯(lián)的聚合物(例如CARBOPOL②941)、以及在水乳膠中均勻分散的微米級(jí)油滴(例如以商標(biāo)Emulsigei^出售的)。另外一些佐劑的實(shí)施例有時(shí)候特指免疫刺激物，其包括細(xì)菌或真菌細(xì)胞壁成分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁肽、p-l，3/l，6-葡聚糖)、源于植物的多種復(fù)合糖(例如多聚糖、乙?；事毒厶?、源于動(dòng)物的多種蛋白和多肽(例如激素、細(xì)胞因子、共刺激因子)、以及源于病毒和其它來源的新核酸分子(例如雙鏈RNA、CpG)。另外，上述各項(xiàng)的各種組合可提供佐劑作用，因此可構(gòu)成本發(fā)明的佐劑。本發(fā)明的疫苗可通過以下任何途徑施用肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、口服、鼻腔給藥、以及上述方法的組合?？贵w本發(fā)明還包括與新的犬TSLP蛋白特異性結(jié)合的多克隆和單克隆(mAb)抗體。如本文中使用的，"抗體"一詞系指免疫球蛋白和/或其片段。天然存在的免疫球蛋白包含實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因編碼的一個(gè)或多個(gè)多肽。已知的免疫球蛋白基因包括A:op/fl、/dm6甴、a(pAa、ga附wa、</g/&、印w7o"和附w恒定區(qū)基因，以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。根據(jù)本發(fā)明的抗體也包含抗體片段，即抗原結(jié)合片段，例如Fv、Fa、和F(ab')2,改造的單鏈結(jié)合蛋白，參考Huston等人，7VW/.^Cflrf.f/.51./1.，85，5879-5883(1988)和Bird等人，5We""，242，423-426(1988)(合并到本文中作為參考)，以及雙功能雜交抗體(參考Lanzavecchia等人，/./w/m/wo/.17，105(1987)),參見Hood等人，Immunology,Benjamin,N.Y.，2nded.(1984),HarlowandLane,Antibodies*ALaboratoryManiml,ColdSpringHarborLaboratory(1988)和HunkapillerandHood,iVa似re，323，15-16(1986)，全部合并到本文中作為參考。舉例來說，以標(biāo)準(zhǔn)方法用新的犬TSLP蛋白免疫的動(dòng)物中產(chǎn)生的血清可直接使用，也可用標(biāo)準(zhǔn)方法從血清中分離出IgG組分，例如用血漿去除術(shù)或采用IgG特異性吸附劑的吸附色譜，例如固定化蛋白A或蛋白G.或者，可制備單克隆抗體，和任選源于此類單抗的抗原結(jié)合片段或重組結(jié)合蛋白。此類單抗或其片段可用本領(lǐng)域已知的方法或者直接修飾來分別進(jìn)行人源化或犬源化。如本文中使用的，一種"表位特異性的"犬TSLP抗體是一種抗犬TSLP的一種片段的抗體，該抗體包含一種表位，其包含一個(gè)或多個(gè)下列列:SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33和SEQIDNO:34;該抗體進(jìn)一步結(jié)合一種蛋白，其包含SEQIDNO:2的M^列，和/或一種蛋白，其包含SEQIDNO:2的^J^酸序列，但不包括28個(gè)氛基酸殘基的信號(hào)序列。在一具體的實(shí)施方式中，表位特異性的犬TSLP抗體是一種單克隆抗體。選擇性結(jié)合本發(fā)明的犬TSLP蛋白的產(chǎn)自雜交瘤的單抗是用熟知的技術(shù)生產(chǎn)的。通常所述過程涉及永久細(xì)胞系與生產(chǎn)所需抗體的B淋巴細(xì)胞的融合。或者，也可^f吏用產(chǎn)生永久抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的非融合技術(shù)，例如病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化[Casali等，5Wewce234:476(1986)卜永久細(xì)胞系通常轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒類、牛、和人源的骨髓瘤細(xì)胞。出于方便和可用性考慮，最經(jīng)常使用的是大鼠和小如果使用人源細(xì)胞通常使用外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)，或者使用非人哺乳動(dòng)物來源的脾或淋巴結(jié)細(xì)胞。宿主動(dòng)物被注射多劑量的純化的抗原(人細(xì)胞在體外致敏)，則該動(dòng)物可產(chǎn)生所需的生產(chǎn)抗體細(xì)胞，以供收獲用于與永久細(xì)胞系的融合。融合技術(shù)也是在本領(lǐng)域熟知的，通常涉及將細(xì)胞與融合劑混合，例如聚乙二醇。雜交瘤用標(biāo)準(zhǔn)程序選擇，例如HAT(次黃嘌呤-氨喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷)選擇。分泌所需抗體的雜交瘤用標(biāo)準(zhǔn)免疫分析選擇，例如蛋白印跡法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)、RIA(放射性免疫分析)等等?？贵w用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)從培養(yǎng)基中回收[Tijssen，iV""/ce7%"/^￡>1矽附《J附柳""。flMfl"(Elsevier,Amsterdam,1985)。很多參考文獻(xiàn)可對(duì)應(yīng)用上述技術(shù)提供指導(dǎo)[Kohler等人，好3^^o/wa7M附々固(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork^1980);Tijssen，/VflcftceawrfT/^oo;(7/五wz^ffie/附附w/wflMflj^(Elsevier,Amsterdam,1985);Ca柳/^e",/1/iri6ofl[vTecA/io/ogv(Elsevier,Amsterdam,1984);Hurrell，Mio朋do/ia/掛6/7Vfo鵬T^cA附.gn^sfl/i"/7WaiftVms(CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)L，1982)。單克隆抗體還可用熟知的噬菌體文庫(kù)系統(tǒng)生產(chǎn)。參見Huse，等人,^d朋ce246:1275(1989);Ward，等人,A^似re,341:544如此生產(chǎn)的抗體，無論多克隆還是單克隆，可被用于，例如用熟知的方法以固定形式結(jié)合于固體載體，通過免疫親和色譜純化犬TSLP蛋白。未標(biāo)記的或用標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記的抗犬TSLP蛋白的抗體也可用作定性或定量檢測(cè)犬TSLP蛋白的免疫分析的基礎(chǔ)。具體使用的標(biāo)記物取決于免疫分析的類型?？墒褂脴?biāo)記物的實(shí)例包括但不限于，放射性同位素標(biāo)記，例如"P、125I、3H、和"C;熒光標(biāo)記，例如熒光素以及衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰和傘形酮；化學(xué)發(fā)光劑，例如蟲熒光素和鄰苯二甲酰肼；以及酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、和6-磷酸葡萄糖脫氫酶。