專利名稱：乳豬胸腺蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)的動(dòng)物胸腺蛋白，尤其是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)的乳豬胸腺蛋白，以及它們的制作方法和用途。
胸腺是一個(gè)分泌激素和產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的免疫器官，由胸腺產(chǎn)生的一族多肽和蛋白質(zhì)能控制調(diào)節(jié)著免疫反應(yīng)的質(zhì)和量。近年，國(guó)外對(duì)胸腺提取物的研究已引起重視。受胸腺活性物質(zhì)能影響角膜及淋巴結(jié)上皮細(xì)胞增殖研究的啟發(fā)，我們從乳豬胸腺中提取出一組中分子量水溶性蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)稱胸腺蛋白，并對(duì)其進(jìn)行促細(xì)胞增殖活性的研究。
1972年，Goldstein等人成功地從小牛胸腺中分離到一組能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多肽，命名為胸腺肽F5，生化分析表明，胸腺F5是具有活性的單一肽類，均為小分子肽類成份，分子量均小于15000道爾頓，但Goldstein報(bào)道的方法中，需要有超高速離心，丙酮沉淀等過程，工藝復(fù)雜，很難推廣使用。
1975年，Hooper等人在小牛胸腺肽的制備中第一次采用超濾技術(shù)，通過截留分子量小于15000道爾頓的胸腺肽組份來制備制劑，簡(jiǎn)化了提純方法。
在這幾年中，許多人對(duì)小牛胸腺肽的進(jìn)一步分離有生物活性的單肽類作了大量的工作，從胸腺肽組織中分離的具有免疫活性成分的分子量如下表
從上述內(nèi)容可以看出，目前已經(jīng)公開的研究結(jié)果，主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于15000道爾頓，還有的學(xué)者認(rèn)為，胸腺中具有生物活性的成份均是分子量在6000道爾頓以下的較小的多肽。不難看出，目前所提取的胸腺肽主要是小分子量的，而且工藝條件復(fù)雜。有時(shí)還需要通過Sephader-150柱層純化，也有人采用生理鹽水浸提，凍融后經(jīng)透析而成。
本發(fā)明的主要目的是利用包括離心分離，透析的方法，從乳豬胸腺中制取一組中分子量的乳豬胸腺蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供一種簡(jiǎn)單的方法，從而能有效的，可滿足實(shí)際需要的來生產(chǎn)這種中分子量的乳豬胸腺蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是利用上述中分子量的乳豬胸腺蛋白，并利用這種中分子量的乳豬胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞，成纖細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的，是利用這種中分子量乳豬的胸腺蛋白所具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，作為化狀品的主要成份之一，可有效的促進(jìn)人體表皮細(xì)胞的增殖和代謝，從而達(dá)到美容或類似的目的。
下面具體描述本發(fā)明所述的中分子量的乳豬胸腺蛋白的制備工藝。
首先，選用40-60天豬齡的健康乳豬的胸腺，拔除胸腺上的脂肪組織，將胸腺高速搗碎，所要注意的是，應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成這些工作，在此期間，勻漿屬低溫高速搗碎，將搗碎后的勻漿加溫，溫度保持在80-90℃之間，時(shí)間為10-30分鐘，然后，離心分離，離心分離后去沉淀，留上清液，進(jìn)行透析，所述的透析可以采用透析器，透析膜，也可以是其它能達(dá)到此目的的透析用具，透析膜或透析器的截留分子量為5萬，然后再用截留分子量為3萬的透析裝置進(jìn)行第二次透析，將二次透析的液體進(jìn)行濃縮，再經(jīng)過常規(guī)手段的處理，如除菌、分裝，凍干，最后就得到了分子量在3-5萬道爾頓的中分子胸腺蛋白。
上述實(shí)例是用來說明本發(fā)明工藝，而不是用來限制本發(fā)明，類似的方法都在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。


圖1是不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的增殖狀況。
圖2是不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對(duì)小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)的增殖狀況。
圖3是乳豬胸腺蛋白(TP)、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
圖4是乳豬胸腺蛋白(TP)、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
圖3、圖4中1是乳豬胸腺蛋白(TP)、2是成豬胸腺蛋白(TP)、3是胸腺肽注射液(TF)、4是肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)。
將上述方法制備的中分子胸腺蛋白進(jìn)行各次試驗(yàn)，具體內(nèi)容如下。
樣品包括本發(fā)明中分子量的乳豬胸腺蛋白(TP)，分子量3-5萬。胸腺肽注射液(TF)，由廣東省生物制品研究所提供。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液由廣東省陽江制藥廠提供。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的制備取健康產(chǎn)婦分娩后3小時(shí)內(nèi)的臍帶，用D-Hanks′液反復(fù)沖洗臍靜脈至無血跡，灌入0.25%胰蛋白酶5ML，置37℃水浴內(nèi)10分鐘，收集消化液，用5ml含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液沖洗臍靜脈，收集沖洗液，將消化液及沖洗液合并收入離心管內(nèi)，1000rpm，離心10分鐘，去上清。加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(內(nèi)含20%小牛血清，200u/ml青霉素，0.2ug/ml鏈霉素，200ug/mlECGS)稀釋沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞接種于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置50%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天換液一次。直至細(xì)胞單層形成，即進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)時(shí)，用D-Hanks′液輕洗細(xì)胞單層2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室溫下消化1-2分鐘，棄消化液，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，并用吸管吹打20-30次，制成細(xì)胞懸液。以1∶2-3比率傳代。用于實(shí)驗(yàn)的為2-3代細(xì)胞，經(jīng)V因子相關(guān)抗原(VR.Ag)的抗體檢測(cè)，確認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞后方作為生物效應(yīng)測(cè)定用細(xì)胞。