抗體可用上述標(biāo)記物通過已知方法標(biāo)記。舉例來說，用熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、或酶標(biāo)記抗體時(shí)可使用偶聯(lián)劑，例如乙醛、碳二亞胺、雙馬來酰亞胺、亞氨酸酯、琥珀酰亞胺、雙重氮化聯(lián)苯胺等等。涉及的常規(guī)方法本領(lǐng)域熟知，如下所述，考例如/附鵬/1卿卿.'4細(xì)cto/G"她，1987，Chan(Ed.)，AcademicPress,Inc.,Orlando,FL.。此類免疫分析可在，例如，受體純化所得餾分中應(yīng)用。本發(fā)明的抗體還可用于鑒定在表達(dá)克隆系統(tǒng)中表達(dá)犬TSLP蛋白的特定cDNA克隆。受體S&基結(jié)合位點(diǎn)特異性的中和抗體還可用作阻斷或下調(diào)犬TSLP蛋白功能的拮抗劑(抑制劑)。此類中和抗體可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地鑒定。犬TSLP蛋白活性的拮抗可用完整的抗體分子、或熟知的抗原結(jié)合片段如Fab、Fc、F(ab)2、和Fv片段完成。此類片段的定義如上文所述，或參考例如KIein，/附附m朋/柳(JohnWiley,NewYork^1982);Parham，Chapter14，inWeir,ed./附附u朋c/^附加o;，第4亂(BlackwellScientificPublishers,Oxford,1986)?？贵w片段的使用和生產(chǎn)在下列文獻(xiàn)描述例如Fab片段Tijssen，/Vfl"/"fl"rfrAeorj;E"wzj附e7m挑MW0flS5"fl^s(Elsevier,Amsterdam,1985)，F(xiàn)v片段[Hochman等人，Biochemistry12:1130(1973);Sharon等人，Biochemistry15:1591(1976);Ehrlich等人美國(guó)專利第4，355，023號(hào)j,以及抗體半分子(Auditore-Hargreaves，美國(guó)專利笫4,470,925號(hào))。進(jìn)一步描述基于已知的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列制備重組Fv片段的方法，例如Moore等人(U.S.PatentNo.4,642，334)和P旭cktlmn[所ft/r"A朋/ogv9:545(1991)。或者，也可用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成。本發(fā)明還包含多克隆和單克隆抗獨(dú)特型抗體，其用上述抗體作為抗原來生產(chǎn)。這些抗體的作用在于其可以模擬配基的結(jié)構(gòu)。產(chǎn)自非犬哺乳動(dòng)物或非犬雜交瘤系統(tǒng)的抗體可任選進(jìn)行改造，以使其在注射給犬時(shí)幾乎無抗原性，即其可犬源化。改造產(chǎn)自動(dòng)物的單克隆抗體以使其在治療施用給人時(shí)降低免疫原性(人源化)的方法已被積極探索，并在很多文獻(xiàn)中描述例如AntibodyEngineering:ApracticalGuide.CarlA.K.Borrebaecked.W.H.FreemanandCompany,1992;Reichman,L.等人，"Reshapinghumanantibodiesfortherapy",7Vfl,M"巡323-327(1988)卜或者，產(chǎn)自非犬哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，例如小鼠單克隆抗體，可與犬抗體或其序列產(chǎn)生嵌合抗體，其對(duì)受體宿主來說，比標(biāo)準(zhǔn)鼠單克隆抗體的免疫原性降低。參見例如，美國(guó)專利笫5,593,861號(hào)，"犬-小鼠異源雜交瘤和編碼犬免疫球蛋白恒定區(qū)的基因片段"，合并到本文中作為參考。另外，Wasserman和Capra[說》c/^附.3160(1977)確定了犬IgM和犬IgA重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。他們進(jìn)一步確定了犬IgAkappa輕鏈的氨基酸序列[WassermanandCapra，/附/ww/ioc/r柳.303(1978)1。McCumber和Capra[Mo/,/附挑w朋/.]i:565(1979)1公開了犬mu鏈的氨基酸全序列。Tang等人FdJ附附MW(ZogyJ附/mi/i(pfl狄Cogy迎259(2001)公開了一種犬IgG-Agamma鏈cDNA和4種犬IgG-Agamma鏈蛋白序列。Tang等人(引文同上)進(jìn)一步描述了犬脾cDNA文庫(kù)的PCR擴(kuò)增，其使用了根據(jù)人、小鼠、豬、和牛IgG保守區(qū)設(shè)計(jì)的變性寡核苷酸引物。此外，Krah等人(美國(guó)專利z^開號(hào)20040181039，7>開于2004年9月16日，合并到本文中作為參考)詳細(xì)描述了非犬抗體犬源化的一種過程。犬TSLP基因的分離A.初步嘗試鑒定犬TSLP的初步嘗試基于克隆的人和小鼠cDNA序列與大鼠、黑猩猩、和恒河猴cDNA序列的序列比較，這些序列從BLAT(公共基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，加利福尼亞大學(xué)圣克魯茲分校)收集。黑猩猩TSLP與人TSLP在氨基酸水平上100°/。相同，而恒河猴TSLP在成熟蛋白上與人TSLP超過90。/o同源性(12/151氨基酸殘基差異)。然而，人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物TSLP蛋白和cDNA序列與鼠TSLP序列有很大差異。人和小鼠TSLPcDNA序列只有43%同源性，不能通過這些物種之間的低嚴(yán)格性跨種雜交進(jìn)行克隆。此外，與小鼠TSLP比較，大鼠TSLP序列在成熟蛋白的氨基酸序列中有39/121差異，提示甚至在近緣的鼠類物種之間，TSLP序列也有顯著差異。遺憾的是，如本文所公開的，犬TSLP序列也與所有這些不同的鼠類和相似的靈長(zhǎng)類序列有差異。因此，通過低嚴(yán)格性跨種雜交獲得犬TSLP是不成功的。實(shí)際上，根據(jù)人、小鼠、大鼠、和猴序列信息設(shè)計(jì)的嘗試用巢式PCR策略克隆犬TSLP直向同源基因的引物沒能確定甚至一條與犬TSLP對(duì)應(yīng)的條帶。B.成功分離犬TSLP基因用人TSLP序列搜索可供收集的犬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(源于全基因組鳥槍測(cè)序；由加利福尼亞大學(xué)圣克魯茲分校提供給公眾)部分確定了犬TSLP外顯子1和4。簡(jiǎn)單地說，在此初步搜索中確定了多個(gè)顯著序列同源性的搜索結(jié)果(參加下述"搜索結(jié)果"1-6)。