小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)由第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院提供(培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基加20%小牛血清)。
本發(fā)明的乳豬胸腺蛋白生物效應(yīng)測(cè)定每次取24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板3塊，于每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)(面積2cm)加入2X10個(gè)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞各72孔，將各檢測(cè)樣品(乳豬胸腺蛋白、成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)，按不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)分別加入3孔細(xì)胞中平行檢測(cè)。每份樣品設(shè)立3孔空白對(duì)照(與鹽水做對(duì)照)。將上述細(xì)胞置5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)每孔內(nèi)活細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)方法為置顯微鏡下每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下的細(xì)胞數(shù)，取其均值，按下列等式換算成每平方厘米培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)。
ECs/cm＝細(xì)胞計(jì)數(shù)均值/0.19625x100[ECs內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)，0.19625為每高倍鏡視野(X400)面積，單位mm]，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖狀況見圖1.圖2。
圖1、圖2提示，本發(fā)明的乳豬胸腺蛋白(TP)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)均有明顯的促增殖生物效應(yīng)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，而且增殖效應(yīng)與乳豬胸腺蛋白(TP)的最佳濃度有關(guān)(0.2mg-0.4mg/ml)。
各種不同檢測(cè)樣品對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖效應(yīng)的影響比較，結(jié)果見圖3，圖4。
圖3、圖4提示1.本發(fā)明的乳豬胸腺蛋白(TP)有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖的作用。2.成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)三種被檢樣品均無明顯促內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖活性，與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)。3.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)雖然有低水平的刺激現(xiàn)象，但與乳豬胸腺蛋白(TP)相比仍有顯著性差異，與成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)結(jié)果比較無明顯意義。說明乳豬胸腺蛋白(TP)中確存在著一組能提高內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖的活性組份。
自1966年Goldstein等首先研究小牛胸腺的丙酮提取物，1975年進(jìn)一步用硫酸銨劃分得到的Fr5以來，大多數(shù)學(xué)者均集中在小分子Fr5的理化特性，生物活性，作用機(jī)理、和開發(fā)利用方面的研究。對(duì)胸腺中分子及大分子蛋白類研究較少。本發(fā)明提取的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)經(jīng)高效液相色譜分析共有6個(gè)組份峰、6條電泳帶，紫外掃描在波長(zhǎng)280nm中有一主要吸收峰，仍屬一組中分子蛋白類混合物。本發(fā)明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)提取方法簡(jiǎn)便，性質(zhì)穩(wěn)定，成本低，經(jīng)用內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)連續(xù)增殖傳代培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，乳豬胸腺蛋白(TP)中存在著一組能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖效應(yīng)的活性組紛，而且出現(xiàn)增殖效應(yīng)與乳豬胸腺蛋白(TP)的最佳濃度相關(guān)的現(xiàn)象。乳豬TP中是否存在著一組與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)相同或類似的或組份和結(jié)構(gòu)不同而功能相同的物質(zhì)，目前仍未明了。但從乳豬胸腺蛋白(TP)提取材料的來源，提取工藝和物質(zhì)分子量結(jié)果分析推測(cè)，本發(fā)明的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)與目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的小分子(分子量＜1.8萬)多肽類物質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，胸腺肽注射液(TF)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)差異較大，而本發(fā)明圖3，圖4結(jié)果也表明，乳豬胸腺蛋白(TP)與成年豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(HGF)的作用效應(yīng)不同。