其序列被集中并用作查詢條件來延伸和組裝犬TSLP基因的部分電子序列，搜索結(jié)果1評(píng)分-60.8字節(jié)(146)，期望值=le-08同一性=33/58(56%),陽(yáng)性=39/58(67%),缺口-1/58(1%)Query:7LYVLSVS—FRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEF63L+SVSFRKIF+LQLVGLVLTY+E"+CDFEKI+YI+LYMGFSbjct:26:LIICSVSVFRKIFVLQLVGLVI/rYNFIDCDFEKIRWKYQEVIYQALEKYMDGVSE"F199SEQIDNO:102:人TSLPSEQIDNO:103>gi|36323560|gb|AACN010632090.1|家犬ctgl9866851299046，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度-1007搜索結(jié)果2評(píng)分-59.7字節(jié)(143)，期望值=3e-08同一性=30/42(71%),陽(yáng)性=33/42(78%)框=-1Query:117QINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSOLQGLWRRFNRPKLKQ158(SEQIDNO*.104)QINTQAKKR+KRVTTNKCEQVGLWRRF+RKQSbjct:588QINNTQAKKKRKKRGVTTNKCREQVAHLIGLWRRFSRIS*KQ463(SEQIDNO:105)SEQIDNO:104:人TSLPSEQIDNO:105>gi|36314527|gb|AACN010674832.1家犬ctg19866851282529，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度-963搜索結(jié)果3評(píng)分=42.0字節(jié)(97),期望值=0.006同一性=21/44(47%),陽(yáng)性=27/44(61%)框--2Query:76LTEIQSI/rraPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQIN119(SEQIDNO:106)L工+LT+GCASA+EFATAALACPGY+++Sbjct:369LARIERLTLHRIRGCASGAREAFAEGTVAALAAECPGYAAAFVS238(SEQIDNO:107)SE(IDNO:106:人TSLPSEQIDNO:107>gi|36442813|gb|AACN011084208.1|家犬ctgl9866851499233，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度=370搜索結(jié)果4評(píng)分=38.9字節(jié)(89)，期望值=0.047同一性=15/32(46%),陽(yáng)性=22/32(68%)閱讀框=+1Query:87TAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQI118(SEQIDNO:108)TGCAKEA+AL++WCPG+++TQ+Sbjct:178TPGCGICAKEAAALGWFCALSVWCPGWAQTQV273(SEQIDNO:109)SEQIDNO:108:人TSLPSEQIDNO:109>gi|36211043|gb|AACN010354273.1|家犬ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度=1369搜索結(jié)果5評(píng)分=42.0字節(jié)(97)，期望值=0.006同一性=21/44(47%)，陽(yáng)性=27/44(61%)閱讀框=-2Query:76LTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQIN119(SEQIDNO:110)Ii1++GCASA+EFATAALACPGY+++Sbjct:369LARIERLTLHRIRGCASGAREAFAEGTVAALAAECPGYAAAPVS238(SEQIDNO:111)SEQIDNO:110:人TSLPSEQIDNO:111>gi|36211043|gb|AACN010354273.1|家犬ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度=1369搜索結(jié)果6評(píng)分=38.9字節(jié)(89)，期望值=0.047同一性=15/32(46%),陽(yáng)性=22/32(68%)框=+1Query:87TAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQI118(SEQIDNO:112)TGCAKEA+AL++WCPG+++TQ+Sbjct:178TPGCGICAKEAAALGWFCALSVWCPGWAQTQV273(SEQIDNO:113)SEQIDNO:112:人TSLPSEQIDNO:113>gi|36211043|gb|AACN010354273.1|家犬ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長(zhǎng)度-1369這個(gè)電子構(gòu)建的序列與人、猴、大鼠、和小鼠TSLP的比較顯示保守的內(nèi)含子/夕卜顯子邊界和基本的序列同一性，確定此序列為犬TSLP直向同源基因的一部分?；诖税l(fā)現(xiàn)隨后設(shè)計(jì)PCR引物并用于擴(kuò)增該基因的缺失部分。通過雙重巢式PCR從犬活化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)cDNA文庫(kù)中獲得2個(gè)部分重疊的克隆。通過巢式PCR獲得完整犬TSLPcDNA的進(jìn)一步嘗試或向5，或3，端延伸序列的嘗試都沒有成功。然而，用這些克隆中的延伸序列信息在犬全基因組鳥槍序列數(shù)據(jù)(加利福尼亞大學(xué)圣克魯茲分校)中進(jìn)行反復(fù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，結(jié)合從此數(shù)據(jù)庫(kù)中人工組裝原始DNA序列，得到電子組裝的全長(zhǎng)犬TSLPcDNA。在體外用DNA合成儀合成此cDNA序列的實(shí)際克隆。綜上所述，用現(xiàn)有的和最新的分子克隆技術(shù)不可能直接從人、小鼠、大鼠、或猴序列中得到犬TSLP序列。只有用收集的人、小鼠、大鼠、和非人靈長(zhǎng)類(NHP)TSLP基因進(jìn)行復(fù)雜的反復(fù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，利用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的內(nèi)含子/外顯子邊界分配和序列同一性，結(jié)合分子PCR克隆技術(shù)，才能確定編碼犬TSLP的基因。一旦得到，所述犬TSLP與成熟的人TSLP蛋白的氨基酸序列相比較有58/132的差異(61%同一性)，與成熟的小鼠TSLP蛋白的氨基酸序列相比較有83/129的差異(33%同一性)(參見下迷)。家犬與人TSLP成熟蛋白序列比較TSLPCF(家犬)長(zhǎng)度141141)TSLPH(人)長(zhǎng)度145(1..145)評(píng)分=167字節(jié)(423)，期望值-le-40同一性-85/139(61%),陽(yáng)性=101/139(72%)Query:1RKIFVLQLVGLVI/TYNFIDCDFEKIRWKYQEVIYQALEKYMDGTRSTEFSHPVYCANPPD60RKIF+MLVGLVI/rY+F+CDFEKI+YI+I<YMGT+STEF++VC+NPSbjct:1RKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAATLSTISKDIilTYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPH60Query:61C1ARIERLTLHRIRGCASGAREAFAEGTVAAIAAECPGYAAAPINNTQAKKKRKKRGVTT120CL1+LT+GCASA+EFATAALACPGY+INTQAKKR+KRVTTSbjct:61CliTEIQSI/TFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTT120Query:121NKCREQVAKLIGLWRRFSR139NKCEQV+LGLWRRF+RSbjct:121NKCLEQVSQLQGLWRRFNR139(SEQIDNO:114)(SEQIDNO:115)SEQIDNO:114:家犬TSLPSEQIDNO:115:人TSLP家犬與鼠TSLP成熟蛋白序列比較TSLPCF(家犬)長(zhǎng)度141(1..141)TSLPM(鼠)長(zhǎng)度136(1..136)評(píng)分=72.0字節(jié)(175)，期望值=7e-12同一性=46/138(33%),陽(yáng)性=67/138(48%),缺口=8/138(5%)Query:1RK工FVLQ-LVGLVLTYNF工DCDFEK工RWKYQEVIYQALEKYMDGTRSTEFSHPVYCANPP59R十F+IjQLV+LTYNF+C+F工Y+工+LC+PSbjCt:1RS!LFI:LQVLVPMGLTYNFSNCNFTS工TK工YCN工工FHDIjTGDLKG7VKFEQIED——CESKP57Query..60DCLARIERIXLHRIRGCASGAREAFAEGTVAALAAECPGYAAAPINNTQAKKKRKKRGVT119CL+ieTL+IGCS+FATALCPGYN++++sbjct:58ac:l:lkieyytijjpipgcps:lpdktfarrtrealndhcpgypeterndgtqemaqe----V113Query-120TNKCREQVAHLIGLWRRF137(SEQIDNO-116)NCQ+++LWFsbjct:1"qnic:l曙sqi:lrlwysf131(SEQIDNO:117)SEQIDNO:116:家犬TSLPSEQIDNO:117:鼠TSLP因此，通過克服前迷困難，本發(fā)明現(xiàn)在提供編碼犬TSLP的DNA序列及其編碼的犬TSLP蛋白。犬TSLP蛋白及其某些片段可作為有用的抗原，例如免疫原，用于產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的多種表位的抗體，包括直鏈的和構(gòu)象的表位。編碼犬TSLP的DNA有助于提供栽體和宿主細(xì)胞，其生產(chǎn)用于免疫和/或用作研究試劑的TSLP蛋白，還有助于提供用于產(chǎn)生抗TSLP抗體的基于DNA的疫苗，可以是適于在^L免疫動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)TSLP的"棵"DNA或質(zhì)粒形式或動(dòng)物病毒栽體。如此得到的犬TSLP基因序列如圖8A(SEQIDNO:1)所示，預(yù)測(cè)的表達(dá)的TSLP蛋白如圖8B(SEQIDNO:2)所示。氨基酸殘基1-28表示信號(hào)序列，氨基酸殘基29-155表示成熟蛋白。鑒定同源TSLP蛋白的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了TSLP蛋白，其包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有80%或更高的同一性，不包括其28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列，而當(dāng)該蛋白作為疫苗施用于犬時(shí)，可產(chǎn)生與犬TSLP蛋白結(jié)合的抗體，其中犬TSLP蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了此類TSLP蛋白的抗原片段。實(shí)際上，證明假定的TSLP蛋白是本發(fā)明的TSLP的一種方法是測(cè)試該假定蛋白能否產(chǎn)生與犬TSLP結(jié)合的抗體，其中犬TSLP包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，一種此類方法是用不同劑量(5-500pg)的假定TSLP-GST抗原接種(例如注射)犬.此類抗原可在基于氬氧化鋁的佐劑中配制，例如吸附凝膠。然后對(duì)所述犬肌肉注射3次第0天、第21天、和第42天。在第0、21、42、和63天采集接種犬和對(duì)照(未免疫)犬的血清樣品?？乖臃N過的犬體內(nèi)的抗體誘導(dǎo)可通過下述ELISA測(cè)定方法評(píng)估將包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的犬TSLP蛋白在包被緩沖液(碳酸氫鈉pH9.0)中稀釋到5jig/ml,在96孔板(Pierce)中每孔加入100fil。4。C觶育過夜。然后用含有0.05。/。吐溫-20(Tween-20)的磷酸緩沖液(PBST)洗板3次。每孔加入200pl封閉液(PBST中2%脫脂牛奶)，室溫孵育60分鐘。用PBST洗板3次。然后，在最上排合適的孔中每孔加入100jil1:100稀釋的測(cè)試犬抗血清。血清樣品稀釋10倍加入板上合適的位置。室溫孵育60分鐘后，用PBST洗板3次。然后，每孔加入100fil1:20，000稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗犬IgG(BethylLaboratories)。室溫孵育60分鐘。然后用PBST洗板3次，每孔加入100jUTMB底物(3，3，，5，5，四甲基苯胺，SigmaChemical公司，St.Louis,MO)。用10-20分鐘在室溫下進(jìn)行顏色反應(yīng)，其后每孔加入50jil0.18M硫酸終止。用ELISA酶標(biāo)儀(ThermoMax;MolecularDevices,Sunnyvale,CA)在450nm波長(zhǎng)測(cè)定了所有孔的光密度(O.D.)。取自注射了假定TSLP抗原的犬的血清樣品被認(rèn)為是可檢測(cè)的，因此，如果其產(chǎn)生的O.D.值等于或大于取自免疫之前的犬血清樣品產(chǎn)生的本底值的3倍，該抗原可鑒定為本發(fā)明的TSLP蛋白。類似地，相關(guān)抗體對(duì)TSLP抗原的效價(jià)可基于最高血清稀釋倍數(shù)來確定，在此稀釋倍數(shù)下，其產(chǎn)生的O.D.值等于或大于取自免疫之前的犬血清樣品產(chǎn)生的本底值的3倍》犬TSLP蛋白特異性表位的抗體抗體可針對(duì)天然形式和重組形式的犬TSLP蛋白及其片段的多種表位產(chǎn)生，包括物種、多態(tài)性、或等位基因變異。另外，抗體可針對(duì)犬TSLP的活化形式或非活化形式，包括天然或變性形式產(chǎn)生。抗獨(dú)特型抗體也在預(yù)期之中?？乖A(yù)定片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式，可通過用犬TSLP和/或其片段，和本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的佐劑，和/或與免疫原性蛋白結(jié)合免疫動(dòng)物產(chǎn)生。如此免疫的動(dòng)物可以是為下調(diào)犬TSLP活性而免疫的犬。