我們根據(jù)KomarovFI胸腺提取物與胃、十二指腸潰瘍有關(guān)的報(bào)道，采用本發(fā)明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)外用治療口腔潰瘍(1×1.2cm)，皮膚感染糜爛長(zhǎng)期不愈傷口(4×5cm)的患者，乳豬胸腺蛋白(TP)表現(xiàn)出良好的抗感染和明顯促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)效果。研究初步表明本發(fā)明乳豬胸腺蛋白(TP)在實(shí)驗(yàn)室促內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖效應(yīng)與臨床外用治療促進(jìn)傷口愈合的結(jié)果相吻合。本發(fā)明乳豬胸腺蛋白(TP)是一種還末受到重視的中分子蛋白，有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)增殖的活性物質(zhì)。至于胸腺蛋白本身的理化特性如何？乳豬胸腺與成年豬胸腺之間的差異，乳豬胸腺蛋白(TP)與目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的各種細(xì)胞因子有什么內(nèi)在聯(lián)系仍需進(jìn)一步全面的深入研究探索。我們認(rèn)為開展對(duì)乳豬胸腺中分子蛋白類的實(shí)驗(yàn)研究有著新的廣闊前景，而且對(duì)進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用乳豬胸腺有十分重要的價(jià)值。
我們采用中分子乳豬胸腺蛋白初步臨床應(yīng)用于治療口腔潰瘍及皮膚損傷取得了良好效果。用注射用水稀釋中分子乳豬胸腺蛋白至濃度為2mg/ml的水溶液。10例口腔潰瘍患者應(yīng)用該液體涂抹潰瘍表面，每日2-3次。治療1-3日，10例患者(2例治療1天后，6例2天后，2例3天后)潰瘍瘡面均完全愈合，并無感染現(xiàn)象發(fā)生，較同期對(duì)照組(治療4-5天后愈合)療效顯著。另有3例皮膚損傷患者用以該品水溶液浸濕的紗布局部外敷皮膚瘡面，每天換藥一次，連續(xù)敷用4-5日后，發(fā)現(xiàn)其中2例感染糜爛傷口有新生的肉芽組織及表皮生成，瘡面炎性滲出及紅腫明顯消除。結(jié)果提示胸腺蛋白有良好的抗感染和明顯促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)的效果，這與胸腺蛋白實(shí)驗(yàn)室促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、小鼠3T3成纖維細(xì)胞(FC)的增殖效應(yīng)相吻合。
圖3，4方框中空白為試樣，陰影為對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種中分子量乳豬胸腺蛋白，其特征在于本發(fā)明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)經(jīng)高效液相色譜分析共有6個(gè)組份峰、6條電泳帶，紫外掃描在波長(zhǎng)280nm中有一主要吸收峰，本發(fā)明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)的分子量在3-5萬道爾頓之間。
2.權(quán)利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的制備工藝，包括選料、搗碎、離心分離、透析、濃縮、除菌、分裝，凍干，其特征在于首先選用40-60天豬齡的健康乳豬的胸腺，拔除胸腺上的脂肪組織，將胸腺高速搗碎，所要注意的是，應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成這些工作，在此期間，勻漿屬低溫高速搗碎，將搗碎后的勻漿加溫，溫度保持在80-90℃之間，時(shí)間為10-30分鐘，然后，離心分離，離心分離后去沉淀，留上清液，進(jìn)行透析，，透析的截留分子量為5萬，然后再用截留分子量為3萬的透析裝置進(jìn)行第二次透析，將二次透析的液體進(jìn)行濃縮。
3.權(quán)利要求2所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的制備工藝，其特征在于所述的透析可以采用透析器，透析膜，也可以是其它能達(dá)到此目的的透析用具。
4.權(quán)利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的用途，其特征在于所述的中分子量的乳豬胸腺蛋白，并利用這種中分子量的乳豬胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞，成纖細(xì)胞的生長(zhǎng)。
5.權(quán)利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的用途，其特征在于所述的中分子量乳豬的胸腺蛋白具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，作為化狀品的主要成份之一，可有效的促進(jìn)人體表皮細(xì)胞的增殖和代謝，從而達(dá)到美容或類似的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)的動(dòng)物胸腺蛋白，尤其是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)的乳豬胸腺蛋白，以及它們的制作方法和用途。本發(fā)明主要是利用包括離心分離，透析的方法，從乳豬胸腺中制取一組具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力、可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖細(xì)胞生長(zhǎng)的中分子量乳豬胸腺蛋白。本發(fā)明還有一個(gè)目的是利用這種中分子量乳豬胸腺蛋白所具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，作為化妝品的主要成分之一，可有效的促進(jìn)人體表皮細(xì)胞的增殖和代謝，從而達(dá)到美容或類似的目的。
文檔編號(hào)C07K1/14GK1081445SQ9210564
公開日1994年2月2日 申請(qǐng)日期1992年7月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月18日
發(fā)明者陳光明, 楊富強(qiáng), 謝汝錦, 邵巖, 張宜俊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍空軍廣州醫(yī)院