合適的宿主，例如純系小鼠如Balb/c,可用所選蛋白免疫，通常使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑和標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫程序(參見HarlowandLane，引文同上)。對(duì)目標(biāo)動(dòng)物施用佐劑可在施用疫苗之前、同時(shí)、或之后.或者，源于本文公開的序列的合成肽，并與栽體蛋白結(jié)合也可用作免疫原。采集多克隆血清并通過免疫分析測(cè)定其對(duì)免疫原蛋白的效價(jià)，例如利用固定于固體栽體的免疫原的固相免疫分析。選擇效價(jià)為1^104或更高的多克隆抗血清并測(cè)試其與其它IL-7家族成員例如嚙齒類IL-7的交叉反應(yīng)活性，測(cè)試方法為竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫分析，例如HarlowandLane，引文同上，第570-573頁(yè)中所述的方法。優(yōu)選至少一種其它IL-7家族成員與例如靈長(zhǎng)類IL-7在此測(cè)定中共同使用。使用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和蛋白化學(xué)技術(shù)，所述IL-7家族成員可生產(chǎn)為重組蛋白并分離。竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫分析可用于交叉反應(yīng)活性測(cè)定。舉例來說，SEQIDNO:2的蛋白可固定于固體載體。分析中加入的蛋白與抗血清-固定抗原結(jié)合相竟?fàn)?。上述蛋白與抗血清-固定蛋白結(jié)合的竟?fàn)幠芰εc包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白相比較。上迷蛋白的交叉反應(yīng)活性百分比可用標(biāo)準(zhǔn)算法計(jì)算。選擇并匯集與上列各蛋白的交叉反應(yīng)活性均小于10%的抗血清。交叉反應(yīng)抗體通過與上列蛋白的免疫吸附從匯集的抗血清中分離出來。免疫吸附的且匯集的抗血清可用于上迷的竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫分析中，進(jìn)行另一蛋白與免疫原蛋白的比較(例如類似IL-7的SEQIDNO:2蛋白)。為進(jìn)行此比較，兩種蛋白用寬范圍濃度進(jìn)行分析，測(cè)定了各蛋白抑制50%抗血清-固定蛋白結(jié)合所需的量.如果另一蛋白所需的量少于所選蛋白所需的量的2倍，另一蛋白可認(rèn)為與免疫原生成的抗體特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體也可用于診斷應(yīng)用，作為捕獲或非中和抗體，可篩選其在不抑制與受體結(jié)合的情況下與抗原結(jié)合的能力。作為中和抗體，其可用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析。其還可用于定性或定量檢測(cè)犬TSLP蛋白或其受體。參見例如Chan(ed.1987)Immunology:APracticalGuide,AcademicPress,Orlando,Fla.;PriceandNewman(eds.1991)PrinciplesandPracticeofImmunofissav,StocktonPress,N.Y.;和Ngo(ed.1988)NonisotopicImmunoassay,PlenumPress.N.Y丄交叉吸附、去除、或其它方法可提供確定選擇性的制劑，例如獨(dú)有的或共有的物種特異性。這可作為鑒定多組抗原的測(cè)試的基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明的抗體，包括抗原結(jié)合片段，可作為強(qiáng)力拮抗劑，其與抗原結(jié)合并抑制可能誘發(fā)生物應(yīng)答的功能性結(jié)合，例如與受體的結(jié)合。另外，上述抗體可直接或通過連接劑間接與藥物或其它治療劑結(jié)合，并可能影響藥物把向。源于本文公開的序列的合成肽與栽體蛋白結(jié)合可用作免疫原。在任何情況下，抗原片段可與其它物質(zhì)結(jié)合，特別是多肽，成為融合的或共價(jià)結(jié)合的多肽可用作免疫原?？乖捌淦慰扇诤匣蚺c多種免疫原共價(jià)結(jié)合，例如鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等等。制備多克隆抗血清的方法參見Microbiology,HoeberMedicalDivision,HarperandRow,1969;Landsteiner(1962)SpecificityofSerologicalReactions,DoverPublications,NewYork;Williams,等人(1967)MethodsinImimmologyandImmunochemistrv,第1巻,AcademicPress,NewYork;和HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,CSHPress,NY。在某些情況下，需要從多種哺乳動(dòng)物宿主，例如小鼠、嚙齒類、靈長(zhǎng)類、人等，制備單克隆抗體，制備此類單克隆抗體的技術(shù)描述可在下列文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，例如Stites，等人(編輯)BasicandClinicalImm咖logv(第4版)，LangeMedicalPublications,LosAltos，Calif.及其所引用的文獻(xiàn)；HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,CSHPress;Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(第2版)，AcademicPress,NewYork;特別是KohlerandMilstein(1975)，A^wre1^:495-497,其討論了一種生產(chǎn)單克隆抗體的方法。其它適合的技術(shù)涉及淋巴細(xì)胞在體外接觸抗原性多肽或者噬菌體或其它類似栽體中抗體文庫(kù)的一部分。參見Huse，等人(1989)"GenerationofaLargeCombinatorialLibraryoftheImmunoglobulinRepertoireinPhageLambda,，，5We"ce^:1275-1281;和Ward,等人(1989)7Vfl似re341:544-546.1。本發(fā)明的多肽和抗體可直接使用或修飾后使用，包括嵌合、犬源化、和/或人源化抗體。.曰/記?？赏ㄟ^共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合完成這種連接。大量標(biāo)記物和結(jié)合技術(shù)已經(jīng)熟知并在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中被廣泛報(bào)道。合適的標(biāo)記物包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光基、化學(xué)發(fā)光基、磁性粒子等等。指導(dǎo)使用此類標(biāo)記物的專利包括美國(guó)專利笫3,817,837、3，850，752、3,939,350、3，996，345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241號(hào)。還有，重組或嵌合免疫球蛋白可以生產(chǎn)，參見Cabilly，美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Moore,等人，美國(guó)專利第4，642，334號(hào)；和Queen，等人(1989)7Vfl《7/lcfl"USA^:10029-10033;或在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，參見Mendez，等人(1997)iVfl,"reG^"W^lf:146-156。上述文獻(xiàn)合并到本文中作為參考.本發(fā)明的抗體也可用于分離蛋白的親和色譜。將抗體連接到固體栽體上以制備色譜柱(參見例如Wilchek等人(1984)Mg仇igwzv附"104:3-55)?；蛘?，與固體栽體結(jié)合的抗原可用于純化相應(yīng)的抗體。各種犬TSLP的抗體也可用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這將有助于檢測(cè)或診斷與各個(gè)抗原表達(dá)有關(guān)的多種免疫疾病。RNA抑制在生產(chǎn)犬TSLP的細(xì)胞中干擾編碼犬TSLP的RNA是另一種抑制TSLP生物活性的方法，可治療很多與TSLP相關(guān)的疾病，例如遺傳過敏性皮炎。為此目的，化學(xué)合成的或在合適的運(yùn)輸栽體，例如質(zhì)粒或病毒載體中克隆的雙鏈RNA分子可被引入活躍生產(chǎn)TSLPmRNA的細(xì)胞，其目的是降低編碼TSLP的內(nèi)源mRNA水平。上述RNA分子進(jìn)入之后(在外源進(jìn)入的分子或者質(zhì)?；虿《据d體進(jìn)入細(xì)胞之后的RNA轉(zhuǎn)錄的情況下)，被3型核糖核酸酶蛋白的裂解活性處理成短核苷酸片段，稱為小分子干擾核糖核酸(siRNA)。上述siRNA片段被整合進(jìn)包含核酸酶的多蛋白復(fù)合物，稱為RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)，其活化是由于siRNA雙螺旋被RNA螺旋酶的活性解旋。此時(shí)單鏈的siRNA引導(dǎo)RISC復(fù)合物到其靶mRNA，然后該mRNA被裂解并隨后被RISC的核酸內(nèi)切活性降解。更具體地，包含TSLP基因或其片段的質(zhì)粒被克隆進(jìn)任何一種商業(yè)出售的真核質(zhì)粒，其中TSLP基因或其片段的轉(zhuǎn)錄由合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，例如CMV或SV40啟動(dòng)子。純化的質(zhì)粒DNA(1-100ug);故注射到皮膚損傷處或遺傳過敏性皮炎特有的環(huán)繞皮膚損傷的區(qū)域。質(zhì)粒DNA的注射可重復(fù)多次，其頻率應(yīng)足以引起TSLPmRNA顯著減少。這種減少可通過以下途徑評(píng)估注射區(qū)域的皮膚活體組織檢查、和測(cè)定TSLPmRNA水平，例如定量PCR方法。下列本發(fā)明的實(shí)施例提供了本發(fā)明的進(jìn)一步了解，絕非意圖限制本發(fā)明的有效范圍。實(shí)施例實(shí)施例1犬TSLPDNA和蛋白序列40通過在電子數(shù)據(jù)庫(kù)中反復(fù)的數(shù)據(jù)挖掘和分子生物學(xué)方法鑒定了一種表達(dá)犬TSLP的犬基因，如上詳述。結(jié)果犬TSLP基因序列如圖8A(SEQIDNO:1)所示，表達(dá)TSLP蛋白的預(yù)測(cè)蛋白如圖8B(SEQIDNO:2)所示。圖8B(SEQIDNO:2)中標(biāo)注星號(hào)的氨基酸瓶基l-28表示信號(hào)序列，氨基酸戎基29-155表示成熟蛋白。實(shí)施例2犬TSLP的克隆與表達(dá)編碼犬TSLP的DNA如本文所述鑒定，并用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法克隆進(jìn)一種供體載體pDONR221(InvitrogenGatewaySystem)。在合作研究機(jī)構(gòu)DNA2.0中進(jìn)行基因組裝并克隆進(jìn)供體栽體，從而構(gòu)建一種質(zhì)粒，稱為pDONR221.G03276，其包含已鑒定的基因組犬TSLP基因。使用2種引物從pDONR221.G03276中PCR擴(kuò)增編碼成熟(即不含信號(hào)序列)犬TSLP蛋白的DNA,其中引物分別含有NcoI和EcoRV位點(diǎn)引物#1:5,AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3，(SEQIDNO:4);和#2:5，-AAAATAGATATCTGAAATGCGACTGAAACGACG-3，(SEQIDNO:5).NcoI和EcoRV消化后，PCR產(chǎn)物插入到載體pIVEX1.3WG(RocheAppliedSciences,商品編號(hào)3728803)的NcoI和SmaI位點(diǎn)。由此產(chǎn)生了一種質(zhì)粒，其包含編碼C端融合6個(gè)組氨酸殘基(6組氨酸標(biāo)簽)的成熟犬TSLP的基因。包含正確插入序列的質(zhì)粒命名為1265-93.D質(zhì)粒。1265-93.D質(zhì)粒用于表達(dá)TSLP,4吏用的設(shè)備為RTSProteomasterInstrument(RocheAppliedSciences,商品編號(hào)3064859)，根據(jù)制造商的建i義操作。如圖1所示，在第2道和第4道有明顯的16kDa條帶(箭頭所示)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(圖2A和圖隆抗體(圖2B)特異性反應(yīng)。實(shí)施例3從宿主細(xì)胞中生產(chǎn)犬TSLP為在E.coli中表達(dá)重組TSLP蛋白，PCR擴(kuò)增了編碼cTSLP的核苷^列(即缺少編碼信號(hào)序列的核苷酸)，其中模板為質(zhì)粒1265-66C,正向引物和反向引物分別含有Ncol和HindIII位點(diǎn)正向引物5，-AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3，(SEQIDNO:6)反向引物5，國(guó)ACATAAAAGCTTTGAAATGCGACTGAAACGACG-3，(SEQIDNO:7)Ncol和HindIII消化后，PCR產(chǎn)物插入到pET42b(+)表達(dá)栽體(Novagen)的NcoI/HindlII位點(diǎn)。此過程產(chǎn)生一種質(zhì)粒，其編碼N端融合GST標(biāo)簽和C端融合6組氨酸標(biāo)簽的成熟cTSLP。包含正確插入序列的質(zhì)粒命名為1265-93B。GST-TSLP-His融合蛋白的表紐E.coliBL21(DE3)/pLysS中進(jìn)行，其包含T7RNA聚合酶基因，該基因受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的lacUV5啟動(dòng)子調(diào)控。含有質(zhì)粒1265-93B的E.coli細(xì)胞在30。C生長(zhǎng)，直到O.D.600達(dá)到0.6，再加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步30。C孵育2小時(shí)。SDS-PAGE顯示在可溶性E.coli餾分中有正確大小(約61kDa)的蛋白條帶(箭頭所示)(圖3A)。蛋白質(zhì)印跡顯示表達(dá)的蛋白與抗GST抗體反應(yīng)(圖3D)。GST-TSLP-His蛋白可用谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化(圖3B)。用Ni-NTA樹脂再次純化后，大部分GST-TSLP蛋白包含在純化柱流穿液中(圖3C)。實(shí)施例4犬TSLP的免疫熒光檢測(cè)使用抗人TSLP蛋白的兔多克隆抗體，通過免疫組織化學(xué)("IHC")測(cè)定了犬TSLP蛋白在犬皮膚和扁桃體組織中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)在石蠟包埋組織塊上進(jìn)行，樣品取自注射鹽水的正常犬皮膚，以及經(jīng)診斷患有多種皮膚病的患犬皮膚，所患皮膚病包括遺傳過敏性皮炎、皮膚紅斑狼療、多形紅斑、和交界型大皰性4J:松解癥。另外，在兩只犬的冷凍扁桃體組織中測(cè)定了TSLP蛋白表達(dá)。通過IHC測(cè)定TSLP表達(dá)的程序如下所述I.制備切片1.包埋皮膚樣品的石蠟塊切片成5-7微米厚度并置于栽玻片上，栽玻片已用多聚L-賴氨酸處理以促進(jìn)粘合。2.切片用二甲苯去除石蠟，用一系列乙醇溶液再水化。3.抗體恢復(fù)在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行[10mM檸檬酸鈉，其中含有0.5m1/升Tween-20,用實(shí)驗(yàn)室微波爐處理25分鐘，達(dá)到99-100。C]。此為恢復(fù)組織切片在石蠟包埋過程中被掩蓋的抗原性的過程。II.免疫染色1.切片在磷酸緩沖液(PBS)稀釋的10。/。正常驢血清中室溫孵育1小時(shí)以降低抗體的非特異性結(jié)合。2.小心去除多余血清，切片用PBS稀釋的兔抗體(1:100)覆蓋，在潮濕箱中室溫孵育1小時(shí)或4。C孵育過夜。3.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，其間小心搖動(dòng)。4.小心去除多余PBS,切片用PBSl:5000稀釋的生物素標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體覆蓋，在潮濕箱中室溫處理30分鐘。5.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，其間小心搖動(dòng)。436.去除多余的PBS，切片在5微克/ml鏈霉親和素-異硫氰酸熒光素(鏈霉親和素-FITC)結(jié)合的PBS中室溫孵育30分鐘。7.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，小心搖動(dòng)。8.切片用蘇木精復(fù)染色2-3分鐘，9.在焚光顯^t鏡下檢查切片。10.拍照合適的圖像。11.實(shí)驗(yàn)對(duì)照包括不加一級(jí)抗TSLP抗體、或用普通兔抗體替換一級(jí)抗TSLP抗體。以下表1總結(jié)了IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSLP表達(dá)在80%AD患犬皮膚組織中檢出，但僅在20。/。注射鹽水的正常皮膚組織中檢出。TSLP還分別在66%多形紅斑患犬和100%遺傳性皮膚病交界型大皰性表皮松解癥患犬皮膚組織中檢出。在皮膚紅斑狼掩患犬皮膚組織中無TSLP蛋白表達(dá)。在石蠟包埋的皮膚組織中，TSLP表達(dá)在汗腺中檢出。冷4顯示了犬皮趺樣品陽(yáng)性IHC染色的一個(gè)實(shí)例，其代表取自診斷為遺傳過敏性皮炎患犬的石蠟包埋皮膚組織樣品。實(shí)施例6犬TSLP免疫過氧化物酶檢測(cè)使用免疫過氧化物酶染色作為檢測(cè)方法，通過免疫組織化學(xué)測(cè)定犬TSLP蛋白在由診斷為遺傳過敏性皮炎患犬皮膚制備的石蠟包埋組織塊中的表達(dá)。在此方法中，表位特異性的大鼠:^ATSLP蛋白單克隆抗體凈皮用作一級(jí)抗體。通過免疫過氧化物酶染色測(cè)定TSLP表達(dá)的程序如下所述特殊試劑普通新生牛血清#N-4762Sigma石蠟包埋皮膚組織一級(jí)抗體大鼠抗人TSLPmAB大鼠IgG2a二級(jí)抗體兔抗大鼠IgG(生物素標(biāo)記)BA-4000VectorLab.Burlingame，CA檢測(cè)試劑鏈霉親和素-辣根過氧化物酶#43-8323ZymedLabs.SanFrancisco,CA3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)底物試劑盒Biogenex#HK129-5KSanRamon,CA1.樣品切片4-6um。2.室溫風(fēng)干IO分鐘。3.丙酮固定IO分鐘。4.PBS(0.01磷酸緩沖液)漂洗3分鐘。5.在含有0.1%疊氮鈉的0.3%過氧化氫中淬滅7-10分鐘6.PBS漂洗5分鐘。7.在保濕箱中用1%普通新生牛血清封閉切片20分鐘。8.瀝千栽玻片，加入l:100稀釋的一級(jí)抗體，室溫2小時(shí)。9.漂洗5分鐘。10.加入二級(jí)抗體(l:400稀釋的兔抗大鼠IgG)，在保濕箱中室溫30分鐘。11.漂洗5分鐘。12.瀝干，加A^檢測(cè)試劑(1:400稀釋的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶)，室溫30分鐘。13.漂洗2次，每次5分鐘.14.加入AEC，2.5分鐘。根據(jù)所需染色深度和背景調(diào)整，15.蘇木精復(fù)染色并制作標(biāo)本。使用表位特異性的犬TSLP抗體，通過IHC檢測(cè)一組AD患犬的犬皮膚組織。圖5所示結(jié)果提示此抗體可與和人TSLP具有相同表位的分子反應(yīng)。犬AD皮膚樣品在表皮增厚的慢性炎癥區(qū)域染色強(qiáng)烈。這種表現(xiàn)與已知的人AD皮膚損傷中的TSLP表達(dá)位置一致，進(jìn)一步表明在犬皮膚AD損傷中識(shí)別的分子是犬TSLP。使用PBS或不同蛋白(淋巴細(xì)胞蛋白)特異性的不同大鼠單克隆抗體不能觀察到染色。實(shí)施例7犬TSLP的表位作圖為鑒定可在能夠中和TSLP活性的疫苗中包含的犬TSLP表位，合成一組基于犬TSLP蛋白序列的相互重疊的肽，并測(cè)試其與抗人TSLP單克隆中和抗體反應(yīng)的能力。為此目的，在MIMOTOPES(Minneapolis,MN)的針上合成一組相互重疊的肽，各長(zhǎng)15個(gè)氨基酸，相互錯(cuò)開2個(gè)氨基酸。上述肽的序列在表2中列出。合成的肽l-57帶有酰胺化末端，結(jié)構(gòu)為NH2-PEPTIDE-PIN。合成的肽58-94(母肽l-37的重復(fù))帶有乙酖化末端，結(jié)構(gòu)為ACETYL-PEPTIDE-PIN。根據(jù)制造商推薦的程序(Mimotopes，Minneapolis,MN)，通過ELISA分析檢測(cè)含表2中所列的肽的針(ThepinscarryingthepeptidelistedinTable2)。如圖6所示，25號(hào)多肽(表位25)，其M酸序列為NH2-ARIERLTLHRIRGCA(SEQIDNO:32),具有最高的抗PAB100單克46隆抗體的反應(yīng)活性。圖7所示為該多肽序列與對(duì)應(yīng)的假定人TSLP多肽序列的比較。表2用于表位作圖的犬TSLP多肽表位號(hào)SEQID表位號(hào)SEQIDNOs:NOs:<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>41ECPGYAAAPINNTQA4888GCASGAREAFAEGTV9542PGYAAAPINNTQAKK4989ASGAREAFAEGTVAA9643YAAAPINNTQAKKKR5090GAREAFAEGTVAALA9744AAPINNTQAKKKRKK5191REAFAEGTVAALAAE9845PINNTQAKKKRKKRG5292AFAEGTVAALAAECP9346NNTQAKKKRKKRGVT5393AEGTVAALAAECPGY10047TQAKKKRKKRGVTTN5494GTVAALAAECPGYAA101本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方式的限制。實(shí)際上，根據(jù)前面所述，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，除本文所述之外的對(duì)本發(fā)明的多種改型是顯而易見的。此類改型理應(yīng)列入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。應(yīng)進(jìn)一步了解，為核酸或多肽給出的所有威基大小或氨基酸大小、以及所有分子量或分子量數(shù)值都是近似的，僅為描述所用。本文引用了很多文獻(xiàn)，其公開的4^內(nèi)容結(jié)合到本文中作為參考。48權(quán)利要求1、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素蛋白(TSLP)或其抗原片段，其中所述TSLP蛋白包含一段氨基酸序列，該序列與SEQIDNO2的氨基酸序列有80％或更高的同一性，不包括其28個(gè)氨基酸殘基信號(hào)序列；并且其中所述TSLP蛋白可與包含SEQIDNO2的氨基酸的犬TSLP的抗體交叉反應(yīng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的TSLP,其中TSLP與表位特異性的犬TSLP抗體結(jié)合。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的TSLP，其為犬TSLP。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的犬TSLP蛋白，其包含SEQIDNO:2中的氨基酸殘基29-155。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的犬TSLP蛋白的抗原片段，其中所述片段包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNOs:8-101、或其中兩個(gè)或多個(gè)序列的組合。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗原片段，其包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、或其中兩個(gè)或多個(gè)序列的組合。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的TSLP蛋白的抗原片段，其中所述抗原片段包含一段氨基酸序列，該序列為NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(SEQIDNO:118)中第5到22位鄰接的氨基酸；并且其中所述抗原片段與表位特異性的犬TSLP抗體結(jié)合。8、疫苗，其包含藥學(xué)上可接受的佐劑和有效量的免疫原，該免疫原選自權(quán)利要求1所述的TSLP蛋白、TSLP蛋白的抗原片段、以及其組合。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其中TSLP蛋白的抗原片段包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、或其組合.10、核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1所述的TSLP蛋白。11、核酸分子，其編碼如權(quán)利要求4所述的TSLP蛋白，或編碼該蛋白的抗原片段。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸分子，其包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。13、表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求ll所述的核酸分子。14、疫苗，其包含如權(quán)利要求13所述的表達(dá)栽體。15、制備TSLP蛋白的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求13所迷的表達(dá)栽體，并且TSLP蛋白在其中表達(dá)。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其進(jìn)一步包括從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離TSLP蛋白。17、在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗TSLP抗體的方法，其包括用有效量的如權(quán)利要求8所述的疫苗免疫哺乳動(dòng)物。18、下調(diào)犬體內(nèi)TSLP活性的方法，其包括用有效量的如權(quán)利要求8所述的疫苗免疫犬。19、治療或預(yù)防特異反應(yīng)性犬的過敏癥狀的方法，其包括用有效量的如權(quán)利要求8所述的疫苗免疫犬。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中過敏癥狀包含過敏性皮炎或哮喘。21、抗犬TSLP抗體，其在哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物雜交瘤體系中被如權(quán)利要求8所述的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生。22、治療特異反應(yīng)性犬的過敏癥狀的方法，其包括施用有效量的如權(quán)利要求21所述的抗犬TSLP抗體。23、根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其進(jìn)一步包含有效量的非TSLP免疫原。24、根據(jù)權(quán)利要求9所迷的疫苗，其進(jìn)一步包含有效量的非TSLP免疫原。25、診斷犬遺傳過敏性皮炎的方法，其包括犬表皮樣品的取樣，以及在表皮樣品中檢測(cè)如權(quán)利要求4所述的犬TSLP蛋白的存在。全文摘要本發(fā)明公開了一種犬TSLP蛋白和編碼該蛋白的核酸。本發(fā)明也公開了該蛋白的包含犬TSLP蛋白特異性表位的肽片段。犬TSLP蛋白和相關(guān)肽片段可用作免疫分析的抗原，也可用作誘導(dǎo)抗TSLP抗體的疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步公開了制備和使用犬TSLP基因、犬TSLP蛋白、以及相關(guān)肽片段的方法。文檔編號(hào)C07K14/54GK101631800SQ200780051269公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2007年12月11日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者D·M·戈曼,J·D·馬特森,M·A·莫西,R·德瓦爾馬萊菲特申請(qǐng)人:先靈-普勞有限公司